7/27/2019 Digestao Do Colageno

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G u t , 1 9 7 8 , 1 9 , 2 4 0 - 2 4 3

D i g e s t i o n o f n a t i v e c o l l a g e n i n t h e g u tMARGARET L . R . HARKNESS R . D. HARKNESS AND MARY F . VENNIF r o m t h e D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y , U n i v e r s i t y C o l l e g e L o n d o n , G o w e r S t r e e t , L o n d o nSUMMARY T h e d i g e s t i o n a n d a b s o r p t i o n o f c o l l a g e n , n a t i v e a n d a r t i f i c i a l l y c r o s s - l i n k e d , h a s b e e ne x a m i n e d i n t h e r a t a n d t h e G a b o o n v i p e r , b y f e e d i n g k n o w n q u a n t i t i e s a n d m e a s u r i n g t h e h y d r o x y -p r o l i n e c o n t e n t o f t h e f a e c e s a n d o f t h e c o n t e n t s o f t h e g u t a t d i f f e r e n t l e v e l s , a n d c o m p a r i n g w i t han u n a b s o r b a b l e m a r k e r p o l y e t h y l e n e g l y c o l ) . I n c u b a t i o n o f c o l l a g e n i n v i t r o w i t h p e p s i n a t 3 7 C a tpH 1 5 f o l l o w e d b y t r y p s i n or c h y m o t r y p s i n c o n v e r t e d a b o u t 4 0n t o d i a l y s a b l e m a t e r i a l .

C o l l a g e n i s a m a j o r c o m p o n e n t o f t h e d i e t o fc a r n i v o r e s , f o r m i n g a b o u t a f i f t h o f t h e t o t a l b o d yp r o t e i n o f a mammal H a r k n e s s e t a l . , 1 9 5 8 ; P i c o ue t a l . , 1 9 6 6 ) . n u m b e r o f v e r t e b r a t e s s w a l l o w t h e i rp r e y w h o l e - s n a k e s , f o r e x a m p l e P o p e , 1 9 6 1 ) -w h i l e o t h e r s e a t e v e r y t h i n g i n c l u d i n g b o n e - f o re x a m p l e , h y e n a s K r u u k , 1 9 7 2 ) . A n e c e s s a r y p r e -l i m i n a r y t o t h e d i g e s t i o n o f h a r d t i s s u e s o r a w h o l ea n i m a l m u s t b e t h e s o l u b i l i s a t i o n o f t h e c o l l a g e nt h a t h o l d s t h e t i s s u e s t o g e t h e r . H o w e v e r , t h e r e s e e m st o b e n o d i r e c t e v i d e n c e t h a t c o l l a g e n i s d i g e s t e d a n da b s o r b e d , n o r i s i t c l e a r how i t m i g h t b e d i g e s t e d a st h e c o l l a g e n m o l e c u l e i n v i t r o i s n o r m a l l y r e s i s t a n tt o a t t a c k b y t h e p r o t e a s e s o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t b e c a u s e o f i t s t r i p l e h e l i c a l s t r u c t u r e . We h a v ee x a m i n e d t h e d i g e s t i o n a n d a b s o r p t i o n o f c o l l a g e nb y f e e d i n g k n o w n a m o u n t s t o r a t s a n d s n a k e s , a n dd e t e r m i n i n g t h e h y d r o x y p r o l i n e c o n t e n t o f t h ef a e c e s , a n d o f t h e c o n t e n t s o f t h e g u t a t d i f f e r e n tp o i n t s . T h e r e s u l t s s h o w t h a t a b s o r p t i o n t a k e s p l a c eb e f o r e t h e f o o d r e a c h e s t h e l a r g e g u t , s o i t w o u l ds e e m t h a t b a c t e r i a a r e n o t i n v o l v e d . E v i d e n c e w a so b t a i n e d i n v i t r o t h a t p e p s i n i n a c i d c o n d i t i o n s c a nb r e a k d o w n c o l l a g e n s u f f i c i e n t l y f o r i t t o b e d i g e s t e db y p a n c r e a t i c e n z y m e s .M e t h o d sANIMALSA d u l t m a l e r a t s , 3 m o n t h s o l d , w e i g h i n g 1 0 0 - 2 0 0 g ,f r o m t h e l o c a l c o l o n y o r i g i n a l l y W i s t a r w e r e u s e df o r m o s t o f t h e e x p e r i m e n t s b u t o n e w a s d o n e o n aGaboon v i p e r B i t i s g a b o n i c u s ) t h a t w a s a b o u t 6 1cm 2 f t l o n g . P r e s e n t a d d r e s s : B o n e a n d J o i n t R e s e a r c h U n i t , ARCB u i l d i n g , London H o s p i t a l M e d i c a l C o l l e g e , T u r n e r S t r e e t ,L o n d o n E l .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 7 O c t o b e r 1 9 7 7

EXPERIMENTAL PROCEDURES

M e t a b o l i c e x p e r i m e n t sT h e r a t s w e r e t r a i n e d t o e a t a q u a n t i t y o f f o o d i n as h o r t p e r i o d o f t i m e b y f e e d i n g t h e m o n c e d a i l y a tt h e s a m e t i m e a n d r e m o v i n g t h e f o o d a f t e r a n h o u r .T h i s t r a i n i n g t o o k a b o u t f i v e d a y s . W a t e r w a sa v a i l a b l e c o n t i n u o u s l y . Two s o r t s o f e x p e r i m e n t w e r ed o n e .1 . R a t s w e r e k e p t a t 2 0 C i n i n d i v i d u a l m e t a b o l i s mc a g e s o n g r i d s t h r o u g h w h i c h f a e c e s a n d u r i n e f e l la n d w e r e s e p a r a t e d b e l o w . F a e c e s w e r e a n a l y s e d f o rt o t a l h y d r o x y p r o l i n e c o n t e n t b e f o r e a n d a f t e r t h ea d d i t i o n o f a k n o w n a m o u n t o f c o l l a g e n o f v a r i o u st y p e s t o t h e d i e t .T h e G a b o o n v i p e r k e p t a t 2 5 C i n a g a r d e n e r sp l a s t i c p r o p a g a t i n g b o x ) w a s g i v e n m i c e t o e a t a f t e ra p e r i o d o f f a s t i n g a n d p a s s a g e o f a l a r g e s t o o lr e p r e s e n t i n g t h e r e m a i n s o f t h e p r e v i o u s m e a l . T h ef a e c e s r e p r e s e n t i n g t h e r e m a i n s o f t h e m i c e , i d e n t i f i e db y h a i r c o l o u r , w e r e a n a l y s e d w h e n t h e y w e r e p a s s e dl a t e r .2 . R a t s w e r e g i v e n a m e a l t o w h i c h a k n o w na m o u n t o f c o l l a g e n h a d b e e n a d d e d , t o g e t h e r w i t ha n u n a b s o r b a b l e m a r k e r , p o l y e t h y l e n e g l y c o l , a n dk i l l e d l a t e r a t i n t e r v a l s b y a b l o w o n t h e h e a d a n db r e a k i n g t h e n e c k . T h e a b d o m e n w a s o p e n e d q u i c k l ya n d S p e n c e r W e l l s f o r c e p s p u t o n t h e j u n c t i o n s a tt h e l o w e r e n d o f s t o m a c h a n d s m a l l i n t e s t i n e , a n da l s o b e t w e e n t h e c a e c u m a n d c o l o n . T h e c o n t e n t so f t h e p a r t s s o s e p a r a t e d w e r e w a s h e d o u t a n da n a l y s e d f o r t o t a l h y d r o x y p r o l i n e a n d t h e m a r k e r .F o o dC u b e s o f MRC D i e t w e r e c r u s h e d a n d m i x e d w i t hw a t e r t o make a s o l i d m a s s 2 0 g + 1 6 m l H 2 0 ) . Aw e i g h e d q u a n t i t y o f t h i s w a s p u t i n a n e a r t h e n w a r ep o t w i t h a n a r r o w o p e n i n g a t t h e t o p s o t h a t t h er a t s a t e b u t d i d n o t s p i l l t h e f o o d . F o o d n o t e a t e n ,

2 4 0

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D i g e s t i o n o f n a t i v e c o l l a g e n i n t h e g u tg e n e r a l l y o n l y a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h a t g i v e n , w a sw e i g h e d . T h e c o l l a g e n o u s m a t e r i a l a d d e d t o t h ef o o d w a s c h o p p e d u p i n t o p i e c e s a b o u t 2 mm s q u a r eo r l o n g i n t h e c a s e o f r a t t a i l t e n d o n . T h e f o l l o w i n gt y p e s o f c o l l a g e n w e r e u s e d :1 . F r e s h r a t t a i l t e n d o n 3 m o n t h s o l d ) .2 . R a t t a i l t e n d o n t r e a t e d w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e 0 * 2 M , 4 C 1 h ) t o s t a b i l i s e c r o s s l i n k s .3 . R a t t a i l t e n d o n t r e a t e d w i t h g l u t a r a l d e h y d e 1 w . v . 4 C I h ) t o i n t r o d u c e a d d i t i o n a l c r o s s l i n k s .4 . T e n d o n o f f o r e l e g f l e x o r m u s c l e s o f s h e e p .5 . C a r t i l a g e o f b o vi n e t r a c h e a .When p o l y e t h y l e n e g l y c o l w a s u s e d , 1 8 mg w a sa d d e d p e r g o f w e t f o o d d i e t .P r e p a r a t i o n o f f a e c e s , d i e t , a n d g u t c o n t e n t s f o ra n a l y s i sT h e f a e c e s a n d s a m p l e s o f t h e d i e t w e r e e x t r a c t e dw i t h t r i c h l o r a c e t i c a c i d T C A ) t o s e p a r a t e c o l l a g -e n o u s m a t e r i a l F i t c h e t a l . , 1 9 5 5 ) . F a e c e s a n d d i e tw e r e e x t r a c t e d f o u r t i m e s f o r 3 0 m i n u t e s w i t h1 0 t i m e s t h e i r w e i g h t o f 5 T C A , t w i c e a t 9 0 C a n dt w i c e a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r e a c h e x t r a c t i o nt h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n td e c a n t e d . T h e f o u r s u p e m a t a n t s w e r e b u l k e d a n dt a k e n t o d r y n e s s o n a w a t e r b a t h . T h e y w e r e t h e nt a k e n u p i n 6 N H C l , h y d r o l y s e d a t 2 5 l b / s q i n 1 7 5 k g / c m 2 ) i n s e a l e d t u b e s 1 1 5 C a p p r o x . ) a n da n a l y s e d f o r h y d r o x y p r o l i n e .T h e g u t c o n t e n t s w e r e a n a l y s e d b y t h e s a m ep r o c e d u r e a s t h e f a e c e s e x c e p t t h a t t h e c o n t e n t sw e r e f i r s t m i x e d w i t h w a t e r a n d m a d e t o a k n o w nv o l u m e . A s a m p l e 1 m l ) w a s t a k e n f o r e s t i m a t i o no f p o l y e t h y l e n e g l y c o l . T h e r e ma i n d e r w a s t r e a t e dw i t h T CA a s a b o v e .B o d i e s o f c o n t r o l m i c e l i t t e r m a t e s o f t h o s e f e dt o t h e G a b o o n v i p e r ) w e r e a n a l y s e d f o r t o t a l c o l -l a g e n b y b o i l i n g t h e m i n 5 T CA f o r t w o h o u r s ,h o m o g e n i s i n g i n a W a r i n g b l e n d e r , m a k i n g t o ak n o w n v o l u m e a n d f i l t e r i n g . An a l i q u o t w a s t a k e nt o d r y n e s s a n d a n a l y s e d f o r h y d r o x y p r o l i n e b y t h eu s u a l p r o c e d u r e . f u r t h e r e x t r a c t o f t h e s o l i d w i t h h o t 5 T CA

w a s a n a l y s e d f o r h y d r o x y p r o l i n e t o m a k e s u r e t h ee x t r a c t i o n p r o c e d u r e w a s a d e q u a t e . T h e a m o u n tf o u n d i n t h i s s e c o n d e x t r a c t w a s n e g l i g i b l e .T h e T CA e x t r a c t i o n m e t h o d w a s c h e c k e d b ya d d i n g k n o w n a m o u n t s o f c o l l a g e n , i n t h e f o r m o fc h o p p e d r a t t a i l t e n d o n , t o f a e c e s a n d t o s a mp l e s o fd i e t b e f o r e e x t r a c t i n g a n d a n a l y s i n g . T h i r t y - s e v e nm i l l i g r a m s o f c o l l a g e n a d d e d g a v e a n a v e r a g er e c o v e r y o f 3 5 9 mg a n a n a l y s i s .S o l u b i l i s a t i o n a n d d i g e s t i o n o f c o l l a g e n i n v i t r oF r e s h r a t o r b o v i n e t e n d o n w a s c h o p p e d c o a r s e l yw i t h s c i s s o r s . One g r a m w e t w e i g h t ) o f t e n d o n

w a s i n c u b a t e d o n a R o l l e r m i x w i t h 2 0 m l p e p s i n ,H C I o r g a s t r i c j u i c e a t pH 1 5 f o r t w o h ou r s a t 3 7 C .A f t e r t r e a t m e n t t h e s o l u t i o n w a s c e n t r i f u g e d f o ro n e h o u r a t 2 5 0 0 0 r p m a t 4 C . T h e s u p e r n a t a n tw a s r e m o v e d a n d m a d e t o k n o w n v o l u me a n d a na l i q u o t t a k e n f o r c o l l a g e n a n a l y s i s . Human g a s t r i cj u i c e w a s o b t a i n e d f r o m U n i v e r s i t y C o l l e g e H o s p i t a la n d u s e d w i t h o u t d i l u t i o n . R a t t a i l t e n d o n c o l l a g e ns o l u b l e i n p e p s i n o r H C l w a s s u b s e q u e n t l y m a d e t o0 - 0 1 M N a 2 H C O 4 , 0 - 1 4 5 N a C l , a n d t i t r a t e d t opH 7 0 . I t w a s t h e n d i g e s t e d w i t h n e u t r a l p r o t e a s e s .T r y p s i n o r c h y m o t r y p s i n w a s a d d e d t o g i v e a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 0 . 5 m g / m l a n d t h e s o l u t i o n si n c u b a t e d f o r 1 8 h o u r s a t 3 7 C . T h e s o l u t i o n s w e r et h e n d i a l y s e d a g a i n s t p h o s p h a t e b u f f e r f o r 2 4 h o u r sa n d t h e s o l u t i o n s i n s i d e a n d o u t s i d e t h e d i a l y s i ss a c k w e r e t a k e n t o d r y n e s s a n d a n a l y s e d f o r c o l l a g e nc o n t e n t .C h e m i c a l m e t h o d sH y d r o x y p r o l i n e i n t h e a c i d h y d r o l y s a t e ) w a sm e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f S t e g e m a n n 1 9 5 8 )m o d i f i e d f o r a u t o m a t e d a n a l y s i s b y G r a n t 1 9 6 4 ) .G e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s d o n e b y t h e m e t h o d o fS t a r k a n d Kuhn 1 9 6 8 ) . P o l y e t h y l e n e g l y c o l w a sm e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f M a l a w e r a n d P o w e l l 1 9 6 7 ) .R e s u l t sESTIMATION O F COLLAGEN DI GESTI O N BYEXAMINATION OF FAECAL HYDROXYPROLINER e s u l t s a r e s h o w n f o r r a t s ) i n T a b l e 1 . A l l t h e c o l -l a g e n o f r a t t a i l t e n d o n a n d n e a r l y a l l t h a t o f s h e e pt e n d o n w a s a b s o r b e d , w h i l e o n l y 60 o f c a r t i l a g ec o l l a g e n a n d 39 o f h i g h l y c r o s s - l i n k e d c o l l a g e nw a s a b s o r b e d .T h e G a b o o n v i p e r a t e s i x m i c e , f i r s t o n e , t h e nf i v e a w e e k l a t e r . F a e c e s w e r e p r o d u c e d t h r e e w e e k sa f t e r t h e s e c o n d m e a l . Two m i c e t a k e n f r o m t h es a m e l i t t e r a s t h e o n e s t h a t w e r e e a t e n w e i g h e d 2 1a n d 2 0 g a n d c o n t a i n e d 7 1 a n d 7 4 mg h y d r o x y -p r o l i n e , a n a v e r a g e o f 7 2 - 5 mg t o g i v e a n e s t i m a t e dt o t a l o f 4 3 5 mg h y d r o x y p r o l i n e i n g e s t e d f r o m t h es i x m i c e . T h e f a e c e s c o n t a i n e d 3 1 mg h y d r o x y p r o l i n ea n d a l a r g e q u a n t i t y o f h a i r . A s t h e s e a n i m a l sg e n e r a l l y v o i d t h e u n a b s o r b e d r e s i d u e o f a m e a l i n as i n g l e m a s s , o n e c a n c o n c l u d e t h a t 9 9 o rv i r t u a l l y a l l t h e c o l l a g e n i n t h e m i c e w a s d i g e s t e da n d a b s o r b e d .EXAMINATION OF CONTENTS OF DIFFERENTPARTS OF GUT AFTER A MEAL CONTAININGCOLLAGENT h e r e s u l t s o f a n a l y s i s o f t h e c o n t e n t s o f t h e d i f f e r e n tp a r t s o f t h e g u t a f t e r m e a l s c o n t a i n i n g c o l l a g e n a r e

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M a r g a r e t L . R . H a r k n e s s , R . D . H a r k n e s s , a n d M a r y F . V e n nT a b l e 1 E f f e c t o f a d d i n g c o l l a g e n t o f o o d o n o u t p u t o fh y d r o x y p r o l i n e i n f a e c e s , i n r a t s w e i g h i n g a p p r o x i m a t e l yJ O O gS o u r c e o f c o l l a g e n A m o u n t o f F a ec a l h y p ro C o l l a g e n

c o l l a g e n m g / d a y ) a b s o r b e da d d e d t of o o d B e f o r e A f t e r m g / h y p r o )T e n d o n r a t t a i l ) f 3 3 5 5 1 . 5 4 1 1 1 1 0 41 3 3 - 5 1 - 3 7 1 - 4 7 9 9T e n d o n s h e e p ) f 9 . 0 1 - 7 8 1 - 4 6 9 0 9 0 09 5 1 - 4 1 8 5C a r t i l a g e b o v i n e f 4 - 1 0 - 7 1 1 - 2 3 6 1t r a c h e a ) 1 4 - 4 0 5 7 1 - 0 7 6 5T e n d o n b o r o h y d r i d e ) f 58 0 9 1 2 5 0 3 71 1 0 - 7 1 . 3 9 2 - 0 2 8 6T e n d o n g l u t a r - 6 - 9 0 - 6 3 2 4 5 3 9a l d e h y d e )T h e f a e c a l h y d r o x y p r o l i n e b e f o r e i s t h e amount i n t h e 2 4 h o u r sb e f o r e a d d i t i o n o f c o l l a g e n t o t h e d i e t . T h e f i g u r e f o r a f t e r i s t h emean o f t h e t h r e e d a y s a f t e r f e e d i n g c o l l a g e n . T h e f i g u r e f o r a b s o r b e d i s c a l c u l a t e d f r o m amount a d d e d t o f o o d a n d t h e d i f f e r e n c eb e t w e e n t h e o u t p u t i n t h e t h r e e d a y s a f t e r f e e d i n g a n d t h e o u t p u te x p e c t e d f r o m t h e f i g u r e f o r t h e d a y b e f o r e . T e n d o n b o r o h y d r i d e )a n d t e n d o n g l u t a r a l d e h y d e ) r e f e r t o r a t t a i l t e n d o n p r e v i o u s l y t r e a t e dw i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e o r g l u t a r a l d e h y d e .

g i v e n i n t h e F i g u r e . L i t t l e h y d r o x y p r o l i n e w a s f o u n di n a n y p a r t o f t h e d i g e s t i v e t r a c t e x c e p t t h e s t o m a c h ,t h o u g h t h e a n a l y s e s f o r p o l y e t h y l e n e g l y c o l s h o w e dt h a t t h e r e s i d u e s o f t h e m e a l h a d p a s s e d t h r o u g hi n t o t h e l a r g e g u t . I t w o u l d s e e m t h a t t h e c o l l a g e n i sd i g e s t e d a n d a b s o r b e d b e f o r e t h e e n d o f t h e s m a l lg u t .

1 0 0 -C

7L

t L

9w

5 0 k .

2 4 8 2 4 1 2 4 6 2 4

D I G ES T I ON O F COLLAGEN i n v i t r oM o r e t h a n 90 r a t t a i l t e n d o n w a s s o l u b l e i np e p s i n , g a s t r i c j u i c e , a n d HCI i n t w o h o u r s a t 3 7 C .B o v i n e t e n d o n w a s i n s o l u b l e i n H C I b u t w a s d i g e s t e db y p e p s i n , t h o u g h t o a l e s s e r e x t e n t t h a n r a t t a i lt e n d o n T a b l e 2 . T h i s may r e f l e c t a n a g e d i f f e r e n c ei n t h e t i s s u e s c o n c e r n e d . A c r y l a m i d e g e l e l e c t r o -p h o r e s i s o f e n z y m e s o L u b i l i s e d c o l l a g e n s h o w e d an u m b e r o f b a n d s t h a t d i d n o t c o r r e s p o n d w i t h t h es i n g l e o r d o u b l e c h a i n s a s s e e n w h e n c o l l a g e n w a ss o l u b i l i s e d i n a c i d a l o n e b u t g o i n g f u r t h e r i n t o t h eg e l . V e r y l i t t l e m a t e r i a l , h o w e v e r , w a s d i a l y s a b l e .When p e p s i n o r a c i d s o l u b l e c o l l a g e n w a s s u b s e -q u e n t l y i n c u b a t e d i n t r y p s i n o r c h y m o t r y p s i na p p r o x i m a t e l y 4 0 w a s d i a l y s a b l e , a l t h o u g h l e s st h a n I w a s d i a l y s a b l e a f t e r i n c u b a t i o n i n b u f f e r .

T a b l e 2 E f f e c t o f g a s t r i c e n z y m e s o n s o l u b i l i s a t i o n o f r a tt a i l t e n d o n 4 - w e e k r a t ) a n d b o v i n e t e n d o n c o l l a g e n *T i s s u e E n z y m e C o l l a g e ns o l u b i l i s e dR a t t a i l t e n d o n G a s t r i c j u i c e 9 7 7HCI(0 0 1 5 N ) 9 5 . 4P e p s i n 9 6 5 0 2 5 m g / m l )P h o s p h a t e b u f f e r 0 . 0pH 7 - 4B o v i n e t e n d o n HCI 0 - 0 1 5 N ) 0 - 5P e p s i n 0 - 2 5 m g / m l ) 3 7 0 0* 2 0 m l s o l u t i o n pH 1 5 t w o h o u r s a t 3 7 C .

I P o l y e t h y l e n e G l y c o lU C o l l a g e n

2 4 8 2 4H o u r s a f t e r f e e d i n g 8 2 4 I n8 2 4S t o m a c h I n t e s t i n e Caecum R e c t u m F a e c e s

F i g u r e D i s t r i b u t i o n o f p o l y e t h y l e n e g l y c o l a n d c o l l a g e n i n t h e g u t a f t e r f e e d i n g t h e m b y m o u t h .

I_ _^ *--IIII 2 4 2

I n n i

7/27/2019 Digestao Do Colageno

4/4

D i g e s t i o n o f n a t i v e c o l l a g e n i n t h e g u t 2 4 3D i s c u s s i o nI t i s c l e a r f r o r n t h e r e s u l t s t h a t n a t i v e c o l l a g e n i sd i g e s t e d a n d a b s o r b e d b y t h e r a t a n d a G a b o o nv i p e r . I n t h e r a t t h e e v i d e n c e w a s t h a t i t w a sa b s o r b e d i n t h e s m a l l g u t , s o t h a t p r e s u m a b l yb a c t e r i a a r e n o t c o n c e r n e d i n t h e b r e a k d o w n . Fromt h e e x p e r i m e n t s i n v i t r o i t s e e m s t h a t t h e c o m b i n a t i o no f p e p s i n a t a c i d pH i n t h e s t o m a c h f o l l o w e d b yn e u t r a l p r o t e a s e s i n p a n c r e a t i c j u i c e c o u l d b r e a kd o w n t h e t r i p l e h e l i x .An i n t e r e s t i n g p r o b l e m i n r e l a t i o n t o d i g e s t i o n o fc o l l a g e n a r i s e s i n i n t e s t i n a l p a r a s i t e s w i t h a c o l l a g -e n o u s c u t i c l e l i k e n e m a t o d e s . T h e i r s u r v i v a l w o u l db e u n d e r s t a n d a b l e i f p a s s a g e t h r o u g h t h e s t o m a c h i sa n e c e s s a r y p r e l i m i n a r y t o d i g e s t i o n o f c o l l a g e n o u sm a t e r i a l s b y p a n c r e a t i c p r o t e a s e s .R e f e r e n c e sF i t c h , S . M . , H a r k n e s s , M. L . R . , a n d H a r k n e s s , R . D .

1 9 5 5 ) . E x t r a c t i o n o f c o l l a g e n f r o m t i s s u e s . N a t u r e L o n d . ) ,1 7 6 , 1 6 3 .G r a n t , R . A . 1 9 6 4 ) . E s t i m a t i o n o f h y d r o x y p r o l i n e b y t h ea u t o a n a l y s e r . J o u r n a l o f C l i n i c a l P a t h o l o g y , 1 7 , 6 8 5 - 6 8 6 .H a r k n e s s , M. L R . , H a r k n e s s , R . D . , a n d J a m e s , D . W. 1 9 5 8 ) . T h e e f f e c t o f a p r o t e i n - f r e e d i e t o n t h e c ol l a g e nc o n t e n t o f m i c e . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y , 1 4 4 , 3 0 7 - 3 1 3 .K r u u k , H . 1 9 7 2 ) . T h e S p o t t e d H y e n a . U n i v e r s i t y o f C h i c a g oP r e s s : C h i c a g o .M a l a w e r , S . J . , a n d P o w e l l , D . W. 1 9 6 7 ) . An i m p r o v e dt u r b i d i m e t r i c a n a l y s i s o f p o l y e t h y l e n e g l y c o l u t i l i z i n g a ne m u l s i f i e r . G a s t r o e n t e r o l o g y , 5 3 , 2 5 0 - 2 5 6 .P i c o u , D . , H a l l i d a y , D . , a n d G a r r o w , J . S . 1 9 6 6 ) . T o t a l b o d yp r o t e i n , c o l l a g e n a n d n o n - c o l l a g e n p r o t e i n i n i n f a n t i l ep r o t e i n m a l n u t r i t i o n . C l i n i c a l S c i e n c e , 3 0 , 3 4 5 - 3 5 1 .P o p e , C . H . 1 9 6 1 ) . T h e G i a n t S n a k e s . R o u t l e d g e , K e g a n P a u l :L o n d o n .S t a r k , M . , a n d K u h n , K . 1 9 6 8 ) . T h e p r o p e r t i e s o f m o l e c u l a rf ra g me n t s o bt a i n e d o n t r e a t i n g c a l f - s k i n c o l l a g e n w i t hc o l l a g e n a s e f r o m C l o s t r i d i u m h i s t o l y t i c u m . E u r o p e a nJ o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y , 6 , 5 3 4 - 5 4 1 .S t e g e m a n n , H . 1 9 5 8 ) . M i k r o b e s t i m m u n g v o n H y d r o x y -p r o l i n m i t C h l o r a m i n - T u n d p - D i m e t h y l a m i n o b e n z -

a l d e h y d . H o p p e - S e y l e r s Z e i t s c h r i f t f u r p h y s i o l o g i s c h eC h e m . , 3 1 1 , 4 1 - 4 5 .