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Centre deDiagnòsticBiomèdic Utilidad del estudio genético en el

diagnóstico e intervención familiar en la enfermedad de Wilson

Cèlia BadenasSecció de GenèticaMolecular

Servei de Bioquímica i Genètica Molecular

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ENFERMEDAD DE WILSON• Herencia autosómica recesiva• Afecta al metabolismo del cobre, que se acumula en hígado,

cerebro, córnea, hígado y otros órganos• Manifestaciones hepáticas, neurológicas,hematológicas,

psiquiátricas o combinaciones de ellas• Desde que el estudio genético está disponible el espectro

fenotípico se ha aumentado• Causada por mutaciones en un único gen: ATP7B

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PROTEÍNA ATP7B• Proteína es una ATPasa tipo-P transportadora de cobre• Expresada en casi todos los tejidos, pero predominantemente en el hígado• ATP7B es necesaria para el transporte eficiente del cobre de los hepatocitos al sistema biliar• En ausencia de la proteína hay una acumulación tóxica de cobre en diferentes tejidos, lo que da

lugar a los síntomas

Int J Mol Sci. 2015 Mar; 16(3): 6419–6431.6 dominios de unión a cobre8 dominios transmembrana1 dominio de transducción dela energía de la hidrólisis del ATP 1 dominio de fosforilación

CONSEJO GENÉTICO : AR

4

Riesgo de portador2/3

Riesgo de portador2/3x1/2=1/3

• Frecuencia 1/30.000-50.000 individuos• Portadores en población general 1/90• Probablemente infradiagnósticada

ATP7B

Riesgo de portador1/90

Riesgo de afectado1/180

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GEN ATP7B• Cromosoma 13 (13q14.3)• 16 tránscritos• Mensajero de referencia NM_000053

• 21 exones• 6655 bp de mRNA• 1465 aa

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GEN ATP7B

800 mutaciones descritasPocos individuos homozigotos

Variabilidad fenotípica

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Estudio molecular de EWDiferente incidencia según las poblaciones

Diferente espectro mutacional

Diferentes mutaciones recurrentes

Frecuencia de portadores 1/11

No se detectan las mutaciones europeas ni del este asiático

86

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DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE ENFERMEDAD DE WILSON

Secuenciación de Sanger: no cuantitativo

Estudio de duplicaciones/deleciones (MLPA)

mut/wt

mut/mut

wt/wt

Secuenciación masiva (NGS)

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Secuenciación de Sanger

Estudio de duplicaciones/deleciones (MLPA): cuantitativoCONTROL

CONTROL

PACIENTE


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Secuenciación de Sanger

Estudio de duplicaciones/deleciones (MLPA)


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RESULTADOS SOSPECHA DE EW

AFECTADO: detección de dos mutaciones en el gen ATP7BEstudio padres para demostrar que ambos son portadores

PORTADOR: baja probabilidad de afectadoEstudio padres para identificar al portador

Los portadores pueden tener niveles de ceruloplasmina plasmática bajos, cobre en orina en los límites de la normalidad, cobre en orina elevado tras estimulación con D-‐penicilamina y/o una elevación moderada del cobre hepático (100-‐250 mg/g peso seco)

NO MUTACIONES: baja probabilidad de afectadoNo estudio familiar

TécnicasSanger + MLPA: detecta >98% de las mutacionesNGS

PROBLEMA!! Variantes de Significado Clínico Incierto (VOUS)

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RESULTADOS DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE ENFERMEDAD DE WILSON

207 CASOS ÍNDICE:59 afectados (2 mutaciones)38 portadores (1 mutación)110 no afectados (0 mutaciones)

100 familiares:10 afectados61 portadores29 no portadores

11 parejas de portadores/afectados:8 no portadores3 portadores (1 cambio no descrito)

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RESULTADOS DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE ENFERMEDAD DE WILSON

59 casos índice con dos mutaciones en el gen ATP7B46 mutaciones diferentes3 de ellas representan el 39% de los

cromosomas mutadosc.1708-1G>A (10)p.Met645Arg (26)p.His1069Gln (10)

1 mutación recurrente es una deleción

Más de 30 polimorfismos (algunos no descritos)

MUTACIONES MISSENSE78/118 (66%) alelos51 (86%) casos índice son portadores de al

menos una mutación missense

MUTACIÓN PROTEÍNA NUM PACIENTESEXÓ TIPO DESCRITA?

DEL EXÓ 1 6 01 no proteína NO

c.51+4A>T 2 I01 splicing SI

c.523-525delAA+c.777-778insCp.Val176Serfs*28,p.Gln260Profs*10 1 02 frameshift NO*

c.845delT p.Leu282Profs*2 1 02 frameshift SI

c.347T>C p.Ile116Thr 1 02 missense SI

c.331C>T p.Gln111* 4 02 nonsense SI

c.562C>T p.Gln188* 2 02 nonsense SI

c.721C>T p.Gln241* 1 02 nonsense NO

c.1285+5G>T+c.3451C>T IVS2+5G>T+p.Arg1151Cys 1 I02,16 missense/splicing SI

c.1708-1G>A 10 I04 splicing SI

c.1555G>A p.Val519Met 1 04 missense SI

c.1739delA p.His580Profs*3 1 05 frameshift SI

c.3182G>A p.Gly1061Glu 2 06 missense SI

c.1934T>G p.Met645Arg 26 06 missense SI

c.2218G>C p.Ala740Pro 4 08 missense NO

c.2128_2133delGGTGGG p.Gly710_Gly711del 1 08 in-frame deletion NO

c.2123T>C p.Leu708Pro 2 08 missense SI

c.2332C>G p.Arg778Gly 1 08 missense SI

c.2297C>T p.Thr766Met 1 08 missense SI

c.2383C>T p.Leu795Phe 1 09 missense SI

c.2532delA p.Val845Serfs*28 2 10 frameshift SI

c.2605G>A p.Gly869Arg 1 11 missense SI

c.2763T>A p.Ser921Arg 2 12 missense SI

c.2795C>A p.Ser932* 1 12 nonsense SI

c.3060+5G>T IVS13+5G>T 1 I13 splicing SI

c.3061-12T>A 1 I13 splicing SI

c.3053C>T p.Ala1018Val 1 13 missense SI

c.2906G>A p.Arg969Gln 1 13 missense SI



c.3221C>T p.Ala1074Val 3 14 missense SI?

c.3083_3085delinsG p.Lys1028Serfs*40 1 14 frameshift SI

c.3190G>A p.Glu1064Lys 1 14 missense SI

c.3207C>A p.His1069Gln 10 14 missense SI

c.3311G>A p.Cys1104Tyr 2 15 missense SI

c.3295G>A p.Gly1099Ser 1 15 missense SI

c.3359T>A p.Leu1120* 4 15 nonsense SI

c.3556G>A p.Gly1186Ser 3 16 missense/splicing? SI

c.3659C>T p.Thr1220M 1 17 missense SI

c.3694A>C p.Thr1232Pro 1 17 missense SI

c.3699+1G>C 1 I17 splicing SI

c.3809A>G p.Asn1270Ser 5 18 missense SI

c.3818C>T p.Pro1273Leu 1 18 missense SI

c.3938T>G p.Leu1313Arg 1 19 missense N0

c.4022G>A p.Gly1341Asp 1 20 missense/splicing? SI

c.4103T>C p.Leu1368Pro 1 20 missense SI

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UK

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

España

Coffey et al 2013Brain 136:1476-1487

LOCALIZACIÓN DE MUTACIONES

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CASO ÍNDICE: M645R/deleción exón 1

Heterozigoto M645R

Deleción heterozigota exón 1

MADRE: deleción exón 1/normal

Normal

Deleción heterozigota exón 1

PADRE: M645R/normal

Heterozigoto M645R

Normal

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CASOS ESPECIALES:EW CON TRES MUTACIONES

Tres pacientes con tres mutaciones

IVS2+5G>T+R1151C/L1368P

L1368P/WTIVS2+5G>T+R1151C/WT

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CASOS ESPECIALES:EW CON TRES MUTACIONES

Varón de 6 años sin información clínica

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CASOS ESPECIALES:EW EN DOS GENERACIONES

A740P/WT

A740P/WT

523_525ins;778dup/WT

523_525ins;778dup/A470P

523_525ins;778dup/A470P

523_525ins;778dup/A470P

M645R/WT

523_525ins;778dup/M645R

523_525ins;778dup/WT

Una familia con tres mutaciones y 4 afectados en dos generaciones

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TIPOS DE TEST

Test predictivo: familiar de afectado con riesgo de estar afectadoSe tienen que conocer las mutaciones del caso índiceSecuenciación y/o MLPA

Test diagnóstico (confimación/exclusión): sospecha de EWSecuenciación sanger + MLPA

Test prenatal: se tienen que conocer las mutaciones en los padresSecuenciación y/o MLPA

Indispensable información clínica!!!

Test de portador (1): familiar de afectado a riesgo de ser portadorSe tienen que conocer las mutaciones del caso índice

Test pre-‐implantacional/pre-‐concepcional: se tienen que conocer las mutaciones en los padresSecuenciación y/o MLPAConfirmación en muestra de LA o BC

Cribado neonatal bioquímico??Confirmación de positivos mediante estudio genético

Test de portador (2): pareja de afectado/portador a riesgo de tener descendencia afectadaSecuenciación sanger + MLPA

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CONCLUSIONES

El tratamiento temprano y preciso de los enfermos de EW es simple y efectivo y puede prevenir el desarrollo de síntomas neurológicos y hepáticos , pero debido al amplio espectro de la enfermedad a veces es difícil llegar a un diagnóstico

Probablemente infradiagnosticada

A todo paciente con sospecha de Enfermedad de Wilson debe realizarse un estudio genético

No correlación genotipo-‐fenotipo, peroDiferencia portadores de afectadosDetecta individuos presintomáticos

La detección de mutaciones en el gen ATP7B implica la ampliación del estudio a familiares a riesgo (asesoramiento genético)

Familiares a riesgoParejas de portadoresOpciones reproductivas

Cribado neonatal

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MUCHAS GRACIAS

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