dissertação de mestrado lara paro...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LARA PARO DIAS
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) E
BACILLUS CALMETTE GUÉRIN (BCG) PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER
DE BEXIGA
ASSESSMENT OF THE ASSOCIATION OF PLATELETS RICH PLASMA (PRP) AND BACILLUS CALMETTE GUÉRIN (BCG) FOR THE TREATMENT OF BLADDER
CANCER
CAMPINAS
2017
LARA PARO DIAS
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) E
BACILLUS CALMETTE GUÉRIN (BCG) PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER
DE BEXIGA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de
Fisiopatologia Cirúrgica.
ORIENTADOR: PROF. DR. WAGNER JOSÉ FÁVARO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNA LARA PARO DIAS E ORIENTADO PELO
PROF. DR. WAGNER JOSÉ FÁVARO.
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
LARA PARO DIAS
ORIENTADOR: WAGNER JOSÉ FÁVARO
MEMBROS:
1. PROF. DR. WAGNER JOSÉ FÁVARO, IB / UNICAMP
2. PROF. DR. ATHANASE BILLIS, FCM / UNICAMP
3. PROF. DR. JOSÉ CARLOS SOUZA TRINDADE FILHO, FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU / UNESP
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 21/12/2017
AGRADECIMENTOS
À minha mãe e irmão, Regina e Lucas; às minhas primas, Roberta, Rafaela; e à amiga e
parceira de trabalho Cristina, por todo apoio, incentivo, suporte e amor.
Ao meu orientador Prof. Dr. Wagner José Fávaro, por ter me acolhido em seu laboratório e
por me proporcionar esta oportunidade de aprendizado na área acadêmica, pelos grandes
ensinamentos, dedicação e pela paciência nos momentos críticos. Muito Obrigada.
À professora Drª. Angela Cristina Malheiros Luzo por apresentar e permitir aprofundar o
estudo com o PRP, pela parceria de trabalho, ensinamentos e dedicação nesta trajetória.
Aos amigos do laboratório LCURGIM e parceiros, que me ajudaram diariamente com os
experimentos, pela amizade e conversas nos momentos de descontração. Obrigada Bruno,
Sofia, Marcela, Mariana, Maisa, Patrick, Joel, Miriam, Letícia, Petra, Eduardo, Miriam,
Queila e Ianny.
À Faculdade de Ciências Médicas, ao Departamento de Anatomia do Instituto de Biologia, e
ao Instituto de Engenharia Química da UNICAMP pela honra de poder desfrutar de toda a
estrutura de seus laboratórios e a todos os funcionários que sempre estavam dispostos a
ajudar.
Aos amigos de longa data, Marina, Malú, Evelyn, Cárin, Paulo Vitor e Danilo, por
continuarem a fazer parte da minha vida, não importam a distância e tempo, e como se fosse
ontem que nos formamos no colegial e saímos para “descobrir o mundo lá fora”.
Às minhas amigas Natacha, Tábata, Renata, Carol, Gisele, Carol, Diana, Carla, Érica, pelo
companheirismo, carinho, risadas e por serem minhas irmãs quando estamos longe das nossas
famílias.
RESUMO
O câncer de bexiga é mundialmente o câncer mais comum e o segundo mais agressivo do trato urinário, com a estimativa de quase 10 mil casos novos no Brasil em 2016, sendo que o principal fator de risco exógeno é o tabaco. O principal tratamento atual para o câncer de bexiga não-músculo invasivo (CBNMI) é a instilação da Bacillus Calmette Guérin (BCG) após a ressecção cirúrgica, porém esta terapia está ligada a fortes e frequentes reações adversas, intolerância e/ou falha de tratamento e alta porcentagem de recorrência tumoral. O estudo da interação do sistema imune através dos Receptores Toll-like (TLR) com o câncer e inflamação está se aprofundando a cada dia, e se mostrando como uma opção terapêutica para o tratamento do câncer. O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) é um lisado plaquetário que libera uma série de fatores de crescimento com propriedades regenerativas que atuam através da promoção de quimiotaxia de fibroblastos, regulação da secreção de colágeno, dentre outras funções. Diante deste cenário, propusemos uma alternativa terapêutica ao BCG, através de um modelo animal com ratos Ficher 344 induzidos quimicamente com n-metil-nitrosouréia (MNU) ao CBNMI, onde realizamos os grupos experimentais: CTL, CTL+PRP, MNU (câncer), MNU+BCG, MNU+PRP e MNU+PRP+BCG, aplicados intravesicalmente. O resultado das análises histopatológicas destes grupos experimentais mostrou 20%, 40% e 60% de inibição tumoral para os grupos MNU+BCG, MNU+PRP e MNU+PRP+BCG respectivamente. A imunorreatividade das proteínas TLR2, TLR4, MyD88, TRIF, IRF-3 e IFN-γ revelaram ativação do sistema imune inato pela BCG (via dependente d eMyD88). Concomitantemente, a terapia intravesical com PRP associado ao BCG levou a ativação do sistema imune inato mediado por TLR2 e TLR4, conforme os resultados representados pela intensa imunoreatividade de IFN-γ (via dependente de TRIF) no grupo de tratamento com PRP associado ao BCG. Concluiu-se, portanto, que o os FC’s presentes no PRP desempenharam papel fundamental na modulação do sistema imune, e que a sua associação ao BCG desencadeia uma melhor resposta imunológica em comparação a terapia com BCG e PRP isolados, podendo ser considerada uma importante estratégia terapêutica para o CBNMI. PALAVRAS-CHAVE: Câncer de Bexiga Não-Músculo Invasivo. Receptores Toll Like. Plasma Rico em Plaquetas. Bacillus Calmette Guérin.
ABSTRACT
Bladder cancer is the world's most common cancer and the second most aggressive of the urinary tract, with an estimated 10,000 new cases in Brazil in 2016, and the main exogenous risk factor is tobacco. The main current treatment for non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) is the instillation of Bacillus Calmette Guérin (BCG) after surgical resection, but this therapy is linked to strong and frequent adverse reactions, intolerance and / or treatment failure and high percentage of tumor recurrence. The study of the interaction of the immune system through Toll-like Receptors (TLR) with cancer and inflammation is deepening every day, and showing itself as an important therapeutic option fot the treatment of cancer. Platelet Rich Plasma (PRP) is a platelet lysate that releases a number of growth factors (GF) with regenerative properties of tissue injury and healing through the promotion of fibroblast chemotaxis, regulation of collagen secretion, and other functions. In this scenario, we proposed a therapeutic alternative to BCG, through an animal model with Fischer 344 mice chemically induced with n-methyl nitrosurea (MNU) to NMIBC, where we performed the experimental groups: CTL, CTL + PRP, MNU (cancer), MNU + BCG, MNU + PRP and MNU + PRP + BCG, applying intravesically. The histopathological results showed 20%, 40% and 60% of tumor inhibition for MNU + BCG, MNU + PRP and MNU + PRP + BCG groups respectively. Immunoreactivity of TLR2, TLR4, MyD88, TRIF, IRF-3 and IFN-γ proteins showed activation of the immune system by BCG (MyD88 dependent pathway). Concomitant, intravesically therapy with PRP plus BCG led to innate immune system activation mediated by TLR2 and TLR4, according to result represented by the intense immunoreactivity to IFN-γ (TRIF-dependent pathway) in the PRP + BCG treatment group. It was concluded, therefore, that GFs present in PRP played a fundamental role in modulation of immune system, and that its association with BCG triggers a better immune response compared to therapy with isolated BCG and PRP, and may be considered an important strategy therapy for NMIBC. KEYWORDS: Non-Invasive Muscle Bladder Cancer. Toll Like Receptors. Platelet Rich Plasma. Bacillus Calmette Guérin.
LISTA DE SIGLAS
BCG - Bacillus Calmette-Guérin
CB - Câncer de bexiga
CBNMI – câncer de bexiga não-musculo invasivo
DAMP - padrões moleculares associados a danos
DNA - ácido desoxirribonucleico
EGF – fator de crescimento epidermal
FC – fator de crescimento
FGF - fator de crescimento de fibroblastos
GM-CSF - fatores estimuladores de colónias de granulócitos-macrófagos
HGF - fator de crescimento de hepatócito
IFN – interferon
IGF - fator de crescimento de insulina
IL – interleucina
L-PRP - plasma rico em plaquetas com leucócitos
LPS - lipopolissacarídeos
MNU - N-metil-N-nitrosourea
MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
NF - Fator nuclear
NO - óxido nítrico
PAMP - patógenos associados a padrões moleculares
PDGF - fator de crescimento derivado de plaquetas
P-PRP – plasma rico em plaquetas puro
PRP – plasma rico em plaquetas
TGF - fator de crescimento de transformação
Th1/ Th2- T-helper tipo 1 e tipo 2
TIR - receptores Toll/IL-1
TLR – receptores Toll-like
TNF – fator de necrose tumoral
TURB – ressecção transuretral do tumor da bexiga
VEGF - fator de crescimento endotelial vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 10 1.1 Carcinoma de Bexiga Não-Músculo Invasivo ................................................. 10 1.2 Tratamento convencional do CBNMI: Imunoterapia intravesical com Bacillus Calmette Guérin (BCG)...........................................................................
12
1.3 Sistema Imune e Câncer: Via de Sinalização dos Receptores Toll-Like (TLR2 e TLR4) ......................................................................................................
13
1.4 Novas perspectivas terapêuticas para o CBNMI: Plasma Rico em Plaquetas (PRP) ...............................................................................................................
16
2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 21 3 OBJETIVOS ...................................................................................................... 3.1 Geral................................................................................................................. 3.2 Específicos........................................................................................................
23 23 23
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 24 4.1 Obtenção do Plasma Rico em Plaquetas (PRP) ............................................... 24 4.2 Avaliação da Viabilidade Celular em linhagem celular tumoral de bexiga 5637 na presença de PRP e BCG ..........................................................................
25
4.3 Animais e Procedimento Experimental para CBNMI ..................................... 26 4.4 Análises Histopatológicas ............................................................................... 27 4.5 Imunomarcação dos Antígenos TLRs (TLR2, TLR4, MyD88, TRIF, IRF-3 e IFN-γ) .................................................................................................................
27
4.6 Análises Estatísticas ........................................................................................ 28 5 RESULTADOS .................................................................................................. 29 5.1 Obtenção do PRP e recuperação de plaquetas viáveis foi satisfatória e mostrou citotoxicidade celular “in vitro” ..............................................................
29
5.2 Tratamento com PRP Associado à Imunoterapia com BCG Reverteu as Alterações Histológicas Induzidas por MNU.........................................................
30
5.3 Tratamento com PRP Associado à Imunoterapia com BCG Estimulou o Sistema Imune Inato e Induziu o Aumento de Interferon .....................................
35
6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 39 7 CONCLUSÕES FINAIS................ .................................................................... 43 8 REFERÊNCIAS ................................................................................................. 44 Anexo I – Comitê de Ética Animal ....................................................................... 51 Anexo II – Comitê de Ética Humano .................................................................... 52 Anexo III – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ................................... 58
10
1 INTRODUÇÃO
1.1 Carcinoma de Bexiga Não-Músculo Invasivo
O câncer de bexiga (CB) é mundialmente o câncer mais comum e o segundo mais
agressivo do trato urinário. Para o ano de 2017 estima-se 79.030 mil casos novos de CB e
16.870 mortes nos EUA, e no Brasil a estimativa para 2016 foi de 9.670 casos novos. Sua
incidência é quatro vezes maior em homens do que em mulheres, sendo que homens
caucasianos são diagnosticados com CB quase duas vezes mais que os afrodescendentes e o
prognóstico mais grave acomete o sexo feminino. A doença tem como característica clínica
ser silenciosa, apresentando pequenos sinais e sintomas como dor ou irritação, hematúria e
aumento da frequência ou urgência ao urinar, e a maioria dos casos é diagnosticada em
pacientes entre 50 a 70 anos de idade1, 2, 3.
Os fatores de risco associados ao CB são exógenos e ambientais, onde o tabagismo é o
principal fator, sendo responsável por mais de 33% dos casos de CBs, seguido pela exposição
ocupacional devido ao contato com certos produtos químicos industriais derivados de aminas
aromáticas e radicais livres de oxigênio. Outros fatores etiológicos envolvidos no
desenvolvimento e progressão do CB incluem infecções de repetição do trato urinário, litíase
nos rins e bexiga; radiação; exposição prolongada a agentes quimioterápicos; e álcool1, 4, 5.
Indivíduos fumantes típicos possuem propensão de duas a três vezes maior que não
fumantes de desenvolver o CB, e o risco é diretamente proporcional à quantidade de cigarros
consumidos diariamente. Na composição do cigarro contém diversas substâncias químicas
genotóxicas, como compostos N-nitrosos e aminas aromáticas, e podem ser encontradas em
níveis consideráveis nas amostras de sangue e urina dos fumantes. Substâncias derivadas de
aminas aromáticas, como a 4-aminobifenil, estão correlacionadas com ligação ao ácido
desoxirribonucleico (DNA) e mutação do gene p53 nos tumores de bexiga humana,
fortalecendo a evidência do envolvimento do tabaco com a carcinogênese urotelial, além da
contribuição da fumaça na promoção do crescimento tumoral através do aumento da
proliferação celular ou supressão da resposta imune6.
O estadiamento histopatológico é realizado por biópsia do tecido e determina a
profundidade de invasão tumoral na parede vesical, classificados por TNM, em que T
representa o tumor primário, N representa acometimento dos linfonodos regionais e M
representa metástases à distância. No momento do diagnóstico, aproximadamente 60% dos
CB são do fenótipo não-músculo invasivo (CBNMI) (Tis, Ta, T1) (Figura 1), que
frequentemente reincidem após tratamento cirúrgico, possuem uma sobrevida média de cinco
11
anos e podem progredir para o fenótipo invasivo (T2, T3, T4) (Figura 1), sendo que a
instabilidade genética é crucial para esta progressão3, 7, 8.
Histologicamente, o CBNMI é divido em três estadios, de acordo com as alterações
celulares malignas: (a) carcinoma intraurotelial in situ ou Tis, caracterizado por lesões planas
e de alto grau, limitadas à mucosa da bexiga; (b) carcinoma papilífero não invasivo ou Ta,
caracterizado por lesões confinadas ao epitélio e limitadas pela membrana basal; e (c)
carcinoma urotelial ou T1, caracterizado por invasão do tecido conjuntivo sub-epitelial ou
lâmina própria4.
Figura 1 – Bexiga urinária e estadiamento dos tumores da bexiga4.
As opções terapêuticas para o CBNMI são a erradicação macroscópica por ressecção
transuretral do tumor da bexiga (TURB) e terapia intravesical adjuvante com agentes
quimioterápicos como mitomicina C, gencitabina e tiotepa, ou imunoterápicos como
interferon e o, mais frequentemente utilizado atualmente, Bacillus Calmette-Guérin (BCG),
que auxiliam na diminuição da recorrência e progressão do tumor, porém estão ligados a
frequentes reações adversas, dificuldade na adesão ao tratamento e até falha terapêutica9, 10.
Com o objetivo de avançar na terapêutica do CBNMI, modelos animais são utilizados
para testar e aprimorar hipóteses clínicas, assim como diferentes abordagens experimentais
têm sido utilizadas para estudar o câncer urotelial. Um modelo eficaz para indução do
12
desenvolvimento do CB é a administração intravesical do composto químico N-metil-N-
nitrosourea (MNU) em ratos. O MNU é o único agente cancerígeno conhecido que atua
diretamente no urotélio sem necessidade de ativação metabólica. É um composto genotóxico
que pode atuar como um iniciador ou promotor do câncer e causar persistente metilação do
DNA, desenvolvendo alterações neoplásicas progressivas e tumores progressivamente menos
diferenciados com o tempo11, 12.
A indução com MNU promove lesões que progridem de hiperplasia, atipia celular,
carcinoma in situ e carcinoma papilar até a tumores músculo-invasivos, que acometem
completamente o lúmem da bexiga e obstruem os ureteres, evoluindo para óbito do animal.
Contudo, a administração intravesical fracionada do MNU permite um modelo de câncer mais
controlado em comparação aos modelos de indução utilizando carcinógenos na dieta ou água
dos animais, além de permitir observar os tumores em curto período de tempo de indução12.
Este modelo de indução é utilizado e aprimorado por pesquisadores ao longo dos anos,
demonstra capacidade de reproduzir naturalmente tumores de bexiga que são clinicamente
observados em humanos, os quais apresentam origem exclusiva no urotélio e são
histologicamente equivalentes ao carcinoma papilífero. Apresenta vantagens como baixo
custo financeiro, facilidade de administração em dose quantificável, e reprodutibilidade em
hospedeiro imunocompetente, o que é importante para o estudo do CBNMI e tratamentos que
envolvem imunoterapia, como por exemplo, a BCG11, 12.
1.2 Tratamento convencional do CBNMI: Imunoterapia intravesical com Bacillus Calmette Guérin (BCG)
A vacina BCG é obtida a partir do bacilo atenuado Mycobacteium bovis e foi
desenvolvida em 1921 para imunização da população contra a tuberculose, e, em 1976,
surgiram os primeiros relatos sobre seu uso na bexiga como imunoterapia para CBNMI. A
fácil acessibilidade ao órgão e, consequentemente, a acessibilidade ao tumor, tornou a
instilação de drogas uma via de administração local muito atraente para o tratamento de
carcinomas vesicais. O sucesso da imunoterapia com BCG depende de alguns critérios como
a habilidade do organismo de desenvolver resposta imunológica aos antígenos da
micobactéria, a viabilidade adequada dos bacilos instilados, ao tamanho e contato do tumor
com a BCG e resistência aos efeitos adversos sistêmicos13, 14.
Atualmente, a BCG tem sido a escolha “padrão ouro” para o tratamento de primeira
linha do CBNMI por se mostrar o tratamento mais eficaz na profilaxia para recorrência e
13
progressão de tumores da bexiga após TURB7, 15, 16. A vacina BCG atua como um estimulante
do sistema reticuloendotelial, causando um processo inicial inflamatório local com infiltração
de granulócitos, macrófagos e linfócitos. Como resultado, há um aumento da fagocitose e da
proporção de células T helper (Th) / supressoras17. Em seguida, são produzidas muitas
citocinas, dentre elas interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12), Fator de Necrose
Tumoral α (TNF-α), interferon (IFN), a molécula de adesão intercelular, etc. A resposta
desencadeada por Th1 é o evento predominante, sendo responsável pela ablação tumoral. A
análise da urina de pacientes tratados com BCG mostrou elevadas concentrações destas
citocinas inflamatórias (Th1), como IL-1, -2, -6, -8, 12, TNF, IFNγ e GM-CSF, que junto com
células Th2 são essenciais para a inibição de tumores. Embora o papel de cada uma dessas
citocinas não estar completamente clara no tratamento do CB, as citocinas Th1 tem sido
associadas à resposta do BCG, enquanto que citocinas Th2 estão correlacionadas com a falha
do tratamento14, 15, 18.
A insuficiência terapêutica do tratamento com BCG está associada em até 50% dos
pacientes, além de vários efeitos colaterais ocorrem em até 90% dos casos9, 10, 19. Os efeitos
secundários locais mais frequentes da terapia com BCG incluem disúria, cistite, frequência
urinária e hematúria macroscópica, enquanto os efeitos colaterais sistêmicos incluem mal-
estar e febre, bem como complicações importantes, como sepse em alguns casos9, 10, 19.
1.3 Sistema Imune e Câncer: Via de Sinalização dos Receptores Toll-Like (TLR2 e TLR4)
Os receptores Toll like (TLR) são proteínas transmembranares responsáveis por detectar
e reconhecer padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs), os quais podem ser
moléculas derivadas de microorganismos, como lipopolissacarídeos (LPS), peptideoglicanos,
flagelinas e ácidos nucleicos microbiais, e moléculas endógenas liberadas de células
hospedeiras mortas após estresse celular ou dano tecidual, denominadas padrões moleculares
associados a danos (DAMPs), como estresse oxidativo e proteínas de choque térmico20.
O TLR4 foi um receptor primariamente identificado e relacionado com o
desenvolvimento embrionário em espécie animal, mas também mostrou capacidade de induzir
a expressão de genes envolvidos na resposta inflamatória e que sua mutação é hiperresponsiva
à LPS, sendo, em seguida, identificada uma família completa de receptores com estruturas
similares, composta por 10 membros (TLR1 – TLR10), nos quais cada um possui uma função
de reconhecimento para um componente específico dos patógenos. A porção citoplasmática
14
dos TLRs apresenta alta similaridade com os receptores de IL-1, e juntos são denominados
receptores Toll/IL-1 (TIR). Já os conteúdos extracelulares dessas famílias de receptores são
estruturalmente não relacionados, pois os TLRs apresentam o domínio extracelular com
repetições ricas em leucinas e os IL-1 possuem um domínio extracelular de imunoglobulina21.
Embora os TLRs indivualmente reconheçam ligantes distintos, os mecanismos de
ativação do TLR e transdução de sinal são altamente conservadores. Ligações obrigatórias
ocorrem através de repetições em domínio citoplasmático TIR e desencadeia a transdução de
sinal através da interação intracelular de receptores TIR com moléculas adaptadoras
citosólicas (MyD88, TRIF, TIRAP, TRAM). Essa ativação da via de sinalização dos TLRs é
estimulada após o reconhecimento por DAMP ou PAMP, e é composta por duas vias: uma
dependente de uma molécula adaptadora de diferenciação mielóide Fator 88 (MyD88) (via
canônica) e uma via independente de MyD88 (via não-canônica), sendo que a via canônica é
comum a todos os receptores TLRs (menos TLR3), e a via não canônica é peculiar à via de
sinalização dos TLR3 e TLR4, e, portanto, dependente da molécula adaptadora do domínio
TIR indutora de IFN-β (TRIF). O TLR4 é o único receptor que sinaliza através de MyD88 e
TRIF20, 21, 22.
As vias, canônica e não canônica (Figura 2), ativam múltiplas cascatas de sinalização
pró-inflamatórias, incluindo o Fator nuclear (NF) -kB, c-Jun quinase N-terminal/AP1,
quinases reguladas por sinal extracelular e p38, assim como a via do interferon (IFN).
Podemos dizer que a via canônica está associada tanto à estimulação por PAMP quanto por
DAMP, e seu mecanismo de ativação está no recrutamento de MyD88 e do domínio TIR que
contém proteínas adaptadoras (TIRAP ou MAL) através da interação TIR-TIR para TLR2 ou
TLR4. A molécula de MyD88 interage com a quinase associada ao receptor de IL-1 (IRAK 1
e IRAK4), no qual a fosforilação do IRAK 4 ativa o IRAK 1, recrutando o receptor associado
ao fator de necrose tumoral 6 (TRAF-6) para formar um complexo composto por kinase 1
ativada (TAK1) com sua proteína de ligação TAB. O complexo TAK1/TAB ativa outro
complexo inibidor da kinase NF-KB (IKK), composto por IKKα, IKKβ e IKKγ/NEMO
(modulador essencial de NF-kB), no qual levam a fosforilação do inibidor de NF-kB,
resultando na ubiquitinação e degradação subsequente de IKB. Assim, o NF-kB fica livre e se
transloca para o núcleo, regulando a transcrição de genes e citocinas inflamatórias e
consequente regulação da produção de quimiocinas como IL-11β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17,
TNF-α, IFN-γ, iNOS e ICAM20, 21, 22.
Já a via não canônica pode ser associada à estimulação por DAMP, em que o TLR4
necessita de TRAM para ativação da interação entre TRIF e TRAF3 e TRAF6, e a interação
15
entre TRAF3 e TBK1/IKKi provoca a fosforilação de IRF-3, conduzindo a sua translocação
para o núcleo e promove a produção de IFN20.
Figura 2: Esquema da via de sinalização do sistema imune mediada por TLR2 e TLR4. Modificado de LIU et
al20.
A relação entre o câncer e a inflamação está fortemente estabelecida através de
investigação epidemiológica e estudos em animais. As inflamações crônicas desencadeadas
por infecções, lesões e obesidade são importantes contribuintes para a carcinogênese, sendo
que esta inflamação é controlada por inúmeros mediadores e vias de sinalização e sofre
grande influência de vários sistemas reguladores, como os TLRs22.
A ativação de TLR induzida por PAMP aciona uma cascata de sinalização pró-
inflamatória e antiviral para promover a eliminação do patógeno, ou, ao menos, aliciar a
inflamação crônica. Recentes estudos mostraram que a inflamação induzida por TLR pode
atuar como promotor da carcinogênese em vários órgãos, como cólon, pulmão, estômago e
pâncreas. Além da ativação de TLR induzida por PAMP, a inflamação e lesão também
induzem a liberação de DAMPs, alguns dos quais atuam como ligantes para TLRs. Os sinais
desencadeados por DAMPs podem promover a carcinogênese de uma forma dependente de
TLR. Por outro lado, as respostas inflamatórias podem não só fornecer sinais promotores de
tumor, mas também contribuir para as respostas imunes antitumorais22.
16
Uma importante via de sinalização para promoção de tumor induzida pela sinalização
dos TLRs é a transcrição do fator NF-kB, que atua na regulação da transcrição de mais de 100
genes pró-inflamatórios. Os TLRs podem promover a carcinogênese através de sinais pró-
inflamatórios, anti-apoptóticos, proliferativos e pro-fibrógenos em ambos os microambientes
tumorais ou em suas próprias células tumorais. Estudos em ratos revelaram que um composto
parecido ao MNU, o agente N-etil-N-nitrosourea, causou mutação no gene TRIF e,
consequentemente, comprometeu a resposta imune mediada por TLR3 e TLR421, 22.
Os TLRs exercem duas funções no câncer: a amplitude e duração da ativação do
receptor pode ter um impacto com a ativação crônica de TLR de baixo grau, favorecendo o
estado pró-inflamatório e a ativação aguda terapêutica de TLR, promovendo uma resposta
antitumoral. A expressão do TLR2 e TLR4 no sistema imune pode promover ou suprimir o
crescimento tumoral de um modo dependente do contexto. Pesquisadores observaram um
profundo papel promotor de tumor do TLR2 em câncer gástrico, e no câncer de pulmão com
adicional efeito metastático; já no fígado o TLR2 mostrou não afetar a hepatocarcinogênese
no âmbito de lesão crônica, porém em modelo puramente genotóxico de câncer de fígado,
houve considerável aumento do número de lesões e diminuição da sobrevida. Para o câncer
colorretal, os tumores do tipo TLR2 deficientes apresentam aumento do desenvolvimento em
comparação com o tumor do tipo selvagem22.
Atualmente os TLRs estão presentes na prática clínica como terapia alvo, ou
imunoterapia, para o tratamento do câncer, porém é importante ressaltar que assim como nos
medicamentos quimioterápicos há abordagens essenciais para avaliar a utilização dos
mesmos, como selecionar tumores passíveis de imunoterapia e qual TLR é capaz de promover
uma resposta imune antitumoral de forma mais eficiente, excluindo aqueles tumores ao qual
apresente um papel promotor, e considerar a combinação de terapias com o objetivo de
aumentar a resposta imune a antígenos específicos, tendo como alvo principal as células
dendríticas22. Desse modo, um estudo destes receptores para avaliarmos a resposta do
tratamento proposto neste trabalho é essencial.
1.4 Novas perspectivas terapêuticas para o CBNMI: Plasma Rico em Plaquetas (PRP)
As plaquetas são pequenos corpos anucleados encontradas no sangue periférico,
primariamente conhecidas por atuarem no processo de hemostasia. Todavia, as plaquetas
contêm numerosas proteínas, citocinas e outros fatores bioativos capazes de promover a
cicatrização de feridas e re-epitelização, auxiliar no recrutamento de leucócitos e células
17
progenitoras para locais de lesão vascular e inflamação, na indução de alterações na
permeabilidade celular, quimiotaxia e proliferação celular, passos que são essenciais na
reparação tecidual23, 24, 25.
Estas plaquetas liberam diversos fatores de crescimento (FC), alguns dos quais
estimulam a angiogênese, promovendo crescimento vascular e proliferação de fibroblastos,
que por sua vez proporcionam um aumento na síntese de colágeno23. Os mais potentes FCs
em restaurar lesões teciduais são: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de
crescimento de transformação β (TGF-β), fator de crescimento de insulina 1 (IGF-1), fator de
crescimento de fibroblastos (FGF), e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Tabela
1). Esses fatores de crescimento se ligam diretamente com a superfície das membranas
celulares e ativam a hemostasia e cura através da indução da sinalização celular que estimula
a angiogênese, proliferação celular, diferenciação celular e formação de nova matriz celular
na reparação dos tecidos 26, 27.
O plasma rico em plaquetas (PRP) é um lisado plaquetário concentrado em um pequeno
volume de plasma com a presença destes FCs, que são liberados quando ativados. É um
composto obtido a partir da centrifugação de sangue total, no qual há separação dos glóbulos
vermelhos, brancos e plaquetas, onde as plaquetas possuem maior concentração em pequeno
volume de plasma, em comparação com os valores basais23, 26, 28, 29.
Vários métodos de obtenção de PRP estão disponíveis, porém é necessário cautela.
Cada método conduz a um diferente produto e ação biológica e, consequentemente, seu
potencial terapêutico apresenta diferentes abordagens. No geral, a obtenção do PRP se resume
em: 1- coleta de sangue em tubos contendo anticoagulante; 2- centrifugação: aqui se separa a
amostras em três camadas, plasma e plaquetas concentradas, glóbulos vermelhos e “buffy
coat” (camada com glóbulos brancos) – o método de separação das camadas e esquema de
centrifugação (número, força e tempo) determina a obtenção de um produto puro de plaquetas
(P-PRP) ou com a presença de leucócitos (L-PRP), entretanto, a literatura tem demonstrado
que sempre há uma quantidade de leucócitos presentes; 3- pipetagem das plaquetas33, 34.
Assim, a centrifugação é o momento em que ocorre a ativação mecânica das plaquetas,
liberando os FCs para o plasma, e o descarte desta porção com os FCs pode promover a
diminuição da eficácia do PRP. Durante as preparações de PRP, quantidades consideráveis de
leucócitos podem estar presentes na porção do PRP devido à densidade de subgrupos de
células brancas ser parecida à das plaquetas, o que caracterizará o tipo de PRP obtido35.
18
Tabela 1 - Fatores de Crescimento presentes no PRP e suas funções30, 31 32.
FC FUNÇÃO
PDGF
Estimula a síntese de DNA; ativação de macrófagos; mitogênese de tecido conjuntivo e
células de origem mesenquimal; promove quimiotaxia de fibroblastos, células de
músculo liso, neutrófilos e células mononucleares; promove a liberação de grânulos a
partir de neutrófilos e monócitos; estimula a fagocitose dos neutrófilos; estimula a
atividade e secreção de colagenase.
TGF-β1
e
TGF-β2
Supressão da proliferação celular; melhora a síntese e inibe a decomposição da matriz
extracelular (diminui a síntese da metaloproteináse e do fator ativador do
plasminogênio); imunossupressor e quimiotático; estimula a mitose de fibroblastos e
queratinócitos, a síntese de colageno tipo I, fibronectina e osteonectina; e acelera o
fechamento de lesões.
VEGF
Estimulação da permeabilidade de vasos sanguíneos, mitogênese de células endoteliais
e angiogênese; e estimulação de linfagiogênese.
EGF
Estimulação da quimiotaxia endotelial e de queratinócitos; estimulação de mitogênese
do epitélio mesenquimal, queratinócitos e fibroblastos, acelerando a cicatrização de
lesões e regulação da secreção de colagenase.
bFGF Estimula a mitogênese de células endoteliais, fibroblastos, queratinócitos, condrócitos e
mioblastos; promove quimiotaxia celular e está envolvido na cicatrização de feridas
crônicas.
IGF-1
IGF-2
IGF-3
Estimula a proliferação, diferenciação e biossíntese do colágeno tipo I; e aumenta a
vascularização das lesões; * tem um efeito maior quando combinado com outros fatores
de crescimento.
HGF Estimula a mitogênese e morfogênese; apresenta funções motogênicas, anti-apoptóticas
e neurotróficas, que contribuem de forma importante para a regeneração dos tecidos.
(PDGF) fator de crescimento derivado de plaquetas; (TGF-β) fator de crescimento de transformação; (VEGF) fator de crescimento endotelial vascular; (EGF) fator de crescimento epidermal; (bFGF) fator de crescimento de fibroblasto básico; (IGF) fator de crescimento de insulina; (HGF) fator de crescimento de hepatócito.
O PRP é classificado em quatro tipos de acordo com a utilização ou não de ativadores
químicos de plaquetas (trombina e/ou cálcio): 1- concentração acima da linha basal do sangue
total sem ativação de plaquetas; 2- concentração acima da linha basal do sangue total com
ativação de plaquetas; 3- quantidade mínima ou nenhum glóbulo branco sem ativação de
plaquetas; e 4- quantidade mínima ou nenhum glóbulo branco com ativação de plaquetas36.
19
Essa diferença tem sido uma ferramenta crucial na escolha dentro da prática clínica, de
acordo com o objetivo desejado e tipo de tecido para aplicação. O PRP com ativadores de
plaquetas para promoção de liberação dos grânulos tem sido muito utilizado na cicatrização
de lesões37. No entanto, de acordo com Mishra et al.36, a sua utilização sem ativação química
sugere melhores respostas. Muitos modelos de estudos tanto em animais quanto em humanos
vêm sendo publicados com a utilização de ambas as técnicas para gerar melhor entendimento
da prática clínica com o PRP.
Em 2014, Küçük et al.26 apresentaram uma alternativa ao tratamento cirúrgico em ratos
com lesão do nervo ciático, aplicando injeções de PRP localmente. Os autores mostraram uma
recuperação motora significativamente melhor nos animais tratados com PRP através das
avaliações eletromiográficas e histomorfométricas, concluindo-se efeitos positivos do PRP na
regeneração de nervos.
Hua et al.38 compararam o tratamento convencional para ectopia cervical (laser) e um
tratamento proposto com aplicação de PRP ativado em gel em humanos. Os resultados
mostraram eficácia terapêutica idêntica para ambos os tratamentos, mas o grau de efeitos
adversos do grupo PRP foi significativamente mais leve. O mecanismo exato do PRP na re-
epitelização escamosa da ectopia cervical não está bem claro. Os autores atribuem o efeito aos
FCs presentes no PRP, como o PDGF, TGF-β, IGF-1, FGF, VEGF, e também à presença de
leucócitos restantes da obtenção do PRP, que promove a fagocitose de micro-organismos,
remove tecidos necrosados e inibe a reação inflamatória.
Outro estudo clínico em humanos mostrou a utilização do PRP enriquecido de
leucócitos e sem ativador de plaquetas misturado a bupivacaina e epinefrina no tratamento da
epicondilite lateral do úmero. Em longo prazo, a técnica se mostrou consideravelmente eficaz,
principalmente relacionado à queixa de dor36.
Costanzo et al.37 publicaram um relato de caso de lesão por extravasamento com
quimioterápico, com necrose de 20% após enxerto. Devido às propriedades regenerativas
conhecidas e estimulação de FCs do PRP, os pesquisadores realizaram aplicações de gel de
PRP alogênico sobre a úlcera deste paciente, observando cicatrização total da lesão ao final de
12 aplicações, o que ratificou o estudo realizado em 2014 por Hoeferlin et al.39, no qual já
haviam associado essa capacidade de cicatrização de lesões à hipótese de que componentes
lipídicos do PRP desempenhavam um papel importante neste processo. Seus dados
demonstram que a fracção de lipídio livre de peptídeo do PRP pode ser pró-migratório e pró-
20
mitogênico, e crucial para superar a interrupção do crescimento proliferativo do fluído de
ferida crônica relacionada a fibroblastos da derme humana adulta.
Os estudos da utilização do PRP na área médica têm se mostrado promissores, tendo
em vista a variedade de aplicações clínicas que foram analisadas nos últimos anos, porém
ainda é necessário o desenvolvimento de mais estudos para o melhor entendimento do
mecanismo de ação deste componente biológico.
21
2 JUSTIFICATIVA
O tratamento do NMIBC continua a ser um desafio no campo farmacêutico devido à
recorrência e progressão da doença, bem como os efeitos colaterais pronunciados ainda
associados às modalidades terapêuticas disponíveis. Apesar da terapia intravesical com BCG
ainda ser considerada a melhor opção de tratamento para CBNMI, os gastos anuais com estes
pacientes aproximaram-se de US$ 4 bilhões nos EUA, devido à necessidade de constante
manutenção da terapia, alta vigilância aos efeitos adversos e repetitivos procedimentos
cirúrgicos15, 40, 41.
Com o objetivo de reduzir gastos, de, principalmente, diminuir a incidência de
progressão e recorrência de tumor, melhorar a qualidade de vida do paciente atenuando
reações adversas e apresentar outras opções de tratamento aos pacientes intolerantes à terapia
intravesical com BCG, vários grupos de pesquisadores vêm buscando melhorias na
farmacoterapêutica, em sua maioria, associando outros fármacos ou compostos biológicos ao
BCG.
Em 2000, Bilen et al.42 associaram BCG ao antineoplásico epirrubicina instilados
intravesicalmente a fim de melhorar a eficácia com eventos adversos toleráveis no tratamento
de câncer de bexiga de alto risco; em 2010, Agarwal et al.43 combinaram a terapia com BCG
ao imunomodulador IFN-α2b, como agente potencializador do BCG; Giacoia et al.44
avaliaram um composto análogo IL15 mutado combinado com a fusão de IL15Ra-Fc em
associação ao BCG em modelo animal; Zhang et al.16 realizaram um estudo também em
modelo animal com Polyporus umbellatus FRIES (Zhuling) e seu principal componente
Polyporus Polysaccharide na tentativa de atenuar os efeitos adverso da BCG.
Por fim, o mecanismo de ação do BCG ainda não é definitivamente claro, mas Solsona
et al.45 sugerem que a fibronectina é um componente importante para o entendimento desta
ação, devido à associação da BCG com o urotélio e células tumorais aos bacilos pela via da
proteína fibronectina. Os autores sugeriram que a eficácia da BCG poderia ser aprimorada
aumentando a exposição à fibronectina através de reação inflamatória provocada com
mitomicina C na mucosa da bexiga e, assim, facilitar sua ligação, porém esta técnica
apresentou alto grau de toxicidade, e seria recomendado somente em pacientes com alta
probabilidade de recorrência de doença, sempre avaliando o risco x beneficio do tratamento.
Neste contexto, os compostos que modulam o sistema imunológico, através de
receptores TLRs, poderiam ser uma estratégia valiosa para o tratamento do câncer, seja usado
22
sozinho ou em combinação com terapias existentes46, 47. Assim, como inúmeras tentativas de
associação da BCG com quimioterápicos e imunomoduladores do sistema imune vêm sendo
propostas, e de acordo com as características regenerativas do PRP descritas no item 1.4,
observamos que há grande importância em estudar as possíveis propriedades
imunomoduladoras e antitumorais do PRP isolado e associando à BCG, como uma ferramenta
promissora para o tratamento do CBNMI.
23
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
• Caracterizar e comparar os efeitos imunológicos e histopatológicos do tratamento com
PRP associado à imunoterapia com BCG no câncer não-músculo-invasivo da bexiga-urinária
(CBNMI) induzido quimicamente em ratos, bem como estabelecer possíveis mecanismos de
ação dessas terapias envolvendo as vias de sinalização dos receptores toll-like (TLRs).
3.2 Específicos
• Avaliar por meio de ensaio de redução do 3-(4,5-dimetiltiazol2yl)-2,5-difenil brometo de
tetrazolina (MTT) a atividade citotóxica do BCG, PRP e BCG+PRP em linhagem celular
tumoral de bexiga 5637.
• Caracterizar a histopatologia e a progressão do CBNMI induzido quimicamente em ratos
frente ao tratamento com PRP associado à imunoterapia com BCG;
• Caracterizar e comparar por meio de imunomarcação os efeitos do tratamento com PRP
associado à imunoterapia com BCG sobre os intermediários da via de sinalização dos TLRs
(TLR2, TLR4, MYD88, TRIF, IRF3 e IFNγ) no CBNMI induzido quimicamente em ratos.
24
4 MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório de Carcinogênese Urogenital e
Imunoterapia (LCURGIM), localizado no departamento de Biologia Estrutural e Funcional -
Instituto de Biologia/Universidade Estadual de Campinas. O projeto foi submetido à análise
pelo Comitê de Ética na Utilização de Animais - CEUA/UNICAMP (protocolo número 3901-
1), e submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos –
CEP/UNICAMP (número do CAAE: 51774515.0.0000.5404), sendo que o projeto aprovado
engloba o presente estudo e será apresentado em forma de dissertação pela pós-graduanda.
4.1 Obtenção do Plasma Rico em Plaquetas (PRP)
O sangue periférico de 4 doadores humanos saudáveis voluntários, com idade acima de
18 anos, de ambos os gêneros feminino e masculino, foram coletados para a obtenção do PRP
seguindo a metodologia descrita por Perez et al.34. Certificamos previamente a não utilização
de medicamentos pelo menos nas 72 horas antecedentes da coleta do sangue, ou histórico de
doenças que comprometessem a quantidade de plaquetas no sangue basal. Foi coletado um
total de 10 mL de sangue e transferido em tubos específicos de coleta (Vacuette – REF
454327) contento 0,5mL de anticoagulante citrato de sódio 3,2% numa proporção de 9:1
respectivamente. Imediatamente após a coleta, o sangue foi centrifugado à 100 x g durante 10
minutos e temperatura à 25ºC (Routine 380R, Hettich Zentrifugen, Munique, Alemanha). O
tempo de coleta de sangue, o preparo e administração devem ser menores que 4 horas, e de
preferencia, manter jejum de 6 horas para evitar a presença de lipídios no PRP48.
Após a centrifugação, observou-se a separação do sangue em três camadas: sobrenadante,
intermédia e inferior (Figura 2). O sobrenadante, a qual possui a maior concentração em
plaquetas, foi coletada com micropipeta de 200 μL, transferida para tubo de coleta seco e
mantida em gelo até o momento da administração nos animais. As amostras de sangue total e
PRP obtidas após a centrifugação foram caracterizadas através de contagem de células
sanguíneas das séries branca e vermelha em contador hematológico (ABX Micron ES 60,
Horiba Medical, Montpellier, França).
25
Figura 3 - Processo de obtenção do PRP. (A) Coleta de sangue humano em tubos contendo anticoagulante citrato de sódio 3,2%. (B) Centrifugação e separação em 3 camadas sanguíneas: camada superior composta por plasma, a qual possui a maior concentração de plaquetas e presença de poucos glóbulos brancos; camada intermédia ou “buff coat” composta por glóbulos brancos; camada inferior composta por glóbulos vermelhos e outras células sanguíneas. (C) Pipetagem da camada superior (PRP).
4.2 Avaliação da Viabilidade Celular em linhagem celular tumoral de bexiga na presença de PRP e BCG
Para avaliar a viabilidade celular na presença de tratamentos PRP, BCG e PRP + BCG
foi realizado o método MTT (3- (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-difeniltétrazolina)49. Para sua
execução, uma linhagem celular do carcinoma de bexiga urinária grau II de Homo sapiens
5637 (HBT-9) foi obtida do banco celular do Rio de Janeiro e incubada à 37ºC, com 5% de
CO2 em meio RPMI-1640 modificado para conter 2 L-glutamina mM, HEPES 10 mM,
piruvato de sódio 1 mM, glicose 4500 mg / L e 1500 mg L de bicarbonato de sódio e soro
fetal bovino até uma concentração final de 10%. Em seguida, as células de carcinoma de
bexiga urinária grau II 5637 (HBT-9) foram semeadas em microplacas de 96 poços na
densidade de 1,5 x 104 células por poço.
Posteriormente, os tratamentos PRP, BCG e PRP + BCG foram adicionados aos poços a
uma concentração de 5% (50 μl por tratamento). Em seguida, as microplacas foram incubadas
à 37°C durante 24h, a fim de determinar a viabilidade celular em função da dose e dos efeitos
dependentes do tempo dos tratamentos PRP, BCG e PRP + BCG. Após a exposição dos
diferentes tratamentos às células, os poços foram lavados com solução salina tamponada com
fosfato a pH 7,4 (PBS) e uma solução de MTT 0,5 mg / mL (Sigma-Aldrich, EUA) diluída em
meio RPMI isento de soro foi adicionada. Assim, as células foram incubadas por mais 2h à 37
°C. Finalmente, o meio de cultura foi removido da placa e foram adicionados 100 μl de
sulfóxido de dimetilo (DMSO) para a dissolução dos cristais de formazan. As placas foram
agitadas durante 10 min e a absorbância medida no leitor de microplacas (Cytation 5, BioTek
26
Instruments, Inc., EUA) em λ = 570 nm. Os valores foram expressos como porcentagens de
redução de MTT em relação ao controle.
4.3 Animais e Procedimento Experimental para CBNMI
No presente estudo foram utilizadas 30 ratas da variedade Fischer 344, na faixa etária de
7 semanas, pesando em média 180 gramas, obtidas no Centro de Bioterismo da Universidade
Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP). Para a indução do CBNMI, 20 animais foram
anestesiados com Cloridrato de Xilazina 2% (5mg/kg i.m.; König, São Paulo, Brasil) e
Cloridrato de cetamina 10% (60mg/kg, i.m.; Fort Dodge, Iowa, EUA), mantidos nesse estado
por 45 minutos para evitar micção espontânea e instilada uma dose de 1,5 mg/kg de N-metil-
N-nitrosouréia (MNU - Sigma, St. Louis, MO, EUA) dissolvida em 0,3 mL de citrato de sódio
(1M pH 6,0) a cada 15 dias (semana 0, 2, 4), totalizando 3 doses (modificado de GARCIA et
al.50). Os outros 10 animais que não receberam MNU foram considerados como Grupos
Controles. Duas semanas após a última dose de MNU, os animais foram submetidos ao
exame de ultrassonografia para avaliar a ocorrência de tumor. Os ultrassons foram avaliados
utilizando um sistema portátil de ultrassonografia controlado por software com um transdutor
linear de 10-5 MHz de 38 mm. Após a indução do CBNMI com MNU, os animais foram
divididos em 6 grupos (5 animais por grupo):
a) Grupo Controle (Grupo 1): recebeu uma dose intravesical de 0,2 mL de solução
fisiológica 0,9% por 4 semanas consecutivas;
b) Grupo Controle + PRP (Grupo 2): recebeu uma dose intravesical de 0,2 mL de
PRP (correspondente à 328x103 - 549x103 plaquetas/mm3) por 4 semanas consecutivas
(protocolo estabelecido por nosso grupo de pesquisa aliado aos experimentos in vivo
com PRP descritos na literatura: COSTANZO et al.37; HUA et al.38).
c) Grupo MNU (Câncer, Grupo 3): recebeu o mesmo tratamento que o Grupo 1;
d) Grupo MNU + BCG (Grupo 4): recebeu uma dose intravesical de 106 UFC (40
mg) de BCG por 6 semanas consecutivas50;
e) Grupo MNU + PRP (Grupo 5): recebeu o mesmo tratamento que o Grupo 2;
f) Grupo MNU + PRP + BCG (Grupo 6): recebeu uma dose intravesical de 0,2 mL
de PRP (correspondente à 316 – 515 x 103 plaquetas/ mm3) por 4 semanas consecutivas.
Após o tratamento com PRP, os animais receberam uma dose intravesical de 106 UFC
(40 mg) de BCG por 6 semanas consecutivas, totalizando 10 semanas de tratamento.
27
As doses intravesicais nos diferentes grupos experimentais foram instiladas via cateter
flexível 20 gauge (Abocath, São Paulo, Brasil). Os animais de todos os grupos experimentais
receberam água e a mesma dieta sólida ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Após os
períodos de tratamento, os animais foram eutanasiados e as bexigas urinárias coletadas e
submetidas às análises histopatológicas e imunohistoquímicas. O protocolo experimental
seguiu os princípios éticos em pesquisa animal (CEUA, protocolo número 3901-1).
4.4 Análises Histopatológicas
Para as análises histopatológicas, amostras da bexiga urinária de todos os animais de
cada grupo experimental (n=5 por grupo) foram coletadas e fixadas em Bouin por doze horas.
Após a fixação, os tecidos foram lavados em álcool etílico a 70%, com posterior desidratação
em uma série crescente de álcoois. Posteriormente, os fragmentos foram diafanizados com
xilol por 2 horas e inclusos em polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EUA).
Em seguida, os materiais foram seccionados no micrótomo Slee CUT5062 RM 2165 (Slee
Mainz, Mainz, Alemanha) com espessura de 5 micrômetros, corados com Hematoxilina-
Eosina e fotografados no fotomicroscópio DM2500 (Leica, Munique, Alemanha).
O diagnóstico das lesões uroteliais foram classificadas conforme o estadiamento
proposto pelo consenso da Organização Mundial da Saúde/Sociedade Internacional de
Patologia Urológica51.
4.5 Imunomarcação dos Antígenos TLRs (TLR2, TLR4, MyD88, TRIF, IRF-3 e IFN-γ)
Amostras da bexiga urinária de todos os animais de cada grupo experimental (n=5
animais por grupo), as mesmas utilizadas para as análises histopatológicas, foram utilizadas
para as imunomarcações. Foram seccionadas com 5 µm de espessura no micrótomo rotativo
Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemanha) e coletados em lâminas silanizadas.
A recuperação antigênica foi realizada por incubação dos cortes em tampão citrato (pH 6.0) a
100ºC em micro-ondas. O bloqueio da peroxidase endógena foi obtido com H2O2 (0,3% em
metanol) com posterior incubação em solução bloqueadora com albumina soro bovino (BSA)
3% por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, os antígenos TLR2, TLR4, MyD88,
TRIF e IFN-γ foram localizados através dos anticorpos primários específicos (Tabela 2),
diluídos em BSA 1% e armazenados overnight a 4 ºC. O kit AdvanceTM HRP (Dako
Cytomation Inc., EUA) foi usado para detecção dos antígenos de acordo com as instruções do
28
fabricante. Após lavagem com tampão TBS-T, os cortes foram incubados com anticorpo
secundário HRP conjugado proveniente do kit AdvanceTM
HRP por 40 minutos e,
posteriormente revelados com diaminobenzidina (DAB), contra-corados com Hematoxilina de
Harris e avaliados no fotomicroscópio DM2500 (Leica, Munique, Alemanha).
Para avaliar a intensidade das imunorreatividades dos antígenos, a porcentagem de
células uroteliais positivas da bexiga urinária foi examinada em dez campos para cada
anticorpo com aumento de 400x utilizando o software Image J (https://imagej.nih.gov/ij/). A
intensidade da marcação foi graduada em uma escala de 0-3, e expressa como 0 (ausência de
imunorreatividade), 0% de células uroteliais positivas; 1 (fraca imunorreatividade), 1-35% de
células uroteliais positivas; 2 (moderada imunorreatividade), 36-70% de células uroteliais
positivas; 3 (intensa imunorreatividade), >70% de células uroteliais positivas52.
Tabela 2 - Características dos Anticorpos Primários para Imunomarcação
Anticorpos Primários Espécie hospedeira Código Fonte
TLR2 Coelho (Policlonal) SC10739 Santa Cruz, EUA
TLR4 Camundongo (monoclonal) SC293072 Santa Cruz, EUA
MyD88 Coelho (Policlonal) SC11356 Santa Cruz, EUA
TRIF Coelho (Policlonal) SC67061 Santa Cruz, EUA
IRF-3 Coelho (Policlonal) BS-9278R Bioss, EUA
IFN-γ Camundongo (monoclonal) 507802 Biolegend, EUA
4.6 Análises Estatísticas
Os parâmetros quantificados (análises histopatológicas e imunohistoquímicas) foram
analisados estatisticamente para os diferentes grupos experimentais. Para tais análises foram
empregados o teste de proporção e o erro tipo-I de 1% foi considerado estatisticamente
significante.
A análise de citotoxicidade in vitro foi comparada entre os grupos por análise de
variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, com o nível de significância
estabelecido em 5% (p <0,05).
29
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção do PRP e recuperação de plaquetas viáveis foi satisfatória e mostrou citotoxicidade celular “in vitro”
A obtenção de PRP concentrou significativamente um grande número de plaquetas,
sendo de 2 a 3 vezes maior no PRP que o valor do sangue total (Figura 4, gráfico 1), com
média de valores concentrados de plaquetas entre 328x103/mm3 e 549x103/mm3. As plaquetas
obtidas foram viáveis e citotóxicas para as células tumorais quando comparadas ao BCG no
ensaio “in vitro” (Figura 4, gráfico 2).
A figura 4, gráfico 2 representa os valores medianos ± S.D. de três experimentos
independentes com n =4 (doadores de PRP). O PRP obtido foi viável e citotóxico para células
de carcinoma da bexiga 5637. A análise estatística mostrou que o tratamento com PRP
sozinho ou associado ao BCG, com uma concentração de 5%, demonstrou citotoxicidade
importante nas células do carcinoma da bexiga 5637, com aproximadamente 35% e 32%,
respectivamente, de inibição da proliferação celular quando comparada ao tratamento com
BCG sozinho (100% de proliferação celular) (Figura 4, gráfico 2). Além disso, o tratamento
BCG não foi citotóxico para células tumorais 5637 (Figura 4, gráfico 2).
30
Doador hum
ano 1
Doador hum
ano 2
Doador hum
ano 3
Doador hum
ano 4
Pla
qu
eta
s (1
03/m
m3)
Con
trol
e
PRP 5
%
BC
G 5
%
PRP +
BC
G 5
%
Via
bil
idad
e C
elula
r (%
)
Figura 4: gráfico 1 – Contagem de plaquetas/mm3 em sangue total e no PRP; gráfico 2 – teste de viabilidade celular tumoral na presença de PRP, BCG e PRP+BCG. (CTL) células tumorais de bexiga não tratadas. (PRP5%) células tumorais de bexiga tratadas com 50µl de PRP. (BCG 5%) células tumorais de bexiga tratadas 50µl de BCG (PRP+BCG5%) células tumorais de bexiga tratadas com a associação de 50µl de PRP + 50µl de BCG. Foram considerados p< 0,05 para diferença significativa (PRP vs PRP+BCG) ANOVA, seguida pelo pós-teste Tukey. 5.2 Tratamento com PRP Associado à Imunoterapia com BCG Reverteu as Alterações Histológicas Induzidas por MNU
Os tratos urinários dos animais dos grupos Controle e Controle + PRP não apresentaram
alterações microscópicas (Figuras 5a, 5b, 5c, 5d; Tabela 4). O urotélio normal foi composto
por 2 - 3 camadas, sendo: uma camada de células basais, uma camada celular intermediária, e
uma camada superficial ou apical composta por células em guarda-chuva (Figuras 5a, 5b, 5c,
31
5d). Contudo, observou-se moderada infiltração de células inflamatórias no urotélio e lâmina
própria dos animais do grupo Controle + PRP (Figuras 5c, 5d).
Em contraste, o trato urinário do grupo MNU (Câncer) apresentou drásticas alterações
histopatológicas, tais como: carcinoma urotelial com invasão da lâmina própria (pT1)
(Figuras 5e, 5f), carcinoma urotelial papilífero (pTa) (Figura 5g) e carcinoma in situ (pTis)
(Figura 5h) em 20%, 40% e 40% dos animais, respectivamente (Tabela 4). O carcinoma pT1
(Figuras 5e, 5f, 5f) foi caracterizado por células neoplásicas agrupadas em pequenos grupos
ou cordões invadindo a lâmina própria, numerosas figuras de mitose e células pleomórficas
com núcleos aumentados. O carcinoma urotelial papilífero (pTa) foi caracterizado por
extensas lesões papilíferas, células uroteliais com arranjo desordenado e com perda da
polaridade, intenso pleomorfismo celular e numerosas figuras de mitose (Figuras 5g, 6b). O
carcinoma pTis (Figuras 5h, 6a) foi caracterizado por uma desordenada proliferação das
células uroteliais (hiperplasia) em um urotélio plano, com acentuadas atipias celulares
caracterizadas por núcleos volumosos, redução do citoplasma e nucléolos múltiplos e
proeminentes.
As lesões neoplásicas mais frequentes no Grupo MNU + BCG foram pTis (Figura 6a) e
pTa (Figura 6b) em 60% e 20% dos animais, respectivamente (Tabela 4). Os outros 20% dos
animais apresentaram hiperplasia plana (Tabela 4), indicando que essa imunoterapia
promoveu 40% de inibição da progressão tumoral. A hiperplasia plana foi caracterizada por
espessamento do urotélio e ausência de atipias citológicas.
As análises histopatológicas dos animais do Grupo MNU + PRP apresentaram 40% de
inibição da progressão tumoral, sendo que 20% desses apresentaram neoplasia intraurotelial
de baixo grau (Figura 6d) e 20% morfologia vesical normal (Tabela 4). As lesões
neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram o pTa (Figura 6c) em 60% dos animais
(Tabela 4).
O tratamento com PRP associado à imunoterapia com BCG apresentou 60% de inibição
da progressão tumoral, sendo que a hiperplasia plana foi a alteração morfológica mais
frequente (Figura 6e; Tabela 4). As lesões neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram o
pT1 (Figura 6f) e o pTa em 20% dos animais (Tabela 4).
32
Tabela 4 - Porcentagem de alterações histopatológicas na bexiga urinária de ratos dos diferentes grupos experimentais
Grupos
Histopatologia Controle
(n=5)
Controle + PRP (n=5)
MNU
(n=5)
MNU + BCG (n=5)
MNU + PRP (n=5)
MNU + PRP + BCG (n=5)
Normal 5 (100%)* 5 (100%)* - - 1 (20%) -
Hiperplasia Plana -
-
-
1 (20%)
-
3 (60%)*
Neoplasia
Intraurotelial de baixo grau
-
-
-
-
1 (20%)*
-
Neoplasia
Intraurotelial de alto grau – Carcinoma in
situ (pTis)
-
-
2 (40%)
3 (60%)*
-
-
Carcinoma Urotelial
Papilífero (pTa)
-
-
2 (40%)
1 (20%)
3 (60%)*
1 (20%)
Carcinoma Urotelial
com Invasão da Lâmina Própria
(pT1)
-
-
1 (20%)*
-
-
1 (20%)*
Lesões Benignas: Hiperplasia Plana; Lesões Pré-Malignas: Neoplasia Intraurotelial de baixo grau; Lesões Malignas: pTis, pTa, pT1. *Significância estatística (teste de proporção, P<0.0001).
33
Figura 5a – 5h - Fotomicrografias das bexigas urinárias dos grupos Controle (a, b), Controle + PRP (c, d) e MNU (e, f, g, h). (a), (b), (c), (d) Urotélio normal composto por 2-3 camadas: uma camada de células basais (cabeça de seta fechada), uma camada intermediária de células (seta), e uma camada superficial ou apical composta por células em guarda-chuva (cabeça de seta aberta). (c), (d) Infiltração moderada de células inflamatórias (asteriscos) no urotélio e lâmina própria. (e), (f) Carcinoma urotelial com invasão da lâmina própria (pT1): células neoplásicas dispostas em pequenos grupos (setas) invadindo a lâmina própria. (g) Carcinoma urotelial papilífero (pTa) caracterizado por extensas lesões papilíferas, células uroteliais com arranjo
34
desordenado e com perda da polaridade, intenso pleomorfismo celular e numerosas figuras de mitose. (h) Carcinoma in situ (pTis), caracterizado por atipia celular: núcleos volumosos com citoplasma reduzido e nucléolos proeminentes (setas). a – h: Lp – lâmina própria, M – camada muscular, Ur – urotélio.
Figuras 6a – 6f - Fotomicrografias das bexigas urinárias dos grupos MNU + BCG (a, b), MNU + PRP (c, d) e MNU + BCG + PRP (e, f). (a) Carcinoma in situ (pTis), caracterizado por atipia celular: núcleos volumosos com citoplasma reduzido e nucléolos proeminentes. (b), (c) Carcinoma urotelial papilífero (pTa) caracterizado por extensas lesões papilíferas, células uroteliais com arranjo desordenado e com perda da polaridade, intenso pleomorfismo celular e numerosas figuras de mitose. (d) Neoplasia intraurotelial de baixo grau (círculo) caracterizada por espessamento do urotélio e presença de poucas células uroteliais atípicas, sem perda da polaridade. (e) A hiperplasia plana (círculo) caracterizada por espessamento do urotélio e ausência de atipias citológicas. (f) Carcinoma urotelial com invasão da lâmina própria (pT1): células neoplásicas dispostas em pequenos grupos (setas) invadindo a lâmina própria. a – f: Lp – lâmina própria, M – camada muscular, Ur – urotélio.
35
5.3 Tratamento com PRP Associado à Imunoterapia com BCG Estimulou o Sistema Imune Inato e Induziu o Aumento de Interferon
As imunomarcações para TLR2 e TLR4 foram significativamente intensas nos grupos
Controle (Figuras 7a, 7d) e MNU+PRP+BCG (Figuras 8c, 8f) em relação aos demais grupos
experimentais (Tabela 5). Ainda, as imunorreatividades para esses antígenos foram
moderadas nos grupos Controle+PRP (Figuras 7b, 7e), MNU+BCG (Figuras 8a, 8d) e
MNU+PRP (Figuras 8b, 8e) e fraca no grupo MNU (Figuras 7c, 7f) (Tabela 5).
As imunorreatividades para MyD88 foram significativamente intensas nos grupos
Controle (Figura 7g), MNU+BCG (Figura 8g) e MNU+PRP+BCG (Figura 8i) em relação
aos grupos Controle+PRP (Figura 7h) e MNU+PRP (Figura 8h), os quais apresentaram
moderadas imunorreatividades (Tabela 5). Fraca imunorreatividade para MyD88 foi
observada no grupo MNU (Figura 7i; Tabela 5).
Similarmente, as imunorreatividades para TRIF e IRF-3 foram significativamente
maiores no grupo Controle, respectivamente, (Figura 7j, 7m ) e MNU+PRP+BCG (Figura
8l, 8o) em relação aos demais grupos experimentais (Tabela 5). E as imunorreatividades para
esses antígenos foram moderadas nos grupos Controle+PRP (Figura 7k, 7n), MNU+BCG
(Figura 8j, 8m) e MNU+PRP (Figura 8k, 8n) e fraca no grupo MNU (Figura 7l, 7o)
(Tabela 5).
O tratamento com PRP associado à imunoterapia com BCG desencadeou intensas
imunorreatividades para IFN-γ (Figura 8r) em relação aos grupos Controle (Figura 7p),
Controle+PRP (Figura 7q), MNU+BCG (Figura 8p) e MNU+PRP (Figura 8q), os quais
apresentaram moderadas imunorreatividades (Tabela 5). Fraca imunorreatividade para IFN-γ
foi observada no grupo MNU (Figura 7r; Tabela 5).
36
Tabela 5 - Intensidade da imunomarcação para os antígenos TLR2, TLR4, MyD88, TRIF, IRF-3 e INF-γ na bexiga urinária dos seis grupos experimentais.
Grupos
Antígenos
Controle (n=5)
Controle+PRP (n=5)
MNU (n=5)
MNU+BCG (n=5)
MNU+PRP (n=5)
MNU+PRP +BCG (n=5)
TLR2 3 (96,3%)* 2 (60,6%) 1 (18,3%) 2 (61,3%) 2 (58,9%) 3 (87,1%)*
TLR4
3 (95,0%)*
2 (62,4%)
1 (20,9%)
2 (60,5%)
2 (60,2%)
3 (90,3%)*
MyD88
3 (91,7%)*
2 (51,5%)
1 (20,1%)
3 (74,2%)*
2 (51,0%)
3 (92,4%)*
TRIF
3 (90,8%)*
2 (48,9%)
1 (21,8%)
2 (63,2%)
2 (42,1%)
3 (88,1%)*
IRF3
3(86.1%)*
2(46.2%)
1(13.0%)
2(45.9%)
2(48.7%)
3(89.8%)*
IFN-γ
2 (57,1%)
2 (40,2%)
1 (15,4%)
2 (59,1%)
2 (40,5%)
3 (79,3%)*
0, ausência de reatividade; 1, fraca imunorreatividade (1% – 35% células uroteliais positivas); 2, moderada imunoreatividade (36% – 70% células uroteliais positivas); 3, intensa imunoreatividade (> 70% células uroteliais positivas). *Significância estatística (teste de proporção, P<0.0001)
37
Figuras 7a – 7r - Imunomarcação da bexiga urinária de animais dos grupos Controle (a, d, g, j, m, p), Controle + PRP (b, e, h, k, n, q) e MNU (c, f, i, l, o, r). (a), (b), (c) Imunomarcação para TLR2 (asteriscos) no urotélio. (d), (e), (f) Imunomarcação para TLR4 (asteriscos) no urotélio. (g), (h), (i) Imunomarcação para MyD88 (asteriscos) no urotélio. (j), (k), (l) Imunomarcação para TRIF (asteriscos) no urotélio. (m), (n), (o) Imunomarcação para IRF-3 (asteriscos) no urotélio. (p), (q), (r) Imunomarcação para IFN-γ (asteriscos) no urotélio a – r: Lp – lâmina própria, Ur – urotélio.
38
Figuras 8a – 8r - Imunomarcação da bexiga urinária de animais dos grupos MNU + BCG (a, d, g, j, m, p), MNU + PRP (b, e, h, k, n, q) e MNU + PRP + BCG (c, f, i, l, o, r). (a), (b), (c) Imunomarcação para TLR2 (asteriscos) no urotélio. (d), (e), (f) Imunomarcação para TLR4 (asteriscos) no urotélio. (g), (h), (i) Imunomarcação para MyD88 (asteriscos) no urotélio. (j), (k), (l) Imunomarcação para TRIF (asteriscos) no urotélio. (m), (n), (o) Imunomarcação para IRF-3 (asteriscos) no urotélio. (p), (q), (r) Imunomarcação para IFN-γ (asteriscos) no urotélio. a – r: Lp – lâmina própria, Ur – urotélio.
39
6 DISCUSSÃO
As plaquetas possuem outras funções biológicas importantes adicionais à homeostase,
como: quimiotaxia, angiogenese, proliferação e diferenciação celular25, 53, contribuição na
resposta imune inata e preservação vascular 54. As plaquetas contém em sua estrutura alfa-
grânulos que são responsáveis pela liberação de diversos FC’s e citocinas quando ativadas,
incluindo o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de
transformação (TGF-β); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); fator de
crescimento epidermal (EGF); fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF); fator de
crescimento de insulina (IGF) e fator de crescimento de hepatócito (HGF); são importantes
contribuintes na regeneração tecidual e inflamação30, 31, 32, 53.
Os efeitos desses FC’s têm sido amplamente estudados em regeneração de nervos e
células nervosas26, tendões24, 55, 56 e ligamentos24, endometriose57, lesões ulcerativas tópicas53,
tendinopatia crônica, cirurgias ortopédicas e reparação de cartilagens articulares24. Neste
trabalho apresentamos a aplicação clínica do PRP para outra especialidade médica (oncologia)
e nossos resultados demosntraram que além das propriedades de regeneração tecidual, o PRP
pode também inibinir o crescimento tumoral, conforme mostrado no ensaio de MTT (figura
4, gráfico 2), ao qual podemos sugerir uma nova atribuição à função das plaquetas de
citotoxicidade em microambiente tumoral e modulador de sistema imune.
Para este estudo, optamos por utilizar um PRP heterólogo, a partir de sangue humano,
devido ao volume de PRP humano extraído ser de 4 a 5 vezes maior do que originário dos
próprios ratos. Kim et al.56 relataram uma série de estudos com PRP humano aplicado em
modelos animais e mostraram que não há uma resposta imunogênica nos animais devido ao
uso do PRP heterólogo. A aplicação única de PRP foi ineficaz para uma mudança estrutural
de tecidos dos órgãos quando se trata de inflamação48, portanto, como no câncer observamos
intensa inflamação aguda, optamos por 4 instilações vesicais do PRP para garantir tempo
hábil de modulação da bexiga urinária.
O método proposto por Perez et al.34 e realizado neste estudo foi reprodutível, sendo
possível obter um plasma rico em plaquetas e pobre em leucócitos, com valores médios de
concentrado de plaquetas entre 328x103/mm3 e 549x103/mm3. Esses valores se mostraram
similares ao estudo de Semeraro et al.58, e sua variação se deve à variabilidade dos doares,
como idade, peso, sexo, período hormonal e contagem basal de plaquetas do sangue total,
influenciando diretamente no valor de plaquetas presentes no PRP (figura 4, gráfico 1).
40
As plaquetas desempenham um papel ativo na imunidade inata e adaptativa através de
interações adesivas com leucócitos e células endoteliais através da P-selectina, o que pode
levar a eventos pró-inflamatórios, incluindo ativação de leucócitos, produção de cascata de
citocinas e recrutamento de leucócitos para locais de lesão tecidual, além de poderem
expressar TRL2, TLR4 e TLR9 em ambas as plaquetas murinas e humanas. A expressão
plaquetária de TLR4 medeia a trombocitopenia induzida por LPS e a produção de TNF-α por
leucócitos, indicando que esses eventos poderiam ser responsáveis pela ativação do sistema
imune inato. Na doença aterosclerótica, a adesão de plaquetas ativadas ao endotélio libera
moléculas pró-inflamatórias e citocinas, como IL-1β e CD40L, citocinas CCL5/RANTES e o
fator plaquetário 4, que são depositados no endotélio vascular por um processo dependente de
P-selectina, com o consequente recrutamento de monócitos para o local da lesão59.
Além disso, Jiang et al.60 demonstraram que a associação de BCG com uma proteína de
ligação à maltose de Escherichia coli (MBP) estimulou TLR2 e TLR4 através da ativação de
moléculas MHC classe II em células dendríticas, promovendo a ativação de células Th1. A
associação de MBP e BCG exerceu um efeito sinérgico, favorecendo a produção de linfócitos
em relação aos tratamentos de MBP e BCG isolados. De forma semelhante, nossos resultados
demonstraram que o tratamento com PRP associado ao BCG levou a um efeito aditivo,
promovendo a inibição da progressão tumoral em experimentos tanto “in vitro” quanto “in
vivo”. O tratamento com PRP sozinho ou associado ao BCG desencadeou citotoxicidade
significativa nas células do carcinoma da bexiga 5673 quando comparado ao tratamento BCG
sozinho, o qual não foi citotóxico para estas células (figura 4, gráfico 2).
Os presentes resultados da histopatologia do grupo MNU mostram a eficiência e
reprodutibilidade do modelo de indução química de CBNMI com MNU proposto por Garcia
et al.50, apresentando lesões indiferenciadas com tumores característicos ao carcinoma de
bexiga não-musculo invasivo em 100% dos animais, como lesões malignas pTis, pTa e pT1.
Nossos dados do grupo MNU+BCG também apresentaram resultados semelhantes ao estudo
de Fávaro et al.12 e dois trabalhos de Garcia et al.
50,52, mostrando maior porcentagem de lesões
não revertidas após o tratamento com BCG e uma pequena minoria de inibição tumoral, em
contrapartida com resultados significativamente satisfatórios com o tratamento proposto em
seus estudos.
A imunoterapia intravesical BCG mostrou diminuição da progressão das lesões
neoplásicas uroteliais e recuperação histopatológica em 20% de animais NMIBC induzidos
quimicamente. No entanto, o tratamento com PRP foi mais eficaz que BCG, com redução da
41
progressão das lesões neoplásicas uroteliais em 40% dos animais. Os animais tratados com
PRP associados ao BCG mostraram claramente melhor recuperação histopatológica do estado
de câncer e diminuição da progressão das lesões neoplásicas uroteliais em 60% dos animais
quando comparados aos grupos que receberam as mesmas terapias administradas
isoladamente.
Podemos sugerir, ainda, que as células inflamatórias observadas na histopatologia do
grupo Controle+PRP são resultantes da ação dos FC’s e consequente atividade quimiotática
das plaquetas proveniente da instilação intravesical do lisado plaquetário. Estas mesmas
células inflamatórias também presentes no grupo MNU+PRP, adicionado ao efeito citotóxico
do PRP, contribuem para a inibição de progressão do tumor mostrado na figura 5d.
A bexiga urinária é um órgão com constante presença de patógenos e substâncias
nocivas ao organismo, pois faz parte de uma via de excreção de toxinas do organismo
(sistema urinário). Portanto, o sistema imune neste órgão está sempre superexpressado,
normalmente com expressão forte para TLR4 e TLR9 e moderada para TLR2, TLR3 e TLR7.
Estudos emergentes em camundongos e humanos mostraram o envolvimento de TLR4,
expressa nas células uroteliais, na resposta imune inata e adaptativa secundária a
uropatógenos61. O perfil das imunomarcações dos antígenos TLR2, TLR4, MyD88, TRIF,
IRF-3 e IFN-γ neste trabalho demonstraram esta propriedade modulatória do PRP sobre o
sistema imune. As intensas imunorreatividades para os antígenos TLR2, TLR4, MyD88, IRF-
3 e TRIF evidenciam animais saudáveis e com seu sistema imune intacto. Ao instilarmos o
PRP, observamos no grupo Controle+PRP uma modulação da bexiga urinária para os
antígenos TRL2, TLR4, MyD88, IRF-3 e TRIF com uma imunorreatividade moderada, porém
neste grupo o PRP não influenciou a expressão de IFN-γ. Estudos mais aprofundados são
necessários para entendermos melhor essa modulação do sistema imune dos animais
saudáveis.
O indivíduo com câncer apresenta seu sistema imunológico comprometido e a
expressão dos TLRs no CBNMI é fraca, porém não completamente perdida, em comparação
ao urotélio normal, sendo que os CBNMI apresentam esta diminuição da expressão de TLR5,
61, o qual é demonstrado neste trabalho pelo grupo MNU (imunorreatividade fraca para todos
os antígenos estudados - tabela 5). Já nos tratamentos individuais com BCG e PRP,
observamos uma recuperação moderada da expressão dos antígenos, o que significa
estimulação do sistema imune, semelhante para ambos os tratamentos. Apenas o antígeno
MyD88 teve sua expressão máxima no grupo MNU+BCG, justificado pelo já estudado
42
mecanismo de ação do BCG estimular a produção de citocinas inflamatórias provenientes da
cascata de ativação dependente de MyD88.
Quando associados os compostos PRP e BCG no tratamento, as expressões de todos os
antígenos atingem máxima imunomarcação (forte), o que significa total recuperação do
sistema imune para este grupo. Destaca-se, aqui, principalmente, a expressão de IFN-γ, pois
houve modificação da expressão deste antígeno que permanecia inalterado para os outros
tratamentos. A expressão de IFN é resultante da estimulação da via independente de MyD88,
ou via não canônica, permitindo concluir que a associação de BCG e PRP ativou tanto a via
canônica como a não canônica dos TLRs.
Em uma série de experiências realizadas pelo nosso grupo de pesquisadores usando o
mesmo modelo animal para estudar o NMIBC, o BCG aumentou os níveis de proteína TLR2
e TLR4, resultando na ativação de MyD88 e NF-κB, e consequentemente aumento das
citocinas inflamatórias (TNF-α)12, 50, 52. Rivadeneyra et al.62 demonstraram que as plaquetas
expressavam TLRs e desencadearam respostas imunes pela ativação de NF-kB. A via de
sinalização TLR4 induz a produção de IFN-γ que tem efeitos antitumorais por indução de
ligante indutor de apoptose (TRAIL) relacionado ao TNF, um potente indutor de morte
celular tumoral63. Shankaran et al.64 mostraram que o efeito supressor de tumor do sistema
imune depende das ações do IFN-γ, que modificam a imunogenicidade das células tumorais.
O IFN-γ estimula diferentes vias bioquímicas antiproliferativas e antitumorais em macrófagos
e células tumorais, bem como reduz o crescimento e metástase de tumores sólidos. O IFN-γ
produzido pelas células T infiltrantes no microambiente tumoral pode ativar tanto as células T
tumorais como também gerar óxido nítrico sintetase induzível (iNOS)65, 66,67 68, 69.
O óxido nítrico (NO) é considerado um dos principais fatores responsáveis pela
atividade citotóxica dos macrófagos contra as células tumorais. Dados anteriores que mostram
concentrações aumentadas de NO na bexiga urinária de pacientes tratados com BCG, sugerem
que o NO é um fator crítico no efeito antitumoral mediado por BCG. O NO pode estimular o
crescimento celular e a diferenciação celular quando presente em baixas concentrações,
enquanto altas concentrações frequentemente resultam em efeitos citotóxicos52, 70.
Dessa forma, podemos concluir que o grupo MNU+PRP+BCG ativou ambas as vias de
sinalização dos TLR2 e TLR4, apresentando resultados mais eficazes na indução de morte
celular imunogênica em relação à estimulação das vias individuais de TLR2 e TLR4 (BCG e
PRP isolados).
43
7 CONCLUSÕES FINAIS
Perante os resultados e discussão apresentados no momento, e nas condições
experimentais estudadas e descritas, os dados obtidos neste trabalho sugerem que PRP
apresenta propriedades de inibição de proliferação celular cultivada “in vitro”, causando
citotoxicidade em células de carcinoma de bexiga urinária grau II.
Sugerimos ainda que os fatores de crescimento presentes no PRP desempenharam um
papel importante na modulação das vias de sinalização de TLR 2 e TLR4, resultando em
ativação distinta do sistema imunológico. A ativação da via de sinalização de interferon pelo
tratamento de PRP associado à imunoterapia com BCG foi eficaz na supressão do surgimento
de lesões neoplásicas uroteliais, conforme mostrado nos resultados da hispatologia e
imunomarcação das proteínas TLR2, TLR4, MYD88, TRIF, IRF3 e IFNγ.
Em conjunto, estes dados ainda sugerem que a ativação da via de sinalização do
interferon pelo tratamento com PRP em combinação com a imunoterapia com BCG podem
fornecer novas abordagens terapêuticas importantes para o câncer de bexiga não-músculo
invasivo.
44
8 REFERÊNCIAS
1. AMERICAN CANCER SOCIETY. Disponível em:
<https://www.cancer.org/content/dam/cancer-org/research/cancer-facts-and-statistics/annual-
cancer-facts-and-figures/2017/cancer-facts-and-figures-2017.pdf>. Acesso em 28/03/17, às
20:30h.
2. INCA. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. Disponível em:
<http://www.inca.gov.br/wcm/dncc/2015/por-tipos.asp>. Acesso em 28/03/17, às 23:15h.
3. KNOWLES MA, HURST CD. Molecular biology of bladder cancer: new insights into
pathogenesis and clinical diversity. Nat Rev ׀ Cancer. 2015; 15:25-41.
4. PASIN E, JOSEPHSON DY, MITRA AP, COTE RJ, STEIN JP. Superficial bladder
cancer: an update on etiology, molecular development, classification, and natural history. Rev
in Urol. 2008; 10 (1):31-43.
5. STOPIGLIA RM, MATHEUS WE, GARCIA PVI, BILLIS A, CASTILHO MA, JESUS
VHF, et al. Molecular assessment of non-muscle invasive and muscle invasive bladder
tumors: mapping of putative urothelial stem cells and toll-like receptors (TLR) signaling. J of
Cancer Therapy. 2015; 6:129-40.
6. CRALLAN RA, GEORGOPOULOS NT, SOUTHGATE J. Experimental models of human
bladder cancinogenesis. Carcinogen. 2005; 27:374-81.
7. HALL MC, CHANG SS, DALBAGNI G, PRUTHI RS, SCHELLHAMMER PF, SEIGNE
JD, et al. Guideline for the management of nonmuscle invasive bladder cancer (stages Ta, T1,
and Tis: update. J Urol. 2007; 178:2314-30.
8. NETTO GJ. Molecular biomarkers in urothelial carcinoma of the bladder: are we there yet?
Nat Rev׀ Urol. 2012; 9:41–51.
9. DOUGLASS L, SCHOENBERG M. The future of intravesical drug deliverey for non-
muscle invasive bladder cancer. Bladder Cancer. 2016; 2:285-92.
10. CHOU R, SELPH S, BUCKLEY DI, FU R, GRIFFIN JC, GRUSING S, et al. Intravesical
therapy for treatment of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review and meta-
analysis. J of Urol. 2017; 197:1189-99.
11. REIS LO, FAVARO WJ, FERREIRA U, BILLIS A, FAZUOLI MG, CAGNON VH. A.
Evolution on experimental animal model for upper urothelium carcinogenesis. World J Urol.
2010; 28:499-505.
45
12. FÁVARO WJ, NUNES OS, SEIVA FRF, NUNES IS, WOOLHISER LK, DURAN N, et
al. Effects of P-MAPA immunomodulatory on toll-like receptors and p53: potential
therapeutic strategies for infectious diseases and cancer. Infect Agent Cancer. 2012; 7:14.
13. MORALES A, EIDINGER D, BRUCE W. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the
treatment of superficial bladder tumors. J of Urol. 1976; 116:180-3.
14. KRESOWIK TP, GRIFFITH TS. Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy for urothelial
carcinoma of the bladder. Immunotherapy. 2009; 1(1):281-8.
15. ASKELAND EJ, NEWTON MR, O’DONNELL MA, LUO Y. Bladder cancer
immunotherapy: BCG and beyond. Adv in Urol. 2012; 2012:1-13.
16. ZHANG GW, QIN GF, HAN B, LI CX, YANG HG, NIE PH, et al. Efficacy of Zhuling
polyporus polysaccharide with BCG to inhibit bladder carcinoma. Carb Polymers. 2014;
118(2015):30-5.
17. RATLIFF, T., RITCHEY, J.K., YUAN, J.J.J., ANDRIOLE, G.L., CATALONA, W.J. T-
Cell Subsets Required for Intravesical BCG Immunotherapy for Bladder Cancer. J of Urol.
1993; 150:1018-23.
18. BOHLE A, BRANDAU S. Immune mechanisms in bacillus Calmette Guerin
imunotherapy for superficial bladder cancer. J Urol. 2003; 170:964-9.
19. PACKIAM VT, SCOTT C, STEINBERG GD. Review article: non–muscle-invasive
bladder cancer: intravesical treatments beyond bacille calmette-guérin. Cancer. 2017; 1:390-
400.
20. LIU Y, YIN H, ZHAO M, LU Q. TLR2 and TLR4 in autoimmune diseases: a
comprehensive review. Clinic Rev Allerg Immunol. 2014; 47:136-47.
21. TAKEDA K, AKIRA S. TLR signaling pathways. Sem in Immunol. 2004; 16:2-9.
22. PRADERE JP, DAPITO DH, SCHWABE RF. The yin and yang of toll-like receptors in
cancer. Oncogene. 2014; 33:3485-95.
23. VENDRAMIN FS, FRANCO D, NOGUEIRA CM, PEREIRA MS, FRANCO TR.
Plasma rico em plaquetas e fatores de crescimento: técnica de preparo e utilização em
cirurgia plástica. Rev Col Bras Cir. 2006; 33(1):24-8.
24. FOSTER TE, PUSKAS BL, MANDELBAUM BR, GERHARDT MB, RODEO SA.
Platelet-rich plasma, from basic science to clinical applications. Am J Sports Med. 2009;
37(11):2259-72.
25. NURDEN AT. Platelets, inflammation and tissue regeneration. Thromb and Haemost.
2011; 105(supp1):S13-S33.
46
26. KÜÇÜK L, GÜNAY H, ERBAŞ O, KÜÇÜK Ü, ATAMAZ F, COŞKUNOL E. Effects of
platelet-rich plasma on nerve regeneration in a rat model. Acta Orthop Traumatol Turc. 2014;
48(4):449-54.
27. RAJABI H, SHAHIN HS, NOROUZIAN M, MEHRABANI D, NAZHVANI SD. The
healing effects of aquatic activities and allogenic injection of platelet-rich plasma (PRP) on
injuries of achilles tendon in experimental rat. WJPS. 2015; 4(1):66-73.
28. FILARDO, G. et al. Platelet-rich plasma intra-articular injections for cartilage
degeneration and osteoarthritis: single- versus double-spinning approach. Knee Surg. Sports
Traumatol. Arthrosc., 20:2082-91, 2011.
29. SHIMOJO AAM, PEREZ AGM, GALDAMES SEM, BRISSAC ICS, SANTANA MHA.
Research article: performance of PRP associated with porous chitosan as a composite scaffold
for regenerative medicine. The Scientific World J. 2015; 2015:12.
30. SOMMELING CE, HEYNEMAN A, HOEKSEMA H, VERBELEN J, STILLAERT FB,
MONSTREY S. The use of platelet-rich plasma in plastic surgery: A systemactic review. J of
Plastic Reconstructive & Aesthetic Surgery. 2013; 66:301-12.
31. LANA JFSD, WEGLEIN A, VICENTE E, PEREZ AGM, RODRIGUES AA, LUZO
ACM, SANTANA MHA, BELANGERO WD. Platelet Rich Plasma and Its Growth Factors:
The State of the Art. In: Platelet Rich Plasma – Regenerative Medicine: Sports Medicine,
Orthopedic, and Recovery of Musculoskeletal Injuries. Editores: LANA JFSD, SANTANA
MHA, BELANGERO WD, LUZO ACM. Springer Science, 2014:59.
32. CUGAT R, CUSCO X, SEIJAS R, ALVAREZ P, STEINBACHER G, ARES O, et al.
Biologic Enhancement of Cartilage Repair: The Role of Platelet-Rich Plasma and Other
Commercially Available Growth Factors. J of Arthrosc and Rel Surg. 2015;31(4):777-83.
33. EHRENFEST DMD, RASMUSSON L, ALBREKTSSON T. Review: Classification of
platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- ande plaletet-rich
fibrina (L-PRF). Trends in Biotechnol. 2009; 27(3):158-67.
34. PEREZ AGM, LICHY R, LANA JFSD, RODRIGUES AA, LUZO ACM, BELANGERO
WD, et al. Prediction and Modulation of Platelet Recovery by Discontinuous Centrifugation
of Whole Blood for the Preparation of Pure Platelet-Rich Plasma. BioRes Open Access. 2013;
2(4):307-14.
35. UBEZIO G, GHIO M, CONTINI P, BERTORELLO R, MARINO G, TOMASINI A, et
al. Bio-modulators in platelet-rich plasma: a comparison of the amounts in products from
healthy donors and patients produced with three different techniques. Blood Transfus. 2014;
12(suppl 1):s214-20.
47
36. MISHRA AK, SKREPNIK NV, EDWARDS SG, JONES GL, SAMPSON S,
VERMILLION DA, et al. Efficacy of Platelet-Rich Plasma for Chronic Tennis Elbow. Am J
of Sports Med. 2014; 42(2):463-71.
37. COSTANZO GD, LOQUERCIO G, MARCACCI G, LERVOLINI V, MORI S,
PETRUZZIELLO A, et al. Use of allogeneic platelet gel in the management of chemotherapy
extravasation injuries: a case report. OncTarg and Therapy. 2015; 8:401-4.
38. HUA X, ZENG Y, ZHANG R, WANG H, DIAO J, ZHANG P. Using platelet-rich plasma
for the treatment of symptomatic cervical ectopy. International J of Gynecol and Obstet.
2012; 119:26-9.
39. HOEFERLIN LA, HUYNH QK, MIETLA JA, SELL SA, TUCKER J, CHALFANT CE,
et al. The Lipid Portion of Activated Platelet-Rich Plasma Significantly Contributes to Its
Wound Healing Properties. Adv in Wound Care. 2014; 4(2):100-9.
40. LAMM DL, BLUMENSTEIN BA, CRISSMAN JD, MONTIE JE, GOTTESMAN JE,
LOWE BA, et al. Maintenance Bacillus Calmete-Guerin immunotherapy for recurrent Ta, T1
and carcinoma in situ transitional cell carcinoma of the bladder: a randomized southwest
oncology group study. J of Urol. 2000; 163:1124-9.
41. LERNER SP, TANGEN CM, SUCHAREW H, WOOD D, CRAWFORD ED. Failure to
achieve a complete response to induction BCG therapy is associated with increased risk of
disease worsening and death in patients with high risk non-muscle invasive bladder cancer.
Urol Oncol. 2009; 27:155-9.
42. BILEN CY, OZEN H, AKI FT, AYGUN C, EKICI S, KENDI S. Clinical experience with
BCG alone versus BCG plus epirubicin. International J of Urol. 2000; 7:206–9.
43. AGARWAL A, AGRAWAL A, VERMA S, MOHANTY NK, SAXENA, S. Serum Th1
and Th2 cytokine balance in patients of superficial transitional cell carcinoma of bladder pre-
and post-intravesical combination immunotherapy. Immunopharmacol and Immunotoxicol.
2010; 32(2), 348-56.
44. GIACOIA EG, MIYAKE M, GOODISON S, SRIHARAN A, ZHANG G, YOU L, et al.
Intravesical alt-803 and BCG treatment reduces tumor burden in a carcinogen induced bladder
cancer rat model; a role for cytokine production and nk cell expansion. Plos one. 2014;
9(6):11.
45. SOLSONA E, MADERO R, CHANTADA V, FERNANDEZ JM, ZABALA JA,
PORTILLO JA. et al. Sequential combination of mitomycin C plus bacillus Calmette-Guérin
(BCG) is more effective but more toxic than BCG alone in patients with non-muscle-invasive
48
bladder cancer in intermediate- and high-risk patients: final outcome of CUETO 93009, a
randomized prospective trial. Eur Urol. 2015; 67:508-16.
46. LAHERU, D, JAFFEE, EM. Immunotherapy for pancreatic cancer - science driving
clinical progress. Nat. Rev. Cancer. 2005: 5:459-67.
47. GARAY RP, VIENS P, BAUER J, NORMIER G, BARDOU M. Cancer relapse under
chemotherapy: Why TLR2/4 receptor agonists can help. Eur. J. of Pharmacol. 2007; 563:1-
17.
48. MARTIN J, MERINO J, ATILANO L, AREIZAGA LM, FERNANDEZ MCG,
ALONSO NB, et al. Platelet-rich plasma (PRP) in chronic epicondylitis: study protocol for a
randomized controlled trial. Trials J. 2013; 14(1):410-5.
49. MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. J of Immunol Methods. 1983; 65:55-63.
50. GARCIA PV, APOLONARIO LM, BOCKELMANN PK, NUNES IS, DURAN N,
FAVARO WJ. Alterations in ubiquitin ligase Siah-2 and its corepressor N-CoR after P-
MAPA immunotherapy and anti-androgen therapy: new therapeutic opportunities for non-
muscle invasive bladder cancer. Int J Clin Exp Pathol. 2015; 8(5):4427-43.
51. EPSTEIN JL, AMIN MB, REUTER VR. The world health organization/international
society of urological pathology consensus classification of urothelial (tranticional cell)
neoplasms of the urinary bladder. Bladder consensus conference committee. Am J Surg
Pathol. 1998; 22:1435-48.
52. GARCIA PV, SEIVA FRF, CARNIATO AP, JUNIOR WM, DURAN N, MACEDO AM,
et al. Increased toll-like receptors and p53 levels regulate apoptosis and angiogenesis in non-
muscle invasive bladder cancer: mechanism of action of P-MAPA biological response
modifier. BMC Cancer. 2016; 16:422, 2016
53. ANANDAN V, JAMEELA WA, SARASWATHY P, SARANKUMAR S. Plateler rich
plasma: efficacy in treating trophic ulcers in leprosy. J Of Clinical Research. 2016; 10(10),
WC06-WC09.
54. NORDING MH, SEIZER P, LANGER HF. Platelets in inflammation and atherogenesis.
Frontiers in Immunol, 2015; 6(art98).
55. DALLAUDIÈRE B, LEMPICKI M, PESQUER L, LOUEDEC L, PREUX PM, MEYER
P, et al. Efficacy of intra-tendinous injection of platelet-rich plasma in treating tendinosis:
comprehensive assessment of a rat model. Eur Radiol. 2013; 23:2830-37.
56. KIM SJ, LEE SM, KIM JE, KIM SH, JUNG Y. Effect of platelet-rich plasma with self-
assembled peptide on the rotator cuff tear model in rat. J Tissue Eng Regen Med. 2015.
49
57. MARINI MG, PERRINI C, ESPOSTI P, CORRADETTI B, BIZZARO D, RICCABONI
P, et al. Effects of platelet-rich plasma in a model of bovine endometrial inflammation in
vitro. Reproductive Biol And Endocrinol. 2016: 14-58.
58. SEMERARO F, AMMOLLO CT, MORRISSEY JH, DALE GL, FRISE P, ESMON NL,
et al. Extracellular histones thrombin generation through platelet-dependent mechanisms:
involvement of platelet TLR2 and TLR4. Blood. 2011; 118(7):1952-61.
59. SEMPLE JW, FREEDMAN J. Platelets and innate immunity. Cell Mol Life Sci. 2010;
67:499-511.
60. JIANG L, LIU G, NI W, ZHANG N, JIE J, XIE F, et al. The combination of MBP and
BCG-Induced dendritic cell maturation through TLR2/TLR4 promotes Th1 activation in vitro
and vivo. Mediators of InflaM. 2017; 2017:14.
61. AYARI C, BERGERON A, LARUE H, MÉNARD C, FRADET Y. Toll-like receptors in
normal and malignant human bladders. J of Urol. 2011; 185:1915–21.
62. RIVADENEYRA L, CARESTIA A, ETULAIN J, POZNER RG, FONDEVILA C,
NEGROTTO S, SCHATTNER M. Regulation of platelet responses triggered by Toll-like
receptor 2 and 4 ligands is another non-genomic role of nuclear factor-kappaB. Thromb. Res.
2014; 133:235–43.
63. LUO JL, MAEDA S, HSU LC, YAGITA H, KARIN M. Inhibition of NF-kappaB in
cancer cells converts inflammation- induced tumor growth mediated by TNFalpha to TRAIL-
mediated tumor regression. Cancer Cell. 2004; 6:297–305.
64. SHANKARAN V, IKEDA H, BRUCE AT, WHITE JM, SWANSON PE, OLD LJ, et al.
IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour
immunogenicity. Nature. 2001; 410(6832):1107-11.
65. LI Z, PRADERA F, KAMMERTOENS T, LI B, LIU S, QIN Z. Cross-talk between T
cells and innate immune cells is crucial for IFN-gamma-dependent tumor rejection. J
Immunol. 2007; 179:1568–76.
66. DUPRE' SA, REDELMAN D, HUNTER JR KW. Microenvironment of the murine
mammary carcinoma 4T1: Endogenous IFN-γ affects tumor phenotype, growth, and
metastasis. Exp. and Mol. Path. 2008; 85: 174-88.
67. MARTINI M, TESTI MG, PASETTO M, PICCHIO MC, INNAMORATI G,
MAZZOCCO M. IFN-gamma-mediated up modulation of MHC class I expression activates
tumor-specific immune response in a mouse model of prostate cancer. Vaccine. 2010;
28:3548–57.
50
68. ALSHAKER HA, MATALKA KZ. IFN-γ, IL-17 and TGF-β involvement in shaping the
tumor microenvironment: the significance of modulating such cytokines in treating malignant
solid tumors. Cancer Cell Int., 2011; 11-33.
69. TATE JR DJ, PATTERSON JR, VELASCO-GONZALEZ C, CARROLL EN, TRINH J,
EDWARDS D, AIYAR A, FINKEL-JIMENEZ B, ZEA AH. Interferon-gamma-induced
nitric oxide inhibits the proliferation of murine renal cell carcinoma cells. Int J Biol Sci. 2012;
8:1109–20.
70. KOSKELA LR, POLJAKOVIC M, EHRÉN I, WIKLUND NP, VERDIER PJ.
Localization and expression of inducible nitric oxide synthase in patients after BCG treatment
for bladder câncer. Nitric Oxide. 2012; 27:185-91.
51
ANEXO I
Comuite de etica animal
52
ANEXO II
Comite de ética humano
53
54
55
56
57
58
ANEXO III
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Avaliação da Associação do Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e Bacillus Calmette
Guérin (BCG) para o tratamento do câncer de bexiga.
Aluna: Lara Paro Dias. Número do CAAE: 51774515.0.0000.5404
Você está sendo convidado a participar como voluntário de uma pesquisa. Este documento,
chamado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, visa assegurar seus direitos como
participante e é elaborado em duas vias, uma que deverá ficar com você e outra com o
pesquisador.
Por favor, leia com atenção e calma, aproveitando para esclarecer suas dúvidas. Se
houver perguntas antes ou mesmo depois de assiná-lo, você poderá esclarecê-las com o
pesquisador. Se preferir, pode levar este Termo para casa e consultar seus familiares ou outras
pessoas antes de decidir participar. Se você não quiser participar ou retirar sua autorização, a
qualquer momento, não haverá nenhum tipo de penalização ou prejuízo. Estou ciente que se
não quiser participar desta pesquisa ou desistir da doação não haverá qualquer prejuízo para o
meu atendimento nos hospitais da UNICAMP.
Justificativa e objetivos:
O objetivo desta pesquisa é caracterizar e comparar os efeitos imunológicos e
histopatológicos do tratamento com PRP associado à imunoterapia com BCG no câncer não-
músculo invasivo da bexiga-urinária (CBNMI) induzido quimicamente em ratos, bem como
estabelecer possíveis mecanismos de ação dessas terapias envolvendo as vias de sinalização
dos receptores toll-like (TLRs)
Procedimentos:
Participando do estudo você está sendo convidado a doar uma pequena quantidade de
seu sangue (9 ml) para obtermos o Plasma Rico em Plaquetas (PRP) ou Lisado Plaquetário.
coletado em tubos de sangue contento citrato de sódio 3,2% numa proporção de 9:1
respectivamente, e em seguida serão centrifugados à 700 rpm durante 10 minutos (centrífuga
SL-700, fabricante Solab científica – equipamentos para laboratórios). Após esta primeira
centrifugação, a segunda porção do soro, com coloração amarelada (PRP) será retirada com a
59
utilização de uma pipeta (10 - 100µl), reservada em um eppendorf de 2,0 mL e mantido em
gelo até o momento da administração nos animais.
Seguindo as orientações da Resolução 441/2011 CNS/MS o eventual armazenamento
deste material, se necessário, terá características de armazenamento em banco biorrepositor.
No presente estudo as amostras de PRP serão de utilização imediata e não serão armazenadas,
não caracterizando a necessidade de criação de banco biorrepositor.
Estou ciente que se não quiser participar desta pesquisa ou desistir da doação não
haverá qualquer prejuízo para o meu atendimento nos hospitais da UNICAMP.
Fui também orientado(a) e estou ciente que minha doação é livre e voluntária, podendo
desistir da doação a qualquer momento. Estou ciente também que não receberei nenhuma
remuneração, compensação material ou financeira ou privilégio pela de sangue. Fui também
informado (a) que não há benefícios decorrentes desta doação nem imediatos e nem a à longo
prazo.
Estou ciente que serão mantidos tanto o sigilo de meus dados quanto a minha
privacidade, em todos os momentos da realização da pesquisa, inclusive no momento da
publicação. Nenhuma informação será dada a outras pessoas que não estejam diretamente
ligadas à equipe de pesquisadores deste projeto.
( ) Concordo em participar do presente estudo e AUTORIZO a utilização do meu
material biológico, sendo necessário meu consentimento a cada nova pesquisa, que
deverá ser aprovada pelo CEP institucional e, se for o caso, pela CONEP.
Contatos:
Em caso de dúvidas sobre o estudo, você poderá entrar em contato com o pesquisador no
Laboratório de Carcinogênese Urogenital e Imunoterapia (LCURGIM) - Departamento de
Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia/Unicamp, localizado á rua Monteiro
Lobato, 255 - Cidade Universitária, Campinas – SP, CEP 13083-862; Tel (19)3521-6308.
Em caso de denúncias ou reclamações sobre sua participação e sobre questões éticas do
estudo, você pode entrar em contato com a secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)
da UNICAMP das 08:30hs às 13:30hs e das 13:00hs as 17:00hs na Rua: Tessália Vieira de
Camargo, 126; CEP 13083-887 Campinas – SP; telefone (19) 3521-8936; fax (19) 3521-
7187; e-mail: [email protected]
Após ter recebido esclarecimentos sobre a natureza da pesquisa, seus objetivos, métodos,
benefícios previstos, potenciais riscos e o incômodo que esta possa acarretar, aceito participar:
60
Nome do(a) participante:
________________________________________________________
_______________________________________________________
Data: ____/_____/______.
(Assinatura do participante ou nome e assinatura do seu responsável LEGAL)
Responsabilidade do Pesquisador:
Asseguro ter cumprido as exigências da resolução 466/2012 CNS/MS e
complementares na elaboração do protocolo e na obtenção deste Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido. Asseguro, também, ter explicado e fornecido uma via deste documento
ao participante. Informo que o estudo foi aprovado pelo CEP perante o qual o projeto foi
apresentado e pela CONEP, quando pertinente. Comprometo-me a utilizar o material e os
dados obtidos nesta pesquisa exclusivamente para as finalidades previstas neste documento ou
conforme o consentimento dado pelo participante.
______________________________________________________
(Assinatura do pesquisador)
Data: ____/_____/______.