chinese journal of tissue engineering research november 19

中国组织工程研究第 17卷第 47期 2013–11–19出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research November 19, 2013 Vol.17, No.47 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.007 [http://www.crter.org] 张乃丽，张育敏，周沫，杨婷，王旭昇，马绍英，徐伟俊，董丽，李宝兴. 可塑形脱矿骨基质/透明质酸骨泥的制备与细胞相容性[J]. 中国组织工程研究，2013，17(47):8182-8188.

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 8182

www.CRTER.org

张乃丽☆，男，1980年生，山东省巨野县人，汉族，

南方医科大学在读博士，

助理研究员，主要从事医

用生物材料的研究。 [email protected] 通讯作者：李宝兴，研究

员，博士生导师，中国辐

射防护研究院，山西省医

用组织库，山西省太原市 030006 [email protected] 中图分类号:R318

文献标识码:B

文章编号:2095-4344

(2013)47-08182-07

修回日期：2013-08-18

(201302092/GW·W)

Zhang Nai-li☆, Studying for

doctorate, Assistant

investigator, Medical Tissue

Bank, China Institute for

Radiation Protection, Taiyuan

030006, Shanxi Province,

China

[email protected]

Corresponding author:

Li Bao-xing, Investigator,

Doctoral supervisor, Medical

Tissue Bank, China Institute for

Radiation Protection, Taiyuan

030006, Shanxi Province,

China

[email protected]

Accepted: 2013-08-18

可塑形脱矿骨基质/透明质酸骨泥的制备与细胞相容性*☆

张乃丽，张育敏，周沫，杨婷，王旭昇，马绍英，徐伟俊，董丽，李宝兴(中国辐射防护研究院，山西省医用组织库，山西省太原市 030006)

文章亮点：

1 应用预制成形的材料修复不规则骨缺损时，常出现材料与骨缺损形状不匹配的问题，制备可任意塑形骨泥对促进不规则骨缺损的愈合具有重要意义。实验应用脱钙骨基质复合不同比例的透明质酸，制备一种可

塑形脱钙骨基质/透明质酸骨泥，根据其黏度及抗离散时间选择最佳复合比例，评价其细胞相容性，初步探讨应用脱钙骨基质复合透明质酸制备可塑形骨泥的可行性。

2 将脱钙骨基质与透明质酸以 15∶1的比例复合时，既保证了骨泥中脱钙骨基质较高的含量，最大限度发挥脱矿骨基质骨传导及骨诱导活性，也保证了骨泥良好的可塑形能力及抗离散能力，有利于其修复不规则

骨缺损，但其修复骨缺损的实际效果，仍有待进一步动物体内修复骨缺损实验及临床实验证实。关键词：生物材料；材料生物相容性；骨组织构建；可塑形骨泥；脱钙骨基质；透明质酸；黏度；抗离散能力；细胞

相容性；骨修复材料；其他基金主题词：生物相容性材料；骨基质；透明质酸；组织相容性试验基金资助中国辐射防护研究院青年科技基金资助项目(YQ120807)*

摘要背景：应用预制成形的材料修复不规则骨缺损时，常出现材料与骨缺损形状不匹配的问题，制备可任意塑形

骨泥对促进不规则骨缺损的愈合具有重要意义。目的：构建可塑形脱钙骨基质/透明质酸骨泥，筛选最佳复合比例并评价其细胞相容性。方法：选取合格供体皮质骨制备脱钙骨基质。分别配置浓度为 0.75%，1.5%，3%，4.5%的透明质酸溶液并检测其黏度，以 450 mg脱钙骨基质与上述各浓度透明质酸溶液 1 mL混合，制备不同比例的脱钙骨基质/透明质酸骨泥。37 ℃条件下将骨泥浸泡在 PBS平衡液中，观察其离散时间，筛选最佳复合比例的脱钙骨基质/透明质酸骨泥。应用脱钙骨基质/透明质酸骨泥浸提液培养 L-929小鼠成纤维细胞，1，4，7 d采用 CCK-8法检测骨泥的细胞毒性。结果与结论：随透明质酸浓度的增加其溶液黏度增大，脱钙骨基质/透明质酸骨泥的离散时间延长，3%浓度的透明质酸与 450 mg脱钙骨基质复合制备的骨泥具有良好可塑形能力，离散时间为 8 h，为最佳复合比例。脱钙骨基质/透明质酸骨泥浸提液培养 L-929小鼠成纤维细胞 1，4，7 d的细胞增殖率分别为 93.72%，101.65%，97.68%，细胞毒性级别为 0或 1 级。表明脱钙骨基质/透明质酸复合质量比为 15∶1制备的骨泥具有良好的可塑形能力及抗离散能力，细胞毒性轻微。

Preparation and cell compatibility of malleable demineralized bone matrix/hyaluronic acid putty

Zhang Nai-li, Zhang Yu-min, Zhou Mo, Yang Ting, Wang Xu-sheng, Ma Shao-ying, Xu Wei-jun, Dong Li, Li Bao-xing (Medical Tissue Bank, China Institute for Radiation Protection, Taiyuan 030006, Shanxi Province, China)

Abstract BACKGROUND: It is important to prepare a malleable putty to repair irregular bone defects because the preformed bone substitute material cannot suit to bone defects. OBJECTIVE: To prepare malleable demineralized bone matrix/hyaluronic acid putty and to screen out the optimal composite ratio, as well as to evaluate its cell compatibility. METHODS: Demineralized bone matrix was prepared from the cortical bone of healthy donors. The hyaluronic acid was dissolved at concentrations of 0.75%, 1.5%, 3%, 4.5%, and the viscosity of them was measured. Then 450 mg demineralized bone matrix was compounded with 1 mL hyaluronic acid solution to prepare the demineralized bone matrix/hyaluronic acid putty, and the optimal ratio of demineralized bone matrix/hyaluronic acid was screened by the disintegrated time of the putty at 37 ℃. L-929 mouse fibroblasts were cultured in the leaching liquor of demineralized

张乃丽，等. 可塑形脱矿骨基质/透明质酸骨泥的制备与细胞相容性

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 8183

www.CRTER.org

bone matrix/hyaluronic acid, and the cytotoxicity was tested by cell count kit-8 assay at days 1, 4 and 7. RESULTS AND CONCLUSION: With the increase of hyaluronic acid concentration, the viscosity of hyaluronic acid solution was increased; the demineralized bone matrix/hyaluronic acid putty was strengthened and the disintegrated time was prolonged gradually. When the ratio of demineralized bone matrix/hyaluronic acid was 15/1, demineralized bone matrix/hyaluronic acid was molded easily, and the disintegrated time was 8 hours in 7 ℃ PBS. The results of cytotoxicity showed that cell proliferation rates were 93.72%, 101.65% and 97.68% at days 1, 4 and 7 respectively, while the cytotoxicity was in grade 0 or 1. These findings indicate that demineralized bone matrix/hyaluronic acid putty at a compound ratio of 15:1 can be molded easily and difficult to disintegrate, with low cytotoxicity. Subject headings: biocompatible materials; bone matrix; hyaluronic acid; histocompatibility testing Funding: the Youth Science and Technology Foundation of China Institute for Radiation Protection, No. YQ120807* Zhang NL, Zhang YM, Zhou M, Yang T, Wang XS, Ma SY, Xu WJ, Dong L, Li BX. Preparation and cell compatibility of malleable demineralized bone matrix/hyaluronic acid putty. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(47):8182-8188.

0 引言 Introduction 在临床骨科、口腔科及整形外科中应用预制成形的修

复材料填充骨缺损时，因修复材料与骨缺损形状不匹配，

填充不完全而留有死腔，从而导致骨延迟愈合或不愈合。

可塑形骨泥可根据骨缺损的形状任意塑形，在修复非承重

部位骨缺损或联合其他骨材料修复承重部位的骨缺损时

可有效填充骨缺损，促进骨缺损的修复愈合[1-2]。此外，

这类材料以液态、泥膏状或含有颗粒状材料的凝胶剂形式

提供到临床，植入时仅需要很小的切口进行微创手术治

疗，可有效减少手术过程中对患者的创伤[3-4]。

作为一种用于修复骨缺损的体内植入材料，可塑形

骨泥应具备以下特性：①良好的生物相容性，以保证其

在临床应用时的安全性。②良好成骨能力，即具有骨传

导能力和/或骨诱导能力，以保证其在临床应用中的治疗效果。③良好的可塑形能力，能在应用时任意塑形，充

分填充骨缺损。④一定的抗离散能力，保证其在植入体

内后不被体液冲散，保持在植入部位发挥骨修复作用。

⑤生物可降解性，具备与新骨生成相适应的降解速率，

以保证骨修复过程顺利完成[5]。

可塑形骨泥主要由成骨基质颗粒和黏性载体组成，这

两种组分直接决定着其理化性质及成骨能力[5]。脱钙骨基

质来源于天然骨组织，生物相容性好，含有天然的骨形态

蛋白，既有骨传导能力也有一定的骨诱导能力[6-12]。孙

晓雷等[7]观察牛松质骨脱细胞后骨基质的生物力学特性、

孔隙率及其黏附特性，探讨其作为组织工程骨天然支架材

料的可行性。结果显示牛松质骨脱细胞骨基质较完整地去

除了细胞的免疫原性，具有良好的骨组织工程支架材料力

学性质，接近生理结构的空隙直径及孔隙率，黏附性能满

足支架材料的要求。Urist等[8]在脱钙骨基质中发现提取了

骨形态蛋白并证实其具有骨诱导活性。Lee等[9]应用脱钙

骨基质颗粒修复大鼠颅骨缺损，在术后4，8，12周新骨生成量均高于对照组。Aspriello等[10]

研究证实单独应用脱

钙骨基质或复合其他骨修复材料应用均可显著改善骨修

复过程。Pietrzak等[11]证实脱钙骨基质中钙残余量为2%时

最有利于其吸收，成骨活性也最高。透明质酸是一种广泛存在于生物体内的大分子酸性

黏多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸双糖单位聚

合而成，其组织相容性好、黏性大、无毒性，具有抗氧化、

免疫调节、促进血管生成等生物活性，在炎症与伤口愈合、

组织再生及肿瘤形成等方面起着重要的调节作用[13-23]。目

前透明质酸及其衍生物已在临床上被广泛应用于促进伤

口愈合与修复、防止术后组织粘连、药物缓释等[24]。

实验应用脱钙骨基质复合不同比例的透明质酸，制备

一种可塑形脱钙骨基质/透明质酸骨泥，根据其黏度及抗离散时间选择最佳复合比例，评价其细胞相容性，初步探讨

应用脱钙骨基质复合透明质酸制备可塑形骨泥的可行性。 1 材料和方法 Materials and methods

设计：体外细胞学实验。时间及地点：于2011年10月至2012年8月在中国辐

射防护研究院医用组织库完成。材料：同种骨来源于合法捐献的合格供体，小鼠成

纤维细胞L-929系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，实验室冻存备用。

可塑形脱矿骨基质/透明质酸骨泥制备及细胞相容性实验

的主要试剂及仪器：

实验方法：

脱钙骨基质的制备：按山西省医用组织库标准选取合

仪器与试剂来源

透明质酸脱矿骨基质/海藻酸钠海藻酸钠 CCK-8 L-DMEM 胎牛血清酶标仪 CO2培养箱旋转式黏度计倒置相差显微镜真空冻干机

曲阜市广龙生物制品厂，中国中国辐射防护研究院青岛晶盐生物科技开发有限公司，中国 Dojindo，日本 Gibco，美国 Hyclone，美国 Bio-Rad，美国 Thermo，美国上海恒平科学仪器有限公司，中国 Olympus-IX71,日本 Dura-Top，美国



www.CRTER.org

格供体皮质骨，按Urist[25]方法，氯仿/甲醇(1∶1)室温浸

泡24 h脱脂，0.6 mol/L HCl溶液4 ℃浸泡48 h脱钙， 2.0 mol/L CaCl2溶液4 ℃浸泡24 h，去除低分子质量蛋白多糖等抗原性物质，0.5 mol/L EDTA溶液4 ℃浸泡4 h，去除非羟基磷灰石钙剂部分蛋白多糖，8.0 mol/L LiCl溶液4 ℃浸泡24 h，皱缩胶原纤维并去除部分高分子质量蛋白多糖，粉碎机粉碎、冻干、过筛，选取粒径为300- 800 μm的骨粉，两层隔菌塑料袋包装，60Co辐照，备用。

透明质酸溶液的配置：在超净工作台上精确称量透明

质酸，加入无菌滤过的pH值7.2的PBS平衡液，分别配置浓度为0.75%，1.5%，3.0%，4.5%的透明质酸溶液。

透明质酸溶液黏度的检测：在水浴中调节透明质酸溶

液温度至37 ℃，应用旋转式黏度计检测上述各浓度透明质酸溶液的黏度，每组设3个平行样本。

脱钙骨基质与透明质酸不同比例复合效果实验：在超净

工作台上，按每毫升透明质酸溶液中加入450 mg脱钙骨基质的比例，分别在0.75%，1.5%，3.0%，4.5%的透明质酸溶液中加入脱钙骨基质，用灭菌处理的玻璃棒混

匀，观察成形情况。不同比例脱钙骨基质/透明质酸骨泥的抗离散能力检测：

在超净工作台上，取相同体积的各组骨泥捏制成球形，

放入6孔培养板中，加无菌PBS平衡液10 mL，置入 37 ℃恒温箱中，观察各组骨泥完全离散的时间，模拟体内生理环境检测各组骨泥的抗离散能力，筛选脱钙骨

基质/透明质酸最佳混合比例。以质量比为7∶3脱矿骨基质/海藻酸钠复合材料为对照，每组设3个平行样本。

脱钙骨基质/透明质酸骨泥浸提液的制备：将上述筛选的

最佳比例配比脱钙骨基质 /透明质酸骨泥按质量比 0.1 g∶1 mL 无血清DMEM的比例，置于封闭容器内，37 ℃ 浸泡72 h，取出材料，将浸提液离心，取上清液加入体积分数为10%的胎牛血清备用[26]

。 L-929小鼠成纤维细胞的培养：复苏L-929小鼠成纤维

细胞，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养，待细胞汇聚约占培养瓶底80%，2.5 g/L胰酶消化传代，培养至第3代。收集第3代L-929细胞，调整细胞浓度为1×107 L-1

，100 μL/孔接种于96孔板，置入37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。

CCK-8法检测材料的细胞毒性：培养24 h后，将96孔细胞培养板中的细胞应用PBS洗涤2次，实验组加入 100 μL材料浸提液培养，对照组加入等量含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液。分别于培养的1，4，7 d每组取5孔平行样，每孔加入10 μL CCK-8液，继续培养5 h，用酶标仪测定在450 nm处吸光度(A值)。活细胞数量用A值表示，按公式计算细胞相对增殖率。细胞相对增殖率=实验组A值/对照组A值×100%，根据细胞相对增殖率结果对试样细胞毒性进行分级。根据医疗器械产品

细胞毒性评判原则，见表1[27]，细胞毒性0或1级为合格；

2级应结合细胞形态分析，综合评价；3，4级为不合格。主要观察指标：观察各浓度透明质酸的黏度及各浓度

比脱钙骨基质/透明质酸骨泥的完全离散时间，评估两者之间的关系，筛选最佳复合比例；通过细胞毒性级别评

价脱钙骨基质/透明质酸骨泥对L-929小鼠成纤维细胞增殖的影响。

统计学分析：计量资料用x_

±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，各组均数采用重复测量的方

差分析，若方差齐性，组间多重比较采用最小极差法

(LSD)，方差不齐，多重比较采用Tamhane’s T2法，检验水准为α=0.05。 2 结果 Results 2.1 透明质酸溶液黏度的检测各浓度透明质酸溶液均为无色透明的黏性液体，随浓度的增加其黏度明显增

大，呈无色透明凝胶，黏度检测结果显示0.75%，1.5%，3%，4.5%浓度透明质酸溶液在37 ℃温度下的黏度分别为 (4 424±111)， (13 186±326)， (81 441±1 871)， (179 683±2 845) mPa·s，各浓度组间比较差异有显著性意义(P=0)，见图1。

图 1 不同浓度透明质酸的黏度

Figure 1 Viscosity of hyaluronic acid at different concentrations

注：随浓度的增加透明质酸黏度明显增大，各浓度

组间比较差异有显著性意义。

表 1 细胞毒性反应分级

Table 1 The cytotoxic reacting grade

级别细胞相对增殖率(%)

0

≥100 1 80-99 2 50-79 3 30-49 4 0-29

透明质酸的浓度

黏度

(×10

4 m

Pa·

s)

20

15

10

5

0



www.CRTER.org

2.2 不同浓度透明质酸与脱钙骨基质的复合情况 0.75%透明质酸溶液组制备的骨泥较为稀薄，难以成形；1.5%透明质酸溶液组制备的骨泥可成形，但仍较稀薄；3%透明质酸溶液组制备的骨泥及脱矿骨基质/海藻酸钠复合材料(7∶3)容易成形，可捏成任意形状也无骨粉散落；4.5%透明质酸溶液组制备的骨泥易成形，但较硬，见图2。

2.3 不同比例脱钙骨基质/透明质酸骨泥的抗离散能

力检测 30 min时，0.75%透明质酸浓度组及对照组骨泥即开始离散、变形；1.5%透明质酸浓度组骨泥有少许膨大；3%及4.5%透明质酸浓度组骨泥无离散，形态保持良好，见图3。

2 h时，0.75% 透明质酸浓度组及对照组骨泥变为扁平丘形，有大量骨粉析出，几乎完全离散；1.5%透明质酸浓度组保持球形，部分骨泥离散；3%透明质酸浓度组骨泥少许膨大，少量离散；4%透明质酸浓度组少许膨大，无骨粉析出，见图4。

4 h时，对照组中的骨粉几乎完全析出；0.75%透明

质酸浓度组骨泥完全变形，但仍可成堆；1.5%透明质酸浓度组骨泥变成圆丘状；3%及4.5%透明质酸浓度组骨泥变成扁平球形，见图5。

图 2 不同浓度透明质酸与脱钙骨基质复合的骨泥

Figure 2 Bone putties composited by demineralized bone matrix with hyaluronic acid at different concentrations

注：0.75% 透明质酸溶液组制备的骨泥较为稀薄，难以成形；1.5% 透明质酸溶液组制备的骨泥可成形，但仍较稀薄；3% 透明质酸溶液组制备的骨泥及对照脱矿骨基质/海藻酸钠复合材料容易成形，可捏成任意形状也无骨粉散落；4.5% 透明质酸溶液组制备的骨泥易成形，但较硬。

图 3 脱钙骨基质与不同浓度透明质酸复合制备骨泥浸泡于PBS平衡液 30 min时的离散情况

Figure 3 Dispersion of demineralized bone matrix/hyaluronic acid putties immersed in PBS for 30 min

注：0.75% 透明质酸浓度组及对照脱矿骨基质/海藻酸钠复合骨泥即开始离散、变形；1.5% 透明质酸浓度组骨泥有少许膨大；3%及 4.5% 透明质酸浓度组骨泥无离散，形态保持良好。

图 4 脱钙骨基质与不同浓度透明质酸复合制备骨泥浸泡于PBS平衡液 2 h时的离散情况

Figure 4 Dispersion of demineralized bone matrix/hyaluronic acid putties immersed in PBS for 2 h

注：0.75% 透明质酸浓度组及对照脱矿骨基质/海藻酸钠复合骨泥变为扁平丘形，有大量骨粉析出，几乎完全离散；1.5% 透明质酸浓度组保持球形，部分骨泥离散；3% 透明质酸浓度组骨泥少许膨大，少量离散；4.5% 透明质酸浓度组少许膨大，无骨粉析出。



注：对照脱矿骨基质/海藻酸钠复合骨泥中的骨粉几乎完全析出；0.75% 透明质酸浓度组骨泥完全变形，但仍可成堆；1.5% 透明质酸浓度组骨泥变成圆丘状；3%及 4.5% 透明质酸浓度组骨泥变成扁平球形。



www.CRTER.org

12 h时，1.5%透明质酸浓度组骨泥完全离散；3% 透明质酸浓度组骨泥失去球形，变成圆丘状；4.5%透明质酸浓度组骨泥变得更加扁平，见图6。24 h时，3%透明质酸浓度组骨泥几乎完全变形，但仍聚集在一起；

4.5%透明质酸浓度组骨泥失去球形，变成圆丘状，见图7。72 h时，4.5%透明质酸浓度组骨泥虽完全变形，但仍聚集在一起，黏附在培养板底部。

2.4 脱钙骨基质/透明质酸最佳复合比例的确定根据不同浓度透明质酸溶液与450 mg脱钙骨基质的复合情

况及各组骨泥的抗离散能力检测得出，3%透明质酸浓度组骨泥具有良好的可塑形能力，也有较强的抗离散能

力，由此确定其为最佳复合比例，即脱钙骨基质/透明质酸质量比为15∶1。 2.5 脱钙骨基质/透明质酸(质量比15∶1)骨泥的细胞毒性评价脱钙骨基质/透明质酸骨泥浸提液培养1，4， 7 d的细胞相对增殖率分别为93.72%，101.65%，97.68%，均大于90%，细胞毒性级为1级或0级，表明脱钙骨基质/透明质酸(15∶1)骨泥细胞毒性轻微，对小鼠L-929细胞的增殖无明显影响。

3 讨论 Discussion

影响可塑形骨泥骨修复能力的最重要因素是成骨

基质颗粒成骨能力[5]。而一种骨修复材料的成骨能力由

其骨传导、骨诱导及骨生成能力3个要素决定[7, 28]。目前

常用的成骨基质颗粒有羟基磷灰石等无机颗粒、以硅酸

盐为主要成分的生物活性玻璃、无机颗粒与合成肽或胶

原的复合物等[3-5]。脱钙骨基质来源于天然骨组织，植入

体内后可被受体新生骨组织逐渐爬行替代，具有良好的

骨传导作用，经适当处理得到的脱钙骨基质可保留其中

的天然骨形态蛋白并使其暴露出来，发挥骨诱导作用

[8-11]。因此，脱钙骨基质具备成为可塑形骨泥的成骨

基质颗粒基本条件，也是常用的可塑形骨泥成骨颗粒。可塑形骨泥中所含的成骨基质颗粒比例也对其成

骨能力有较大影响，成骨基质颗粒含量高的骨泥成骨能

力优于含量低的骨泥[30]。目前在临床上应用的可塑形同

种骨修复材料多采用硫酸钙、甘油、大分子有机化合物

等作为黏性载体[5]。在这些可塑形同种骨修复材料中脱

钙骨基质含量一般为40%左右或更低，在一定程度上限制了其骨修复能力。实验采用透明质酸作为黏性载体，

在脱钙骨基质/透明质酸的质量比为15/1即脱钙骨基质含量较高的情况下，即可制备出具有良好可塑形能力及

抗离散能力的骨泥。在能到达相似可塑性能力及更好抗

离散能力的情况下，骨泥中脱钙骨基质含量远高于以海

藻酸钠为黏性载体的脱钙骨基质骨泥(脱钙骨基质/海藻酸钠为7/3)[31]

，也远高于已广泛应用于临床的脱钙骨基

质骨泥Grafton Putty(Osteotech, Inc，美国)，脱钙骨基质含量约为60%[32]

。黏性载体把松散的成骨基质颗粒黏合在一起使其

具有可塑形能力，提高可操作性，且在植入体内后能保

持在植入部位发挥骨修复作用，黏性载体应具有一定的

黏度及良好的生物相容性。可塑形骨泥黏性载体良好的

生物相容性及较高的黏度亦是保证其安全有效修复骨

缺损的先决条件之一[5]。实验采用的透明质酸是一种广

泛存在于人体和其他生物体细胞间基质及胞外基质的

高分子非蛋白质酸性黏多糖，在许多生物过程中起着非



注：对照脱矿骨基质/海藻酸钠复合骨泥中及 0.75%透明质酸浓度组骨泥已于浸泡 4 h时完全离散；1.5% 透明质酸浓度组骨泥完全离散；3% 透明质酸浓度组骨泥失去球形，变成圆丘状；4.5% 透明质酸浓度组骨泥变得更加扁平。



注：对照脱矿骨基质/海藻酸钠复合骨泥中及 0.75% 透明质酸浓度组骨泥已于浸泡 4 h时完全离散；3% 透明质酸浓度组骨泥几乎完全变形，但仍聚集在一起；4.5% 透明质酸浓度组骨泥变成圆丘状。



www.CRTER.org

常重要的作用，具有重要的生理功能[13-15]

。透明质酸平

均相对分子质量为 105-107，具有良好生物相容性及天

然可降解，且降解产物可以被机体吸收。透明质酸溶液

的黏度随分子质量或浓度的增加而增大，分子质量几倍

的差别就造成黏度上百倍的差异[33]。实验中应用的透明

质酸的分子质量为1.5×106，黏度检测结果显示，浓度

为 0.75%的透明质酸溶液在 37 ℃条件下黏度为 (4 424±111) mPa·s，浓度为 4.5%时黏度更高达 (179 683±2 845) mPa·s，具有良好黏度。高黏度的透明质酸溶液为骨泥保持良好的可塑形能力及抗离散能

力提供了保障。实验发现在脱钙骨基质/透明质酸为15∶1的复合比

例时，骨泥具有良好的可塑形能力，37 ℃条件下，在PBS中浸泡8 h才开始离散，24 h仍可聚集在一起。温度也是影响黏性载体黏度的重要因素，温度每升高1 ℃则可能导致黏性载体的黏度下降几倍到几十倍，从而导致骨泥的抗

离散能力随温度升高而迅速下降。以甘油为黏性载体的脱

钙骨基质骨泥则存在37 ℃体温时黏度迅速下降而导致骨泥在植入部位保持能力较低的问题

[30]。实验中体温条件下

透明质酸溶液的较高黏度及骨泥的较强的抗离散能力都

为骨泥植入体内后保持在植入部位提供了有力保证。体外细胞毒性评价是一种快速灵敏、成本较低的用

于检测材料是否含有对受体有害的物质的标准方法，与

短期体内埋入实验具有高度的相关性[34-35]

。实验应用

CCK-8法，采用L-929细胞株对所制备脱钙骨基质/透明质酸进行细胞毒性评价。CCK-8法是一种用于测定细胞增殖或细胞毒性中活性数目的高灵敏度，无放射性的比

色检测法。CCK-8法比其他四唑盐检测法如MTT法敏感度高、操作简便

[36-37]。检测结果显示，培养1，4，7 d

的细胞增殖率均高于90%，细胞毒性级为0或1级，表明所制备脱钙骨基质/透明质酸骨泥的细胞毒性轻微[27]

。脱钙骨基质颗粒的粒径大小也对可塑形同种骨修复材

料的骨修复能力有一定影响，脱钙骨基质颗粒粒径过小可

被宿主吞噬细胞当做异物吞噬，发挥不了骨修复作用；脱

钙骨基质颗粒粒径过大则会导致其中的成骨诱导因子不能

有效释放出来，延缓骨愈合时间[12]。实验采用粒径为

300-800 μm的脱钙骨基质颗粒，既保证了其不会被巨噬细胞吞噬，又使其中的成骨活性因子可以较快释放出来。综上所述，将脱钙骨基质与透明质酸以15∶1的比

例复合时，既保证了骨泥中脱钙骨基质较高的含量，最

大限度发挥脱矿骨基质骨传导及骨诱导活性，也保证了

骨泥良好的可塑形能力及抗离散能力，有利于其修复不

规则骨缺损，但其修复骨缺损的实际效果，仍有待进一

步动物体内修复骨缺损实验及临床实验证实。作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者，实施为第一、

二作者，资料收集为第一、三作者，校审为通讯作者，评估为

所有作者。

利益冲突：课题未涉及任何厂家和相关雇主或其他经济组

织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：同种皮质骨获取遵循的程序符合山西省红十字

医用组织库伦理学标准。

学术术语：CCK-8试剂中含有WST–8：化学名2- (2-甲

氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5- (2,4-二磺酸苯)-2H-四

唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯

的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的

黄色甲臜产物。生成甲臜物的数量与活细胞数量成正比。用酶

联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映

活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检

测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验

以及药敏试验等。作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，

无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他

人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

4 参考文献 References [1] Liao SS,Guan K,Cui FZ,et al.Lumbar spinal fusion with a

mineralized collagen matrix and rhBMP-2 in a rabbit model.Spine (Phila Pa 1976). 2003;28(17):1954-1960.

[2] Baroth S,Bourges X,Goyenvalle E,et al.Injectable biphasic calcium phosphate bioceramic: The HYDROS concept. Biomed Mater Eng.2009; 19(1):71-76.

[3] Wang Z,Lu B,Chen L,et al. Evaluation of an osteostimulative putty in the sheep spine.J Mater Sci Mater Med.2011; 22(1): 185-191.

[4] Bodakhe S,Verma S,Garkhal K,et al.Injectable photocrosslinkable nanocomposite based on poly(glycerol sebacate) fumarate and hydroxyapatite: development, biocompatibility and bone regeneration in a rat calvarial bone defect model. Nanomedicine (Lond).2013. [Epub ahead of print]

[5] 张乃丽,李宝兴,张育敏,等.可塑形骨泥的研究进展[J].中国修复重建外科杂志, 2012,26(11):1391-1397.

[6] Becker W, Burton E, Raul C. A comparison of demineralized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone formation in human extraction sockets. J Periodontol. 1994; 65(12):1128-1133.

[7] 孙晓雷,马信龙,马剑雄,等. 牛脱细胞骨基质的生物力学特性及其黏附性[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(49): 9659-9663.

[8] Urist MR,Chang JJ,Lietze A,et al.Preparation and bioassay of bone morphogenetic protein and polypeptide fragments. Methods Enzymol.1987; 146:294-312.

[9] Lee DW, Koo KT, Seol YJ, et al. Bone regeneration effects of human allogenous bone substitutes: A preliminary study. J Periodontal Implant Sci. 2010; 40:132-138.

[10] Aspriello SD,Ferrante L,Rubini C,et al.Comparative study of DFDBA in combination with enamel matrix derivative versus DFDBA alone for treatment of periodontal intrabony defects at 12 months post-surgery.Clin Oral Investig.2011; 15:25-32.



www.CRTER.org

[11] Pietrzak WS,Ali SN,Chitturi D, et al. BMP depletion occurs during prolonged acid demineralization of bone: Characterization and implications for graft preparation.Cell Tissue Bank.2011;12:81-88.

[12] Darby I. Periodontal materials.Aust Dent J.2011; 56:107-118. [13] Chung C,Beecham M,Mauck RL,et al.The influence of

degradation characteristics of hyaluronic acid hydrogels on in vitro neocartilage formation by mesenchymal stem cells. Biomaterials.2009;30(26): 4287-4296.

[14] Ibrahim S, Kang QK, Ramamurthi A. The impact of hyaluronic acid oligomer content on physical, mechanical, and biologic properties of divinyl sulfone-crosslinked hyaluronic acid hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2010; 94(2): 355-370.

[15] Dereure O. Hyaluronic acid and immunity. Ann Dermatol Venereol. 2010; 137 Suppl 1:S26-29.

[16] Mendoza G,Alvarez AI,Pulido MM,et al.Inhibitory effects of different antioxidants on hyaluronan depolymerization. Carbohydr Res.2007;342(1):96-102.

[17] Jae KK,Periasamy S,Jae HK,et al. Structural and antioxidant properties of gamma irradiated hyaluronic acid. Food Chem. 2008;109(4):763-770.

[18] Day AJ,de la Motte CA.Hyaluronan cross-linking: a protective mechanism in inflammation? Trends Immunol.2005;26(12): 637-643.

[19] Termeer C,Benedix F,Sleeman J,et al.Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4.J Exp Med.2002;195(1):99-111.

[20] Kobayashi H,Sun GW,Terao T.Production of prostanoids via increased cyclo-oxygenase-2 expression in human amnion cells in response to low molecular weight hyaluronic acid fragment.Biochim Biophys Acta. 1998;1425(2):369-376.

[21] Jiang D,Liang J,Noble PW.Regulation of non-infectious lung injury, inflammation, and repair by the extracellular matrix glycosaminoglycan hyaluronan. Anat Rec (Hoboken).2010; 293(6):982-985.

[22] Franz S, Allenstein F, Kajahn J, et al. Artificial extracellular matrices composed of collagen I and high-sulfated hyaluronan promote phenotypic and functional modulation of human pro-inflammatory M1 macrophages. Acta Biomater. 2013; 9(3):5621-5629.

[23] West DC, Hampson IN, Arnold F, et al. Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science.1985; 228(4705):1324-1326.

[24] Skardal A, Zhang J, McCoard L, et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A.2010; 16(8):2675-2685.

[25] Urist MR. Bone:formation by autoinduction. Science. 1965; 150:893-899.

[26] GB/T 16886.12-2005. 医疗器械生物学评价,第12部分:样品制备与参照样品.

[27] GB/T 16886.5-2003. 医疗器械生物学评价,第5部分:体外细胞毒性试验

[28] Kneserl U,Schaeferl DJ,Munder B,et al.Tissue engineering of bone. Min Invas Ther＆Allied Technol. 2002;11(3):107-116.

[29] Innes JF,Myint P. Dminerialised bone matrix in veterinary orthopaedics: a review. Vet Comp Orthop Traumatol.2010; 23(6):393-399.

[30] Lee YP, Jo M, Luna M, et al.The efficacy of different commercially available demineralized bone matrix substances in an athymic rat model. J Spinal Disord Tech. 2005;18(5):439-444.

[31] 徐伟俊,李宝兴,张育敏,等.可塑型脱矿骨基质/海藻酸钠复合材料的制备及细胞相容性[J].中国组织工程研究,2012,16(29): 5433-5436.

[32] Wang JC,Kanim LE,Nagakawa IS,et al.Dose-dependent toxicity of a commercially available demineralized bone matrix material. Spine (Phila Pa 1976).2001;26(13):1429-1436.

[33] Prestwich GD. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine.J Control Relaese.2011;155(2):193-199.

[34] Wallin RF, Arscott EF.A Practical Guide to ISO 10993-5: Cytotoxicity. MDDI. 1998; 20:96-98.

[35] Galia CR,Macedo CA,Rosito R,et al.In vitro and in vivo evaluation of lyophilized bovine bone biocompatibility.Clinics (Sao Paulo). 2008;63(3):801-806.

[36] Ishiyama M,Tominaga H,Shiga M,et al.A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicity with a highly water-soluble tetrazolium salt, neutral red and crystal violet.Biol Pharm Bull. 1996;19(11):1518-1520.

[37] Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS. Lymphocyte proliferation response during Eimeria tenella infection assessed by a new, reliable, nonradioactive colorimetric assay. Avian Dis. 2002; 46(1):10-16.

chinese journal of tissue engineering research november 19

Documents