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Universidade Federal de PelotasCentro de Biotecnologia

Caracterização molecular de isolados de leptospira

Odir Antônio Dellagostin, Ph.D.odir@ufpel.edu.br

TAXONOMIA

Leptospira interrogans

Leptospira weilii

Leptospira borgpetersenii

Leptospira noguchii

Leptospira santarosai

Leptospira alexanderi

Leptospira kirschneri

Leptospira genospecies 1

Leptospira wolffii

Patogênicas

Intermediárias

Saprófitas

19 espécies genômicas >250 sorovares

Leptospira biflexa

Leptospira meyeri

Leptospira wolbachii

Leptospira genospecies 3

Leptospira genospecies 4

Leptospira genospecies 5

Leptospira fainei

Leptospira broomii

Leptospira inadai

Leptospira licerasiae

Caracterização sorológica

Baseada na reação antígeno x anticorpo

Detecta variações antigênicas (proteínas,

mas principalmente LPS)

Difícil de ser realizada pois requer bateria

de soros bem caracterizados

Só realizado em centros de referência

Caracterização sorológica x molecular

Caracterização sorológica x molecular

Caracterização molecular

Baseada no DNA

Detecta variações na seqüência de nucleotídeos

ou no tamanho de fragmentos de DNA

Requer apenas equipamentos comuns de biologia

molecular

Pode ser realizada em qualquer laboratório

Principais técnicas de caracterização molecular

Seqüenciamento de DNA

Pulsed Field Gel Electrophoresis – PFGE

Variable Number of Tanden Repeats – VNTR

Multi Locus Sequence Typing – MLST

Seqüenciamento do gene 16S rDNA

Extração de DNA e PCR

Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA

PCR

Seqüenciamento de DNA

http

://w

ww

.life

.uiu

c.ed

u/ib

/335

/del

etio

ns.jp

g

(Fonte: Morey et al., 2006)

PFGEEletroforese em Campo Pulsado

Equipamento

PrincípioDNA Bacteriano

Árvore Filogenética

Resultado de uma análise por PFGE

Eletroforese de DNA de diferentes amostras

PFGE

VNTR

VNTR 7

VNTR 2 VNTR 11

VNTR 10

VNTR 4

VNTR 9

VNTR 19

VNTR

Caracterização Molecular

MA B

Eletroforese

250 pb

100 bp

CÓPIAS

5

2

A

B

VNTR 1= 50 pb

VNTR

VNTR 1

VNTR 1

VNTR

N° ordem Origem do isolado VNTR7

VNTR10 VNTR19 TipificaçãoVNTR (sorovar)

1 Canino - Canis familiaris (M5/90) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae

2 Canino - Canis familiaris (M12/90) 10 3 10 Canicola

3 Canino - Canis familiaris (M5/91) 10 3 10 Canicola

4 Humano - Homo sapiens (M21/96) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae

5 Rato - Rattus norvegicus (M9/99) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae

6 Rato - Rattus norvegicus (M11/99) 1 7 2 Icterohaemorrhagiae

7 Rato - Rattus norvegicus (M10/99) 10 3 10 Canicola

8 Canino - Caninus familiaris (LO1) 10 3 10 Canicola

9 Canino - Caninus familiaris (LO2) 10 3 10 Canicola

10 Canino - Caninus familiaris (LO5) 10 3 10 Canicola

11 Canino - Caninus familiaris (LO6) 10 3 10 Canicola

12 Canino - Caninus familiaris (LO8) 10 3 10 Canicola

13 Canino - Caninus familiaris (LO11) 10 3 10 Canicola

14 Canino - Caninus familiaris (LO12) 10 3 10 Canicola

15 Suíno- Sus scrofa domestica (L03) 10 3 10 Canicola

16 Suíno- Sus scrofa domestica (L04) 10 3 10 Canicola

VNTR de isolados brasileiros de L. interrogans

VNTR de isolados de Pelotas

MLST – Multi Locus Sequence Typing

(Ahme et al., 2006)d

Conclusão

• Seqüenciamento do gene 16S rDNA – Permite a identificação da espécie.

• PFGE – Possibilita a identificação do sorovar na maioria dos casos. Difícil de ser realizada.

• VNTR – Permite a identificação de sorovar, porém apenas de L. interrogans.

• MLST – Técnica mais aprimorada. Permite a diferenciação de isolados de um mesmo sorovar. Ideal para o estudo de surtos.

Universidade Federal de PelotasCentro de Biotecnologia

Grupo de pesquisa em leptospirose

UFPel – Centro de Biotecnologia• Odir A. Dellagostin• Éverton F. da Silva• Fabiana K. Seixas• Sandra D. Jouglard• José Antônio Aleixo• Gustavo Cerqueira• Daiane Hartwig• Karine Forster• Danieli Hartmann• Michel Fagundes• André Grassmann

CPqGM – Fiocruz - BA• Albert Ko• Alan McBride• Flávia da Cruz - UFBA

Financiamento• Bio-Manguinhos (Fiocruz• CNPq, CAPES, NIH

Bio-Manguinhos - Fiocruz• Marco Medeiros• Ana Paula Argondizzo

UFPel – CCZ• Claudiomar Brod• Cláudia Fernandes

FMVZ - USP• Silvio A. Vasconcellos• Fabiana Miraglia

UFF• Walter Lilenbaum

Muito obrigado!

odir@ufpel.edu.br

www.ufpel.edu.br/cenbiot

www.ufpel.edu.br/cenbiot/biomol