biotechnology 2012-02

Next-generation sequencing =High-throughput sequencing =

Massive parallel sequencing

2

Анализ данных

Сырые изображения

Риды

Сборка и выравнивание

Поиск вариантов

Аннотирование

4

DO NOT COPY WITHOUT PERMISSION5

Sanger NGS

Library preparation

Template preparation

Sequencing

6

Параметры NGS секвенаторов

• Производительность

• Длина прочтения (рида)

• Количество ридов

• Точность

• Типы возможных ошибок

• Стоимость запуска

Методы NGS

• Секвенирование синтезом

– Пиросеквенирование

– Полупроводниковое секвенирование

– Синтез с обратимой терминацией

– Секвенирование в реальном времени

• Секвенирование лигированием

8

NGS technologiesПлатформа Методика

секвенированияПодготовка матрицы Прибор Особенности

454 Life Sciences (Roche)

Пиросеквенирование Эмульсионная ПЦРGS FLX Titanium,GS Junior

+ Длинные риды- Ошибки в гомополимерах

Solexa (Illumina)Синтез с обратимой терминацией

Твердофазная ПЦР (Bridge PCR)

HiSeq 2000,MiSeq

+ Высокая производительность

Applied Biosystems (Life Technologies)

Лигирование Эмульсионная ПЦР SOLiD 4+ Высокая точность- Короткие риды

Ion Torrent (Life Technologies)

Полупроводниковое секвенирование

Эмульсионная ПЦРIon PGM,Ion Proton

+ Низкая стоимость- Ошибки в гомополимерах

Helicos BiosciencesСинтез с обратимой терминацией

Нет HeliScope - Короткие риды

Pacific BiosciencesСеквенирование в реальном времени

Нет PacBio RS+ Длинные риды- Высокий процент ошибок

9








HiSeq 2500,MiSeq












10








HiSeq 2500,MiSeq












11








HiSeq 2500,MiSeq












12








HiSeq 2500,MiSeq












13








HiSeq 2500,MiSeq












14

“Benchtop” sequencers

16

454 (Roche)

GS FLX Titanium GS Junior

17

Chemistry of DNA synthesis

Пиросеквенирование

19

Пиросеквенирование

20

Ion Torrent(Life Technologies)

21


23

Быстрая прямая детекция

Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242

Пластина сенсора

Кремниевый субстрат

Drain SourceBulk

дНТФ

К ресиверу

∆pH

∆Q

∆ V

Чувствительный слой

H+

24

CGCTAAGTAATATTCGCCCCGTTCACACGATTCCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGTTAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

CGCTAAGTAATATTCGCCCCGTTCACACGATTCCTCTGTAGTTCAGTCGGTAGAACGGCGGACTGTTAATCCGTATGTCACTGGTTCGAGTCCAGTCAGA

1 100

GGAGCCAAATTCTAAAAATTCGCTTTTTTAGCGCAATGTCACTGACCTTAGTTGAACATTGTTTTTTAACGGATAGCGGGTTTTTAACATCTTAAGCGCC

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

GGAGCCAAATTCTAAAAATTCGCTTTTTTAGCGCAATGTCACTGACCTTAGTTGAACATTGTTTTTTAACGGATAGCGGGTTTTTAACATCTTAAGCGCC

101 200

CTCGACCTTTATGGTTGAGGGCGTTTTGCTATGAACGCCATCACCATTTTCCCCTCGATTATAAAACTTGAGTTATTCAGTAGTCTCCCCTCTTGCAACT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

CTCGACCTTTATGGTTGAGGGCGTTTTGCTATGAACGCCATCACCATTTTCCCCTCGATTATAAAACTTGAGTTATTCAGTAGTCTCCCCTCTTGCAACT

201 300

CACACCCAAAACTGCCTAACGAAAAGTTATTAATTTTCAATCATATTGCTATCAGTATTTACATTTTTTCGCTGTGCTAGAAAGGGCGCATTTATGTTAG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

CACACCCAAAACTGCCTAACGAAAAGTTATTAATTTTCAATCATATTGCTATCAGTATTTACATTTTTTCGCTGTGCTAGAAAGGGCGCATTTATGTTAG

301 400

CTCGTTCAGGGAAGGTAAGCATGGCTACGAAGAAGAGAAGTGGAGAAGAAATAAATGACCGACAAATATTATGCGGGATGGGAATTAAACTACGCCGCTT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

CTCGTTCAGGGAAGGTAAGCATGGCTACGAAGAAGAGAAGTGGAGAAGAAATAAATGACCGACAAATATTATGCGGGATGGGAATTAAACTACGCCGCTT

401 500

AACTGCGGGTATCTGTCTGATAACT

|||||||||||||||||||||||||

AACTGCGGGTATCTGTCTGATAACT

501 600

25

Чипы Ion 314 и Ion 316 с проточными ячейками

pH-сенсорные чипы

26

Расположение лунок на поверхности pH-сенсорных чипов

Ion 314 Ion 316 Ion 318

pH-сенсорные чипы

Вид сенсорных чипов на срезе (сканирующая электронная микроскопия) 27

Scalability

2011 2012 2013

10 Mb

100 Mb

1 Gb

10 Gb

100 Gb

28

Sequencing: Ionograms

Sequence: AATCTTCTG…

Key Sequence

TTT

TCAG

AA

29

Illumina

HiSeq MiSeq

30

Модифицированные нуклеотиды

Illumina

32

Bridge PCR

33

Applied Biosystems(Life Technologies)

SOLiD 34

Лигирование

Секвенирование лигированием

36

Лигирование с олигонуклеотиднымизондами

37

HeliScope™

Мономолекулярное секвенирование

PacBio RS

39

http://www.youtube.com/watch?v=TboL7wODBj4&feature=player_embedded


Helicose

40


Pacific Biosciences

• Большая длина прочтения• Ошибки не зависят от последовательности• Чтение модифицированных нуклеотидов

• Высокий процент ошибок• Высокая стоимость 41

Phospholinked Fluorescent Nucleotides or Real-time sequencing

42

Pacific BioSciences

43

Oxford Nanopore

44

Sanger & NGS

47

Next Next generation sequencing

48

Спасибо за внимание

biotechnology 2012-02

Documents

ngs technologies

ion proton

ph ion

illumina hiseq miseq

heliscope pacbio rs

generation sequencing

realtime sequencing

highthroughput sequencing