xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL ..........................................................................................ii

LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................................iv

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ....................................................................v

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME .........................................vi

UCAPAN TERIMA KASIH .............................................................................vii

ABSTRAK ............................................................................................................x

ABSTRACT ..........................................................................................................xi

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xvii

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xviii

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xix

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xxii

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................ 4

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................. 4

1.3.1 Tujuan umum .......................................................................... 4

1.3.2 Tujuan khusus ......................................................................... 4

1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................... 5

1.4.1 Manfaat akademis ................................................................... 5

1.4.2 Manfaat praktis ....................................................................... 5

BAB II KAJIAN PUSTAKA ................................................................................ 7

2.1 Pre-eklampsia .................................................................................... 7

2.1.1 Definisi pre-eklampsia .......................................................... 7

2.1.2 Epidemiologi ........................................................................ 9

xiii

2.1.3 Kriteria diagnosis pre-eklampsia ........................................ 11

2.1.4 Patomekanisme pre-eklampsia ........................................... 12

2.2 Polimorfisme genetik ...................................................................... 28

2.2.1 Polimorfisme nukleotid tunggal .......................................... 28

2.2.2 Protein ERAP 2, polimorfisme rs2549782 Gen ERAP 2 &

pre-eklampsia ...................................................................... 29

2.3 DNA Fetal Ekstraseluler ................................................................. 31

2.3.1 Aplikasi klinis dari cell-free fetal DNA pada darah

maternal .............................................................................. 32

2.3.2 Prosedur pemeriksaan DNA ekstraseluler .......................... 33

2.4. Protein Sistatin C ............................................................................ 34

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS

PENELITIAN ...................................................................................... 38

3.1 Kerangka Berpikir ............................................................................ 38

3.2 Konsep Penelitian ............................................................................ 39

3.3 Hipotesis Penelitian ......................................................................... 39

BAB IV METODE PENELITIAN .................................................................... 41

4.1 Rancangan Penelitian ...................................................................... 41

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian .......................................................... 42

4.3 Penentuan Sumber Data .................................................................. 42

4.3.1 Populasi target ...................................................................... 42

4.3.2 Populasi terjangkau .............................................................. 42

4.3.3 Populasi sampel .................................................................... 42

4.3.4 Kriteria inklusi ...................................................................... 43

4.3.5 Kriteria Eksklusi ................................................................... 43

4.3.6 Besar Sampel ........................................................................ 43

4.4 Variabel Penelitian ......................................................................... 45

4.5 Definisi Operasional Variabel Penelitian....................................... 46

4.6 Bahan dan Materi Penelitian .......................................................... 48

xiv

4.6.1 Ekstraksi DNA (Qiagen extraction kit, Germany) .................... 48

4.6.2 Genotying SSP-PCR ............................................................. 48

4.6.3 Protein Sistatin C .................................................................. 49

4.7 Alat atau Instrumen Penelitian ......................................................... 49

4.7.1 Ekstraksi DNA (Qiagen extraction kit) .............................. 49

4.7.2 Genotying SSP_PCR ........................................................... 50

4.7.3 Protein Sistatin C ............................................................... 50

4.8 Prosedur Pengambilan atau Pengumpulan Data ............................ 50

4.8.1 Prosedur Penelitian ............................................................. 51

4.8.2 Metode Ekstraksi DNA ...................................................... 51

4.8.3 Metode Genotyping dengan SSP-PCR ............................... 53

4.8.4 Metode Pemeriksaan Sistatin C .......................................... 53

4.8.5 Alur Penelitian .................................................................... 56

4.9 Analisis Data .................................................................................. 57

BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN .................................... 58

5.1 Distribusi Karakteristik Umur Ibu, Paritas, dan Usia Kehamilan

pada Kedua Kelompok .................................................................. 58

5.1.1 Pembahasan karakteristik umur ibu ...................................... 59

5.1.2 Pembahasan karakteristik usia kehamilan ............................ 60

5.1.3 Pembahasan karakteristik paritas ......................................... 62

5.2 Risiko Pre-eklampsia pada Polimorfisme Gen ERAP2 .................. 63

5.3 Risiko Pre-eklampsia Pada Kadar cff DNA Tinggi ....................... 72

5.4 Risiko Pre-eklampsia pada Kadar Sistatin C Tinggi ...................... 79

5.5 Kebaruan Penelitian ....................................................................... 82

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN .................................................................. 84

6.1 Simpulan ......................................................................................... 84

6.2 Saran ............................................................................................. 85

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................... 86

LAMPIRAN

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Studi hubungan genom pada keluarga preeklampsia .......................... 17

Tabel 4.1 Primer Genotyping SSP-PCR .............................................................. 53

Tabel 5.1 Distribusi karakteristik umur ibu, paritas, dan usia kehamilan pada

kedua kelompok ................................................................................. 58

Tabel 5.2 Risiko Pre-eklampsia pada Polimorfisme gen ERAP2 ..................... .. 63

Tabel 5.3 Risiko Pre-eklampsia pada Kadar cff DNA Tinggi .......................... .. 72

Tabel 5.4 Risiko Pre-eklampsia pada Kadar Sistatin C Tinggi ......................... .. 80

xvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Skema tentang faktor-faktor yang berperan dalam

perkembangan preeklampsia dan interaksi diantaranya …........... 19

Gambar 3.1 Konsep Penelitian...........................................................................39

Gambar 4.1 Rancangan Penelitian ..................................................................... 41

Gambar 4.2 Hubungan Antar Variabel.............................................................. 45

Gambar 4.3 Alur Penelitian ................................................................................ 56

Gambar 5.1 Polimorfisme gen ERAP 2 Alel T ................................................. 64

Gambar 5.2 Polimerfisme gen ERAP 2 Alel G ................................................. 64

Gambar 5.3 Hasil Kadar DNA Fetus Ekstraseluler Pada Sirkulasi Maternal....73

Gambar 5.4 Peran DNA Fetus Ekstraseluler Pada Patogenesis

Pre-eklampsia................................................................................. 77

xvii

DAFTAR SINGKATAN

ACOG : American College of Obstetricians and Gynecologists

ANC : Ante Natal Care

Cff DNA : Cell Free Fetal DNA

CST3 : Cystatin 3

CpG : Cystatin Guanin

Cu : Cuprum

DNA : Deoxyribonucleic Acid

EDRF : Endothelial-derived Relaxing Factor

EKG : Elektro Kardiografi

ERAP 2 : Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 2

GAPDH : Glyceraldehid-3-Phosphate Dehydrogenase

GFR : Glomerular Filtration Rate

HELLP : Hemolysis Elevated Liver Enzyme Low Platelet Count

HLA-G : Human Leukocyte Antigen-G

HPHT : Hari Pertama Haid Terakhir

ICAM-1 : Intercellular Adhesion Molecule 1

IRD : Instalasi Rawat Darurat

kDa : kilo Dalton

LDL : Low-Density Lipoprotein

MDA : Malondialdehid

MHC : Major Histocompatibility Complex

MnSOD : Manganese containing Superoxyde Dismutase

NADPH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NF-KB : Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B

Cells)

PE : Pre-eklampsia

PCR : Polymerase Chain Reaction

PDGF : Platelet-derived Growth Factor

PGI2 : Prostaglandin I2 / Prostacyclin

RAS : Renin-Angiotensin System

RhD : Rhesus Fetal D

RNA : Ribonucleic Acid

ROC : Receiver Operating Characteristic Curve

ROS : Reactive Oxygen Species

RSUP : Rumah Sakit Umum Pusat

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

SOD : Superoxyde Dismutase

xviii

SPSS : Statistical Package for the Social Sciences

SSP-PCR : Single Spesific Primer- Polymerase Chain Reaction

TAX2 : Thromboxane A2

Th1 : T Helper 1

TNFα : Tumor Necrosis Factor α

tPA/PAI : Tissue Plasminogen Activator/Plasminogen Activator Inhibitor

USG : Ultrasonografi

Zn : Zinc

xix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Surat Keterangan Kelaikan Etik (Litbang) .................................. .. 96

Lampiran 2 Surat Ijin Pelaksanaan Penelitian ................................................ .. 97

Lampiran 3 Penjelasan Penelitian ................................................................... .. 98

Lampiran 4 Informed Consent ........................................................................ 100

Lampiran 5 Kuesioner Penelitian ................................................................... . 101

Lampiran 6 Hasil Polimorfisme gen ERAP 2 ................................................ . 103

Lampiran 7 Hasil Kadar DNA Fetus Ekstraseluler Pada Sirkulasi

Maternal ....................................................................................... 107

Lampiran 8 Data Karakteristik Subjek, Hasil Laboratorium, dan Hasil

PemeriksaanHistopatologi......... ................................................... 108

Lampiran 9 Analisis Data ................................................ ............................... 110

x

ABSTRAK

POLIMORFISME RS2549782 GEN ENDOPLASMIC RETICULUM

AMINOPEPTIDASE 2, TINGGINYA KADAR DNA FETAL

EKSTRASELULER DAN SISTATIN C SERUM MATERNAL SEBAGAI

FAKTOR RISIKO TERJADINYA PRE-EKLAMPSIA

Sampai saat ini, mekanisme terjadinya PE belum memperoleh kesepakataan

luas sehingga disebut disease of theory. Hal ini terkait dengan variasi penanganan

dan morbiitas dan mortalitas maternal dan fetal. Pada akhir-akhir ini, studi tentang

plasenta terkait dengan mekanisme PE mendapat perhatian serius. Tujuan penelitian

ini adalah untuk membuktikan polimorfisme rs2549782 gen ERAP 2, kadar DNA

fetal ekstraseluler, dan sistatin C yang tinggi dalam serum maternal sebagai faktor

risiko terjadinya PE yang dapat memperkaya teori terjadinya PE.

Penelitian ini adalah matched case control study dilaksanakan di Bagian/SMF

Obstetri dan Ginekologi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar, Laboratorium

Biomol FK UNUD, dan Laboratorium Prodia Denpasar, Bali selama 12 bulan dari

1 Agustus 2016 sampai dengan 1 Agustus 2017. Pemeriksaan polimorfisme

rs2549782 gen ERAP 2, kadar DNA fetal ekstraseluler, dan sistatin C berturut-turut

dengan sample sejumlah 62 maternal diatas 20 minggu terdiri atas 31 PE sebagai

kasus dan 31 sebagai kontrol. Analisis data dengan SPSS for windows edisi 16

dimana uji asosiasi polimorfisme rs2549782 gen ERAP2, kadar DNA fetal

ekstraseluler dan kadar sistatin C serum maternal memakai Uji X2. Uji diskriminan

dengan regresi logistik dan data ditampilkan dalam bentuk tabel dan narasi.

Didapatkan, polimorfisme gen ERAP2 pada kasus adalah 7,20 kali (OR=7,20;

IK95%: 2,18 – 23,75; p;0.001) dibandingkan dengan kontrol. Kadar DNA fetal

ekstraseluler pada kasus adalah 8,38 kali (OR= 8,38; IK; 95% 2,67-26,33, p;0.001)

lebih tinggi dibandingkan kontrol. Kadar sistatin C pada kasus adalah 7,03 kali

(OR; 7,03 IK; 95% 2,29-21,48, p;0.001) lebih tinggi jika dibandingkan dengan

kontrol. Selain itu, pada analsis jalur didapatkan tidak terdapat perbedaan bermakna

polimorfisme rs2549782 gen ERAP2, kadar DNA fetal ekstraseluler, dan kadar

sistatin C.

Dengan demikian, polimorfisme rs2549782 gen ERAP2, DNA fetal

ekstraseluler, dan sistatin C serum maternal yang tinggi meningkatkan risiko

terjadinya PE. Selain itu, peran rs2549782 gen ERAP2 adalah linier yang

membuktikan gen tersebut berperan pada mekanisme terjadinya PE.

Kata Kunci: Pre-eklampsia, polimorfisme rs2549782 gen ERAP2, DNA fetal

ekstraseluler, sistatin C.

xi

ABSTRACT

POLYMORPHISM RS2549782 GEN ENDOPLASMIC RETICULUM

AMINOPEPTIDASE-2, HIGH CONSENTRATION OF FREE FETAL DNA

AND CYSTATIN C IN MATERNAL AS RISK FACTORS OF PRE-ECLAMPSIA

Until now, the mechanism of the occurrence of PE has not gained widespread

agreement so that it is called as a disease of theory. This is related to variations in

treatment and maternal and fetal morbiitas and mortality. In recent years, the study

of placenta associated with PE mechanism received serious attention. The aim of

this study was to prove the polymorphism of rs2549782 ERAP 2 gene, extracellular

fetal DNA content, and high C cystatin in maternal serum as risk factor for PE

which can enrich the theory of PE.

This research is a matched case-control study was conducted in Departement

Obstetrics and Gynecology Medical Faculty Udayana University / Sanglah

Denpasar General Hospital, Biomol Laboratory FK UNUD, and Laboratory Prodia

Denpasar, Bali for 12 months from 1 August 2016 until 1 August 2017.

Polymorphism rs2549782 gen ERAP 2, level extracellular fetal DNA, and cystatin

C respectively in maternal sirculation with a sample of 62 maternals over 20 weeks

consisting of 31 PE as case and 31 as control. Data analysis with SPSS for windows

16th edition where the association test of polymorphism rs2549782 gene ERAP2,

extracellular fetal DNA level and maternal serum cystatin C level using test X2.

Discriminant test with logistic regression and data are displayed in tabular and

narrative form.

Obtained, the ERAP2 gene polymorphism in the case was 7.20 times (OR = 7,20;

IK95%: 2.18 - 23.75; p; 0.001) compared with the control. The extracellular fetal

DNA high level in the case was 8.38 times (OR = 8.38, IK; 95% 2.67-26.33, p;

0.001) higher than control. The level of cystatin C in the case was 7.03 times (OR,

7.03 IK; 95% 2.29-21.48, p; 0.001) higher when compared with control. In an path

analysis, there were no significant differences in polymorphism of rs2549782

ERAP2 gene, extracellular fetal DNA, and cystatin C.

Thus, polymorphism of rs2549782 ERAP2 gene, extracellular fetal DNA, and high

maternal serum C cystatin increase the risk of PE. In addition, the role of rs2549782

of the ERAP2 gene is linear which proves that the gene plays a role in the

mechanism of occurrence of PE.

Keywords: Pre-eclampsia, polymorphism rs2549782 Gen ERAP2, extracellular

fetal DNA, cystatin C.

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sampai saat ini, pre-eklampsia (PE) masih merupakan masalah kesehatan

maternal terkait dengan prevalensi yang relatif menetap dengan morbiditas,

mortalitas ibu dan janin yang tinggi. Penyebab PE itu sendiri adalah kehamilan;

akan tetapi mekanisme pasti terjadinya PE belum mendapatkan kesepakatan luas

sehingga PE masih merupakan the disease of theories. Terdapat banyak teori yang

berkembang namun semua teori tersebut belum bisa menjawab penyebab pasti

terjadinya PE, seperti misalnya teori hormonal, teori radikal bebas, teori oksidatif,

teori imunologis, dan teori iskemia plasenta. Berkembangnya biologi molekuler

mempengaruhi banyaknya dukungan terhadap teori genetik serta peran tingginya

kadar DNA janin ekstraseluler di darah ibu hamil.

Di seluruh dunia, prevalensi PE berkisar 2–10% dari seluruh kehamilan,

sedangkan di negara berkembang diperkirakan jumlahnya tujuh kali lipat

dibandingkan negara maju (WHO, 2015). Di Indonesia prevalensi PE adalah 3-7

% dan merupakan penyumbang angka kematian ibu (AKI) nomor tiga setelah

perdarahan dan infeksi. Pada akhir akhir ini, penyebab AKI terlihat bergeser dari

obstetrik menuju non obstetrik (Kemenkes, 2014). Di rumah sakit Pendidikan

RSUP Sanglah Denpasar, prevalensi PE adalah 5,83 – 6,06 % (Oka dan Surya,

2004; Sutopo dan Surya, 2011).

2

Pada satu dekade terakhir, studi PE difokuskan pada peran plasenta yaitu

keadaan hipoperfusi plasenta dengan faktor pencetus yang multifaktorial; seperti

faktor genetik, faktor vaskular, inflamasi, imun dan lingkungan (Williams dan

Pipkin, 2011). Pada PE, invasi sel trofoblas mengalami gangguan sehingga

remodelling arteri spiralis tidak lengkap. Hal ini menyebabkan sirkulasi

uteroplasenta berada dalam keadaan tahanan tinggi dan sebagai akibatnya adalah

hipoperfusi plasenta (Zusterzeel, et al., 2000; Fisher, 2004). Hipoperfusi placenta

memicu stres oksidatif plasenta (Zusterzeel, et al., 2000) dan apoptosis sel

sinsiotrofoblas dimana fragmen sel sinsiotrofoblas hasil apoptosis tersebut masuk

ke dalam sirkulasi darah maternal. Selanjutnya, hal ini mengaktivasi sel endotel

dan leukosit melepaskan radikal bebas dan sitokin (Poston dan Raijmakers, 2004).

Radikal bebas dan sitokin dalam plasma darah maternal kembali mengaktivasi

endotel memproduksi radikal bebas (Raijmakers, et al., 2004a). Hal ini

merupakan sirkulus sebab akibat yang terjadi berkesinambungan.

Berdasarkan prevalensi PE yang relatif menetap dan masih merupakan suatu

disease of theory maka sangat diduga bahwa mekanisme terjadinya PE melibatkan

faktor genetik. Founds, et al., (2009) melaporkan bahwa terjadi perubahan

ekspresi endoplasmic reticulum aminopeptidase2 (ERAP2) pada placenta

maternal dengan PE. Selanjutnya, Zhang,et al., (2010) menemukan bahwa

ERAP2 diekspresikan pada sel sinsitiotrofoblast. Sementara, ERAP2 sendiri

adalah keluarga oksitosinase dimana Tsujimoto dan Hattori (2005) telah

melaporkan peran oksitonase dalam pemeliharaan kehamilan agar tetap fisiologis.

Selain itu, ERAP2 juga berperan pada regulasi tekanan darah, respon imun, dan

3

produksi sitokin pro-inflamasi (Tanioka,et al., 2005). Penemuan diatas didukung

oleh Johnson,et al., (2009) yang melaporkan bahwa terdapat hubungan

polimorfisme rs2549782 gen ERAP2 pada ibu dengan PE, yang didukung oleh

hasil studi Hill,et al., (2011). Dengan demikian, diduga polimorfisme rs2549782

gen ERAP2 berhubungan dan berperan pada mekanisme terjadinya PE.

Hipoperfusi plasenta mengakibatkan kerusakan trofoblas dimana pelepasan

destruksi sel-sel trofoblas plasenta yaitu DNA fetal ekstraseluler dan masuk

kedalam sirkulasi darah maternal; berperan sebagai antigen toksin, sehingga

memicu rekasi antigen antibodi. Pemeriksaan DNA fetal ekstraseluler serum

maternal merupakan sebuah metode diagnosis non invasif pada studi tentang

mekanisme terjadinya PE. Selain itu, DNA fetal ekstraseluler juga dapat

dipergunakan sebagai indikator untuk mengetahui kesejahteraan janin dan risiko

terjadinya patologik janin itu sendiri (Manokhina,et al.,2014). Jumlah DNA fetal

ekstraseluler yang tinggi dalam plasma maternal berkorelasi secara bermakna

dengan PE. Selain itu, hal ini juga terkait dengan terjadinya sindroma HELLP dan

pertumbuhan janin terhambat intrauterin (Engel,et al.,2007).

Hipoperfusi plasenta berhubungan dengan peningkatan kadar protein sistatin

C dimana protein tersebut diduga berperan pada mekanisme terjadinya PE. Kadar

sistatin C menjadi penyebab tingginya jumlah DNA fetus ekstra seluler dan

mengakibatkan penurunan fungsi ginjal terhadap ekskresi DNA fetal ekstra

seluler (Hahn,et al.,2011) sehingga terjadi akumulasi protein tersebut dalam

sirkulasi maternal. Tingginya jumlah DNA fetus ini akan menimbulkan

peningkatan substan pro-inflamasi yang akan berpengaruh terhadap terjadinya

4

kerusakan endotel. Kerusakan endotel sistemik dapat mengakibatkan munculnya

komplikasi PE (Levine, et al., 2004).

Dengan demikian, dilakukan studi tentang polimorfisme rs2549782 gen

ERAP2, protein DNA fetal ekstraseluler, dan sistatin C sebagai faktor risiko yang

berperan pada mekanisme terjadinya PE.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah pasien dengan polimorfisme rs2549782 gen ERAP2 serum maternal

lebih tinggi risikonya mengalami PE dibandingkan dengan tanpa

polimorfisme rs2549782 gen ERAP2?

2. Apakah pasien dengan kadar DNA fetal ekstraseluler serum maternal yang

tinggi memiliki risiko terjadinya PE lebih besar dibandingkan maternal

dengan kadar DNA fetal ekstraselulerrendah?

3. Apakah pasien dengan kadar sistatin C serum maternal yang tinggi memiliki

risiko terjadinya PE lebih besar lebih besar dibandingkan dengan kadar

sistatin C yang rendah?

3.1 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan umum

Untuk mengetahui peran polimorfisme rs2549782 gen ERAP2, DNA fetal

ekstraseluler dan sistatin C pada mekanisme terjadinya PE

5

1.3.2 Tujuan khusus

1. Untuk membuktikan pasien dengan polimorfisme rs2549782 gen ERAP2

memiliki risiko terjadinya PE lebih besar dibandingkan dengan pasien

tanpa polimorfisme rs2549782 gen ERAP2.

2. Untuk membuktikan pasien dengan kadar DNA fetal ekstraseluler serum

yang tinggi memiliki risiko terjadinya PE lebih besar dibandingkan pasien

dengan kadar DNA fetal ekstraseluler yang rendah.

3. Untuk membuktikan pasien dengan kadar sistatin C serum yang tinggi

memiliki risiko terjadinya PE lebih besar dibandingkan pasien dengan

kadar sistatin C yang rendah

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat akademis

Hasil studi ini diharapkan dapat memperkaya dan menguatkan mekanisme

terjadinya PE terkait teori genetik yang melibatkan polimorfisme rs2549782 gen

ERAP2, DNA fetal ekstraseluler dan sistatin C. Selain itu, dapat meningkatkan

pemahaman peran plasenta dan juga mendukung teori lama bahwa PE adalah

toksemia gravidarum.

1.4.2 Manfaat praktis

Jika hipotesis penelitian ini terbukti maka polimorfisme rs2549782 gen

ERAP2, DNA fetal ekstraseluler dan sistatin C yang tinggi didalam plasma darah

maternal dapat dipakai untuk indikator:

6

1. Risiko kemungkinan terjadinya PE.

2. Risiko terjadinya komplikasi sindroma HELLP pada PE.

3. Prognosis PE sehingga dapat dipakai untuk pertimbangan terminasi

kehamilan terkait upaya penyelamatan ibu.