Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

Klíčová slova: Nukleární magneticko-rezonanční terapie(NMRT); Chondrocyty; Interleukin-1b; genové pole; metaloprotenáza; buněčný růstAbstrakt

Úvod: Po desetiletí se ukázalo, že terapie nukleární magnetickou rezonancí (NMRT) byla úspěšná při léčbě bolesti u pacientů trpících osteoartrózou (OA) kolen nebo rukou, bolestí zad a osteoporózou. I když lze prokázat klinický výsledek, je méně znám o základním mechanism, kterým NMRT moduluje buněčné procesy vedoucí k pozorovanému snížení bolesti. Tato studie implementuje analýzu potenciálních signálních transdukčních drah zapojených do přenosu signálu NMRT v buňkách chondrosarkomu Cal-78 a NMRT ovlivňujících buněčný růst a životaschopnost buněk Cal-78 stimulovaných interleukinem IL-lp a C28 / I2 chondrocytů. Byly hodnoceny změny v expresi zánětlivých proteinů, jako jsou metaloproteinázy MMP1, MMP3, MMP8, MMP9, MMP10 a MMP13, jakož i interleukinů IL6 a IL8.

Metoda: Analýza základní cesty byla provedena technologií genového pole následovaná využitím biologické techniky, tzv. gene reporter assays (Cignal™ Reporter Assay). Buněčná proliferace byla testována barvením kalceinem a eFlourem 670; S-fáze buněk byla stanovena pomocí BrdU testu. Změny v expresi zánětlivých proteinů byly vyhodnoceny provedením kvantitativní RT-PCR, enzymatických imunoanalýz a měřením luminexu.

Výsledek: Interpretace genového pole v kombinaci s výsledky testu reportérového genu přibližně odhaluje indexy NMRT ovlivňující dráhu transformačního růstového faktoru (TGF) - β a mitogenem aktivovanou protein (MAP) kinázu. Buněčný růst a životaschopnost obou buněčných linií se nezměnil pomocí NMRT, ačkoli jejich inhibice způsobená IL-lp byla výraznější v nepřítomnosti stimulace NMRT. I když IL-lp prokazatelně stimuloval zvýšení exprese MMP a IL, zdálo se, že tyto účinky jsou v obou buněčných liniích rozdílně regulovány. Je zajímavé, že úroveň RNA MMP13 a IL-8 jsou statisticky sníženy pomocí NMRT pouze v buňkách C28 / I2.

Závěr: Naše zjištění týkající se účinků IL-lp, které jsou méně významné za NMRT než za kontrolních podmínek, plus snížená exprese MMP-13 zdůvodňují předpokládaný protizánětlivý účinek NMRT relevantní pro úlevu od bolesti. Objasnění způsobu zpracování signalizace pomocí NMRT u cílových buněk rozšíří perspektivy klinické adaptace NMRT k přesnějši a účinnější aplikaci tohoto alternativního terapeutického působení.

Použité zkratky

NMRT: Nukleární magneticko rezonanční terapie OA:

Osteoartritida; MRI: Magneticko rezonanční tomografie; MAPK/ERK: proteinová kináza aktivovaná mitogenem/kináza regulovaná extracelulárním signálem; TGF-β: Transformující růstový faktor-Beta; Smad: matky proti dekapentaplegickému homologu; MMP: Matrix Metaloproteináza; IL-1β: Interleukin 1 Beta; IL6: Interleukin 6; IL8: Interleukin 8; BMP1: Kostní morfogenetický protein; ITG: Integrin; IGF: Signální dráha IGF; EGF: epidermální růstový faktor; FGF: Fibroblastový růstový faktor; NFκB: Nukleární faktor-kappaB; JNK: c-Jun N-terminální kináza; TIMP: tkáňový inhibitor matrixových metaloproteináz; EGFR: receptory pro epidermální růstové faktory.

ÚvodOsteoartritida (OA) je hlavní chronické onemocnění kloubů se

symptomy charakterizovanými destrukcí kloubní chrupavky v kloubech, zejména kolen, kyčlí a ruky [1,2]. Léčba bolesti a postižení jako hlavních klinických příznaků OA zahrnuje řadu různých lékařských přístupů, jako je fyzioterapie, farmakologická léčba nebo chirurgické metody [3-5]. Protože žádná z těchto metod není schopna působit přímo na příčinu nemoci, je vývoj nových, účinnějších a zejména neinvazivních metod k dosažení snížení bolesti pacientů s OA mimořádně zajímavý.

Klinická pozorování prokázala pozitivní účinky jaderné magnetické rezonance na léčbu bolestivých poruch pohybového aparátu [6], které vedly k vývoji NMR terapie s polem s nízkou intenzitou (NMRT). Na základě provedených klinických studií se předpokládá, že NMRT způsobí úlevu u pacientů s bolestí dolní části zad s následným návratem k aktivitám v každodenním životě, aniž by byly pozorovány vedlejší účinky. [7,8]. Dvojitě zaslepená, randomizovaná a placebem kontrolovaná studie terapeutických účinků NMRT na OA kloubů ruky a prstů měla za následek významné zvýšení fyzické funkce trvající nejméně šest měsíců [9]. Byla popsána zlepšení bolesti u pacientů s OA kolen v důsledku chondroprotektivního účinku na lidskou kloubní chrupavku [10-12]. Froböse a kol. prokázali, že pacienti postižení destrukcí chrupavky v

Bibiane Steinecker-Frohnwieser1*, Lukas Weigl2, Gertrude Weberhofer2, Werner Kullich1 and Hans Georg Kress2

1Ludwig Boltzmann Institute for Rehabilitation of Internal Diseases, Ludwig Boltzmann Cluster for Rheumatology, Balneology and Rehabilitation, Saalfelden, Austria2Department of Special Anaesthesia and Pain Management, Medical University Vienna, Austria

*Address for CorrespondenceBibiane Steinecker-Frohnwieser, Ludwig Boltzmann Institute for Rehabilitation of Internal Diseases, Saalfelden, Austria, Tel: +43 3685 23037; Fax: +43 3685 22323-142; E-mail: lbi.groebming@aon.at

Submission: 24 March 2014Accepted: 06 May 2014Published: 12 May 2014

Reviewed & Approved by: Dr. Guangju Zhai, Department of Genetics, Memorial University of Newfoundland, Canada

Research ArticleOpen Access

Journal of

Orthopedics & Rheumatology

Avens Publishing GroupInviting Innovations

Avens Publishing Group

J Orthopedics RheumatolMay 2014 Vol.:1, Issue:3© All rights are reserved by Steinecker-Frohnwieser et al.

Vliv nukleární magneticko rezonanční terapie (NMRT) a stimulace interleukinu IL1-b na buňky chondrosarkomu Cal 78 a chondrocyty C28 / I2

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 02

ISSN: 2334-2846

koleni, vykazovali pozitivní adaptaci chrupavčitých struktur při NMRT - doložené MRI [13]. Dále předpokládali, že mechanismus, který je základem pozorovaných účinků, byl založen na stimulaci intaktních nebo částečně fungujících chondrocytů s následnou zvýšenou syntézou kolagenu. Zatímco dosud v chondrocytech nebyly detekovány žádné účinky indukované NMRT s ohledem na apoptózu a životaschopnost buněk, ošetření NMR vedlo ke zvýšení rychlosti proliferace buněk kvantifikované jejich počítáním [14]. Studie na primárních kulturách lidských dermálních fibroblastů vystavených NMR vedly ke zřetelným změnám jak v buněčných, tak v extracelulárních složkách: (i) extracelulární matrice buněk exponovaných NMR měla méně cross-link kolagenu a (ii) bylo detekováno zvýšení kolagenu I, III a IV rozpustné frakce pomocí NMRT [15]. Statistiky ze studií týkajících se účinků NMRT na lidské chondrocyty potvrzují vyvolání změny modulace signálních transdukčních drah zapojených do degenerace chrupavky, což může způsobovat klinickými studiemi pozorované snížení bolesti [16].

Chondrocyty v mezibuněčném prostoru jsou obecně zodpovědné za vyvážené množství extracelulární matrice a jsou řízeny extracelulární signalizací. Vykazují změněné vzorce buněčných reakcí během procesu OA. Kromě buněčné smrti, změny buněčné proliferace nebo kompenzačního zvýšení syntetické aktivity, OA chondrocyty aktivují nebo deaktivují expresi genu nebo podstoupí fenotypovou modulaci [17]. Kromě toho pozitivně neodpovídají na mechanickou stimulaci integrinem indukované stimulace dráhy MAPK / ERK [18,19]. Kromě toho složky dráhy TGF-ß / Smad nebo MAPK představují silné mediátory syntézy matrice chrupavky [20-22], s možnou interakcí mezi podtypy MAPK a signální cestu TGF-ß / Smad během chondrogeneze [23]. Podtypy MAP kinázy (MAPK / ERK, p38 kináza, c-Jun N-terminální kináza) jsou konstitutivně exprimovány v kloubních chondrocytech určených k regulaci diferenciace, apoptózy, zánětlivých odpovědí a aktivaci matricových metaloproteináz (MMP) [24-26]. Ten funguje jako intersticiální kolagenázy a ve spolupráci degraduje složky extracelulární matrice hrající zásadní roli v patologických podmínkách, např.: zánět kloubů a degenerativní onemocnění kloubů [27-29]. Proti regulačním účinkům růstových faktorů vyrovnáváním anabolických a katabolických procesů, stimuluje zkoumaný prozánětlivý cytokinový interleukin IL-lp produkci degradujících enzymů a potlačuje syntézu proteinů ovlivňováním buněčných MAPK cest [30-32]. Za experimentálních podmínek stimulace chondrocytů IL-lp posouvá vzorec buněčné exprese do zánětlivějšího stavu indukcí exprese a aktivace MMP, respektive IL6 a IL8. [33-35].

Tato studie se zabývá dosud nevyřešenou otázkou, zda by buněčné mechanismy v chondrocytech mohly být modulovány prostřednictvám NMRT s polem o nízké intenzitě, což by vedlo ke zlepšení destrukce chrupavky doprovázené snížením bolesti. Kromě studií buněčné proliferace pomohla analýza souboru genů osteogeneze a studií reportér-genů prozkoumat faktory transformující signál a efektory podílející se na TGF-β a také MAPK indukované dráhy v buňkách chondrosarkomu (Cal-78). Byl zkoumín i možný vliv NMRT na prozánětlivé cytokiny, jako jsou IL-6 a IL-8, jakož i MMP-1, -3, -8, -9, -10 a 13 buněk chondrosarkomu (Cal-78) a chondrocytů (C28 / I2).

MetodaBuněčná kultura

Buněčná linie lidského chondrosarkomu Cal-78 byla poskytnuta od Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Culture a lidské chondrocyty HCH, vč. primární buněčné linie byly zajištěny od Promocell (Germany). Buněčná kultura byla vytvářena podle instrukční příručky. C28/I2, imortalizovaná buněčná linie lidských chondrocytů (laskavě poskytovaná Prof. M. B. Goldringem, Harvard Institute of Medicine, Boston, MA) bylakultivována v Dulbecoově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM)doplněném 10% FCS při 37 ° C pod 5% CO2. Pro studie zahrnujícíizolaci RNA a sběr buněčných supernatantů činilo množstvínaočkovaných buněk, pokud není uvedeno jinak, v případě buněkCal-78 10 000 buněk / cm2, zatímco buňky C28 / I2 byly naočkoványv hustotě 5 000 buněk / cm2. Tři až čtyři dny po naočkování buněkbyl přidán IL-lp (10 ng / ml, Sigma-Aldrich, USA). 10 hodinovéterapeutické ošetření NMR při pokojové teplotě obvykle začalo 2hodiny po přidání IL-lp po dobu 2 hodin denně, po dobu 5 dnů.Buňky inkubované při pokojové teplotě po stejnou dobu fungovalyjako kontrola. V případě studie genového pole byly buňky ošetřenypo dobu 20 hodin během 5 dnů nebo podle jiných individuálníchindikací.

Nukleární magneticko rezonanční terapie (NMR)

Ošetření NMR bylo aplikováno speciálním zařízením pro magnetickou nukleární rezonanci přizpůsobeným pro buněčné kultury (MedTec Company, Wetzlar, Německo) indukující řízenou nukleární rezonanci protonů. Buňky byly stimulovány po různá časová období v závislosti na metodickém požadavku.

Buněčná proliferace, testy buněčné hustoty

Hustota buněk - Calcein měření: Buňky byly vysety na 24-jamkovou destičku s hustotou 1 000 buněk / cm2. Pro měření hustoty buněk byly buňky inkubovány po dobu 30 minut při 37 ° C v PBS (fosfáty pufrovaný fyziologický roztok) obsahující 2 uM kalceinacetomethylesteru (Calcein AM; Sigma-Aldrich, USA). Fluorescence při emisní vlnové délce 530 nm byla detekována pomocí čtečky destiček s excitační vlnovou délkou 485 nm. Pro analýzu byla fluorescence normalizována na fluorescenci kontrolních buněk v den 0 před prvním ošetřením NMR.

Poliferace buněk - BrdU-test: BrdU Flow Kit (BD Biosciences, USA) byl použit pro dlouhodobé sledování charakteristik buněčné proliferace buněk C28 / I2 po stimulaci po dobu 10 hodin pomocí NMRT. Po každém procesu štěpení byly buňky naočkovány při hustotě 5000 buněk / cm2. Integrace BrdU do nově syntetizované DNA buňkami vstupujícími a postupujícími přes S (syntézu DNA) fázi buněčného cyklu bylo provedeno podle instrukční příručky. Konečná měření byla provedena v pěti různých časových bodech pomocí průtokového cytometru (FACSCalibur, BD Bioscience, USA); analýza dat a sběr dat byly provedeny pomocí Cellquest Pro Software (BD Bioscience, USA).

Poliferace buněk - Dye eFlour-670: Buňky byly označeny pomocí eFlour 670 (eBioscience, USA) v koncentraci 5 uM, podle pokynů výrobce. První měření začalo den poté, co byly buňky naočkovány do kultivačních lahví o objemu 25 cm3, zatímco druhý a třetí měřený bod byl stanoven na čtvrtý den po 5 hodinách a na šestý den po 10 hodinách ošetření pomocí NMRT.

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 03

ISSN: 2334-2846

Data FACS byla shromážděna na FACSCalibur a analýza dat a sběr dat byla provedena pomocí softwaru Cellquest Pro (BD Bioscience, USA).

Detekce mtrvých buněk - Barvení propidium jodidem: Po trypsinizaci a promytí v PBS byly 2 x 105 až 106 buňky suspendovány ve 190 ul vazebného pufru (10 mM Hepes / NaOH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2 filtrováný skrz 0.2 µm membránový filtr). Bylo přidáno 10 µl roztoku propidium jodidu (PI, 20 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA) a buňky byly analyzovány průtokovým cytometrem.

Transfekce - Luciferázový test

Test reportérového genu (Cignal ™ Reporter Assay, Immune reporter Signalizující 10cestný reportér Luciferase, SAbioscience, Qiagen, USA) byl použit pro měření změn aktivity (obojí) zvyšuje a snižuje) specifických signálních drah. Byla studována aktivita deseti transkripčních faktorů. Podle pokynů společnosti pro transfekci buněk byl 1 µl každé reportérové DNA smíchán se SureFECT (SAbioscience, Qiagen; USA) v Opti-MEM a po vytvoření komplexu byl rozdělen na 96-jamkovou destičku. Přidáním 100 µl suspenze buněk Cal78 v hustotě 3x105 buněk / ml byl proces transfekce ponechán po dobu 16 hodin. Následně bylo médium změněno a po dalších 24 hodinách byly buňky podrobeny působení NMRT po dobu 1 hodiny nebo byly udržovány po dobu odpovídající pokojové teplotě. Luciferáza byla aktivována aplikací systému Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, USA) a luminiscence byla měřena čtečkou destiček Victor X3 (Perkin Elmer).

Isolace RNA

Celková RNA extrakce obou typů buněčných linií byla provedena pomocí systému RNeasy (QIAGEN). V případě experimentů qPCR byly RNA ošetřeny DNasou-I podle instrukčního manuálu (QIAGEN). Kvantifikace a kontrola kvality izolované RNA byly provedeny měřením optické hustoty při A260 a kontrolou poměru A260 / A280 nanophotometrem (Implen). Kvalita RNA byla dále testována elektroforézou na denaturačním agarózovém gelu.

Gene-Array analýzy

Pro testování relevantních genů byl použit systém profilování exprese mikročipů specifický pro mikročip pro lidskou osteogenezi (OHS -026, SAbiosciences, QIAGEN). Soubor RNA sestávající z RNA ze tří různých experimentů buněk Cal78 ošetřených NMR po dobu 20 hodin byl převeden na značenou cRNA (True Labeling-AMP™ 2.0, GA-030, SABioscience, QUIAGEN). Hybridizační a detekční postup byl proveden podle popisu společnosti. Signály získané chlazenou CCD kamerou byly analyzovány pomocí softwaru GEArray Expression Analysis Suite od SABioscience.

RT-qPCR

Izolovaná RNA (1 µg na reakci a sondu) sloužila jako templát pro syntézu cDNA prvního řetězce pomocí reverzní transkriptázy RNase H + iScript a směsi oligo (dT) a náhodných primerů po dobu 30 minut při 37 ° C (iScriptcDNA Synthesis Kit, BioRad). Sekvence PCR primerů a velikosti amplikonů byly pro MMP-1:fwd 5’CTGTTCAGGGACAGAATGTGCT3’ and rev 5’TCGATAT-GCTTCACAGTTCTAGGG3’; 85 bp for MMP-3: fwd 5’TTTTG-GCCATCTCTTCCTTCA3’ and rev 5’TGTGGATGCCTCTTGGG-

TATC3’ 139 bp; and for MMP-13: fwd 5’TCCTCTTCTTGAGCT-GGACTCATT3’ and rev 5’CGCTCTGCAAACTGGAGGTC3’ 97 bp. Further primers used: MMP-9: fwd 5’GGGACGCAGA-CATCGTCATC3’ and rev 5’TCGTCATCGTCGAAATGGGC3’, 139 bp; MMP-10: fwd 5’TGCTCTGCCTATCCTCTGAGT3’ and rev 5’TCACATCCTTTTCGAGGTTGTAG3’, 103 bp; IL8: fwd 5’ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC3’ and rev 5’AACCCTCT-GCACCCAGTTTTC3’, 112 bp; IL6: fwd 5’AAATTCGGTA-CATCCTCGACGG3’ and 5’GGAAGGTTCAGGTTGTTTTCTGC3’, 112 bp; GAPDH: 5’TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3’ and rev 5’TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT3’, 102 bp; Aldolase: fwd 5’ATGAGTCCACTGGGAGCATTG3’ and 5’ACCGCCCTTG-GATTTGATAAC3’, 209 bp. Sekvence primerů byly odvozeny z databáze Primerbank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank). Relativní kvantifikace genové exprese byla dosažena pomocí RealMasterMix SYBR ROX (5'PRIME, Eppendorf, USA, Německo) na mistrovském stroji (Eppendorf Mastercycler realplex). Reakce byly prováděny dvojmo s glyceraldehyd-3-fosfát dehydro-genasou (GAPDH) a aldolasou jako vnitřní kontrolou.

Standardní teplotní profil s počátečním aktivačním krokem při 95°C (3min), následovaný 3-krokovým PCR programem obsahujícím denaturaci 95°C (15 s), žíhání 60°C (30 s) a 70°C ( 20 s) prodloužení po dobu 40 cyklů. Po každém běhu qPCR byla získána křivka tání. Jako kontrola byly provedeny reakce bez RT a bez DNA a gelová elektroforéza. Exprese mRNA byla kvantifikována metodou ΔΔCt.

Sada Fluorokine® MAP Human MMP

Buňky byly vysety s vhodnou hustotou buněk do šesti jamkových destiček. NMRT bylo prováděno po dobu 10 hodin během pěti dnů v přítomnosti i nepřítomnosti IL-1β. Pro kontrolní buňky byly paralelně inkubovány při RT; supernatanty byly shromažďovány ve všech případech. Duplicitní supernatanty byly spojeny a zředěny 2,5krát v předepsaném ředicím pufru. U obou buněčných linií byly supernatanty buněčných kultur měřeny na MMP-1, -3, -9 a -13 podle pokynů od výrobce Fluorokine® MAP Human MMP Kits (R&D Systems Europe, England)

Enzymový imunotest

Pro kvantitativní detekci lidského interleukinu-6, respektive interleukinu-8, byly použity sendvičové ELISA (lidský IL-6 platinový ELISA, eBioscience; lidský IL-8 platinový ELISA, eBioscience, USA). Supernatanty byly zředěny podle potřeby 1:5 až 1:100 krát a postupovaly podle instrukčního manuálu. Všechna měření byla prováděna dvojmo při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček Anthos 2010 (Anthos Mikrosysteme GmbH, Germany).

Statistické analýzy

Data z qPCR jsou uvedena jako průměr (± standardní chyba) alespoň čtyř samostatných experimentů, přičemž experimenty RT-qPCR a ELISA byly prováděny dvojmo. Statistická významnost byla stanovena Studentovým t-testem a Wilcoxon-Mann-Whitneyovým testem; Hodnoty p <0,05 byly považovány za významné (*** p <0,001; ** p <0,01; * p <0,05), všechny hodnoty p jsou oboustranné. Analýza dat byla provedena pomocí softwaru SigmaPlot 11.0 (Systat software inc., USA).

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 04

ISSN: 2334-2846

VýsledkyRůst buněk - životaschopnost buněk

Na základě předchozích zjištění, že terapie nukleární magnetickou rezonancí (NMR) může ovlivnit růst buněk a také regenerovat chrupavku [13,14], byly buňky Cal-78 a C28 / I2 ošetřeny pomocí NMRT v různých časových obdobích měření buněčné proliferace. Buňky Cal-78 ošetřené NMRT po dobu devíti hodin rozdělené po dobu sedmi dnů nevykazovaly významný rozdíl v buněčném růstu ani v nepřítomnosti, ani v přítomnosti IL-1β (Zobrazení 1A). IL-1β sám v obou případech dramaticky snížil buněčný růst. Je zajímavé, že za kontrolních podmínek nastaly rozdíly v buněčné proliferaci mezi buňkami ošetřenými IL-lp a neošetřenými buňkami po třech dnech. Pro NMRT indukované rozdíly byly detekovány pouze v sedmý den (Zobrazení 1A). Zajímavé je, že jsme také testovali NMRT na buněčném růstu lidských dermálních dospělých fibroblastů (HDFa), synoviálních sarkomových buněk (SW982) a lidských chondrocytů (HCH, primární buňky) barvením kalceinem. Časem nebyl detekován žádný významný rozdíl mezi kontrolními buňkami a buňkami ošetřenými NMR. Procento PI pozitivních buněk Cal-78 vzrostlo pod vlivem IL-1β pod kontrolou i NMRT téměř ve stejném rozsahu. However, the observed augmentation in percent dead cells demonstrated only for control cells statistical significance (Zobrazení 1B). Proliferační charakteristika buněk C28 / I2 stimulovaných NMRT byla testována pomocí barviva pro buněčnou proliferaci eFlour 670. Stimulace NMRT po dobu deseti hodin během osmi dnů nezměnila rychlost proliferace buněk prokázanou změřením X Geo Mean of fluorescence pro kontrolu vs. NMRT ve čtyři dny (439,67 vs. 433,38), šestý den (189,76 vs. 180,67) a osmý den ( 88,56 vs. 92,23).

Pokud jde o dlouhodobý účinek NMRT na buněčnou proliferaci, procento C28 / I2 buněk během S-fáze bylo pozorováno po dobu čtrnácti dnů (Zobrazení 1C). Proto byly buňky stimulovány pomocí NMRT po dobu sedmi hodin během čtyř dnů před prvním měřením, následovaly další tři hodiny ošetření pomocí NMRT a dvě rozdělení.. Procento S-fáze bylo měřeno ve čtyřech dalších časových bodech, což neodhalilo žádný rozdíl ve tvaru křivky ve srovnání s kontrolou (Zobrazení 1C).

Gene-Array analýzy

Analýza genového pole osteogeneze prokázala expresi 50 ze 114 testovaných genů v buňkách chondrosarkomu Cal-78. Vzorek pro hybridizaci genového pole byl syntetizován ze skupiny RNA izolované ze tří experimentů s buňkami ošetřenými po dobu 20 hodin s NMRT během 5 dnů. Sledovatelné geny lze rozdělit na geny, které byly přítomny pouze pod kontrolou (n = 11) nebo za ošetřených podmínek (n=9, Zobrazení 2A). V případě genů exprimovaných za nestimulovaných a stimulovaných podmínek (prahová hodnota byla nastavena na 0,01) jsme se zaměřili na rozdíly v hladinách exprese vyvolané NMRT. Zatímco kostní morfogenetický protein (BMP1), regulátor indukce TGF-β dráhy byl snížen pod vlivem NMRT, BMP2 se nezměnil. Smad3 a 4, klíčové modulátory signální dráhy TGF-β byly oproti tomu regulovány; zvýšení Smad3 bylo proti regulaci Smad4 směrem dolů. Kromě toho byly integriny ITGB1 a ITGA3 také obráceně regulovány pomocí NMRT, podobné expresi inzulinových a epidermálních růstových faktorů (IGF1, EGF), fibroblastového růstového faktoru

(FGF) a jejich receptorů (EGFR, FGFR3) (Zobr. 2B). Zajímavé je, že,

control

control

control

control

NMR treated

NMR treated

NMR treated

NMR treated

/ IL-1beta/ IL-1beta

A400

300

200

100

0norm

. num

ber o

f cel

ls (%

)

B20

15

10

5

0

C100

80

60

40

20

0

PI p

ositi

ve c

ells

(%)

S-p

hase

(%)

2h 2h 2h 2h 1h

(*)

(*)

(**)

(**)

(**)

0 2 4 6 8days

days

IL-1ᵦ - + - +

pass. #0pass. #1+4d

pass. #1+7d pass. #2+7dpass. #2+4d

7h NMRT+3h NMRT

split1 split2

0 2 4 6 8 10 12 14

Zobrazení 1: Vliv NMR terapie na buněčný růst a životaschopnost. (A) Buňky byly ošetřeny po dobu devíti hodin pomocí NMR nebo udržovány při pokojové teplotě jako kontrola. Buňky Cal-78 byly navíc stimulovány IL-1β (10 ng/ml). Každý časový bod a sloupec představuje střední hodnotu ± standardní chyba; počet pokusů je uveden v závorkách. Graf představuje normalizovaný počet buněk měřený barvením kalceinem (n = 10). Sloupce ukazují časy NMRT nebo zpracování při pokojové teplotě.

(B) Životaschopnost buněk Cal-78 byla měřena barvením mrtvých buněkpropidium jodidem a následnou průtokovou cytometrií. Data jsou uvedenajako průměrné hodnoty ± standardní chyba, (n=5); kde je uvedeno, bylybuňky ošetřeny IL-1β.

(C) Vliv NMRT na charakteristiky dělení buněk (% S-fáze) C28/I2 chondrocyty sledovány po delší časové období (n=3). Buňky byly během měřeného období rozděleny dvakrát a den předem bylo provedeno ošetření NMRT 0 (7 h) a v den 4 (3 h), jak je naznačeno šipkami. Je přířazen počet pasáží a počet dní po rozdělení buněk.

Úroveň významnosti je dána hodnotami p od podle Student’s t-test (A) a Mann-Whitney Rank Sum Test (B), resp. ( *: p<0,05; **: p<0,01).

kolageny I, XII a XV byly regulovány pomocí NMRT, kolagen IX byl zvýšeně regulován a kolagen II vypadal nezměněn (Zobr. 2B). Transkripční faktor NFKB1 vykazoval snížené hladiny RNA při ošetření NMRT. Genové pole bylo také testováno na změny vyvolané NMR v expresi lidských chondrocytů (HCH buňky).

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 05

ISSN: 2334-2846

Kvůli nízké kvalitě výstupu RNA bylo možné detekovat pouze slabé signály, nebo vůbec žádné signály. Bylo provedeno srovnání genů odhalujících potenciální zájem v buňkách Cal78 (Zobr. 2B). Toto pozorování vedlo ke shodným změnám na úrovni RNA faktoru stimulujícího kolonie (CSF2), Col12, VEGF-B, NFkB1 a MMP13, v tomto pořadí. Testování luciferázové aktivity buněk Cal-78 transfekovaných různými konstrukty reportérového genu a stimulace buněk pomocí NMR po dobu jedné hodiny odhalilo mírné zvýšení dráhy TGF-P, zatímco buňky transfekované NFKB-luc odhalily silné zvýšení aktivity luciferázy (Zobr. 2C). Fdále, za těchto podmínek byla aktivita luciferázy silně zvýšena, když byla kontrolována MAPK / ERK a MAPK / JNK. Navíc testované konstrukty reportérových genů odhalily pouze minimální změny v expresi při stimulaci NMRT.

Vliv IL-1β na C28/I2 a Cal-78 cells

Na základě nálezů NMRT jako účinné terapie u pacientů s OA se výzkum zaměřil na mediátory zánětu. Kvantitativní PCR byla v podstatě použita k charakterizaci změn ve vzorci exprese MMP-1, -3, -10, -13 a TIMP3, IL6 a IL8, v daném pořadí v důsledku podáváníIL-lp na Cal-78 a C28 / I2 (Tab. 1). Obě buněčné linie reagovaly naléčbu odlišně s IL-1β,

zejména pokud jde o expresi MMP-1, -10 a -13. Průměrná hodnota poměru nestimulovaných vs. IL-1 stimulovaných buněk Cal-78 odhalila 21 až 44násobnou změnu v expresi MMP-1 (44.1± 14.9), MMP-3 (28.6 ± 12.8) a MMP-10 (21.3 ± 8.0). Co se týče buněk C28 / I2, indukce genové exprese byla podstatně nižší ve srovnání s buňkami Cal-78.. U MMP-1 lze pozorovat menší účinek stimulace IL-1β na buňky C28 / I2, co je možné připsat vysoké bazální expresi, zatímco obecně nebyly MMP-3 a MMP-10 účinně indukovány (Tab. 1). Exprese dvou zánětlivých cytokinů IL6 a IL8 byla podobně ovlivněna IL-1ß, i když mezera v expresi IL8 byla méně výrazná. Exprese TIMP3 v obou buněčných liniích se významně nezměnila z poměrně vysoké bazální úrovně exprese (Tab. 1). Analýza buněčných supernatantů z obou buněčných linií (± IL-1β) tato pozorování potvrdila (Zobr. 3a, 3b).

Efect NMR léčby na C28/I2 a Cal-78 buňky ± IL-1β

Obě buněčné linie byly exponovány s nebo bez IL-1β (IL-1β (+)/IL-1β (-)) při NMRT po dobu 10 hodin v období pěti dnů. Expresní úrovně MMP-1, -3, -10, -13, TIMP3, IL6, a IL8, byly v tomto pořadí byly analyzovány kvantitativní RT-PCR. Pouze minimální exprese mohla být detekována pro MMP-8 a MMP-9 v obou buněčných liniích. Byly pozorovány rozdíly C28/I2(IL-1β (±)) buněk pro MMP-13 jakož i v Cal-

Zobr. 2: Změny v genové expresi v důsledku NMR zpracování buněk Cal-78 a HCH buněk. (A) Dva výsečové grafy shrnují expresi 114 genů detekovaných pomocí pole genů pro osteogenezi a pod vlivem NMRT. RNA ze tří různých experimentů byly spojeny a fungovaly jako vzorek.

(B) Uvádí se podrobná analýza jednotlivých genů a jejich velikost změny v expresi v závislosti na ošetření pomocí NMRT a ve srovnání s kontrolou Cal78 (šedé šrafování) a buněk HCH (zelené pruhy). Vzhledem k neefektivnosti izolace RNA z buněk HCH nemohly být některé geny zdůvodněny (červená výseč) nebo prokázaly pouze tendenční změnu, jak je dáno světle zelenou výsečí. Možné zvýšení genové exprese je indikováno zeleným šrafovaným pruhem mírně nad, možné snížení je dosaženo zeleným šrafovaným pruhem mírně pod jednou násobnou změnou, resp..

(C) Luciferázový reportérový genový test pro vyhodnocení změn aktivity transkripčních faktorů pomocí NMRT. Data jsou normalizována pro kontrolu. NFκB: jaderný faktor - zesilovač kapa-lehkého řetězce aktivovaných B-buněk, NFAT: Jaderný faktor aktivovaných T-buněk, INF, INFγ: Interferonγ, MAPK/ERK, MAPK/JNK: Mitogen-aktivované proteinkinázy / extracelulární signálně regulovaná kináza/c-Jun N-terminal kináza, TGFβ: Transformující růstový faktor β, cAMP/PKA: Proteinkináza A, c/EBP: CCAAT/enhancer-binding protein GR: Glucocorticoid Receptor (http://www.sabiosciences.com/reporterassays.php).

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 06

ISSN: 2334-2846

Tab. 1: Statistická analýza ∆CT hodnoty popisující vliv IL-1β na Cal-78 a C28/I2 buňky. Průměr ∆CT hodnot MMPs, ILs a TIMP3 je zadán, odpovídající standardní odchylky jsou uvedeny v závorkách. Počet experimentů (n) a jsou indikovány hodnoty p. Testovat rozdíly mezi nestimulovanými (IL-1β(-)) a stimulované (IL-1β (+)) buňky při použití Student’s t-test, p-values dány.

Změna exprese stimulací IL-1β Cal-78 and C28/I2.

control NMR 10 h

C28/I2 ∆CT IL1β(-) n ∆CT IL1β(+) n p-value ∆CT IL1β(-) n ∆CT IL1β(+) n p-value

MMP1 3,15 (± 0,87) 8 4,21 (± 0,39) 5 0,013 3,25 (± 1,13) 8 4,24 (± 0,44) 5 n.s.

MMP3 14,08 (± 0,45) 8 15,13 (± 0,75) 5 0,032 14,24 (± 0,59) 8 15,16 (± 0,78) 5 n.s.

MMP10 16,94 (± 0,63) 5 15,65 (± 0,50) 5 0,007 17,28 (± 0,99) 5 15,62 (± 0,79) 5 0,02

MMP13 11,88 (± 1,06) 8 8,35 (± 0,99) 5 0,0002 12,26 (± 1,09) 8 8,58 (± 1,09) 5 0,0003

TIMP3 5,12 (± 0,56) 7 4,15 (± 0,64) 4 0,046 5,09 (± 0,38) 7 4,33 (± 0,52) 4 n.s.

IL6 3,22 (± 0,59) 4 1,48 (± 0,15) 5 0,003 3,91 (± 0,43) 5 1,5 (± 0,30) 4 0,00003

IL8 4,81 (± 1,27) 5 0,17 (± 0,08) 4 0,0012 5,55 (± 1,30) 5 0,24 (± 0,17) 4 0,003

Cal78 ∆CT IL1β(-) n ∆CT IL1β(+) n p-value ∆CT IL1β(-) n ∆CT IL1β(+) n p-value

MMP1 13,41 (± 1,72) 7 7,65 (± 1,57) 7 0,00003 13,03 (± 2,42) 6 8,04 (± 1,33) 7 0,0009

MMP3 13,06 (± 1,37) 7 8,32 (± 1,31) 7 0,00009 12,54 (± 1,47) 7 8,44 (± 1,33) 7 0,0005

MMP10 17,80 (± 1,36) 5 13,72 (± 0,81) 5 0,0009 17,94 (± 1,42) 5 13,84 (± 0,80) 5 0,0007

MMP13 7,53 (± 3,28) 6 6,78 (± 0,93) 6 n.s. 8,70 (± 1,77) 6 6,87 (± 0,65) 6 n.s.

TIMP3 3,50 (± 0,29) 4 4,36 (± 0,52) 4 0,04 3,35 (± 0,44) 4 4,28 (± 0,54) 4 n.s.

IL6 2,08 (± 0,63) 5 -1,58 (± 0,50) 7 0,000008 1,82 (± 1,0) 5 -1,41 (± 0,36) 7 0,0012

IL8 5,65(± 1,12) 5 -2,96 (± 0,90) 7 0,000001 5,71 (± 1,05) 5 -2,93 (± 0,83) 7 0,000001

AMMP1 MMP3 MMP1340000

20000

40

20

0

10000

5000

60 40 20 0

pg p

rote

in/m

lng

pro

tein

/ml

(***/***)

(***/***)

(***/***)

(***/***)

(**/***)

(*/***) (***/**)

(**/***)(*/*)

1600

1200

800604020 0

IL6 IL8

(7/8)

(7/6)

(6/7)

(6/7)

1200 800 400 6 4 2 0

B

C281/2

(-)

C281/2

(-)

C281/2

(-)

C281/2

(-)

C281/2

(-)

C281/2

(+)

C281/2

(+)

C281/2

(+)

C281/2

(+)

C281/2

(+)

Cal78(+)

Cal78(+)

Cal78(+)

Cal78(+)

Cal78(+)

Cal78(-)

Cal78(-)

Cal78(-)

Cal78(-)

Cal78(-)

(7/5)

(6/6)

(15/15)

(9/8)

750050002500

300200100 0

controlNMRT-10 h

Zobr. 3: MMP a interleukin v supernatantech buněčné kultury. Obě buněčné linie byly vystaveny po dobu 10 hodin NMR (barevné sloupce) nebo placebo za stejnou dobu (šedé sloupce) s/bez IL-1β stimulace; sloupce tedy představují průměrnou koncentraci proteinu supernatantů buněčné kultury v jednom bodě za ošetřeného a ve druhém za kontrolních podmínek.

(A) Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí luminexového testu na MMP-1, -3 and -13, a na IL6 a IL8 s ELISA

(B). Student’s t-test byl použit k testování významnosti rozdílů mezi IL-1β nestimulovanými a IL-1β stimulovanými buňkami (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001). Počet expresí (n) na IL6 a IL8 jsou uvedeny v závorkách, n=5 pro všechna měření MMP.

78(IL-1β(-)) na MMP-3 a v Cal-78(IL-1β(+)) na MMP-10. IL6 exprese nebyla ovlivněna NMRT, poměrové hodnoty IL8 nalezené v C28 / I2 (IL-1β˛ (-)) mírně poklesly (Zobr. 4).

Koncentrace proteinů MMP, IL6 a IL8 byly stanoveny stanovením buněčných supernatantů

Prostřednictvím systému luminexů jsme kvantifikovali MMP-1, -3 a -13 jako i MMP-8 a -9, obojí nebylo exprimováno v detekovatelném množství v žádné buněčné linii (Zobr. 3a). NMRT nemělo žádný vliv na expresi MMP-1, -3 a -13, zatímco

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 07

ISSN: 2334-2846

IL-1β výrazně zvýšila koncentraci MMP-3 a MMP-13 v obou buněčných liniích a MMP-1 pouze v buňkách Cal-78. C28/I2(IL-1β (±)) a Cal-78(IL-1β (-)) prokázala tendenci ke snížení MMP-1 a C28/I2(IL-1β (-)) ke snížení MMP-3 produkce podle NMRT na proteinové úrovni. Oba zánětlivé cytokiny IL6 a IL8 byly měřeny standardními technikami ELISA, aby se testovaly rozdíly v expresi proteinu vyvolané NMRT. Nebyly detekovány žádné rozdíly, i když IL-lβ signifikantně indukovala expresi proteinů obou interleukinů (Zobr. 3b).

Discussion Klinicky je bolest a ztráta funkce kloubů u OA hlavním

problémem vedoucím k významně snížené kvalitě života pacientů trpících touto nemocí. [36,37]. Na základě své vysoké frekvence představuje OA jednu z nejdražších chorob, a to jak z hlediska přímých, tak nepřímých nákladů. Možnosti léčby jsou spíše omezené a převážně se vyvíjely k léčbě pouze symptomů bez ovlivnění mechanismu příčinných chorob. Farmakologická léčba je spojena s gastrointestinálními, renálními a kardiovaskulárními riziky. Zvláštní význam má vývoj nových terapií zlepšujících celkový stav pacientů s OA z hlediska kvality života na jedné straně a snižování velké socioekonomické zátěže na straně druhé. [38]. NMRT s nízkou intenzitou pole se úspěšně používá k léčbě pacientů s OA a je diskutováno, že funguje tak, že bojuje proti základním příčinám [12,39]. O účincích a mechanismu působení NMRT na buněčné úrovni je známo méně, což je základ této studie, ve které jsme se pokusili objasnit, jak může NMRT modulovat.

chondrocyty (Cal-78 a C28/I2) s a bez aktivovaných zánětlivých mechanismů.

Obecně cytokiny produkované zánětlivými buňkami hrají klíčovou roli při zánětu, ničení kloubů a ovlivňování funkce, proliferace a morfologie chondrocytů [40,41]. IL-1 hraje důležitou roli v zánětlivých procesech OA [34]. Naše výzkumy prokázaly rozsáhlé snížení buněčného růstu buněk Cal-78 v přítomnosti prozánětlivého cytokinu IL-1β, poprvé zjištěného ve třetí den léčby. Přestože byly předpokládány mírné změny v buněčném růstu lidských chondrocytů indukované NMRT [14], Studie na lidských dermálních fibroblastech se shodují s našimi výsledky, že nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v růstu mezi kontrolními a CalT78 a C28 / I2 buňkami ošetřenými NMRT. Popsané zlepšení struktury chrupavky u pacientů s kolenním OA po NMRT by proto mohlo být vysvětleno především zvýšenou metabolickou aktivitou chondrocytů než přímým zvýšením buněčného růstu. [13]. To by také vysvětlilo pozorování, že NMRT, když se aplikuje na buňky pod kontrolou (IL-1β(-)) oproti zánětlivým podmínkám (IL-1β(+)), zmenšuje rozdíl v buněčném růstu mezi těmito dvěma skupinami. Významné rozdíly v proliferaci mezi IL-1β(-) a IL-1β(+) ve skupinám, které nebyly ošetřeny NMRT, došlo ve třech dnech, zatímco při NMRT byl významný rozdíl tohoto parametru měřitelný pouze v sedmý den experimentálního postupu. V souladu s tím IL-1β doplněný k buňkám Cal 78 za kontrolních podmínek zvýšil počet buněk pozdního stádia apoptózy a mrtvých buněk, na rozdíl od buněk ošetřených NMRT, se významnými změnami, což svědčí o tom, že NMRT indukuje vliv na metabolickou aktivitu chondrocytů.

Výsledky z genových polí poukazují na vliv NMRT na strukturu, funkci a vlastnosti chrupavky prostřednictvím změn v expresi kolagenu FACIT (Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple helices) IXα2 a XIIα1 [42], zatímco kolageny I, III a IV, o nichž bylo prokázáno, že jsou ovlivněny v lidských dermálních fibroblastech podle NMRT [15], nebyly ovlivněny. Mezi proteoglykany dekorinem a biglykanem vykazovaly tyto látky enormní nárůst exprese pomocí NMRT [43]. Biglycan má signální vlastnosti vůči sestavení matrice, buněčné migraci a adhezi [44]. Zjištění, že biglycan je krátkodobým aktivátorem EGFR, a tedy MAPK, opět ukazuje, že NMRT může také hrát rozhodující roli v regulaci homeostázy chondrocytů a pericelulární matrice [45]. Kromě up-regulace EGF pomocí NMRT, prostřednictvím změn v expresi ligandů a složek TGF-P dráhy, BMP1, BMP2 a Smad3, Smad4 a IGF2, může NMRT interferovat s modulací chondrocytů zánětlivými procesy [46,47]. Integriny ITGB1 a ITGA3 byly dostupné regulovány NMRT [48]. Stimulace integrinů moduluje diferenciaci, remodelaci matrice, reakce na mechanickou stimulaci, přežití buněk chondrocytů a reguluje genovou expresi cestou MAPK [49,50].

Pomocí testů reportérového genu jsme dokázali, že NMRT po dobu 1 hodiny aktivovaly MAPK / ERK a MAPK / JNK v buňkách Cal-78. Pokud NMRT moduluje extracelulární signalizaci změnami v expresi ligandů a / nebo receptorů, pak by tyto změny mohly ovlivnit signální kaskády MAPK [51,52]. Zatímco NFKB, transkripční faktor a důležitý regulátor v buněčných odpovědích [53], byl v genových polích regulován, exprese luciferázy pod kontrolou

Zobr. 4: Kvantitativní nalýza genové exprese RT-PCR. Boxploty ukazují průměrné hodnoty poměrových hodnot mezi NMRT ošetřenými a kontrolními buňkami zjištěnými pomocí metody-∆∆Ct. Hodnoty poměru představují násobnou změnu v genové expresi indukované NMRT v rámci stimulace obou buněčných linií ± IL-1β. Statistické vyhodnocení je založeno na změnách hodnot ∆Ct získaných z kontrolních buněk a buněk ošetřených NMR. qRT-PCR, byl proveden pro metaloproteinázu MMP-1, -3, -10 a -13 a interleukin IL6 a IL8, na obou buněčných liniích v nepřítomnosti nebo v přítomnosti IL-1β (± IL-1β). Významné rozdíly jsou dány hodnotami p generovanými Studentovým t-testem (*: p<0,05; **: p<0,01); počet experimentů byl mezi pěti a sedmi; všechna měření byla prováděna dvojmo. Hodnota jedna pro žádnou změnu je označena přerušovanou čarou.

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 08

ISSN: 2334-2846

NFKB byl zvýšen po NMRT. Tento rozpor by mohl být přičítán různému času zpracování NMR použitému v těchto dvou experimentálních aplikacích.

MMP a interleukiny silně zapojené do manifestace osteoartrózy mohou představovat další cíle, které reagují na NMRT. MMP se za fyziologických podmínek účastní různých procesů, včetně hojení ran, kostní resorpce a vývoje plodu, zatímco patologicky jsou spojeny s artritidou, autoimunitními chorobami, fibrózou, srdečním selháním a rakovinou [54]. V našich experimentech na úrovni RNA byly pozorovány mírné změny pro MMP-3 a MMP-10 v buňkách Cal-78 a pro MMP-13 v buňkách C28 / I2. Zatímco MMP-3 aktivuje MMP-1 a štěpí širokou škálu matricových proteinů, oba jsou nejvíce všudypřítomně exprimované MMP, zatímco MMP-13 v pojivové tkáni má omezenější vzorec exprese a obvykle se produkuje pouze chrupavkami a kostmi během vývoje a chondrocytů u OA [55,56]. Inhibitory MMP-13 vykazují chondroprotektivní účinky a potenciálně modulují bolest kloubů [57,58]. Snížení hladin MMP-13 v buňkách C28 / I2 pomocí NMRT, i když poněkud malé, může mimo jiné hrát roli při pozorovaném zlepšení bolesti a funkčnosti pacientů s OA, kteří podstoupili NMR terapii [7,9,41]. Zatímco se exprese IL6 nezměnila, snížená exprese IL8 v buňkách C28 / I2 (IL-1ß (-)) může naznačovat mírnou sníženou regulaci hlavního mediátora v zánětlivých reakcích. Důvodem, proč buňky Cal-78 nevykazují významné změny hladin MMP-13 / IL8, může být vysoká bazální exprese MMP-13 v kombinaci se známými deficity v modulaci nádorových buněk obecně [59]. Jak ukazují předložené údaje, existuje obrovský rozdíl v expresi MMP a interleukinů mezi buňkami chondrosarkomu a chondrocyty (Tab. 1). Zatímco analýza na úrovni RNA různých genů naznačila mírný vliv na expresi genů, nebyli jsme schopni potvrdit tato zjištění na hladině proteinu.

ZávěrNaše studie odhalila různé signální dráhy jako potenciální cíle

pro nízkofrekvenční NMRT. Výsledky testů buněčné proliferace a qRT-PCR ukazují, že účinky mediátoru pro zánět IL-lß jsou méně významné při NMRT než za kontrolních podmínek. Tato zjištění a pozorovaná redukce exprese MMP-13 pomocí NMRT zdůvodňují předpokládaný protizánětlivý účinek NMRT zodpovědný za úlevu od bolesti. Kromě toho objasnění toho, jak je NMRT zpracováváno cílenými buňkami, rozšíří perspektivu klinické adaptace NMRT přesnější a účinnější aplikací tohoto alternativního terapeutického působení..

Reference

1. Aigner T, Sachse A, Gebhard PM, Roach HI (2006) Osteoarthritis: pathobiology-targets and ways for therapeutic intervention. Adv Drug Deliv Rev 58: 128-149.

2. Bijlsma JW, Berenbaum F, Lafeber FP (2011) Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice. Lancet 377: 2115-2126.

3. Page CJ, Hinman RS, Bennell KL (2011) Physiotherapy management of knee osteoarthritis. Int J Rheum Dis 14: 145-151.

4. Kon E, Filardo G, Drobnic M, Madry H, Jelic M, et al. (2012) Non-surgical management of early knee osteoarthritis. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 20: 436-449.

5. Skou ST, Roos EM, Laursen MB, Rathleff MS, Arendt-Nielsen L, et al. (2012) Total knee replacement plus physical and medical therapy or treatment with physical and medical therapy alone: A randomised controlled trial in patients with knee osteoarthritis (the MEDIC-study). BMC Musculoskelet Disord 13: 67.

6. Kupce E (2001) Applications of adiabatic pulses in biomolecular nuclear magnetic resonance. Methods Enzymol 338: 82-111.

7. Kullich W, Schwann H, Walcher J, Machreich K (2006) The effect of nuclear resonance therapy with a complex 3-dimensional electromagnetic nuclear resonance field on patients with low back pain. J Back Musculoskeletal Rehab 19: 79-87.

8. Kullich W, Schwann H, Machreich K, Ausserwinkler M (2006) Additional outcome improvement in the rehabilitation of chronic low back pain after nuclear resonance therapy. Rheumatologia 20: 7-12.

9. Kullich W, Ausserwinkler M (2008) Functional improvement in osteoarthritis of the hand after treatment with uclear magnetic resonance. Orthopädische Praxis; 44: 287-290.

10. Auerbach B, Melzer C (2003) Prospektive Untersuchung zur Wirksamkeit der MultiBioSignal-Therapie bei der Behandlung der Gonarthrose. Z Orthop Ihre Grenzgeb 141.

11. Jansen H, Brockamp T, Paletta JRJ, Ochman S, Raschke MJ, et al. Does have low-energy NMR an effect on moderate gonarthrosis? In 52nd Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society.

12. Levers A, Staat M, van Laack W (2011) Analyse der Langzeitwirkung der MBST Kernspinresonanz-Therapie bei Gonarthrose. Orthopädische Praxis 47: 536-543.

13. Froböse I, Eckey U, Reiser M, Glaser C, Englmeier F, et al. (2000) Evaluation of the effectiveness of three-dimensional pulsed electromagnetic fields of the multibiosignal therapy on the regeneration of cartilagenous structures. Othopädische Praxis 36: 510-515.

14. Temiz-Artmann A, Linder P, Kayser P, Digel I, Artmann GM, et al. (2005) NMR in vitro effects on proliferation, apoptosis, and viability of human chondrocytes and osteoblasts. Methods Find Exp Clin Pharmacol 27: 391-394.

15. Digel I, Kurulgan E, Linder Pt, Kayser P, Porst D, et al. (2007) Decrease in extracellular collagen crosslinking after NMR magnetic field application in skin fibroblasts. Med Bio Eng Comput 45: 91-97.

16. Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Höller C, Sipos S, Kullich W, et al. (2009) Influenve of NMR therapy on metabolism of osteosarcoma- and chondrocarcoma cell lines. Bone 44: S295.

17. Aigner T, Kim HA (2002) Apoptosis and cellular vitality: issues in osteoarthritic cartilage degeneration. Arthritis Rheum 46: 1986-1996.

18. Millward-Sadler SJ, Wright MO, Davies LW, Nuki G, Salter DM (2000) Mechanotransduction via integrins and interleukin-4 results in altered aggrecan and matrix metalloproteinase 3 gene expression in normal, but not osteoarthritic, human articular chondrocytes. Arthritis Rheum 43: 2091-2099.

19. Leong DJ, Hardin JA, Cobelli NJ, Sun HB (2011) Mechanotransduction and cartilage integrity. Ann N Y Acad Sci 1240: 32-37.

20. Yang X, Chen L, Xu X, Li C, Huang C, et al. (2001) TGF-beta/Smad3 signals repress chondrocyte hypertrophic differentiation and are required for maintaining articular cartilage. J Cell Biol 153: 35-46.

21. Las Heras F, Gahunia HK, Pritzker KP (2012) Articular cartilage development: a molecular perspective. Orthop Clin North Am 43: 155-171

22. Bobick BE, Kulyk WM (2008) Regulation of cartilage formation and maturation by mitogen-activated protein kinase signaling. Birth Defects Res C Embryo Today 84: 131-154.

23. Li J, Zhao Z, Liu J, Huang N, Long D, et al. (2010) MEK/ERK and p38 MAPK regulate chondrogenesis of rat bone marrow mesenchymal stem cells through delicate interaction with TGF-beta1/Smads pathway. Cell Prolif 43: 333-343.

24. Stanton LA, Underhill TM, Beier F (2003) MAP kinases in chondrocyte

Citation: Steinecker-Frohnwieser B, Weigl L, Weberhofer G, Kullich W, Kress HG. The Influence of Nuclear Magnetic Resonance Therapy (NMRT) and Interleukin IL1-b Stimulation on Cal 78 Chondrosarcoma Cells and C28/I2 Chondrocytes. J Orthopedics Rheumatol. 2014;1(3): 9.

J Orthopedics Rheumatol 2(2): 9 (2014) Page - 09

ISSN: 2334-2846

We would like to thank Brigitta Schweiger for her technical assistance in perfoming the enzyme-linked immunoassays (Elisa).

Acknowledgements

differentiation. Dev Biol 263: 165-175.

25. Chun JS (2004) Expression, activity, and regulation of MAP kinases in cultured chondrocytes. Methods Mol Med 100: 291-306.

26. Sondergaard BC, Schultz N, Madsen SH, Bay-Jensen AC, Kassem M, et al. (2010) MAPKs are essential upstream signaling pathways in proteolytic cartilage degradation--divergence in pathways leading to aggrecanase and MMP-mediated articular cartilage degradation. Osteoarthritis Cartilage 18: 279-288.

27. Brinckerhoff CE, Matrisian LM: Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat Rev Mol Cell Biol 2002, 3: 207-14.

28. Parks WC, Wilson CL, López-Boado YS (2004) Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity. Nat Rev Immunol 4: 617-629.

29. Hadler-Olsen E, Fadnes B, Sylte I, Uhlin-Hansen L, Winberg JO (2011) Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease. FEBS J 278: 28-45.

30. Arend WP (2001) Cytokine imbalance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: the role of interleukin-1 receptor antagonist. Semin Arthritis Rheum 30: 1-6.

31. Goldring MB, Otero M (2011) Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol 23: 471-478.

32. Goldring MB, Otero M, Tsuchimochi K, Ijiri K, Li Y (2008) Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis 67 Suppl 3: iii75-iii82.

33. Lim H, Kim HP (2011) Matrix metalloproteinase-13 expression in IL-1β-treated chondrocytes by activation of the p38 MAPK/c-Fos/AP-1 and JAK/STAT pathways. Arch Pharm Res 34: 109-117.

34. Moon MH, Jeong JK, Lee YJ, Seol JW, Park SY (2012) Sphingosine-1-phosphate inhibits interleukin-1β-induced inflammation in human articular chondrocytes. Int J Mol Med 30: 1451-1458.

35. Abramson SB, Attur M (2009) Developments in the scientific understanding of osteoarthritis. Arthritis Res Ther 11: 227.

36. Hunter DJ, McDougall JJ, Keefe FJ (2008) The symptoms of osteoarthritis and the genesis of pain. Rheum Dis Clin North Am 34: 623-643.

37. Berenbaum F (2012) Osteoarthritis as an inflammatory disease (osteoarthritis is not osteoarthrosis!). Osteoarthritis Cartilage 21: 16-21.

38. Berenbaum F (2008) New horizons and perspectives in the treatment of osteoarthritis. Arthritis Res Ther.

39. Kullich W, Overbeck K, Spiegel HU (2013) One-year-survey with multicenter data of more than 4,500 patients with degenerative rheumatic diseases treated with therapeutic nuclear magnetic resonance. J Back Musculoskelet Rehabil 26: 93-104.

40. Schuerwegh AJ, Dombrecht EJ, Stevens WJ, Van Offel JF, Bridts CH, et al. (2003) Influence of pro-inflammatory (IL-1 alpha, IL-6, TNF-alpha, IFN-gamma) and anti-inflammatory (IL-4) cytokines on chondrocyte function. Osteoarthritis Cartilage 11: 681-687.

41. Fan Z, Bau B, Yang H, Soeder S, Aigner T (2005) Freshly isolated osteoarthritic chondrocytes are catabolically more active than normal chondrocytes, but less responsive to catabolic stimulation with interleukin-1beta. Arthritis Rheum 52: 136-143.

42. Käpylä J, Jäälinoja J, Tulla M, Ylöstalo J, Nissinen L, et al. (2004) The fibril-

associated collagen IX provides a novel mechanism for cell adhesion to cartilaginous matrix. J Biol Chem 279: 51677-51687.

43. Roughley PJ (2006) The structure and function of cartilage proteoglycans. Eur Cell Mater 12: 92-101.

44. Midwood KS, Williams LV, Schwarzbauer JE (2004) Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. Int J Biochem Cell Biol 36: 1031-1037.

45. Iacob S, Cs-Szabo G (2010) Biglycan regulates the expression of EGF receptors through EGF signaling pathways in human articular chondrocytes. Connect Tissue Res 51: 347-58.

46. Tian-Fang Li, Regis J. O’Keefe, and Di Chen (2005) TGF-β signaling in chondrocytes. Front Biosci 10: 681-688.

47. van der Kraan PM, Blaney Davidson EN, Blom A, van den Berg WB (2009) TGF-beta signaling in chondrocyte terminal differentiation and osteoarthritis: modulation and integration of signaling pathways through receptor-Smads. Osteoarthritis Cartilage 17: 1539-1545.

48. Humphries JD, Byron A, Humphries MJ (2006) Integrin ligands at a glance. J Cell Sci 119: 3901-3903.

49. Loeser RF (2002) Integrins and cell signaling in chondrocytes. Biorheology 39: 119-124.

50. Shakibaei M, Csaki C, Mobasheri A (2008) Diverse roles of integrin receptors in articular cartilage. Adv Anat Embryol Cell Biol 197: 1-60.

51. Guo X, Wang XF (2009) Signaling cross-talk between TGF-beta/BMP and other pathways. Cell Res 19: 71-88.

52. Sondergaard BC, Schultz N, Madsen SH, Bay-Jensen AC, Kassem M, et al. (2010) MAPKs are essential upstream signaling pathways in proteolytic cartilage degradation--divergence in pathways leading to aggrecanase and MMP-mediated articular cartilage degradation. Osteoarthritis Cartilage 18: 279-288.

53. Roman-Blas JA, Jimenez SA (2006) NF-kappaB as a potential therapeutic target in osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Osteoarthritis Cartilage 14: 839-848.

54. Ra HJ, Parks WC (2007) Control of matrix metalloproteinase catalytic activity. Matrix Biol 26:587–596.

55. Meller D, Li DQ, Tseng SC (2000) Regulation of collagenase, stromelysin, and gelatinase B in human conjunctival and conjunctivochalasis fibroblasts by interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha. Invest Ophthalmol Vis Sci 41: 2922-2929.

56. Vincenti MP, Brinckerhoff CE (2002) Transcriptional regulation of collagenase (MMP-1, MMP-13) genes in arthritis: integration of complex signaling pathways for the recruitment of gene-specific transcription factors. Arthritis Res 4: 157-164.

57. Piecha D, Weik J, Kheil H, Becher G, Timmermann A, et al. (2010) Novel selective MMP-13 inhibitors reduce collagen degradation in bovine articular and human osteoarthritis cartilage explants. Inflamm Res 59: 379-389.

58. Li NG, Shi ZH, Tang YP, Wang ZJ, Song SL, et al. (2011) New hope for the treatment of osteoarthritis through selective inhibition of MMP-13. Curr Med Chem 18: 977-1001.

59. Meierjohann S, Hufnagel A, Wende E, Kleinschmidt MA, Wolf K, et al. (2010) MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Mol Cancer 9: 201.