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COMPOSICIÓN BOTÁNICA DE MIELES MEDIANTE qPCR Y ANÁLISIS DE CURVAS DE DISOCIACIÓNRev Mex Cienc Pecu 2016;7(4):489-505

Composición botánica de mieles de la península deYucatán, mediante qPCR y análisis de curvas de

disociación

Botanical composition of honeys from the YucatanPeninsula, by qPCR and dissociation curve analysis

Alejandra Vanessa Castillo Cázaresa, Yolanda Beatriz Moguel Ordóñezb, Moisés Alberto CortésCruzc, Elsa Espinosa Huertaa, Miguel Enrique Arechavaleta Velascod, María Alejandra Mora Avilésa

RESUMEN

El método cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR), seguido por análisis de curvas de disociación,fue desarrollado para la detección rápida y simultánea de la composición botánica en mieles de la Península deYucatán, México. Cinco muestras de miel ciclo apícola 2013 y cinco del 2014, se caracterizaron para definir elcontenido de cinco especies de plantas de importancia apícola; Viguiera dentata, Gymonopodium floribundum, Piscidiapiscipula, Acacia angustissima y Mimosa bahamensis. Siete iniciadores de genes genéricos (Adh1, Hmg2, Brass lip,Plant 1, Plant nest, Act1, y Helli-all) se emplearon para caracterizar las especies vegetales y las muestras de miel.Al finalizar la amplificación se obtuvo una curva de disociación por reacción representando productos específicos deamplificación. Los resultados obtenidos indicaron que el contenido taxonómico en las muestras de miel fue diferencialM-1 (V. dentata), M-3 (M. bahamensis y G. floribundum), M-4 (G. floribundum), M-8 (M. bahamensis) y M-13 (V.dentata y G. floribundum). M-7, M-11 y M-12 no revelaron tener ninguna de las especies analizadas, mientras queM-14 y M-15 presentaron un patrón de amplificación diferente a las especies incluidas en este estudio; concordandocon los análisis palinológicos. P. piscipula no mostró ningún patrón de amplificación con ninguno de los iniciadoresde este estudio y A. angustissima no fue identificada en ninguna muestra de miel, aun cuando el análisis palinológicoreveló presencia de esta especie en M-3 y M-4, posiblemente derivado de la ausencia de similitud con los genes deestudio.

PALABRAS CLAVE: PCR cuantitativo, Miel, Curvas de disociación, Marcadores moleculares genéricos, Melisopalinología.

ABSTRACTA polymerase chain reaction quantitative method (qPCR) followed by melting curve analysis was used for fast andsimultaneous detection of botanical composition of honey samples from Yucatán Peninsula, Mexico. Ten honey samplesfrom 2013 and 2014 production were collected directly from beekeepers and analyzed for Viguiera dentata,Gymnopodium floribundum, Piscidia piscipula, Acacia angustissima and Mimosa bahamensis content. Seven primersfrom generic genes (Adh1, Hmg2, Brass lip, Plant 1, Plant nest, Act1, and Helli-all) were used to amplify plant speciesand honey samples DNA. Comparisons of melting curves among plant and honey samples for each primer amplification,revealed a variable taxonomic content M-1 (V. dentata), M-3 (M. bahamensis y G. floribundum), M-4 (G. floribundum),M-8 (M. bahamensis) y M-13 (V. dentata y G. floribundum). M-7, M-11 and M-12 did not have evidence of presencefor any of the plant species under study, whilst M-14 and M-15 showed a different plant species amplification pattern.These results correlate to melissopalynological analysis for most cases. P. piscipula was not detected in any honeysample; however, according to melissopalynological analysis A. angustissima was present in M-3 and M-4 even thoughit was unable to detect it, possibly due to a low or no similarity with generic genes sequence.

KEY WORDS: Quantitative PCR, Honey, Melting curves, Gene molecular markers, Melissopalynology.

Recibido el 14 de septiembre de 2015. Aceptado el 27 de noviembre de 2015.a Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Campo experimental Bajío, Km 6.5 Carr. Celaya-San Miguel de Allende, 38110,

S/N Celaya, Gto. México. Tel: 01800 088 2222 Ext. 85246. [email protected]. Correspondencia al último autor.b Campo Experimental Mocochá, INIFAP. México.c Centro Nacional de Recursos Genéticos, INIFAP. México.d Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal. INIFAP. México.

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Alejandra Vanessa Castillo Cázares, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2016;7(4):489-505

INTRODUCTION

Mexico is among the top five honey producingand exporting countries worldwide. Honeyquality is determined based on flavor, color andaroma(1,2), which are the result of the plantspecies in the zone of production. Plant speciesof a honey production region provides a specificbotanical composition to honey, which is uniqueto that place of origin. Efforts on marketingclassified honey based on botanical origin areincreasing, particularly in Yucatan Peninsularegion(3). Yucatan Peninsula accounts for 30 %of total production from which, 90 % is forinternational markets(4,5). Honey has specificphysicochemical and sensorial traits that respondto a broad diversity of plant species in eachregion. Approximately 2,400 plant species havebeen recorded nationally, 600 of which arevisited by honey bees and 30 of them areimportant in honey production(6,7,8).

Ninety percent of annual honey production inthe region depends on two main nectar sources:Viguiera dentata (sunflower goldeneye; localterm is tajonal) from December to February;and Gymnopodium floribundum (dzildzilche; localterm is t´sit´silche´) from March to May. Bothspecies bloom during the driest time of year.During the rainy season, from June to November,a large variety of legumes and vines flower, butthey account for only 8 % of the total annualhoney harvest in the region(9).

A widely used method to identify among theplant species from which, a honey has beenproduced is pollen analysis, based on the specificmorphology of the pollen(10-14). However,currently there are a number of differentmethodologies that can complementmelissopalynological analysis.

Pollen content in honey is extremely low (tracelevels), however, it varies depending on thefloral abundance in each zone, and their nectarand pollen contribution, which results in theunder- or over-representation of some species.This highlights the need for additional methodsthat depend less on pollen traces to estimate

INTRODUCCIÓN

México se encuentra entre los cinco primerospaíses en producción y exportación de miel anivel mundial. La calidad de la miel se establecea través de sus diferentes propiedades como elsabor, color y aroma(1,2), mismas que sonproducto de las especies vegetales de la zonay que le confiere su or igen botánico.Actualmente existen algunos esfuerzos porcomercializar la miel clasificada, siendo laPenínsula de Yucatán la región que más haavanzado en este rubro(3).

La Península de Yucatán aporta el 30 % de laproducción nacional de miel y aproximadamenteel 90 % se destina al mercado internacional(4,5).Estas mieles poseen características fisicoquímicasy sensoriales específicas debido a que provienende una gran diversidad de especies nativaspropias de la región. Hasta la fecha se hanregistrado aproximadamente 2,400 especiesvegetales, de las cuales 600 son melíferas y 30de ellas consideradas de gran importanciaapícola(6,7,8).

A pesar de la diversidad de especies melíferasexistentes, cerca del 90 % de la producciónanual de miel en la Península de Yucatán,proviene de dos principales flujos de néctar;floración de tajonal (Viguiera dentata) en losmeses de diciembre a febrero y floración det´sit´silche´ (Gymnopodium floribundum)durante marzo a mayo. Ambas especies florecenen el período de más baja precipitación pluvial.En el período de junio a noviembre (período demayor precipitación pluvial) florecen una altaproporción de leguminosas y enredaderas; sinembargo, solamente se cosecha un 8 % deltotal anual(9).

El método empleado más comúnmente, paradistinguir las especies vegetales que dieron origena una miel, es mediante el análisis palinológico,fundamentado en la morfología particular de cadapolen presente en la miel(10-14); sin embargo,existen en la actualidad diferentes metodologíasque complementan el análisis melisopalinológico.

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honey physicochemical parameters and botanicalcontent, such as proteomics(15), opticalspectrophotometry and electronic sensors(16),and fluorescence spectrophotometry(17), amongothers.

An effective method for identifying the botanicalsource are those based on DNA, suitable forthe honey qual ity regulations used forstandardization within the European Union andother countries(18). Defining honey botanicalsources with the aim of adding value to thefinal product requires detection of homologousnucleotide sequences using genericoligonucleotides derived from metabolic genes.These genes are common to all plant speciesbut have amplification patterns highly specificto each plant family.

The objective of the present study was todevelop and validate generic oligonucleotideamplification system using quantitative PCR andSYBR® Green, as well as dissociation curveanalysis, in order to characterize the plantspecies and to identify pollen sources in honeyproduction from the Yucatan Peninsula.

MATERIAL AND METHODS

Honey samples. Ten honeycombs with at least80 % operculation were collected from theapiary at the Mocochá Experimental Station(21°07’N, 89°26’W; 10 m asl) of the NationalInstitute of Forestry, Agricultural and LivestockResearch (Instituto Nacional de InvestigaciónesForestales, Agrícolas y Pecuarias – INIFAP)during different flowering cycles. Honey wasextracted from the honeycombs using a stainlesssteel extractor. The extractor was washed withwater and dried with 70 % alcohol to preventcontamination between honey samples. Afterextraction, each honey sample was filtered andstored at room temperature in polyethyleneterephthalate (PET) containers. All samples weresent to the Vegetal Tissue Culture and GeneticEngineering Laboratory at the Bajío ExperimentalStation (INIFAP). Five samples were collectedduring the 2013 season (M-1, M-3, M-4, M-7

El contenido de polen en las mieles es muybajo (niveles trazas) pero varía dependiendode la riqueza floral de cada zona y del aportede néctar y polen de cada especie vegetal, porlo cual, algunas especies se encuentran sub- osobre-representadas en el perfil palinológico yse reconoce la necesidad de establecer otrasmetodologías menos dependientes de las trazasde polen en la miel, como la proteómica(15), laespectroscopia óptica y sensores electrónicos(16)o espectrometría de fluorescencia para estimarparámetros físico-químicos y contenido floral(17),entre otros.

Una opción para identificar las especiesvegetales presentes en la miel, son los métodosanalíticos basados en el ADN; adecuados parala normalización como base para la armonizaciónen la Unión Europea y otros países(18). En estesentido, la definición del origen botánico de lasmieles con fines de proporcionar un valoragregado al producto, establece la necesidadde contar con un sistema de detección desecuencias nucleotídicas homólogas, empleandooligonucleótidos genéricos derivados de genesmetabólicos que, si bien son afines a todas lasespecies, también tienen patrones deamplificación muy particulares entre familias deplantas.

Este estudio se centró en el desarrollo yvalidación de sistemas de amplificación deoligonucleótidos genéricos por PCR cuantitativo(qPCR) empleando SYBR-Green y análisis delas curvas de disociación, para la caracterizaciónde especies de plantas de importancia apícolaen la península de Yucatán presentes en la miela través del polen, como una herramienta paraidentificar el origen botánico de las mieles.

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras de miel. Diez panales con al menos el80 % de operculado se colectaron del apiariodel Campo Experimental Mocochá, Yucatán,ubicado en km 1.5 carretera Mocochá-exHacienda Carolina, a 21º 07’ LN y 89º 26’ LO,a 10 msnm, durante los diferentes ciclos de

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and M-8) and five samples during the 2014season (M-11, M-12, M-13, M-14 and M-15).Palynology analyses were done of each sampleto generate floral origin reference data.

Melissopalynological analysis. The honeysamples were acetolyzed following Louveaux(19).Acetolyzed pollen grains identified in the honeyswere fixed on slides with glycerinated gelatin.Grain structural characteristics (e.g. shape, size,openings and structural elements) were analyzedunder microscope (Motic BA 410) with an imageanalyzer. Based on their characteristics, pollengrains were classified and identified using thepublished literature(20).

Plant Material. Leaves of five plant speciesknown as the most important in honeyproduction in the region were collected: Viguieradentata (flowers December to February);Gymnopodium floribundum (flowers February toApril); Piscidia piscipula (fishpoison tree; locallyknown as ja´bin) (flowers from March to April);Acacia angustissima (prairie acacia; locallyknown as xáax) (flowers from June to August);and Mimosa bahamensis (Bahama mimosa;locally known as sak káatsim) (flowers fromJuly to November).

DNA extraction. Plant DNA extraction was doneusing a commercial kit (DNeasy Plant Mini;Qiagen®) following manufacturer instructions.Honey samples DNA was extracted from 50 gof honey per sample. This amount wasdistributed evenly among four 50 mL tubes(NALGEN®), approximately 30 mL double-distilled sterile water added to each, andincubated in water bath at 40 °C for 15 min.Each tube was then agitated by inversion, andcentrifuged at 10,000 xg for 15 min until asediment (i.e. pollen traces) settled. Once pollentraces were obtained, the pollen DNA extractionwas performed using protocol published by theEuropean Union Federal Office of ConsumerProtection and Food Safety (2011), and modifiedby the Vegetal Tissue Culture and GeneticEngineering Laboratory. DNA concentrationranged from 40 to 200 ng/L, depending onpollen content.

floración que se presentan en la región. Lospanales se llevaron al laboratorio para extraerindividualmente la miel utilizando un extractorde acero inoxidable, el cual se lavó y secó conagua y alcohol al 70% para evitarcontaminaciones entre muestras. Las muestrasse filtraron y almacenaron a temperaturaambiente en frascos de polietileno tereftalato(PET) para su posterior envío al laboratorio deCultivo de Tejidos Vegetales e IngenieríaGenética, en el Campo Experimental Bajío delINIFAP. Se obtuvieron cinco muestras de miel(M-1, M-3, M-4, M-7 y M-8) del ciclo apícola2013 y cinco (M-11, M-12, M-13, M-14 y M-15)del ciclo 2014. Para tener de referencia el origenfloral de las mieles, se realizó el análisispalinológico de cada muestra.

Análisis melisopalinológico. Las mieles seacetolizaron de acuerdo al método reportadopor Louveaux(19). Los gránulos de polenacetolizados se montaron en portaobjetos congelatina glicerinada y se observaron suscaracterísticas estructurales como forma,tamaño, aberturas y elementos estructuralesutilizando un microscopio Motic BA 410 provistode un analizador de imágenes. Los gránulos depolen se clasificaron e identificaron de acuerdoa las referencias publicadas por Palacios et al(20).

Material Vegetal. Se recolectó en los alrededoresdel apiario del Campo Experimental Mocochá,hojas de cinco especies de importancia apícola;Viguiera dentata (tajonal) (florece diciembre afebrero), Gymonopodium f lor ibundum(t´sit´silche´) (florece febrero a abril), Piscidiapiscipula (ja´bin) (florece marzo a abril), Acaciaangustissima (xáax x) (florece junio a agosto)y Mimosa bahamensis (sak káatsim) (florecejulio a noviembre), para su análisis molecular yutilizarlo como referencia de cada especie.

Extracción de ADN. La extracción de ADN deplantas se realizó empleando el kit comercialDNeasy Plant Mini (Qiagen®), siguiendo lametodología descrita por el proveedor. Laextracción de ADN de miel se realizó empleando50 g de miel por cada muestra distribuyéndose

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Primers. Seven previously published consensussequence primers were used to establish plantspecies amplification patterns(18), and thento identify these amplification patterns andtheir dissociation curves in the honey samples:1) non-coding tRNA-Leu chloroplastic DNAsequence of trnL (UAA) intron, consensus of 19species including algae, bryophytes, pteridophytes,gymnosperms and angiosperms(18,21) (Plant 1);2) nested Plant 1 sequence (Plant nest)(18);3) canola and sunflower actin (Act)(18); 4)sunflower profilin (Helli-all)(18); 5) canolalipase (Brass-lip)(18); 6) sorghum, rice andrye alcohol dehydrogenase (Adh1)(18); and7) cotton, pepper, tomato, potato and tobacco3-hydroxymethyl glutaryl CoA (Hmg2)(18).

qPCR Amplification. SYBR® Green systemamplification was done with the following reactionbuffer: 1X Fast Master mix SYBR® Green buffer(Applied Biosystems No. Cat. 4385612); 150 nMgeneric marker derived primers; and 100 ngDNA. Amplification conditions (equipment: ABIPRISM 7000, Applied Biosystems) were: 1 cycleat 95 °C for 20 sec (pre-denaturation); 40 cyclesat 95 °C for 3 sec (denaturation); and 1 cycleat 60 °C for 30 sec (alignment and extension).After amplification, a dissociation curve (fusiontemperature curve [Tm]) analysis was run toverify the presence of specific and non-specificproducts according to the fusion temperatureof each reaction(22,23). Each plant and honeyDNA sample was amplified in triplicate toestablish amplification pattern consistency.

In order to verify homogeneous DNA concen-trations TaqMan® 18S (human18s rRNA No. Cat.4319413E, Applied Biosystems) commercialprobe was used as internal control, togetherwith the TaqMan® Universal PCR Master Mix IIwith UNG (No. Cat. 4440038, Appl iedBiosystems) mixture. Reaction elements withoutDNA template were used as a negative control.

RESULTS

The internal control (18S) amplification curvesvalidated the standard DNA concentration and

en 4 tubos de 50 ml (NALGEN®), se agregaronaproximadamente 30 ml de agua dobledestilada-estéril, y se incubó en baño María a40 ºC durante 15 min. Posteriormente cadatubo se agitó por inversión y se centrifugó a10,000 xg por 15 min, hasta obtener unsedimento (trazas de polen). A partir de estepunto se siguió el protocolo de extracción deADN de trazas de polen en miel publicado porla Oficina Federal de Protección al Consumidory Seguridad Alimentaria de la Unión Europea(2011), con modificación en el laboratorio deCultivo de Tejidos Vegetales e IngenieríaGenética del Campo Experimental Bajío delINIFAP. La concentración de ADN osciló entre40 y 200 ng/L, dependiendo del contenido depolen por muestra de miel.

Iniciadores. Se utilizaron siete iniciadores desecuencias consenso publicadas previamente porLaube et al(18) para establecer los patrones deamplif icación de especies vegetales, yposteriormente identificar estos patrones deamplificación y sus curvas de disociación en lasmuestras de miel: 1) secuencia no codificantede DNA cloroplástico tRNA-Leu de cloroplastotrnL (UAA) intrón consenso de 19 especiesincluyendo algas, briofitas, pteridofitas,gimnospermas y angiospermas(18,21) (Plant 1),2) secuencia anidada de Plant 1 (Plant nest)(18),3) Actina de canola y girasol (Act)(18), 4) Profilinade girasol (Helli-all)(18), 5) Lipasa de canola(Brass-lip)(18), 6) Alcohol deshidrogenasa desorgo, arroz y centeno (Adh1)(18) y 7) 3-hidroximetilglutaril CoA de algodón, chile, tomate, papay tabaco (Hmg2)(18).

Amplificación qPCR. La amplificación se realizóempleando el sistema SYBR Green a través dela siguiente mezcla de reacción: buffer FastMaster mix SYBR Green (Applied BiosystemsNo. Cat. 4385612) 1X, iniciadores derivados delos marcadores genéricos (150 nM) y ADN (100ng). Las condiciones de amplificación requeridaspara el equipo ABI PRISM 7000 (AppliedBiosystems) fueron 1 ciclo a 95 °C por 20 seg(pre-desnaturalización), seguido de 40 ciclos a95 °C durante 3 seg (desnaturalización) y 60 °C

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quality for executing the following reactions withthe generic metabolic gene primers. Theestablished concentration was 50 ng/reaction,which resulted in amplification between cycles17 and 20, the least amount of separationbetween replicates, increasing reliability amongreactions (Figure 1).

Amplification of generic genes in studied plantspeciesPrimer Plant 1 exhibited amplification in all theplant DNA samples, but not in the negativecontrol (Figure 2A). Amplification of the Plantnest primer was also observed in all five species.However, differences in amplification cycles werepresent between different species; that is, Plantnest primer exhibited greater similarity with M.bahamensis, G. floribundum and A. angustissimathan with P. piscipula and V. dentata (Figure2B).

NTC

P. piscipula, G. floribundum, V. dentata, M. bahamensis y A.

por 30 seg (alineación y extensión). Al finalizarla amplificación se realizó un análisis de lascurvas de disociación (curva de temperatura defusión (Tm)) para verificar la presencia deproductos específicos e inespecíficos según latemperatura de fusión que posean(22,23). Cadamuestra de ADN de planta y de miel se amplificópor triplicado para establecer la consistenciadel patrón de amplificación.

Como control interno para verif icarconcentraciones homogéneas se utilizó la sondacomercial TaqMan 18s (human18s rRNA No. Cat.4319413E Applied Biosystems) utilizando lamezcla TaqMan Universal PCR Master Mix IIwith UNG (No. Cat. 4440038 Appl iedBiosystems). El control negativo consistió delos elementos de reacción sin ADN molde.

RESULTADOS

Las curvas de amplificación del control interno(18S) validaron la calidad la concentración deADN estándar para el desarrollo de lasreacciones subsecuentes con los iniciadores degenes metabólicos genéricos. La concentraciónestablecida fue de 50 ng/reacción, presentandoamplificación entre los ciclos 17 y 20, teniendomenor diferencia de separación entre cada unade las réplicas, incrementando la confiabilidad dehomogeneidad de una reacción a otra (Figura 1).

Amplificación de genes genéricos en especiesvegetales melíferas

El iniciador Plant 1 mostró evidencia deamplificación en todas las muestras de ADN deplantas, no así para el control negativo sin ADNmolde (Figura 2A). La amplificación con losiniciadores Plant nest también mostróamplificación en todas las especies; sin embargo,se observó un diferencial en los ciclos deamplificación entre las diferentes especies, esdecir, la secuencia de iniciadores de Plant nestdemostró tener mayor similitud en las especiesM. bahamensis , G. floribundum y A.angustissima que en P. piscipula y V. dentata(Figura 2B).

Figura 1. Curvas de amplificación qPCR del genconstitutivo 18S (control interno) de ADN de plantas(Piscidia piscipula, Gymnopodium floribundum, Viguieradentata, Mimosa bahamensis y Acacia angustissima)(Software 7000 SDS v 1.2.3, Applied Biosystems)Figure 1. qPCR amplification curves for the 18Sconstitutive gene (internal control) of plant DNA (Piscidiapiscipula, Gymnopodium floribundum, Viguiera dentata,Mimosa bahamensis and Acacia angustissima) (7000 SDSv 1.2.3 software, Applied Biosystems)

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Primers Act, Brass-Lip and Helli-all amplified inall plant DNA samples in a range of differentcycles (Figure 2C, 2D AND 2F). Primer Hmg2amplified in M. bahamensis, V. dentata, G.floribundum and A. angustissima, but did notamplified in P. piscipula (Figura 2E). Noamplification was observed with the Adh1primers in any of the five studied plant species.

E

M. bahamensis

A. angustissima G. floribundum

NTC P. piscipula

V. dentata

C

A. angustissima

V. dentata G. floribundum

P. piscipula y M. bahamensis

NTC

NTC

M. bahamensis

G. floribundum

P. piscipula

B

A. angustissima

V. dentata

F

NTC

M. bahamensis V. dentata

A. angustissima

G. floribundum y P. piscipula

NTC

P. piscipula

M. bahamensis

G. floribundum y V. dentata

D

A. angustissima

NTC

A. angustissima

V. dentata

G. floribundum

P. piscipula M. bahamensis

A

Los iniciadores del gen Actina, Bras-lip y Helli-all evidenciaron amplificación en todas lasmuestras de ADN de plantas en un rango deciclos diferenciales (Figura 2C, 2D y 2F). Conlos iniciadores Hmg2 se observó unaamplificación para las muestras de plantas M.bahamensis, V. dentata, G. floribundum y A.angustissima, mientras que P. piscipula no

Figura 2. Curvas de amplificación qPCR de ADN de plantas (V. dentata, G. floribundum, P. piscipula, A. angustissimay M. bahamensis) con el sistema SYBR Green. Iniciadores A) Plant 1; B) Plant nest; C) Actina; D) Brass-lip; E) HMG; F) Helli-all. NTC control negativo sin ADN (Software 7000 SDS v 1.2.3, Applied Biosystems)

Figure 2. qPCR amplification curves for the five studied plant species (Piscidia piscipula, Gymnopodium floribundum,Viguiera dentata, Mimosa bahamensis and Acacia angustissima) using the SYBR® Green system. Primers:A) Plant 1; B) Plant nest; C) Actin; D) Brass-lip; E) Hmg2; and F) Helli-all. NTC = negative control withoutDNA (7000 SDS v 1.2.3 software, Applied Biosystems)

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PCR amplification product and dissociationcurve analysis in plant speciesA single curve for each species was observed inthe analysis of dissociation curves derived fromthe Plant 1 amplification, when compared tothe fluorescence derivative (maximum curvepeak corresponded to product fusiontemperature - Tm). Variation below the curvewas associated with the number of gene copiesin each species (Figure 3A). Temperature andfluorescence values also varied between specieswith the Plant nest primer and single dissociationcurves for each of the five plant species wereobserved (Figure 3C). This confirms that use ofPlant nest reduced the spectrum of similaritybetween species, making detection moreaccurate. However, even though all five speciesshowed amplification, the negative controlamplified as well. This non-specific amplificationmay have been caused by primer dimerformation, which made Plant nest primerunsuitable for this purpose.

Dissociation curves obtained with Act primerexhibited a single product in all five plantspecies, with variations in temperature andfluorescence. This eliminates the possibility ofcrossed amplification (Figure 3E). Brass-lipprimer on the other hand, gave single productsfor M. bahamensis and A. angustissima (Figure3G). Curves for G. floribundum, V. dentata andP. piscipula exhibited two or more non-specificcurves due to the non-specific binding of theprimer to the genome sequences in these threespecies.

When using Hmg2 primers single curves wereobserved for A. angustissima and G. floribundum(Figure 3I). The fluorescence values producedfor Hmg2 gene were relatively lower than theother genes, reducing the size of the area belowthe curve. This may have been a result of aconsiderably lower number of Hmg2 gene copiesin the plant species under study, even thoughthere was specificity in the sequences.

Finally, Helli-all primers produced single curvesfor G. floribundum and V. dentata (Figure 3K).

mostró amplificación (Figura 2E). Finalmente,no se observó evidencia de amplificación conlos iniciadores Adh1 de alcohol deshidrogenasaen ninguna de las especies de planta bajoestudio.

Análisis de curvas de disociación de losproductos de amplificación en especies floralesEn las curvas de disociación derivadas de laamplificación con iniciadores Plant 1 se observóun producto específico para cada una de lasespecies, respecto a la derivada de fluorescencia(el pico máximo de la curva correspondiente ala temperatura de fusión (Tm) del producto)con una variación en las áreas bajo la curvaasociado al número de copias del gen en cadauna de las especies (Figura 3A). Al igual quePlant 1, cuando se empleó el iniciador Plantnest, la temperatura y el valor de la fluorescenciavariaron entre las especies; observándose unproducto específico en las curvas de disociaciónpara las cinco especies de plantas (Figura 3C).De esto se confirma que Plant nest reduce elespectro de similitud entre las especies,haciendo más precisa la detección. Sin embargo,es de notar que aun cuando hay amplificaciónen todas las especies, el control negativo (sinADN molde) también presentó amplificación, loque establece un fenómeno de amplificacióninespecífica derivado posiblemente de formaciónde dímeros entre los iniciadores eliminando laposibilidad de emplear al iniciador Plant nest.

Los resultados de la amplificación empleandolos iniciadores Act del gen actina, muestranque las curvas de disociación muestran un soloproducto en todas las especies con variantesen la temperatura y fluorescencia, eliminandoasí las posibilidades de amplificación cruzada(Figura 3E).

En la curvas de disociación para el iniciadorBrass-lip, las especies que obtuvieron unproducto específico fueron M. bahamensis y A.angustissima (Figura 3G). Las muestras G.f lor ibundum , V. dentata y P. piscipulapresentaron dos o más productos inespecíficos,

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Figura 3. Comparación del patrón de curvas de disociación producto de la amplificación con iniciadores de genes genéricos en plantasA: Cloroplasto trnL (UAA) intrón (Plant 1); C: Cloroplasto trnL (UAA) intrón (Plant nest); E: Actina (Act); G: Lipasa (Bras lip);I: 3-hidroxi metilglutaril CoA (Hmg2); K: Profilina (Helli all) y mieles B: Cloroplasto trnL (UAA) intrón (Plant 1); D: CloroplastotrnL (UAA) intrón (Plant nest); F: Actina (Act); H: Lipasa (Bras lip); J: 3-hidroxi metilglutaril CoA (Hmg2); L: Profilina (Helli all)(Software 7000 SDS v 1.2.3, Applied Biosystems)

Figure 3. Comparison of dissociation curve patterns of amplification products generated with five generic gene plant primers in plantspecies and honey samples. Plant species: A) Chloroplast trnL (UAA) intron (Plant 1); C) Chloroplast trnL (UAA) intron (Plantnest); E) Actin (Act); G) Lipase (Brass lip); I) 3-hidroxymethyl glutaryl CoA (Hmg2); and K) Profilin (Helli all). Honey samples:B) Chloroplast trnL (UAA) intron (Plant 1); D) Chloroplast trnL (UAA) intron (Plant nest); F) Actin (Act); H) Lipase (Brass lip);J) 3-hidroxymethyl glutaryl CoA (Hmg2); and L) Profilin (Helli all) (7000 SDS v 1.2.3 software, Applied Biosystems)

NTC

G. floribundum

M. bahamensis

A. angustissima

D

M-3 y M-13

M-4, M-7, M-8 y M-12

M-11 y M-1

M-14 y M-15

NTC

V. dentata

NTC

M. bahamensis G. floribundum

A. angustissima

V. dentata P. piscipula

C

P. piscipula

NTC

M-1

M-14

M-3

M- 4 M-7

M-8

M-11

M-12

M-13

M-15

Ba

A. angustissima

P. piscipula

V. dentata G. floribundum

M. bahamensis

NTC

E

NTC

M-3

M-1

F

NTC, M-1, M-7, M-12, M-13, M-14 y M-15

M-8

M-3

H

M. bahamensis

A. angustissima

G

NTC

J

M-15

M-14

NTC

M-3 M-4

G. floribundum

A. angustissima

I K

NTC

G. floribundum V. dentata

M-13

M-3

L

A

498


Fusion temperature values differed for M.bahamensis, P. piscipula and A. angustissima,and non-specific or single curves were recordedfor these species.

PCR amplification product and dissociationcurve analysis in honey samplesAfter analyzing the dissociation curves for thestudied plant species, the dissociation curvesderived from honey samples DNA amplificationwere analyzed and compared to the plantcurves. Simi lar ly to plant species, noamplification was observed with the Adh1 primerin all honey samples. This confirms thatgraminea species (i.e. grasses and cereals) werenot part of the botanical composition of thestudied honey samples. All the honey DNA samplesexhibited amplification with the Plant 1 primer,although, based on the dissociation curves, nosingle product was generated in any of thehoney samples (Figure 3B).

The same held true for the Plant nest primerswhere amplification was observed in all honeysamples, but no single dissociation curvesobtained., Negative control also exhibitedamplification, indicating formation of dimersbetween primers and thus eliminating thepossibility of using these primers for accuratedetection (Figure 3D).

Act primer produced amplification in all honeysamples. In the dissociation curve analysis,sample M-1 exhibited a specific product at 76.9°C with 0.11 fluorescence, probably due to thepresence of V. dentata. Sample M-3 had aspecif ic product at 73.3 °C with 0.13fluorescence, in this case probably due to thepresence of M. bahamensis (Figure 3E). Thiswas confirmed by the palynological analysis,which identified the presence of V. dentata inM-1 and M. bahamensis in M-3.

Honey samples M-3, M-4, M-8 and M-11amplified with Brass-lip primers, however, onlyM-3 and M-8 had a single curve, both at 70.2°C and 0.5 fluorescence; indicating the presenceof M. bahamensis. This agrees with the

esto derivado de la unión no específica deliniciador a las secuencias en los genomas deestas especies de plantas.

La curva de disociación obtenida en laamplificación con los iniciadores Hmg2 seobservó un producto específico para A.angustissima y G. floribundum (Figura 3I). Seobservó que con este iniciador los valores defluorescencia son comparativamente más bajosque con los otros genes, haciendo que el áreabajo la curva sea menor, esto puede ser debidoa que el número de copias del gen Hmg2 esconsiderablemente menor en las especies deplantas estudiadas aun cuando hay especificidaden sus secuencias.

Finalmente, en las curvas de disociaciónobtenidas al amplificar con los iniciadores Helli-all, se observó un producto específico para laespecie G. floribundum y V. dentata (Figura3K). Las muestras de M. bahamensis, P. piscipulay A. angustissima presentaron un perfil dedesnaturalización diferente (valores detemperatura de fusión distintas) mostrandoproductos de amplificación inespecíficos.

Análisis de curvas de disociación de losproductos de amplificación en ADN de miel

Una vez realizado el análisis de las curvas dedisociación de las especies melíferas, seanalizaron y compararon las curvas dedisociación derivadas de los productos deamplificación de ADN de muestras de miel (datosno mostrados).

Nuevamente y al igual que ocurrió en ladetección en las especies de planta, no seobservó evidencia de amplificación con losiniciadores Adh1 en ninguna muestra de miel.Una vez más se confirmó que las especies degramíneas (pastos y cereales), no son parte dela composición taxonómica de las muestras demiel bajo estudio. Con el iniciador Plant 1 delgen cloroplasto trnL (UAA) intrón, se observóamplificación para todas las muestras de ADNde mieles, sin embargo, no se obtuvo un único

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palynological analysis, which resulted in 45.3 %M. bahamensis pollen grains presence (Figure 3H).The curve that defines amplification of A.angustissima DNA was not identified in any ofthe honey samples, but palynological analysisdid identify this species in M-3 (22.2 %) andM-4 (58 %).

Amplification using the Hmg2 primer wasobserved in all the honey samples except M-1and M-8. The curves indicated that honeysamples M-3 and M-4 had a single product withcurve characteristics (temperature/fluorescence)similar to the curve from G. floribundum DNAamplification, suggesting that these two samplescontained pollen from this species. This agreeswith the honey collect date, the flowering periodof the species and the palynological analysis(Figure 3J). On the other hand, honey samplesM-14 and M-15 showed single curves at a highertemperature and fluorescence value than thoseobserved in M-3 and M-4 with the same Hmg2primer; the resulting curves for these honeysamples did not coincide with any of the curvesobtained with the Hmg2 primer for plants underanalysis.

The Helli-all primer resulted in amplification ofhoney samples M-3, M-4, M-7, M-11, M-12, M-13 and M-15. M-3 sample showed a single curvethat suggested a pattern similar to that of G.floribundum (Figure 3L). This coincides with theresult for this sample using the Hmg2 primer,suggesting the presence of this species in thissample (Figure 3J). Sample M-13 exhibited acurve similar to that for V. dentata (Figure 3L).

DISCUSSION

Characterization of floral origin in honeysproduced in Mexico using primers from genericmetabolic gene consensus sequences anddissociation curve analysis provides newanalytical support for melissopalynology as partof an initial detection stage.

SYBR® Green fluorophore tends to adhere toany amplified product, either the target

producto para ninguna muestra de miel deacuerdo al análisis de las curvas de disociación(Figura 3B).

El iniciador Plant nest del gen de cloroplastotrnL (UAA) intrón, también mostró amplificaciónpara todas las mieles, asimismo, este iniciadorconservó el patrón de curvas de disociación dela amplificación de ADN de todas las plantascoincidiendo con las mieles; sin embargo, elcontrol negativo (sin ADN molde) tambiénmostró amplificación, evidenciando así laformación de dímeros entre iniciadores yeliminando la posibilidad de hacer una detecciónconfiable con estos iniciadores (Figura 3D).

Cuando se emplearon los iniciadores Act delgen actina se observó amplificación para todaslas muestras de miel; sin embargo, en el análisisindividual de las curvas de disociación, lamuestra de miel M-1 mostró un productoespecífico a 76.9 ºC con una fluorescencia 0.11,con la probable presencia de la especie V.dentata, mientras que la muestra M-3 obtuvoun producto específico a 73.3 ºC con unafluorescencia de 0.13 con la oportunidad depresencia de M. bahamensis (Figura 3E). Estose confirmó con el análisis palinológico, el cualindicó la presencia de V. dentata y M.bahamensis en las muestras M-1 y M-3,respectivamente.

El iniciador Brass lip que amplifica el gen lipasamostró amplificación para las mieles M-3, M-4,M-8 y M-11; sin embargo, en el análisis de lascurvas de disociación las muestras M-3 y M-8fueron las muestras que presentaron un soloproducto específico a 70.2 ºC y con unafluorescencia de 0.5. Esto indicó la presenciade M. bahamensis coincidiendo en el análisispalinológico encontrando un 45.3 % de gránulosde dicha especie en la muestra (Figura 3H). Esde hacer notar que la curva de disociación queacota la amplificación de ADN de A. angustissimano fue obtenida para ninguna de las mieles, noobstante que mediante el análisis palinológico,esta especie sí se encontró en M-3 (22.2 %) yM-4 (58 %).

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Cuando se empleó el iniciador Hmg2 del gen 3-Hidroximetilglutaril CoA se observó amplificaciónen todas las muestras de miel excepto en M1y M8. La curva de disociación indica que lasmuestras M-3 y M-4 presentaron un productoespecífico similar en características a la curvade disociación (temperatura/ fluorescencia) dela amplificación de ADN de G. floribundum,sugiriendo que estas dos muestras de mielcontienen la especie; coincidiendo con la fechade colecta de la miel, la floración de esta especiey el análisis palinológico (Figura 3J). Es deresaltar que con el iniciador Hmg2, las muestrasde miel M-14 y M-15 muestran presencia de unproducto específico a una temperatura mayor ya una fluorescencia también superior a laobtenida en las muestras M-3 y M-4; lascaracterísticas de estas curvas de disociaciónno tienen precedente en la caracterización deninguna de las especies melíferas analizadascon este iniciador en el presente trabajo,

La amplificación con los iniciadores Helli-all quecodifican al gen profilina se obtuvo para lasmuestras de miel M-3, M-4, M-7, M-11, M-12,M-13, M-15. La curva de disociación mostrópresencia de un producto específico para lamiel M-3 similar al patrón obtenido de la curvade la especie G. floribundum (Figura 3L). Esteresultado coincide y ratifica al obtenido con eliniciador Hmg2 donde se sugiere la presenciade esta misma especie (Figuras 3J). Por suparte la muestra de miel M-13 mostró unacurva de disociación semejante al patrón de lacurva de disociación de la especie V. dentata(Figura 3L).

DISCUSIÓN

La identificación del origen floral de las mielesproducidas en México por medio de la utilizaciónde iniciadores provenientes de secuenciasconsenso de genes metabólicos genéricos y elanálisis con curvas de disociación establecenuna nueva posibil idad de apoyo a lamelisopalinología en una primera etapa dedetección cualitativa.

sequence or a non specific DNA sequence,adding up all these signals and producing asingle amplification curve. The amplificationpattern cannot be used directly to determinespecificity, but dissociation curve analysisprovides information of a specific amplification.In a dissociation curve, fluorescence decreasesgradually as temperature increases(23). Byanalyzing these dissociation temperature (orfusion) curves, specific products can be identifiedsince curve shape is related to GC (guanineand cytosine) content, and amplicon size andsequence(22).

The seven sets of primers from generic genesequences used here, generated specificamplification patterns even though thesesequences are highly conserved in multiplebiological families and different kingdoms. Thechloroplast trnL (UAA) intron gene, the basefor the Plant 1 and Plant nest primers, amplifiedthe DNA samples from all five studied plants.However, this result did not agree with thedissociation curve analysis, which showed non-specificity with the target sequence in the honeysamples DNA. One possible explanation is thatsince pollen is a masculine germinal cell it haslow probabilities of containing plastids (cells fromthe maternal line), thus limiting identification ofDNA chloroplastic sequences from honeysamples(24). These results contrast with Laubeet al(18), who established that this multicopysequence found in the chloroplast gene wasadequate for detecting low DNA levels in plantsand is therefore apt for detecting plant DNA inhoney.

Amplification and dissociation curve analysis withAct primer identified V. dentata in honey sampleM-1 and M. bahamensis in sample M-3. Viguieradentata blooms between December and January,which coincides with the collect date of sampleM-1 (24 January 2013), and the palynologicalanalysis (7.5 % V. dentata). This proportion ofpollen in honey sample M-1 indicates “minorimportant pollen” according to the InternationalApiculture Botanical Commission (ComisiónInternacional Botánica Apícola)(19). However, the

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fact that the Act primer detected such low levelsof pollen content indicates that this primer ishighly efficient; being difficult to detect theseamounts using traditional methods. Two specieswere detected in the M-3 sample, M. bahamensis(Act and Brass-lip) and G. floribundum (Hmg2and Helli-all). Nonetheless, it was classified asa M. bahamensis monofloral because this speciesaccounted for 65 % of the pollen grains, making itthe predominant pollen in the melissopalynologicalanalysis. Its dominance in this sample coincideswith this species’ flowering period and the collectdate of honey sample. Brass-lip primer confirmedthe presence of M. bahamensis in M-8 withfusion temperatures similar to those for thisspecies, but the area below the curve was lessthan that detected for M-3, indicating a lowerpollen content.

Both Hmg2 and Helli-all primers confirmed thepresence of G. floribundum in honey sampleM-3. This validates the presence of this speciesin this honey sample, as well as identifying twogeneric metabolic genes that produce consistentresults, providing additional primers for verificationof honey botanical source. Although these genescome from distant plant families (Asteraceae forHelli-all, and Solanaceae for Hmg2), there maybe high sequence similarity between the profilin(Helli-all) and 3-hydroxylmethyl glutaryl CoA(Hmg2) genes and their homologues in G.floribundum. For instance, profilin (PRF4) fromthe Arabidopsis profilins family exhibit greatersimilarity to the profilins from other species thanto the other three Arabidopsis profilins (PRF1,PRF2, PRF3)(25). At the amino acid level, PRF4was 78.6 to 82.4 % identical to the pollen-specific profilins of monocotyledons such as Zeamays (corn), Phleum pratense (Timothy grass),Betula verrucosa (silver birch), Nicotianatabacum (tobacco) and Triticum aestivum(wheat).

Hmg2 showed a single dissociation curve inhoney samples M-14 and M-15, however, thisspecific product was not observed in any of thestudied plant species; its temperature in thedissociation curves was far higher than those

El fluoróforo SYBR® Green suele adherirse acualquier producto amplificado sea éste elproducto blanco o no-blanco, y todas estasseñales se suman produciendo una sola curvade amplificación, por lo que el patrón deamplif icación no puede ser empleadodirectamente para determinar especificidad. Paraestablecer esta especificidad es convenienterealizar un análisis curvas de disociación. Enuna curva de disociación la fluorescencia decrecede forma gradual a medida que aumenta latemperatura(23). Mediante el análisis de lascurvas de la temperatura de disociación (curvasde fusión) es posible identificar productosespecíficos, cuya forma se relaciona con elcontenido de GC (guanina y citosina), tamañode los amplicones y la secuencia de losmismos(22).

De los siete pares de iniciadores provenientesde secuencias de genes genéricos, fueinteresante observar los diferentes patrones deamplificación aun cuando estas secuencias sonaltamente conservadas en múltiples organismosde familias y reinos divergentes. En un primeranálisis se establece que el gen Cloroplasto trnL(UAA) intrón, que conformó la base para eldiseño de los iniciadores Plant 1 y Plant nest,amplifican en las muestras de ADN de las cincoespecies de plantas bajo estudio; sin embargo,este resultado no concuerda cuando lasmuestras de miel son sometidas a escrutinio desus curvas de disociación, al mostrarinespecificidad de la secuencia blanco con lascontenidas en las muestras de ADN extraídasde miel. Una posible explicación es que el polenal ser una célula germinal masculina tiene muybajas probabilidades de contener plastidios(células de herencia materna) limitando así laidentificación de secuencias cloroplásticas enADN proveniente de las muestras de miel(24).Lo anterior contrasta con lo publicado por Laubeet al(18), quienes afirman que esta secuenciamulticopia en cloroplasto fue adecuada para ladetección de bajos niveles de ADN en plantas,siendo aplicable para la detección de ADN deplantas en la miel.

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Durante el análisis con el iniciador Act del genactina, se encontró la presencia de V. dentataen la miel M-1 y M. bahamensis en la miel M-3.La especie V. dentata se produce entre el mesde diciembre y enero coincidiendo con la fechade colecta (24/01/2013) de la muestra M-1 ycon el análisis palinológico, mediante el cual seencontró un porcentaje del 7.5 % de la especie.El porcentaje de polen de esta especieencontrado en la miel se considera como “polenminoritario importante” de acuerdo a la ComisiónInternacional Botánica Apícola(19); sin embargo,el hecho que el iniciador Act del gen actina lohaya detectado es muy positivo, ya que podríaidentificarse dicha especie en muy bajosporcentajes difíciles de detectar por el métodotradicional. La miel M-3 de la cual se detectarondos especies M. bahamensis (Act y Brass-lip) yG. floribundum (Hmg2 y Helli-all) se clasificócomo monofloral de la especie M. bahamensis,ya que los gránulos se encontraron en unporcentaje del 65 % considerado como “polenpredominante” por el análisis melisopalinológico,coincidiendo con la fecha de floración de laespecie y la de colecta de la miel. De manerasimilar, Brass lip confirmó la presencia deM. bahamensis en la muestra M-8 contemperaturas de fusión similares a las obtenidaspara la especie; pero con un área bajo la curvainferior a M-3 indicando contenidos bajos deesta especie.

Los iniciadores Hmg2 y Helli-all confirmaron lapresencia de G. floribundum en la muestraM-3, corroborando no solo la presencia de laespecie en la muestra de miel, sino que ademásse reportan dos genes metabólicos genéricosque son consistentes en los resultados,proporcionando con esto iniciadores adicionalesde verificación. Es interesante notar que si bienestos dos genes provienen de familias distantes(Asteraceae en el caso del iniciador Helli-all ySolanaceae, en el caso de Hmg2), es muyposible que haya una alta similaridad desecuencias entre los genes profilina (Helli-all) y3-hidroxi metilglutaril CoA (Hmg2) con suscontrapartes homólogas en G. floribundum. Eneste sentido de acuerdo con Huang et al(25)

for the five plant species. These two honeysamples were collected at the end of theflowering period of the principal plant speciesused in honey production. The sequencesimilarity of these primers are probablyassociated with secondary species in this cyclesuch as Mimosa pudica, Acacia gaumeri, Burserasimaruba, Pithecellobium albicans, Senna pallida,Guazuma ulmifolia, Lysiloma latisiliquum andLeucaena leucocephala, among others.

Overall, the most frequent species in the studiedhoney samples were V. dentata, G. floribundumand M. bahamensis, which bloom for the longestperiods among the five analyzed plant species.Acacia angustissima and P. piscipula were notdetected in any of the honey samples, mostlikely because they bloom for only a very shortperiod during the flowering season.

The results indicate that amplification patternswere successfully established for the five studiedplant species based on their florescence derivatives.These patterns could then be compared to thepatterns detected in honey samples for pollensource identification. Three of the main speciespresent during the season of honey productionwere identified. Four of the genes (profilin,lipase, 3-hydroxylmethylglutaryl CoA, and actin)contained useful sequences for plant speciesidentification based on amplification patternswhich were then validated on honey samplesto estimate the presence of one or more plantspecies.

None of the five plant species were identified insamples M-7, M-11 and M-12, even though thesamples were collected during these species’flowering period. This was confirmed by thepalynological analysis results in whichAsteraceae, Malvaceae and Fabaceae specieswere identified. Similarly, honey samples M-14and M-15, which exhibited a distinctamplification pattern possibly related to speciesnot included in the present analysis, showedthe presence of Lysiloma bahamensis, Mimosapudica and Acacia gaumeri after thepalynological.

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una de las profilinas que conforman parte de lafamilia de profilinas de Arabidopsis (PRF4)presentó mayor similitud con otras especies quecon las otras tres profilinas de Arabidopsis(PRF1, PRF2, PRF3). A nivel aminoácido PRF4fue 78.6 a 82.4 % idéntica a profilinas de polen-específico de monocotiledóneas como Zea mays(maíz), Phleum pratense (hierba timotea), Betulaverrucosa (abedul blanco), Nicotiana tabacum(tabaco) y Triticum aestivum (trigo).

La muestras de miel M-14 y M-15 amplificaronel gen 3-hidroxi metil glutaril CoA (Hmg2); sinembargo, se trata de un producto específicoque no se observó en la amplificación deninguna de las especies estudiadas por tenertemperatura muy superior a la obtenida paralas otras especies en el análisis de las curvasde disociación; además es importante resaltarque estas muestras fueron colectadas al finaldel periodo de producción de las principalesespecies florales de importancia apícola, por loque se considera que la similitud de estosiniciadores está asociada a otras especiessecundarias encontradas en el mismo ciclo, comoMimosa pudica, Acacia gaumeri, Burserasimaruba, Pithecellobium albicans, Senna pallida,Guazuma ulmifolia, Lysiloma latisiliquum yLeucaena leucocephala, entre otras.

En general, las especies que mostraron mayorfrecuencia en las muestras de miel fueronV. dentata (tajonal), G. floribundum (t´sit´silche´)y M. bahamensis (sak káatzim), estas tresespecies tienen presencia floral por más tiempoa lo largo del año; mientras que A. angustissima(xáax x) y P. piscipula (ja´bin) no presentaronevidencia de presencia en ninguna muestra demiel, debido probablemente a que estas especiesflorecen por periodos muy cortos en latemporada de floración.

De acuerdo con nuestros resultados fue posibleestablecer el patrón de amplificación de las cincoespecies bajo estudio de acuerdo a la derivadade la fluorescencia en cada producto deamplificación, y con ello comparar el patrónobtenido para cada una de las mieles estudiadas.

In the present results, V. dentata was identifiedby the genes actin and profilin, M. bahamensisby the genes actin and lipase, and G.floribundum by the genes Hmg2 and profilin.Acacia angustiss ima was detected viapalynological analysis at very low percentagesin honey samples M-4 (6.2 %), M-8 (2.0 %)and M-12 (0.5 %). These levels were probablybelow the detection limit of the markers usedin the genetic analysis.

Use of primers other than those used in thepresent analysis, with a broad similarity inmetabolic function, could help to establishamplification patterns for P. piscipula and A.angustissima. In addition, design of new geneamplification primers that do not amplify any ofthe studied plant species or honey samples (e.g.Adh1) could be part of a strategy to identifyother plant species on the Yucatan Peninsula.

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

The amplification results as well as the analysisof the dissociation curves for the studied plantspecies and honey samples, demonstrated thata single gene could be used to detect morethan one species (e.g. actin and profilin) in thesame sample. Two different genes can alsodetect the same species in the same sample(e.g. actin and lipase for M. bahamensis, Hmg2and profilin for G. floribundum), thus confirmingand reinforcing detection results. Finally, actinand prof i l in gene sequences l inked tometabolic activity of cell wall function canindependently identify the same species (e.g.V. dentata) in honey samples harvested atdifferent times. The detection system presentedhere, using DNA amplification with generic geneconsensus sequences, is an effective protocolthat can support melissopalynology analysisin identifying pollen content of specific plantspecies in honey.

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En este sentido se obtuvo evidencia de la presenciade tres de las especies de mayor importancia enel ciclo apícola. De esto observamos que los genesprofilina, lipasa, 3-hidroxi metilglutaril CoA y enmayor medida actina, están conformados desecuencias útiles para identificar patrones deamplificación en cada especie y compararlascon las obtenidas en mieles para unaaproximación de la posible presencia de una omás especies.

Se encontró que, aun cuando las muestras demiel se cosecharon dentro de los periodos defloración de las cinco especies estudiadas, nose detectó la presencia de dichas especiesvegetales en las muestras de miel M-7, M-11 yM-12, confirmando dichos resultados con losanálisis palinológicos, donde se observarondiferentes especies de Asteraceae, Malvaceae yFabaceae principalmente. Por otra parte, aúncuando las muestras M-14 y M-15 no indican lapresencia de alguna de las cinco especies bajoestudio, demostraron tener un patrón deamplif icación diferente y posiblementerelacionado con especies no incluidas en nuestroanál is is, concordando con los anál isispalinológicos, ya que en dichas muestras demiel se detectaron especies como Lysilomabahamensis (tzalam), Mimosa pudica (xmuuts´)y Acacia gaumeri (box káatsim), entre las masimportantes.

La especie V. dentata fue identificada por losgenes actina y proflina, M. bahamensis por losgenes actina y lipasa; y G. floribundum por losgenes Hmg2 y prof ilina. Es importantemencionar que la especie A. angustissima sedetectó por palinología en las mieles M-4, M-8,y M-12 en muy bajos porcentajes (6.2, 2.0 y0.5 % respectivamente) lo cual probablementeestuvo debajo del límite de detección de losmarcadores utilizados.

Finalmente, para la caracterización de lasespecies endémicas que no fueron detectadaspor los iniciadores diseñados de secuenciasconsenso de genes metabólicos generales, seemplearán otros genes con características deamplia similitud en función metabólica a través

de especies, que pudieran establecer el patrónde amplificación e identificación de Piscidiapiscipula (ja´bin) y Acacia angustissima (xáaxx). Asimismo, el diseño de nuevos iniciadorespara la amplificación de genes que noamplificaron para ninguna especie o muestrade miel como el caso de Adh1, podrá estableceruna estrategia para la identificación de especiesimportantes de la Península de Yucatán.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Los resultados de amplificación y posteriorcomparación de curvas de disociación de plantasy muestras de miel, establecen que un sologen puede detectar más de una especie (actinay profilina), asimismo, dos genes diferentes enfunción pueden detectar la misma especie enuna misma muestra (actina y lipasa para M.bahamensis y Hmg y profi lina para G.floribundum), confirmando y reforzando con ellolos resultados de detección. Por otro lado,secuencias de genes ligados entre si, por suactividad metabólica en pared celular (actina yprofilina), identificaron independientemente lamisma especie (V. dentata) en muestras de mielde cosechas diferentes. De esta manera sepuede establecer que este sistema basado endetección por amplificación de ADN empleandosecuencias consenso de genes genéricos,constituye un nuevo protocolo de apoyo a lamelisopalinología para identificar contenido deespecies.

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