products and services - carnabio · 2020. 3. 18. · mark1 skmlck smmlck qik drak1 nuak2 camkk2 sik...
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PRODUCTS AND SERVICES-Kinase company-
Kinases ~Available from Carna Biociences~
1 www.carnabio.com
TKL
STE
CK1
AGCCMGC
Other
CAMK
TKTIE1
RYK
LMR3
LMR1 LMR2 IRAK2
IRAK3
SgK288
RIPK3RIPK1
LRRK1SgK496
ANKRD3ALK7
TESK2
ANPaANPb
HSER
CYGFCYGD
ILK
MLKL
ARAF
KSR2KSR1
SuRTK106CCK4
MPSK1
GAK
AAK1BIKE
CASK
HUNK
SNRK
DCAMKL3PSKH2PSKH1
VACAMKL
CAMK1g
TSSK4
PRP4
IRE2IRE1 SCYL2
SCYL1
SRLK6 SRLK5
TAO1
ZC4/NRKMYO3AMYO3B
SCYL3PIK3R4
CK1a2
MASTL
YANK1
YANK2
YANK3
VRK3
SBK
SgK493SgK196
SgK086caMLCK
DAPK2
DRAK2 Obscn.d1
SgK494
MAST4
MAST1
MAST3
GPRK5
CDKL4CDKL1CDKL3CDKL2
CDKL5MOK
PCTAIRE3
PCTAIRE2PFTAIRE2PFTAIRE1
CCRK
Erk3
Erk4
NEK10
WEE1b
NEK5
PLK4
FusedULK1
TTN
CLIK1CLIK1L
ObscnSPEG.d2Trad
Qsk
SPEG.d1Trio
ULK4ULK2
CRK7
CDK10PITSLRE
CHED
MAK
RHOK
MAST2 PRKY
SgK069 SgK110
SgK223
SgK269
SgK495
Trb3
Trb1 Trb2
PINK1 PDK1
RSKL2RSKL1
SgK396
NRBP1NRBP2
MAP3K15
KHS1
YSK4
KHS2
SgK307SgK071Slob
TBCK
KIS RNAseL
EphA10
EphB6
HER3/ErbB3
PRPK
MISR2
p70S6Kb
ROR2ROR1
YESSRC
HCKLCK
BLKFRK
BRKSRM
ARG
TECTXK
ITKBMXBTKROSALK
LTKINSRIGF1R
LYNa, LYNb
FMSPDGFRβ PDGFRα
KIT
KDRFLT1
IRRFESFER
FGFR2FGFR3
FGFR4 FGFR1RET
TIE2
FLT3MET
RONMER
TYRO3AXL
HER2
ABL
FYN[isoform a][isoform b]
FGR
MUSK
TRKA
TRKCTRKB
DDR2DDR1
ZAP70SYKFAK
EphA1
EphA2
EphA8
EphA6
EphA7
EphA4EphA5
EphA3
EphB4EphB3 EphB1
EphB2 HIPK2HIPK1
HIPK3
PYK2
MSSK1DYRK1ADYRK1B
DYRK2DYRK3 CLK2
CLK3
SRPK1SRPK2
CLK1CLK4
HIPK4
ACK TNK1JAK1
TYK2JAK2
RAF1BRAF
JAK3
MLK1
MLK3IRAK1
IRAK4
TESK1
TGFβR1ALK4
LRRK2
RIPK2
PBKMOS
MLK2DLK
TAK1-TAB1ZAK LIMK1
LIMK2
BMPR1B
ACVR2BACVR2A
TGFβR2ALK2ALK1
LZK
BMPR2
HER4EGFR
CTKCSK
BMPR1A
FLT4
PAK2 PAK6PAK5
LOKSLK
COT
WNK1 WNK3
WNK2WNK4CDC7
MAP4K2MAP3K3MAP3K2
MAP3K5MAP3K4
MAP2K2MAP2K1MAP2K5
MAP2K4
MAP2K6MAP2K3
MAP2K7
HGKMINK
PAK1 MST1MST2
MST3
MST4
TAOK2TAOK3
PAK3
STLK3OSR1
YSK1
MAP3K1MAP3K14
BUBR1
VRK1VRK2
TTBK1TTBK2
CK1δCK1εCK1αCK1γ1
CK1γ3CK1γ2 AKT1 AKT2SGK3 PKN2
PKN1 PKCηPKCε
PKCαPKCβ1
PKCγPKCβ2SGK
SGK2
AKT3
Haspin
PKN3
PAK4
PKCδPKCθPKCι
PKCζRSK1 RSK2
RSK4RSK3MSK2
p70S6KCRIK
ROCK1ROCK2
DMPK1
MRCKαMRCKβ
NDR1
PKACαPRKX
PGKCGK2
BARK1BARK2CK2α1/β GPRK7
GPRK4
GPRK6 PKACβ
LATS2LATS1
NDR2
PKACγCK2a2/b
CDK2CDK3
PCTAIRE1(CDK16)/CycY
CDC2
CDK6CDK4
CDK5CDK7
CDK8
JNK1p38βp38αp38γp38δ
Erk2Erk1Erk5
NLK
JNK2 JNK3
CDK9CDK9/CycK
GSK3βGSK3α
CDK11
Erk7
ICK
TTK
AurAAurB
AurC
PLK2PLK3
PLK1
PEKNEK1
NEK2MYT1
NEK6NEK9
NEK7
PKD2
PKD1PKD3
PKRWEE1
NEK11
TLK1TLK2
NEK3NEK4
NEK8
CHK1LKB1
CaMKK1
TSSK2
MNK1CHK2
MAPKAPK2CAMK2γ
CAMK2αCAMK2δ
CAMK2β
CAMK1αCAMK1β
CAMK1δ
CAMK4
PHKG1PHKG2
DCAMKL2DCAMKL1
MGC42105
NuaK1MELK
BRSK2BRSK1
AMPKα2/β1/γ1, AMPKα2/β2/γ1AMPKα1/β1/γ1, AMPKα1/β2/γ1
MAPKAPK3
MAPKAPK5 MNK2 PIM1
PIM2
PASK
TSSK1
IKKαIKKβ
IKKεTBK1
DAPK1DAPK3
MARK4MARK2
MARK3MARK1
skMLCK smMLCK
QIK
DRAK1
NuaK2
CaMKK2
SIK
PIM3
TNIK
TSSK3
SSTK
MAP3K6
GCN2
ULK3
DMPK2
STK33
HRI
HH498
DYRK4
MLK4
HPK1
MSK1
BUB1
CHAK1EEF2KPDHK1PDHK2PDHK3PDHK4
Atypical
Erk2Erk5JNK1JNK2 (inactive only)MAP2K1MAP2K6MAP2K7p38a
Inactive & Inactive-mutants
MutantsABL [E255K]ABL [T315I]ALK [C1156Y]ALK [F1174L]ALK [G1202R]ALK [G1269A]ALK [L1196M]ALK [R1275Q]ALK [T1151_L1152insT]ALK2 [Q207D]ALK2 [R206H]BRAF [T599 V600insT]BRAF [V600E]BTK [C481S]EGFR [d746-750]EGFR [d746-750/T790M]EGFR[D770_N771 ins NPG]EGFR [L858R]EGFR [L861Q] EGFR [T790M]EGFR [T790M/L858R]EML4-ALKFGFR1 [V561M]FGFR2 [N549H]FGFR2 [V564I]FGFR3 [G697C]FGFR3 [K650E]FGFR3 [K650M]FGFR3 [V555L]FGFR3 [V555M]FGFR4 [N535K]FGFR4 [V550E]FGFR4 [V550L]JAK2 (JH1 JH2)[V617F]KIT [D816E]KIT [D816V]KIT [D816Y]KIT [T670I]KIT [V560G]KIT [V560G/D816V]
LRRK2 [G2019S]MAP2K1 [F129L]MAP2K1 [P124L]MET [D1228H]MET [M1250T]MET [Y1235D]NPM1-ALK PDGFRa [D842V]PDGFRa [T674I]PDGFRa [V561D] RET [G691S]RET [M918T]RET [S891A]RET [Y791F]YES(YESs) [T348I]
Lipid Kinases
PI4KBPIK3C3PIK3CA / PIK3R1 PIK3CB / PIK3R1 PIK3CD / PIK3R1PIK3CGPIKFYVE(PIP5K3)PIP4K2APIP4K2BPIP4K2CPIP5K1APIP5K1BPIP5K1CPIP5KL1
SPHK1SPHK2
2www.carnabio.com
キナーゼ蛋白質製品 ~High Quality Active Kinase Products~
全て自社内で製造された約450の高品質蛋白質製品を品質データを添えてご注文を頂いてから2-3日でお届け致します。自社内でクローニングしたキナーゼ遺伝子を昆虫細胞や大腸菌に導入し、発現・精製した活性を有するキナーゼ蛋白質(アッセイグレード)は5ugの少量包装からmg単位のバルクサイズまで幅広いご要望にお応えしてご提供可能です。
文献をもとに選択されたコンストラクト
DNA配列を確認してから発現
PMF(Peptide Mass Fingerprinting)によるアミノ酸配列確認
最適な基質を用いての活性測定データをご提供ロットごとに提示
宿主由来蛋白質の混入をチェック
ロット間差の少ない安定した製造で一貫性のあるデータ取りをサポート
◆ 上流キナーゼによる活性化
◆ タグ除去による活性化
◆ ATP処理による活性化
高活性蛋白質製品の秘密
PIKシリーズを始めとした豊富なラインナップで脂質キナーゼ探索をサポート致します。
ほとんどの蛋白質製品は製造過程で活性を有していますが、
一部の製品には活性処理を施し安定した活性を保証しています。
TK、STKに加え脂質キナーゼ蛋白質製品も充実
キナーゼ蛋白質のリン酸化活性測定にご使用頂ける蛋白質基質もご用意しております。
基質キナーゼ蛋白質製品
カスタムなご要望にもご対応致します。
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
1
0 2 4 6 8 10 12
P/(P
+S)
EGFR (ng/µl)
13CBS-0004
13CBS-0005
11CBS-1108
ロット間活性安定性データ
* ターゲットリストは別紙をご参照ください。
ビオチン化キナーゼ蛋白質製品 ~Biotinylated Kinases~
3 www.carnabio.com
表面プラズモン共鳴(SPR)やバイオレイヤー干渉法(BLI)といった物質間の相互作用を評価する系(解析機器)でご利用いただけるビオチン化キナーゼ蛋白質を販売しております。これらの解析機器で低分子化合物の創薬研究・開発を行なう際、リガンドとする標的分子蛋白質を活性、構造を保持したままセンサー表面に固定化(固相化)することはとても難しいことです。カルナ自社製造ビオチン化キナーゼはバイオロジカルに特異的部位のみをビオチン化し、バインディング測定などでのリアルタイムで安定したデータ取得を簡易に可能にします。SPRやBLIだけでなく、AlfaScreenTMやHTRF®技術を用いたアッセイ等様々な用途、解析機器でご利用いただける製品です。
バイオロジカルに作成されたカルナのビオチン化タンパクの特徴
一つのキナーゼ分子に一つのビオチン分子をラベリング特異的部位をビオチン化ATP結合サイトへのビオチンの結合がないため、高活性を維持バキュロウイルス発現システムにより蛋白質を取得購入後のラベリングが不要で取扱いが簡単 → 時間、コスト削減に貢献
(*ご要望に応じて活性化処理をしていないキナーゼも提供可能です)安定した活性維持のため、一部活性化処理をしたキナーゼを提供
Biotin
Binding kinetics of ibrutinib to BTK[T474I]BTK[T474I] Ibrutinib
Time
Resp
onse
Biotin
Biotin acceptor peptideFlag-tag™ Kinase
Baculovirus
Insect Cell
Biological Biotinylation
Binding kinetics of bosutinib to ABL
Resp
onse
Time
<当社のビオチン化キナーゼを用いたSPRデータを当社ホームページにてご覧いただけます。 (NTRC社測定)>
* ターゲットリストは別紙をご参照ください。
4www.carnabio.com
キナーゼアッセイキット ~QuickScout Screening Assist® Kits~
カルナバイオサイエンスの QuickScout Screening Assist® Kits はインハウスでキナーゼ阻害剤の特異性を調べるスクリーニング、プロファイリングにご利用いただけます。初回ご購入後は必要な試薬を単品でお求めいただけます。ATP、Metalを含まない基質単体も用意しておりますので、お客様で最適化を行ないアッセイいただくことも可能です。
* キナーゼの希釈倍率とMSAの測定パラメータはキナーゼ毎に異なります。* ターゲットリストは別紙をご参照ください。
プラットフォーム 最少販売単位 キット構成品
QuickScout® MSAMobility Shift Assay
QuickScout® FPFP(IMAP™)
QuickScout® ELISAELISA
QuickScout® ADP-GloTMADP-GloTM
QuickScout® TR-FRETTR-FRET
1 x 384-well plate相当
400dp
1 x 384-well plate相当
400dp
1 x 384-well plate相当
400dp
1 x 384-well plate相当
400dp
1 x 96-well plate相当
100dp
パーキンエルマー社のLabChip® テクノロジーを用いた機器でご利用いただけます
● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● ターミネーションバッファー ● プロトコル(分離条件込み) HPでサンプル※公開
● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● ELISA用抗体(TTK, WEE1は除く)● プロトコル
● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● プロトコル
● キナーゼ蛋白質 ● 基質ミクスチャー(ATP, Cation 含む)● アッセイバッファー ● プロトコル
● キナーゼ蛋白質● 基質溶液● キナーゼ希釈バッファー(Cation含む)● アッセイバッファー● 検出試薬添加用MgCl2溶液● プロトコル
本製品はカスタムメイドで、通常、ご発注後2~3週間でお届けいたします。
リピート購入率の高い簡便さを実感 いただける製品です
当社プロファイリングサービスのノウハウを盛り込んだ信頼性の高い製品必要な試薬とプロトコルがセットになった Ready-To-Run タイプ 1キットを複数回に分けてアッセイ実施が可能
キナーゼの活性測定が簡便にできるアッセイキットの特長
キナーゼプロファイリング・スクリーニングサービス
5 www.carnabio.com
>320のターゲットリストの中から探索ご希望のターゲットキナーゼをお選びいただき最適化された条件で測定し、信頼のおける測定結果データにてご報告致します。4つのプラットフォームを用いることでお客様の幅広いターゲット探索をサポート、ATP濃度はKm値に加え1mMでの測定をお選び頂けることでセルベースアッセイデータと相関性のあるカイネティックな化合物の反応を予見頂けます。
1mM ATP 濃度を用いてより生体に近い環境で測定することにより化合物の特性を見極めることが出来ます。
ATP濃度 = Km値付近に加え、1mMで測定
ターゲットキナーゼへの結合速度が非常に遅い阻害剤の本来の阻害活性を評価するにはプレインキュベーション試験をお勧め致します(室温 30 分での事前インキュベーションを行うため、室温での活性安定性が確認されたキナーゼでのみ実施しております)。
スローバインダーに最適なプレインキュベーションサービス
基質のリン酸化/非リン酸化を測定することにより、ダイレクトなリン酸化を評価
PO₄
Fluorescentpeptide substrate
FITC
Phospho-peptideproduct
Kinase
ATP
P P P P
( - )Electrophoresisof Analytes
Pressure-driven Flow
(+)
(Vacuum)(Sipper)
Product:More Negatice
Substrate :More Positive
Laser Detection
Substrate Peak
Product Peak
1:Mobility Shift Assay
2:IMAP™ (Immobilized Metal Ion-Affinity Partitioning)3:ELISA (Enzyme linked immunosorbent Assay)4:ADP-Glo™
TK
PYK2
TNK1JAK1
TYK2JAK2
JAK3
FMSKIT
KDRFLT1
YESSRC
HCKLCK
BLK
HER2
FRK
HER4EGFR
BRKSRM
ARGABL
CTKCSK
TECTXK
ITKBMXBTK
ROSALKLTK
INSRIGF1R IRR
FESFERFGFR2
FGFR3FGFR4 FGFR1
RETTIE2
FYNFGRLYN
FLT4
FLT3MET
RONMER
TYRO3AXL
ACK
MUSKTRKA
TRKCTRKB
DDR2DDR1
ZAP70SYK
FAKEphA1
EphA2
EphA8
EphA6
EphA7
EphA4EphA5
EphA3
EphB4
EphB3 EphB1EphB2 HIPK2
PDGFRB PDGFRA
TIE1RYK
LMR3
LMR1 LMR2
SuRTK106CCK4
ROR1ROR2
EphA10
EphB6
HER3/ErbB3TK
PYK2
TNK1JAK1
TYK2JAK2
JAK3
FMSKIT
KDRFLT1
YESSRC
HCKLCK
BLK
HER2
FRK
HER4EGFR
BRKSRM
ARGABL
CTKCSK
TECTXK
ITKBMXBTK
ROSALKLTK
INSRIGF1R IRR
FESFERFGFR2
FGFR3FGFR4 FGFR1
RETTIE2
FYNFGRLYN
FLT4
FLT3MET
RONMER
TYRO3AXL
ACK
MUSKTRKA
TRKCTRKB
DDR2DDR1
ZAP70SYK
FAKEphA1
EphA2
EphA8
EphA6
EphA7
EphA4EphA5
EphA3
EphB4
EphB3 EphB1EphB2
PDGFRB PDGFRA
TIE1RYK
LMR3
LMR1 LMR2
SuRTK106CCK4
ROR1ROR2
EphA10
EphB6
HER3/ErbB3
IC50 (nM)
Sunitinib vs. TKs at [ATP]=Km bin. Sunitinib vs. TKs at [ATP]=1mM
0.1 1 10 100 1,000>10,000
キナーゼ阻害剤の作用の経時変化 (ATP=1mM)
4つのプラットフォーム*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
p38αキナーゼに対する化合物の阻害効果を継時的に検討しました。一般的な阻害剤である SB202190 は、反応開始直後からキナーゼ反応の阻害を示すのに対し、slow binderとして知られる BIRB796 は時間の経過につれて阻害率が上昇しました。
キナーゼプロファイリング・スクリーニングサービス
6www.carnabio.com
MAP3K Cascade MAP2K Cascade
MAPK
COTMAP3K1RAF1BRAFMLK1MLK2MLK3MOS
MAP2K1 ERK2
JNK2
ErktideMAP3K2TAK1-TAB1DLK
MAP2K4MAP2K7
MAP2K1MAP2K2
MAP2K4MAP2K7
MAP2K3MAP2K6
MAP2K6
MAP2K5
p38α
ERK2
JNK2Erktide
EGFRpeptide
p38α
ERK5
ERK1, ERK2JNK1, JNK2, JNK3p38α, p38β, p38γ, p38δ
ERK5
Erktide
EGFRpeptide
Erktide
Erktide
EGFRpeptide
Erktide
EGFRpeptide
MAP3K3MAP3K4MAP3K5
ATP conc.=1mM in Mobility Shift Assay (MSA)
QuickScout™ Pre-Selected Panel Profiling Series
MAPK Cascade Panel
© 2011 Carna Biosciences, Inc.
Serine/Threonine キナーゼ 30 種のパネルで、キナーゼ種は系統樹のグループから多様性を重視してセレクトしました。生理的に重要なキナーゼを含んでおり、創薬ターゲットとしても重要です。TK20 パネル、Cell Cycle30 パネルと組み合わせてのご利用も有用です。
細胞周期の調節に関連するキナーゼ 30 種のパネルで、お客様の化合物が細胞の増殖等に影響を及ぼすかどうかを判断するのに最適です。キナーゼは主として細胞周期に直接作用するものが含まれており、阻害すると細胞の正常な増殖が損なわれることが懸念されます。
Tyrosine キナーゼ 20 種のパネルです。セレクトされたキナーゼの内、例えばABL や EGFR 等は臨床で用いられる抗がん剤の主要な標的分子で生理学にも重要な役割を果たしています。STK30パネルとの組み合わせで系統樹全体を網羅でき、初期スクリーニングに最適です。
MAPキナーゼは細胞外からの刺激をカスケードにて核内に伝える重要なキナーゼ・ファミリーです。化合物の作用解析に有用なパネルとして 31 種のMAPキナーゼ・カスケードを選択しています。
MAPK Cascade Panel ver. 2.0
STK Panel ver. 3.0TK Panel ver. 2.0
Cell Cycle Panel ver. 2.0
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
QuickScout® セレクトパネルシリーズ独自にセレクトしたパネルシリーズはお客様の化合物の初期プロファイリングに最適です。
カイネティクス測定アッセイ ~PhosphoSens™~
7 www.carnabio.com
PhosphoSens™技術はマサチューセッツ工科大学(MIT)にて開発され、MITが保持する特許を米国アッセイクオント社が独占的に実施権を有しています。
PhosphoSens™ では Sox にシステイン残基を導入した改良型 CSoxセンサーを使用。CSoxを結合させた基質がキナーゼ、ATP、Mg2+の存在下でリン酸化されるとMg2+がリン酸基と CSoxにキレーティングされ複合体を形成。ここに励起光を照射することで蛍光を発する。この蛍光強度の変化を経時的に検出することで、基質のリン酸化状態の変化をリアルタイムでモニター。
ハイスループットな試験をご希望なら、エンドポイントでの測定が可能な Phosphosens™ RED がお勧めです。反応系にeuropium を添加することで、Mg の配位を置換して 360nm の励起で 616-620nm の赤色域の蛍光を発する complex が形成されます。complex が発する赤色光を時間分解蛍光測定 (100-200 μ seconds delay) で検出することにより、青~緑色領域で強くみられる化合物の自家蛍光などのバックグラウンドの蛍光を排除し、エンドポイントでの測定を可能にしました。
PhosphoSens™ RED
Screening EGFR variants with AQT0099PhosphoSensTM Technology
試薬を混合して測定するだけで Km、Vmax、kcat、IC50、Kinact、Kon、Koff、Residence Time等々ご要望に合わせて幅広いデータを取得頂けるアッセイキットです。PhosphoSens™基質とアッセイに必要な試薬は全て個別にご購入頂けるため、お手元でそのまま簡単にアップスケールして頂けます(キナーゼ蛋白質別売)。
PhosPhosens™ キナーゼアッセイキット
あらかじめリン酸基を結合させた CSox 結合基質にMg2+を添加すると、基質のリン酸基とCSoxによってMg2+がキレーティングされ蛍光(Chelation-enhancedfluorescence:CHEF)を発します。ここにフォスファターゼを加えると、基質の脱リン酸化が誘導されると共にMg2+ に対する基質の親和性が減少し蛍光が消失していくため、蛍光強度の変化を継時的に測定することで、フォスファターゼによる基質の脱リン酸化をモニターできます。キット中の試薬を混合して測定するだけの簡単な操作で、ご要望に応じた幅広いデータを取得頂けます。(フォスファターゼ別売)。
PhosPhosens™ フォスファターゼアッセイキット
アッセイ構築に必要な基質をお探しですか? PhosphoSens™基質探索サービスをご利用頂ければ、ジェネリックな基質から選択性の高い基質までお客様のアッセイ用途に合わせた最適な基質をシステマチックに探索しお届けいたします。キナーゼ蛋白質のみならず細胞および組織ライセートを用いての評価アッセイの構築にもお役立て頂けます。
基質探索サービス
お客様の化合物をお預かりしてご希望のパラメーターにて測定。まずはご相談ください。
カイネティクス測定サービス
PhosphoSens™ を使った4つのサービス
様々なパラメーター解析が可能リン酸化/脱リン酸化状態の変化をリアルタイムにモニターできるため、Km、Vmax、kcat、IC₅₀、 Kinact、Kon、Koff、Residence Time 等々ご要望に合わせて測定頂けます
マイクロプレートリーダーを選びませんExcitation;360nm、Emission;485nm の測定が可能な装置なら OK
多様なプレートリクエストに対応可能96-well、384-well、1536-wellのプレートでご使用頂けます
PhosphoSens™ はMg2+ をキレーティングすることで蛍光を発する(Chelation-enhanced fluorescence:CHEF)Sulfonamido-Oxine(Sox)をペプチドなどの基質に結合させ、キナーゼによる基質のリン酸化を蛍光強度の増加として経時的に検出することを可能にした技術です。ホモジニアスなアッセイ系で簡便にダイレクトなカイネティクス測定が可能なサービスです。お客様の創薬における構造活性相関(SAR)の解析やMechanism of Action(MOA) 探索にお役立てください。(AssayQuant社提供) *ターゲットリストは別紙をご参照ください。
Weak Affinity Chromatography (WAC™ )
Kinase IC50 (nM)2 KD (nM) t1/2 (min)FGFR1 0.9 1.3 52FGFR3 1 1.7 43FGFR4 60 39 1
NVP-BGJ398
➡異なるサブタイプに対する結合・解離の違いを知る事ができるNVP-BGJ398 に対する FGFR 1,3,4 のシングルカイネティクスカーブ
➡同程度の IC50 値を示すターゲット間では、 化合物のターゲットに対する真の結合能を見極めることができる
Ponatinib に対する酵素アッセイ結果と Residence Time 測定結果の相関性
8www.carnabio.com
キナーゼ蛋白質相互作用解析 ~ResidenceTimer™~
フラグメント創薬 (Fragment-Based Drug Discovery)における1st screeningに最適な最新技術WAC™の受託サービスを提供しています。WAC™は100μM ~ 数mM 程度のこれまで見逃していた弱い親和性のフラグメントもハイスループットで検出測定できるクロマトグラフィーアッセイです。複数の化合物をまとめて測定できるため、非常に短時間で大量の化合物評価(2000-3000 compounds/week)が可能です。(SARomics社提供)
Throughput
info Content
Quality Control
Cost efficiency
WACTM NMR SPR TS++ ++ ++
-
-
++
+
-
-
+
++
++
-
++
++
++
他の評価系と比較して、時間 /費用の削減、信頼性の高い結果や豊富な情報量など圧倒的な優位性を示します
WAC™ による K 値算出式
正確:NMRやX線結晶構造解析の結果と高い相関性
迅速:結果のお届けまで最短3週間(試験開始後)
信頼:創薬化学向けのハイクオリティーなデータ(Kd値にて算出)
非特異な相互作用を軽減(ビオチン分子一つをラベリングしたビオチン化キナーゼの使用により、ばらつきの無い固相化が可能なため)
ターゲットを中性PHで固相化することによりキナーゼ蛋白質の活性低下軽減を実現
全ての試験が均一バッファーで行われるため、ターゲット間の比較評価が容易
センサーチップへの固相化が難しいターゲットも多数評価済み(リストにないデータについてもご相談ください)
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
(NTRC社提供)
• 目的タンパク質をHPLC カラムに固相化(基本的にどのようなタンパク質でも使用可能)• フラグメントの滞留時間(tR)から固相化されたタンパク質との選択性・親和性を測定• 有機溶媒ではなく、生理的なバッファーを移動相に使用• LC-MS による検出• 滞留時間の変化から直接 K 値を算出D
ResidenceTimer™ はカルナバイオサイエンスのビオチン化キナーゼを用い、SPR(表面プラズモン共鳴)法による化合物とタンパク質の相互作用を速度論的に解析するサービスです。キナーゼ蛋白質と低分子化合物の結合の検出用に開発された高感度SPR機器、Biacore T200 (GE Healthcare)を用いて経時的に観察したアフィニティーセンサーグラムから2分子間の結合特異性を確認、結合親和性をカイネティクス解析致します。測定はn=2以上5濃度、化合物の結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd、解離定数(K =kd/ka)、residence time (t=1/kd) をパラメーターとした測定結果をご報告致します。ATP競合化合物のみならずアロステリック効果を示す化合物測定にも最適です。
D
D
NanoBRET™ TE Intracellularキナーゼセルベースアッセイ
9 www.carnabio.com
ヒトキナーゼに対する薬剤の効能をより正確に予測するためにはターゲットタンパク質-化合物間の相互作用を生体内に近い細胞内環境で評価し、薬剤の阻害能、選択性、親和性を定量測定することが極めて重要です。また、平衡状態における測定に加え、カイネティックスを評価し、薬剤のResidence Timeなど速度論的パラメータにも薬剤の最適化において考慮することが望まれています。NanoBRET™ Target Engagement (TE) Intracel-lular Kinase Assay System (Promega社)を用いた当社提供のセルベースアッセイサービスでは、リストからご希望のキナーゼターゲットをご選択頂き生体内に近い条件の下、そのターゲットに対してお客様の化合物がどのように作用するのかを評価、定量的な結果をお届けいたします。化合物をお送り頂くだけで、インタクトな細胞内で測定されたIC₅₀値、阻害率、そして Residence Time 評価結果を得ることが可能です。
インタクトな細胞内で全長発現されたキナーゼタンパク質に対する化合物の作用を探る1タイプの細胞透過性トレーサーで幅広いキナーゼタンパク質ターゲット探索が可能
細胞内ATP環境での測定でより生体内に近い反応を予測する
NanoBRET BTK
IC50 Data Sample
Residence Time Analysis Sample
阻害率測定試験(10倍希釈系列3濃度測定、n=2) 試験期間:被験物質受領後約2週間
IC₅₀値測定試験(Half-Log希釈系列8濃度測定、n=1/n=2)
試験期間:試験物質受領後約2週間
Residence Time解析(IC₅₀値測定試験の結果をベースにn=3で行います)
試験期間:試験濃度決定後約3週間
(注)Residence Time解析をご利用いただく前に試験濃度設定の為、 IC₅₀値測定試験をご利用いただく必要がございます。
サービス概要
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。リストに無いターゲットにつきましてはご相談ください。
[Target occupancy with 1μM Crizotinib]
標的タンパク質(NanoLuc® lucifer-ase融合タンパク質)を発現させた細胞にBRET acceptorとなる蛍光標識した膜透過性tracerを添加する。Tracerが標的分子に結合するとBRETが起こり、acceptorが蛍光を発する。
化合物を添加することによる、蛍光強度シグナルの変化にて結合阻害を検出。
NanoBRET™ System
Nluc
BRET
Nluc
Nluc NanoLuc® luciferase Fluorescent tracer
Test compound Target protein
NanoBRET™ (HEK 293 cells)Cell Chem Biol. 2018 Feb 15;25(2):206-214.e11
Carna Kinase Profiling serviceATP Km, Mobility Shift Assay
セルベースチロシンキナーゼアッセイ
キナーゼHEK293セルベースアッセイ ~ClariCELL™ ~
10www.carnabio.com
米国Advanced Cellular Dynamics(ACD) 社が開発したセルベースチロシンキナーゼアッセイパネルを用いたプロファイリング受託サービスを提供しております。本サービスはヒトチロシンキナーゼを発現させた細胞を用いて、それぞれのチロシンキナーゼに対する化合物の阻害作用を明確にすることが出来ます。細胞内でのキナーゼ阻害作用を研究するのに最適です。また、プロファイリングサービスのほか、リストに掲載されている Ba/F3 細胞の提供もいたします。
米国Cell Assay Innovations(CAI) 社が開発したClariCELL™ キナーゼセルベースアッセイプラットフォームを用いてお客様の化合物を受託スクリーニング・プロファイリング致します。ClariCELL™ キナーゼセルベースアッセイではヒト細胞にヒト全長キナーゼを transient に強制発現させ、抗リン酸化抗体を用いて同時に強制発現させた基質あるいはキナーゼの自己リン酸化レベルを定量します(基質を同時に強制発現させるかどうかはキナーゼによって異なります)。他のシステムと異なり、ターゲットに特異的なリン酸化を検出するため、単純な化合物による阻害の評価のみならず選択性の検討や作用機序の解析も可能です。CAI社の最新技術はアッセイ開発にかかる時間を劇的に削減、スクリーニングの効率化を可能にします。
* Daley & Baltimore; Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1988; 85(23):9312-6 ** Melnick et al., pnas.0511292103
Without Compound
With CompoundCell Viability Inhibition
Analysis of cell viability
1. IC₅₀値測定 (阻害率を3倍希釈系列10濃度で測定(n=2)し、IC₅₀値を算出)2. 阻害率測定 (10倍希釈系列3濃度での測定(n=2))
2つのプロファイリング測定サービス
市場最大、95種のチロシンキナーゼがアッセイ可能!
細胞内セリン・スレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼのアッセイ
初期スクリーニングからリード探索、選択性プロファイリングにも有用リン酸化をダイレクトに検出
キナーゼ全長を強制発現させた細胞を使用
変異体を含むターゲットの同時測定が可能多様性
興味のあるキナーゼや細胞を選択柔軟性
CompoundsKinase +/-Substrate
Human Embryonic Kidney(HEK 293) cells or other
Block Phosphorylation?
Transfection Treatment
Incubation
Lysis
Transfer
ELISA Assay(or comparable)
Ba/F3 Cell
Target TK dimer Kinase Inhibitor
Survival by TK activity
Apoptosis(Death)
Unreactive
Reactive
ACD社が開発したセルベースチロシンキナーゼアッセイパネルは、Daley & Baltimore (1988)* およびJonathan S.Melnick et al.(2005)** の研究に基づいて作られております。ヒトチロシンキナーゼを形質導入したBa/F3細胞の生存、増殖を指標にキナーゼに対する化合物の作用を評価します。95種のチロシンキナーゼから選択可能。化合物の阻害率、またはIC₅₀値の測定を行ないます。セルベースチロシンキナーゼアッセイパネルを用いて臨床で使われているキナーゼ阻害薬をプロファイリングした結果は、既に報告されている結果と良く一致することを確認しております。
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
カスタムアッセイのご要望にも対応いたします。
ヒト腫瘍細胞株を用いた解析サービス
11 www.carnabio.com
オランダ Netherlands Translational Research Center B.V. (NTRC) 社によるヒト腫瘍細胞株を用いた化合物受託解析サービスをご提供いたします。100種類以上のヒト腫瘍細胞株パネルを用いた化合物プロファイリング全細胞株についてATCCのライセンスを取得済み。各種データベースを独自に構築、卓越した解析技術との融合により、がん創薬に有用な踏み込んだ解析が可能です。
Oncolines™ ~ がん細胞の増殖を指標にした化合物プロファイリング ~
OncolinesProfiler™ ~ 既存薬剤との類似性解析サービス~
GeneNominator™ ~ 遺伝子発現と薬剤感受性の相関解析サービス ~
◆ 多様な組織由来の細胞株に対する化合物の作用を遺伝子変異の情報と組み合わせて解析
◆ 150 種類以上の既存薬剤のOncolines™評価結果データベースと お客様の化合物の評価結果との関連性を統計解析
◆ 抗がん剤、分子標的薬、キナーゼ阻害剤、エピジェネティクス関連 因子阻害剤など幅広い既存薬剤を網羅
◆ CCLEに蓄積された18,900 遺伝子の発現レベル情報と、お客様の化合物のOncolines™ 評価結果との相関関係を統計解析
◆ 既存薬剤のOncolines™評価結果データベースなどを利用した独自の補正により、信頼性の高い結果を提示
◆ 薬剤感受性に関連性が高いシグナル経路を明確に解析
◆ 継代数の少ない同一 Lotの細胞株を使用し試験毎のバラつきを抑制
遺伝子変異解析サンプル:debrafenibdebrafenib in A-172 Cells debrafenib in A-375 CellsWaterfall Plot
BRAF-mutant cell(赤色)にて高い阻害効果を示す
BRAF
BRAFの変異と薬剤感受性に有意な相関有り
Oncolines™をフルパネルでご利用いただいたお客様に無償でご提供!
Afatinibに対する感受性とEGFRの発現量に有意な相関有り
◆ がん関連遺伝子変異データベースを用いて、薬剤感受性と100 種以上の遺伝子変異との関連性を解析
◆ 細胞株は世界最大の細胞バンクATCCのライセンスを受けており、ATCC 推奨の培地で培養しています
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
【アッセイ方法】細胞株を384well plateに播種し 24時間培養後に化合物を添加、その後72時間化合物存在下で培養し、細胞中のATP 量を指標に細胞の増殖を測定します。試 験 は 9 濃 度 (half-log), duplicateで実施し、阻害曲線からGI₅₀、IC₅₀、LD₅₀を算出します。
ピアソン相関係数による検定、Fisherのz変換による補正などを実施します
薬剤感受性関連遺伝子遺伝子発現プロファイルデータ
NTRC Oncolines™ IC50
相関解析
ヒト腫瘍細胞株を用いた解析サービス
12www.carnabio.com
SynergyFinder™ ~ 薬剤併用効果解析サービス ~
CI0.5 = 0.20
2 剤を混ぜて試験実施concentration, times log IC50
viab
ility
, % o
f con
trol
-1 0 1
100
80
60
40
20
-20
阻害曲線の Shift を検証
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
ratio 1
ratio 2
ratio 3
F (fraction affected)
CI v
alue
[MEK-i] nM0 3000 6000 9000
[PI3
K-i]
nM
0
2000
4000
6000
8000
10000
Shift を数値化(CI 値: Combination Index)
◆ お客様化合物のOncolines™ 結果を、SynergyFinder™ にて検討する細胞種および組合わせる薬剤の選択に役立てることができます◆ SynergyFinder™ は組合わせた化合物の相乗効果を、相加効果と区別して解析できます◆ 従来から用いられている抗がん剤から分子標的薬まで、NTRCで事前にプロファイリングした多様な化合物との組合わせが可能です
◆ HTSが可能な実験設備を用い、同様のサービスを行なっている他社よりも迅速に低価格でサービスをご提供いたします
SynergyFinder™ 併用効果解析サンプル (trametinib)
concentration, times log IC500 1-1
0
20
40
60
80
100
120
trametinib + dabrafenib
viability, % of untreated
TrametinibDebrafenibTrametinib + Debrafenib 1 : 0.7Trametinib + Debrafenib 4.3 : 1Trametinib + Debrafenib 1 : 2.1
concentration, times log IC500 1-1-2
0
20
40
60
80
100
120
trametinib + vemurafenib
viability, % of untreated
TrametinibVemetinibTrametinib + Vemetinib 1 : 1.1Trametinib + Vemetinib 2.6 : 1Trametinib + Vemetinib 1 : 3.4
trametinib + dabrafenibの方が相乗効果が高い
SynergyScreen™ ~ 薬剤併用スクリーニングサービス ~◆ お客様の化合物と相乗効果を示す化合物を、Oncolines™ で事前に評価済みの>150 既存薬剤ライブラリーから、簡便にスクリーニング いたします。◆ スクリーニングを実施する細胞株は、Oncolines™試験により得られる薬剤感受性情報や遺伝子変異との相関データをもとにお選び頂けます
◆ ヒットしたコンビネーションは更に詳細な相乗効果データを取得頂くため、薬剤併用効果解析サービス SynergyFinder™ で検証されることを お勧めいたします。
SynergyFinder™ による検証
SynergyScreen™ 結果サンプル ( ヒットコンビネーション )AZD-8055 in MOLT-4 cells
concentration, log M-10 -8 -6 -4
viab
ility
,%of
untre
ated
0
20
40
60
80
100
120 plus 132 nM JQ1
青:AZD-8055 単剤の阻害曲線緑:JQ1 を一定量加えた場合の AZD-8055 の 阻害曲線(細胞株:MOLT-4)
青:irinotecan 単剤の阻害曲線緑:PARP inhibitor を一定量加えた場合の Irinotecan の 阻害曲線(細胞株:SW48)
緑の阻害曲線が青の阻害曲線に比べて左側へシフトすればヒットコンビネーションと判断
AZD-8055 + JQ1 in MOLT-4 cellsAZD-8055JQ1AZD-8055 + JQ1 1 : 1AZD-8055 + JQ1 4 : 1AZD-8055 + JQ1 1 : 4
concentration, times log IC500 1-1-2
viab
ility
,%of
untre
ated
0
20
40
60
80
100
120
75% inh. Isobologram AZD-8055 + JQ1 in MOLT-4
[AZD-8055] nM0 30 60 90 120
[JQ
1]nM
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
SinglesAZD-8055 + JQ1 1 : 1AZD-8055 + JQ1 4 : 1AZD-8055 + JQ1 1 : 4
【AZD-8055 と JQ1 の併用効果解析(細胞株:MOLT-4)】 【irinotecan と PARP inhibitor の併用効果解析(細胞株:SW48)】
CI 値(Combination Index)が 1未満 ⇒ 相乗効果を確認(CI 値<1の場合:Isobologramにて青色の直線より内側にプロット)
【試験方法】A. 各既存薬剤について、単剤にて9 濃度 (half-log), duplicate の細胞増殖阻害試験を実施し、阻害曲線を作成B. お客様の化合物を一定濃度で加えた状態で、既存薬剤の細胞増殖阻害試験を 9 濃度 (half-log), duplicateで実施、阻害曲線を作成 AとB、2つの阻害曲線を基に相乗効果を判定
タンパク質相互作用のセルベースアッセイ
13 www.carnabio.com
本セルベースアッセイには、スプリットされたブラジル産ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼ(Emerald Luc, E-Luc)が細胞内で会合することによって発光するスプリットルシフェラーゼシステムを用いております。このシステムでは,GPCRをはじめ細胞内の様々なタンパク質間相互作用を簡便かつ高感度に発光シグナルとして測定することが可能です。バリデーションの取れている樹立済みの安定発現株に加え、お客様のニーズに合わせてご希望の安定発現細胞株の構築も承ります。
スプリット ルシフェラーゼ システム
GPCRへの応用
発 光
Protein-Y Protein-X
Emerald Luc-CEmerald Luc-N
会合
スプリットルシフェラーゼ技術においては切断位置が重要であり、適度な重なりを持たせることが必要です。しかし、重なりを作りすぎるとタンパク質相互作用と無関係に光ってしまい、バックグランドが高くなってしまいます。そこで当社は N 末 12 種類 と C 末 25 種類のアミノ酸フラグメントを作成し、適切な組合わせを見出しました。(特許取得済み)応用例としてはFKBP/Rapamycin/FRB 複合体の検出、GPCRの会合などもございます。
発光
Emerald Luc-CEmerald Luc-N
FKBP
ラパマイシン
FRB
Rapamycin
0 105
100
0
80
60
40
20
Complementation
Luminescence (%)
Time (min)
FK506 100µM
FK506 1µM
FK506 10µM
0 4020 3010
100
0
80
60
40
20
Dissociation
Luminescence (%)
Time (min)
リガンドがGPCR に結合すると細胞内ドメインにβ-アレスチンがリクルートされ、その下流にシグナルが伝達されていきます。当社では下図に示しますように、GPCR に Emerald-Luc の C- 末部分を、β-アレスチンに同N- 末部分を結合させた遺伝子を細胞内で同時に発現させ、リガンドのGPCR への結合をスプリットルシフェラーゼで検出するアッセイ系を構築いたしました。この方法はGPCR に広く応用できますので、現在、スプリットルシフェラーゼとGPCR およびβ- アレスチンのフュージョンタンパクを安定発現させた細胞株の種類を拡充中です。 これらの細胞株はご注文後、すぐの発送が可能です。リストに無い細胞株につきましても、特注にて細胞株の樹立を受託いたします。
FKBP-FRB相互作用への応用免疫抑制剤であるラパマイシンは、FKBP 及び FRB と結合して複合体を形成します。FKBP に E-luc の N末を、FRB に E-luc の C末を結合させたタンパクをHEK293 細胞に発現させ、ラパマイシンを用いて FKBP 及び FRB の相互作用を惹起した ( 左図 ) ところ、ラパマイシン添加による生物発光が経時的に観察され (中図 )、この反応は競合的阻害剤であるFK506によって阻害されました (右図 )。スプリットGFP システムにおいては、一度会合したGFP は乖離することはできませんが、スプリットルシフェラーゼシステムにおいては、相互作用した分子が乖離する反応も検出できる点が、この方法の一つの大きなメリットです。
スプリットルシフェラーゼを用いたGPCRリガンドアッセイ
β-アレスチンEmerald Luc-C
Emerald Luc-N
GPCR
β-アレスチン
Emerald Luc-N
Emerald Luc-C
リガンド
β-アレスチン
リガンド
リン酸化 リン酸化
発 光
*ターゲットリストは別紙をご参照ください。
結晶化・構造解析サービス
14www.carnabio.com
~ Three Structure Services ~
構造生物学およびドラッグデザイン分野で豊富な経験を蓄積し長年に渡って獲得した専門技術・ノウハウを備え持つエキスパートで構成されたスウェーデンのSARomics社との提携により高品質な結晶構造解析サービスをご提供いたします。最新のロボット・結晶化・観察装置など充実した機器を備えたラボに加え、新開設された世界有数の最新シンクロトロン施設MAX IV Laboratoryと隣接した戦略的な立地条件を携えることにより、短期間で精度の高い結晶化サービスをご利用頂きやすい価格でお届けすることが可能です。
結晶化用タンパク質がスタンバイ済み。即時結晶化・構造解析に取り掛かることができます。納期目安: 化合物受領後 2~8週間
すでにリストに含まれているターゲットをご希望の場合はFastLane™ Premium/FastLane™ Standardサービスをご利用頂くことにより費用・時間ともに大幅に縮小頂けます。3次元構造を視覚的にとらえることをご検討中でしたら、まずはご相談ください。
タンパク質製造準備が整った状態でお客様の化合物を受領し既存のプロトコールにそって迅速に結晶化・構造解析いたします。納期目安: 化合物受領後 6~12週間150種以上のキナーゼ、フォスファターゼを含むターゲットをご用意しております。
お客様のご希望に沿ったX線結晶化構造解析受託サービスを提供致します。ご依頼のターゲットについて、先ずはどのようなご提案が可能か調査を行い、お見積りをご提示させて頂きます。ターゲットタンパク質製造(クローニング/発現/精製)から、単結晶化/共結晶化、X線回析データ収集、データ処理、立体構造解析までのフルサービス、またはお客様ご希望の工程のみのご提供など柔軟に対応させて頂くことが可能です。
(*ターゲットリストは別紙をご確認下さい)
(*ターゲットリストは別紙をご確認下さい)
プロジェクトマイルストーン例Gene-to-Structure Services はここからのスタートとなります。0. Start-up プロジェクトに関する契約書締結
1. 発現ベクター構築/クローニング
4. 結晶化 (soaking and/or co-crystallization)5. X線回析データ収集(MAX IVを含むシンクロトロン放射光)(月2回)
FastLane™ Standard Services はこちら以下からのスタートとなります(Start-up費用は発生いたします)2. タンパク質発現/精製
FastLane™ Premium Services はこちら以下からのスタートとなります(Start-up費用は発生いたします)3. DSFによる蛋白質に対する化合物の結合評価
スモールスケール蛋白質発現(評価報告)ラージスケール蛋白質発現および精製
タンパク質製造終了後報告書をお届けします
DSF評価報告書(参考)をお届けいたします
結晶化およびデータ収集終了後報告書をお届け致します
最終解析結果報告書をお届けいたします
タンパク質発現/精製
6. データ処理及び立体構造解析(複数の結晶化複合体の中からご希望数のみ解析致します)
構造解析
結晶化/X線回析データ取得
抗体-抗原 結晶化・構造解析サービス
抗原抗体複合体の三次元X線構造解析は、抗原決定基(エピトープ)と抗体の抗原結合部位(パラトープ)の特異的結合における詳細要因を解明し、抗原-抗体間の相互作用を最適化させる為には欠かせません。
FastLane™ Premium Services
FastLane™ Standard Services
Gene-to-Structure Services (Fee for Service)
dynamic light scattering (DLS), CD spectroscopy, differential scanning fluorimetry (DSF)などの技術を用いてのタンパク質性状確認
最適結晶化条件を同定し、実験プロトコルを確立:ハイスループットスクリーニングおよび結晶観察最新ロボット装置を駆使することにより少量の蛋白質で迅速に最適な条件を同定
www.carnabio.com
TEL: 078-302-7091(営業部直通) / FAX: 078-302-7086〒650-0047 神戸市中央区港島南町1-5-5 BMA3F
E-mail: info@carnabio.com
カルナバイオサイエンス株式会社
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