manual de laboratorio
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Guía de pruebas de laboratorio para Inmunohematología y Banco de Sangre Sección de Inmunohematología y Banco de
Sangre
Facultad de Microbiología
Universidad de Costa Rica
Dr. Carlos Cordero Gómez
Dr. Miguel Rodríguez Pineda 2009
Universidad de Costa Rica
Facultad de Microbiología
Sección de Inmunohematología y Banco de Sangre
Guía de pruebas de laboratorio para Inmunohematología y Banco de Sangre
Página 2
Indice
Prefacio ................................................................................................................................. 4
Introducción .......................................................................................................................... 5
La flebotomía o recolección de sangre. .................................................................................. 9
Suspensión de trabajo en el laboratorio de Inmunohematología, glóbulos rojos al 3-5%, .... 12
Lavado de muestras en Inmunohematología. ...................................................................... 14
Lectura, interpretación y escore de las reacciones de aglutinación. ..................................... 16
Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en adultos. ............................................. 19
Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en recién nacidos ................................... 22
Determinación en tubo de subgrupos sanguíneos ABO. ...................................................... 25
Determinación en tubo del antígeno Rh/ D. ........................................................................ 29
Detección del antígeno D débil ............................................................................................ 32
Células Control de Antiglobulina Humana. ........................................................................... 34
Conservación de Glóbulos Rojos. .......................................................................................... 37
Determinación del fenotipo Rh ............................................................................................. 39
Determinación de la sustancia H en saliva ........................................................................... 44
Determinación fenotípica del sistema MNSs........................................................................ 49
Determinación fenotípica de los sistemas de grupo sanguíneo Kell, Duffy y Kidd. ............... 55
Células Rastreadoras o células pantalla ............................................................................... 60
Prueba de inmunoglobulina indirecta. ................................................................................. 64
Prueba de antiglobulina directa ........................................................................................... 70
Estudio de Anticuerpos Irregulares ...................................................................................... 74
Prueba de compatibilidad sanguínea ................................................................................... 81
Identificación de Anticuerpos .............................................................................................. 94
Técnica de adsorción de anticuerpos ................................................................................... 98
Técnica de Elución de Anticuerpos .................................................................................... 100
Incompatibilidad materno- fetal ........................................................................................ 107
Anemia Hemolítica Autoinmune ........................................................................................ 112
Anexo 1 ............................................................................................................................. 116
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Reactivos anti-A y anti-B .................................................................................................... 116
Anexo 2 ............................................................................................................................. 119
Procedimientos para eliminar anticuerpos interferentes. .................................................. 119
2.1 Uso de reactivos Thiol para separar autoaglutinación .............................................................. 119
2.2 Autoadsorción en frío ................................................................................................................ 120
2.3 Técnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas frías ............................. 121
2.4 Adsorción de autoanticuerpos fríos utilizando estroma de eritrocitos de conejo. .................. 122
2.5 Disociación de IgG utilizando cloroquina .................................................................................. 123
2.6 Adsorción autóloga de autoanticuerpos con reactividad caliente............................................ 125
2.7 Técnica utilizando ZZAP ............................................................................................................. 126
Anexo 3 ............................................................................................................................. 128
Técnicas de elución de anticuerpos ................................................................................... 128
3.1 Elución ácida con digitonina ...................................................................................................... 128
3.2 Técnica de Rubin modificada .................................................................................................... 129
3.3 Técnica de eluído de Lui ............................................................................................................ 130
Anexo 4 ............................................................................................................................. 131
Procedimientos para estudio de anemias hemolíticas inducidas por medicamentos ......... 131
4.1 Demostración de la formación de complejos inmunes inducidos por droga ........................... 131
4.2 Detección de anticuerpos contra penicilina o cefalotina .......................................................... 132
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Prefacio
La presente guía de laboratorio pretende orientar al estudiante en el aprendizaje
de las principales técnicas de Laboratorio de Inmunohematología y Banco de
Sangre.
Está constituida por los procedimientos que el estudiante debe realizar en las
sesiones prácticas de los cursos de Laboratorio de Inmunohematología y Banco
de Sangre de la carrera de Licenciatura en Microbiología y Química Clínica de
la Universidad de Costa Rica.
El propósito principal es que el estudiante logre a través del desarrollo de los
procedimientos que se presentan obtener su propia vivencia en cada práctica
realizada, hacer las anotaciones pertinentes y desarrollar las destrezas y
habilidades propuestas.
También que el estudiante cuente con un material propio de consulta rápido
para su futuro ejercicio profesional.
Los autores
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Introducción
Las secciones de Inmunohematología y Banco de Sangre tienen bajo su
responsabilidad el preparar los hemocomponentes y seleccionar el más indicado
para el paciente a quien el médico se lo prescribe.
Para cumplir con esta labor se debe interaccionar con los donantes de sangre,
realizar pruebas inmunohematológicas como la determinación de grupos
sanguíneos, fenotipos y pruebas de compatibilidad dentro de otras.
El buen desenvolvimiento dentro del Laboratorio y la utilización de medidas
preventivas es un aspecto básico y fundamental para los cursos de Laboratorio
de Inmunohematología y Banco de Sangre.
Aquí le brindamos algunas de las recomendaciones importantes para la
seguridad en el Laboratorio y Banco de Sangre.
En 1987 el CDC introduce el concepto que la sangre de todo paciente debe ser
tratada como potencialmente infecciosa para el Virus de la Hepatitis B (HBV),
Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y otros patógenos transmitidos
por vía parenteral.
Toda persona que labore en un laboratorio de Banco de Sangre debe saber que
el SIDA y la hepatitis se trasmiten por medio de fluidos corporales y que, por lo
tanto, se deben guardar todas las normas de seguridad necesarias para evitar el
contagio.
La exposición ocupacional al HIV es menos frecuente que la del HBV, debido a
que las concentraciones en que se puede encontrar el HBV son mucho más
altas, además de que este virus puede permanecer estable a 25ºC por más de
siete días, lo que explica su mayor frecuencia e infección.
La transmisión ocupacional de HBV y del HIV se relaciona con:
• inoculación percutánea de sangre, plasma, suero u otros fluidos
corporales, debido a accidentes con agujas.
• Contaminación de la piel con sangre o fluidos corporales sin que medien
punciones, debido al contacto directo de una lesión y el fluido
contaminante.
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• Exposición de mucosas ( oral, nasal o conjuntiva) a sangre o fluidos
corporales, como resultado de pipetear con la boca, salpicaduras al
momento de quitar un tapón de un tubo y/o centrifugación inadecuada
que genere aerosoles con material infeccioso y que entren en contacto con
lesiones en piel.
Los estudiantes deberán cumplir con los siguientes puntos dentro del Laboratorio:
1- No correr.
2- Siempre que va a manipular o trasladar muestras dentro del Laboratorio
estas deberán de estar en una gradilla, no las cargue en las manos, además
utilice guantes para dicho transporte.
3- Utilice zapatos cerrados, no utilice zapatillas abiertas o sandalias. Con el
objetivo de proteger los pies de salpicaduras de sangre o lesiones por
vidrios quebrados.
4- Si se tiene el pelo largo amárrelo con una cola, para evitar que este se vaya
a contaminar con el material que se utiliza.
5- Es importante utilizar antejos para evitar salpicaduras en los ojos, en
especial en aquellas maniobras donde se puedan generar aerosoles.
6- Si se ve afectado por alguna salpicadura lave con abundante agua y en
casos de alguna lesión con algún vidrio debe acudir donde un médico que
lo asista.
7- Siempre utilice gabacha dentro del Laboratorio.
8- Antes de empezar la práctica y hasta el final de la misma utilice guantes.
Los guantes pueden estar hechos de látex o vinil. En ambos casos
demuestran una buena barrera protectora; sin embargo, los de látex
permiten conservar mayor sensibilidad táctil.
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Se debe tener como norma general el uso de guantes cuando se realiza
cualquier procedimiento dentro del laboratorio.
9- Queda prohibido el uso de teléfonos celulares durante el Laboratorio.
10- Lavado de manos.
El frecuente lavado de manos es una de las medidas de precaución más
útiles e importantes, éste se debe realizar posterior al contacto con
pacientes y muestras de laboratorio,
Las manos se deben lavar con agua y jabón:
• después de completar el trabajo y antes de irse del laboratorio
• después de quitarse los guantes
• antes de cualquier otra actividad donde intervenga contacto entre
manos y mucosas
• inmediatamente después de un contacto accidental con sangre o
fluidos corporales
• antes de ir al servicio sanitario.
11- Limpieza de superficies de trabajo.
Todas las superficies de trabajo deben limpiarse antes y después del
trabajo con cloro casero diluido 1:10 o con alcohol yodado. Otros
instrumentos a desinfectar son las tijeras y las centrífugas.
La dilución de cloro recomendado inactiva al HBV en 10 minutos y al
HIV en 2 minutos.
Cuando ocurra un derrame de sangre o fluidos corporales se debe
proceder de la siguiente manera:
• utilizar guantes y gabacha
• absorber el líquido con una toalla o papel absorbente. El objetivo de
este paso es eliminar la mayor cantidad de proteína, ya que las
soluciones de cloro son menos efectivas en presencia de altas
concentraciones proteínicas
• limpiar la superficie con cloro diluido.
• Colocar un papel absorbente empapado con cloro sobre la superficie
sucia
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• Limpiar de nuevo y descartar todo lo usado en un recipiente de
bioseguridad
12- Precaución con agujas.
Los accidentes con agujas se pueden prevenir de la siguiente manera:
• No tapar las agujas después de haber sido utilizadas.
• No separar las agujas de las jeringas.
• No manipular las agujas con las manos.
• Poner las agujas una vez utilizadas en un recipiente rojo o naranja con
el símbolo de bioseguridad.
• Estos recipientes deben de estar colocados cerca del área utilizada para
las flebotomías.
13- Descarte de material.
• Todo material que resulta luego de realizar las pruebas en el
Laboratorio debe ser descartado en recipientes de plástico que
contengan solución de hipoclorito de sodio al 0.5%, aquí se incluyen
tubos, pipetas, portaobjetos y frascos.
• Mientras tanto, el material seco como gasas, aplicadores, papel debe
ser depositado en bolsas de basura de material resistente, estas bolsas
deben de ser de color naranja o rojo y portar el símbolo de
bioseguridad.
• Todos los residuos del Laboratorio que contengan fluidos corporales
deben ser autoclavados previo descarte definitivo.
14- Otras medidas de seguridad.
• No consumir comidas ni bebidas en el laboratorio.
• No guardar alimentos en las refrigeradoras o congeladores que
contengan muestras o bolsas de sangre.
• Estos equipos deben de ser rotulados también como biopeligrosos.
• Es totalmente prohibido fumar dentro del laboratorio.
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Procedimiento 1
La flebotomía o recolección de sangre.
Principio:
La recolección de sangre debe ser practicada mediante métodos asépticos, con
un sistema cerrado, guantes y una sola punción venosa.
En caso de que la primera punción no fuera óptima, para la segunda punción se
debe utilizar un equipo nuevo.
Método:
Antes de la flebotomía:
- Revisar la identificación de los tubos que se van a utilizar.
- Rotular el tubo con el nombre y apellidos de la persona que pertenece la
muestra, número de identificación que puede ser el número de cédula.
- Indicar la persona responsable de realizar el procedimiento, ya sea con las
iniciales o un número designado por el Laboratorio.
- Otra información importante de indicar es la ubicación, fecha y hora de la
extracción.
Preparación de la punción venosa:
- Inspeccionar ambos brazos y seleccionar la mejor vena.
- Limpiar con un algodón impregnado con alcohol al 70% un área de 8
centímetros alrededor del sitio seleccionado para la punción.
- Realizar la limpieza de adentro hacia afuera en forma circular.
- Limpiar en dos ocasiones cuando se amerite.
- La zona debe de estar seca antes de la punción venosa.
Flebotomía:
- Colocar el torniquete.
- Introducir la aguja en la vena seleccionada en un ángulo de 45º y con el bisel
hacia arriba.
- Dejar que la sangre fluya libremente dentro del tubo.
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- Si se está recolectando sangre anticoagulada inmediatamente después de
retirado el tubo del adaptador procesa a mezclar la sangre con suavidad.
- Aflojar el torniquete cuando la extracción haya concluido.
- Colocar un algodón sobre la vena.
- Retirar la aguja y hacer presión con el algodón sobre la vena.
- Indicar al paciente que doble el brazo y que lo mantenga en esa posición por
10 minutos.
- Descartar el material con la aguja en el envase de desecho.
- Colocar las muestras obtenidas en el espacio correspondiente dentro de la
gradilla.
Cuidados:
La recolección de sangre es un procedimiento sencillo y seguro para las
personas. No representa riesgo alguno, sin embargo, en muy pocas ocasiones se
pueden presentar ciertos inconvenientes como:
Desvanecimiento, lipotimia, síncope
Estas reacciones pueden explicarse por una descarga vasovagal. Si esto se
presenta se debe indicar a la persona que coloque la cabeza entre las piernas o
coloque al paciente en posición de Trendelemburg.
Si se presenta nauseas indicar al paciente que respire profundamente.
Si hay hiperventilación el paciente debe respirar en una bolsa de papel.
Si se observa una tendencia a perder el conocimiento, proteja la persona de un
golpe colocando en una posición que evite las caídas.
Tomar la presión y el pulso.
Hematoma durante o después de la flebotomía Si este se presenta se debe de:
Retirar inmediatamente el torniquete y la aguja del brazo.
Colocar tres o cuatro gasas estériles sobre el sitio de venipuntura y aplicar
firmemente presión digital durante 7 – 10 minutos. Una alternativa
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consiste en aplicar un apósito ajustado, que se puede retirar 7 – 10
minutos después para permitir la inspección.
Si se desea, aplicar hielo, cubierto con una gasa, en el área durante 5
minutos.
Si se sospecha una punción arterial, retirar la aguja de inmediato y aplicar
presión firmemente durante 10 minutos. Aplicar un vendaje compresivo
enseguida.
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Procedimiento 2
Suspensión de trabajo en el laboratorio de Inmunohematología, glóbulos rojos al 3-5%,
Principio
La suspensión de trabajo de glóbulos rojos al 3-5% es un procedimiento de
rutina en el laboratorio de Inmunohematología.
La suspensión no requiere ser exacta, sino que puede estar en un rango de
concentración entre un 3 a 5%.
Esta concentración permite una proporción adecuada de reacción entre los
glóbulos rojos y los anticuerpos presentes en los reactivos o muestras a analizar
a través de la reacción de aglutinación.
Este procedimiento tiene como característica principal ser un método
cualitativo, por lo que es importante desarrollar las destrezas necesarias para
realizarlo correctamente.
Materiales y muestras 1. Tubos 12x75 mm limpios y secos.
2. Pipetas Pasteur o de transferencia.
3. Solución salina fisiológicas (0.9%).
4. Muestras de sangre anticoagulada con EDTA.
5. Centrífuga serológica (3000 rpm ).
6. Guantes.
7. Gabacha.
8. Recipientes de descarte de material.
Método: Cuantitativo
1. Transfiera al menos 1 ml de sangre total a un tubo de ensayo
adecuadamente rotulado.
2. Añada solución salina 1 centímetro antes de la boca del tubo.
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3. Centrifugue 1 minuto a 3500 rpm con la centrífuga serológica hasta
obtener un paquete de eritrocitos.
4. Descartar el sobrenadante.
5. Repetir los pasos 1 al 4 dos veces más. El sobrenadante final debe de
estar claro y puede ser completamente removido.
6. Con una pipeta automática transfiera 0.3 ml de los glóbulos rojos lavados
a un tubo de ensayo que contenga 9.7 ml de solución salina fisiológica.
7. Tapar el tubo y mezclar con suavidad hasta homogenizar la solución.
Cualitativo 1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo.
2. Con una técnica apropiada de uso de material biopeligroso tomar una
pipeta Pasteur y transferir una pequeña muestra de sangre al tubo.
3. Añadir solución salina hasta alcanzar una coloración rojo “tomate”.
4. Realice comparaciones visuales con soluciones ya preparadas al 3-5%
5. Descartar el material en los recipientes destinados en el laboratorio.
Práctica:
Realizar al menos 5 suspensiones de forma cualitativa hasta determinar qué
cantidad de sangre y de solución salina deben de se añadidos para hacer una
suspensión de trabajo.
Tenga presente que los seres humanos poseen diferentes valores de hematocrito
(proporción de glóbulos rojos en sangre) por lo que la cantidad de muestra
necesaria para realizar una buena suspensión de trabajo puede variar, de ahí que
es muy importante desarrollar la destreza para hacer suspensiones entre el 3-5%.
Repita el procedimiento tantas veces sea necesario, hasta que domine la técnica
y las proporciones.
Resultados, discusión y conclusiones: _______________________________________________________________
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Procedimiento 3
Lavado de muestras en Inmunohematología.
Principio
Los lavados de muestras sanguíneas para obtener sólo el paquete globular es un
procedimiento de rutina dentro de cualquier sección de Inmunohematología.
El propósito es eliminar cualquier interferente proteico que pueda alterar la
reacción de aglutinación. Este aspecto es tan importante que se pueden obtener
reacciones falsas positivas o negativas a partir de muestras mal lavadas.
Materiales y muestras:
1. Tubos 12x75 mm limpios y secos
2. Pipetas Pasteur o de transferencia
3. Solución salina 0.9%
4. Centrífuga serológica (3000 rpm )
5. Guantes
6. Gabacha
7. Recipientes de descarte de material
8. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA
Método:
1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo.
2. Transferir con una pipeta Pasteur y técnica apropiada de uso de material
biopeligroso una muestra de sangre que no pase de 1 ml a un tubo de
ensayo.
3. Añadir solución salina hasta alcanzar 1 centímetro antes de la boca del
tubo.
4. Equilibrar y centrifugar por 1 minuto a 3500 rpm en una centrífuga
serológica.
5. Una vez centrifugado debe de quedar un paquete globular.
6. Descartar el sobrenadante.
7. Resuspender los glóbulos rojos.
8. Añadir solución salina hasta 1 centímetro antes de la boca del tubo.
9. Repetir el mismo procedimiento dos veces más.
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10. En el último lavado debe de quedar un sobrenadante claro.
11. Descartar el sobrenadante y realizar una suspensión de trabajo al 3-5%
12. Descartar el material en los recipientes adecuados de la práctica.
Práctica:
Realizar al menos cinco lavados de glóbulos rojos.
Repetir el procedimiento tantas veces sea necesario hasta que domine la técnica.
Resultados, discusión y conclusiones:
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Procedimiento 4
Lectura, interpretación y escore de las reacciones de aglutinación.
Principio
Cuando se presentan reacciones de aglutinación se pueden observar diferentes
grados y fuerzas de reacción entre los antígenos y los anticuerpos.
Esta observación es muy importante en Inmunohematología, pues se puede
utilizar estas características distintivas para identificar situaciones donde se
presentan casos de mezclas de anticuerpos, mezclas de sangre e incluso
haciendo uso de un escore o puntuación determinar si los glóbulos rojos en
estudio son homocigotas o heterocigotos para un determinado sistema de grupo
sanguíneo.
Materiales y Muestras:
1- Reactivo anti-A.
2- Glóbulos A al 3-5%
3- Tubos de ensayo
4- Pipetas volumétricas de 1 ml, 5ml y 10 ml
5- Pipetas automáticas
6- Centrífuga serológica (3500 rpm)
7- Solución salina 0.9%
8- Recipientes de descarte de material
9- Un marcador permanente
10- Guantes
11- Gabacha
Método:
Realizar a un volumen final de 100 ul diluciones dobles del antisuero (reactivo
de anti-A) con solución salina hasta una dilución final de 1:512 de la siguiente
manera.
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1- Rotular los tubos correspondientes.
2- Colocar 100 ul. de solución salina del tubo rotulado 1:2 hasta el tubo
1:512.
3- Dispensar 100 ul. del reactivo anti A al tubo rotulado 1:1 y al tubo
rotulado 1:2.
4- Mezclar el tubo 1:2
5- Transferir 100 ul del tubo 1:2 al siguiente tubo 1:4.
6- Mezclar, continuar el procedimiento de forma repetitiva hasta llegar al
tubo 1: 512.
7- Descartar los últimos 100 ul.
8- Añadir una gota de las células “A” a cada uno de los tubos.
9- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.
10- Desprender el botón con suavidad frente a la luz para observar el
grumo.
11- Anotar las características observadas en cada reacción de
aglutinación y asignar el puntaje que correspondiente en base a la
información de la tabla 1.
Tabla 1: Característica del grumo, intensidad de reacción y puntaje
obtenido.
Observación Macroscópica
Designación en cruces Escore o Puntuación
Un solo grumo de
aglutinación
4+ 12
Un grumo grande con
varios medianos.
3+ 10
Muchos grumos
medianos
2+ 8
Grumos pequeños con
fondo turbio
1+ 5
Fondo turbio con grumos
muy pequeños
Positivo débil ó +/- 2
Hemólisis H 12
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Resultados:
De las reacciones que obtuvo lea, interprete, describa y dibuje el grado de
aglutinación de las reacciones según corresponda:
Escore Observación Una
reacción de
4+
Una
reacción de
3+
Una
reacción de
2+
Una
reacción de
1+
Una
reacción
negativa
Una
reacción de
campo
mixto
Una
reacción de
hemólisis
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Procedimiento 5
Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en adultos.
Principio:
El sistema de grupo sanguíneo ABO fue el primer sistema descubierto por el Dr.
Karl Landsteiner en 1900 y que le valió el premio Nobel en Fisiología y
Medicina del año 1930. (1)
Este sistema involucra tres antígenos: A, B y H. El antígeno H se produce por la
acción de una fucosiltransferasa capaz de añadir una fucosa a la sustancia
precursora.
La sustancia H puede ser convertida en el antígeno de grupo sanguíneo A por
acción de la transferasa A que añade una N-acetil galactosamina a la cadena
precursora o una galactosa en el caso de la transferasa B; el fenotipo O es el
resultado de una transferasa inactiva, la cual es incapaz de añadir carbohidratos
al antígeno H.
Los seres humanos mayores de 3 a 6 meses de edad desarrollan a través de una
respuesta T independiente anticuerpos antitéticos naturales del tipo IgM capaces
de activar al complemento contra los antígenos ABO que no se posean.
Se desarrollan a partir de la estimulación de sustancias tipo azúcares presentes
en los alimentos y bacterias del medio.
Este sistema es de gran importancia en el campo de la medicina transfusional y
en la investigación clínica. Ha sido de gran ayuda en el ámbito antropológico
donde lo han utilizado como marcador serológico en genética de poblaciones,
desarrollo embrionario, diferenciación celular y en las neoplasias.(2,3)
El siguiente procedimiento es un método aceptable, sin embargo, recuerde que
existen diferentes casas comerciales y que cada una utiliza distintos
componentes para fabricar reactivos así como los tiempos de incubación y de
reacción, por lo que nunca se debe de pasar por alto leer la especificación
técnica que recomienda la casa comercial para el uso de reactivos.
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Materiales y muestras:
Tubos de ensayo 12x75 mm Pipetas Pasteur Solución salina
Centrífuga serológica
Recipientes de descarte de material
Guantes
Gabacha
Marcador permanente (pilot)
Para realizar las determinaciones, generalmente se utilizan muestras de sangre
total anticoagulada con EDTA (tubo tapón lila), sin embargo, también se
pueden utilizar sangre sin anticoagunlante. (tubo tapón rojo).
Los glóbulos rojos pueden ser suspendidos en el suero autólogo, plasma o
solución salina, pueden ser lavados y resuspendidos en solución salina antes de
la prueba.
Reactivos
1- Anti-A
2- Anti-B
3- Células A1 y B. Estas células pueden ser obtenidas comercialmente o
preparadas diariamente en el laboratorio en una suspensión entre el 3-5%
Método:
Grupo eritrocitario, (Prueba directa):
1- Rotular 2 tubos como A y B.
2- Homogenizar la muestra de sangre.
3- Realizar una suspensión de trabajo entre el 3-5%.
4- Agregar una gota de la suspensión de trabajo a los tubos rotulados como
A y B.
5- Añadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A.
6- Añadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B.
7- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm.
8- Resuspender suavemente el botón.
9- Leer, anotar e interpretar las reacciones.
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Prueba en suero/plasma (grupo inverso)
1- Centrifugar la muestra a analizar por 5 minutos.
2- Rotular dos tubos como células A y células B.
3- Añadir al tubo rotulado como células A una gota de células A al 3%.
4- Añadir al tubo rotulado como células B una gota de células B al 3%.
5- Añadir a cada tubo dos gotas de suero /plasma de la muestra centrifugada.
6- Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm.
7- Leer, anotar e interpretar las reacciones.
8- Comparar los resultados obtenidos con el grupo eritrocítico.
Práctica: Determinar el grupo ABO eritrocítico y sérico de al menos 10 muestras
sanguíneas y que en ellas vayan todas las posibles combinaciones de grupos
ABO. Resultados, discusión y conclusiones:
Muestra Anti-A Anti-B Células - A Células- B Interpretación 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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Procedimiento 6
Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en recién nacidos
Principio
La determinación del grupo sanguíneo ABO en el recién nacido es de suma
importancia en la detección y diagnóstico de la enfermedad hemolítica del
recién nacido, así como en la terapia transfusional.
En este tipo de paciente, debido a la inmadurez del sistema inmune al
nacimiento no se tiene la capacidad de producir anticuerpos hasta los primeros
tres a seis meses de vida, razón por la cual la prueba sérica o inversa no puede
ser aplicada.
También las reacciones de aglutinación con el grupo eritrocítico tienden a dar
más débil que en los pacientes adultos debido a que los determinantes
antigénicos ABO en los glóbulos rojos se encuentran en poca cantidad,
pobremente ramificados y expresados en comparación con los antígenos de
glóbulos rojos de personas adultas.
Es por lo anterior que en la determinación de grupo sanguíneo ABO del Recién
Nacido se añade a la batería de reacción un tubo adicional para el reactivo anti-
AB que ayude a detectar y confirmar la reacción.
Una de las ventajas de utilizar este reactivo adicional es que va dirigido contra
otros determinantes antigénicos que los reactivos anti-A o anti-B individuales,
por lo que al utilizar los tres reactivos en conjunto aumenta las posibilidad de
detección antigénica en contraposición que si se utilizara sólo un medio de
reacción, disminuyendo así las reacciones falsas negativas (1,2)
Materiales y muestras
Tubos de 12 x75 mm
Pipetas Pasteur
Solución salina
Centrífuga serológica
Recipientes de descarte de material
Guantes
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Gabacha
Marcador permanente (pilot)
Muestras de Sangre de cordón umbilical
Reactivos
1- Anti-A
2- Anti-B
3- Anti-AB
Método:
Por lo general se utilizan muestras de sangre de cordón umbilical (tubo tapón
rojo).
A una alícuota de la muestra realizar tres lavados con solución salina
fisiológica.
Del paquete globular lavado hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5%.
Lo anterior debido a que este tipo de muestra posee muchos elementos
adiciones interferentes como son la mezcla de sangre materna y la gelatina de
Wharton que interfieren con las reacciones de aglutinación.
1- Rotular 3 tubos de prueba como A, B y AB.
2- Transferir una gota de la suspensión de trabajo a los tubos rotulados como
A, B y AB.
3- Añadir al tubo rotulado como A dos gotas del anti A.
4- Añadir al tubo rotulado como B dos gotas del anti B.
5- Añadir al tubo rotulado como AB dos gotas del anti AB.
6- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3500 rpm.
7- Leer, anotar e interpretar las reacciones.
Práctica:
Realizar la determinación de al menos 5 muestras de recién nacido, tratar que no
sean del mismo grupo ABO.
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Muestra Anti-A Anti-B Anti-AB Interpretación 1
2
3
4
5
Comentarios y anotaciones adicionales:
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Procedimiento 7
Determinación en tubo de subgrupos sanguíneos ABO.
Principio
El sistema de grupo sanguíneo ABO presenta dentro de sus características
algunos fenotipos poco frecuentes clasificados como subgrupos, los cuales se
hacen evidentes a nivel de laboratorio como reacciones de aglutinación más
débil de lo esperado.
Razones que justifican la presencia de estos subgrupos son:
- Mutaciones en los genes A y B que provocan la expresión aberrante de los
genes, codificando la producción de glicosiltransferasas con menor actividad
enzimática para la conversión del antígeno H.
- Expresión débil de un alelo alterno que se ubica en el locus ABO.
- Efecto de genes modificadores o inhibidores que regulen la expresión de los
genes ABO.
La mayor frecuencia de subgrupos ABO es para el antígeno A. Los eritrocitos
de los diferentes subgrupos de A varían ampliamente en la densidad antigénica.
Se ha calculado que los eritrocitos que son A1 pueden expresar entre 1-1.5
millones de sitios antigénicos en contraposición con eritrocitos Am o Ael donde
se ha podido determinar apenas expresan unos 2000 sitios antigénicos.
Los subgrupos de A se clasifican en:
A1, A2, A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael.
Los subgrupos de B se clasifican en:
B3, Bx, Bm, Bel.
Los subgrupos de ABO pueden ser detectados a través de patrones de reacción
serológica incongruentes entre los resultados de la prueba directa con la prueba
inversa.
La observación minuciosa de los siguientes aspectos es fundamental para
determinar las características de los diferentes subgrupos:
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- Grado de aglutinación con anti-A y anti-A1.
- Grado de aglutinación con anti-AB.
- Grado de aglutinación con anti-H.
- Presencia de anticuerpos anti-A1 en el suero.
- Presencia de sustancias A, B y H en secreciones de saliva.
- Estudios de Absorción/Elución para antígenos ABH en eritrocitos.
Método:
Técnica en tubo para la detección del antígeno A1 utilizando la lectina Dolichos biflorus.
A cada tubo adecuadamente rotulado añadir 1 gota suspensión entre el 3-5% de
glóbulos rojos A1, A2, A1B, A2B, B y O.
A los tubos anteriores añadir 1 gota de la lectina anti-A1.
Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm.
Leer, anotar e interpretar los resultados obtenidos.
Interpretación:
- Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+.
- Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación.
Técnica en tubo para la detección del antígeno H utilizando la lectina Ulex europeaus:
Añadir 1 gota suspensión de glóbulos rojos A1, A2, A1B, A2B, B y O a cada
tubo adecuadamente rotulado.
Añadir 1 gota de la lectina anti-H a cada tubo.
Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm.
Leer por aglutinación y anotar los resultados.
Interpretación:
- Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+.
- Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación.
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Práctica
1) Determinar el grupo ABO de al menos 10 muestras.
Muestra Anti-A Anti-B Células- A Células-B Interpretación
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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2) De las muestras clasificadas escoger las de grupo A y O para determinar
la cantidad de sustancia A o H con las lectinas anti-A1 y anti-H.
3) Hacer las lecturas e interpretar los comentarios que considere necesarios.
4) Anotar en orden de fuerza de aglutinación las reacciones utilizando
Lectina anti - A1 y Lectina anti H para células A1B, A1, B, O, A2 y A2B.
5) Realizar determinaciones en recién nacido.
6) A las muestras de glóbulos rojos rotulados como 1, 2, 3 y 4 realizar sólo
el grupo eritrocítico y anotar el resultado.
Muestra Anti-A Anti-B Anti-AB Interpretación
Grado de Aglutinación
Fondo Grado de Aglutinación
Fondo Grado de Aglutinación
Fondo
1
2
3
4
Anotaciones:
________________________________________________________________________________________________________________________________
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Procedimiento 8
Determinación en tubo del antígeno Rh/ D.
Principio
La definición de Rh positivo o Rh negativo se refiere a la presencia o ausencia
del antígeno Rh (D) en los eritrocitos humanos.
El primer anticuerpo contra el antígeno D fue descrito en 1939 por Levine y
Stetson, encontrado en el suero de una mujer cuyo hijo había padecido de una
enfermedad hemolítica del recién nacido y además había presentado una
reacción hemolítica después de haber sido transfundida con sangre de su
esposo.
En 1940, Landsteiner y Wiener describieron el anticuerpo obtenido por
inmunización de cerdos y conejos con glóbulos rojos del mono Macacus rhesus.
Estos aglutinaron aproximadamente el 85% de las pruebas con eritrocitos
humanos y fueron denominados con el correspondiente factor Rh positivo y los
que no reaccionaron como Rh negativo. El término Rh se nombra en honor a la
especie en que se descubrió el antígeno
Los antígenos del sistema Rh se encuentran en los seres humanos y en algunas
especies de primates. El antígeno D está completamente desarrollado al nacer.
Los reactivos anti-D pueden tener tres tipos de presentación, los de alto
contenido proteico, los salinos a base de IgM y los químicamente modificados,
que son IgG´s con mayor capacidad aglutinante que los IgG nativos.
Los de alto contenido proteico poseen una concentración entre el 20-24% más
otros aditivos macromoleculares dando un resultado más pronto y una lectura
más fiable.
El diluyente de elevado peso molecular puede producir aglutinación
espontánea de los eritrocitos si estos se encuentran recubiertos de
inmunoglobulinas como son los casos de autoinmunidad y de la enfermedad
hemolítica del recién nacido.
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Un aspecto a tomar en consideración es que estos sueros, debido a los aditivos
que se le añaden para ayudar a la aglutinación pueden producir reacciones
falsas positivas.
Para detectar estos falsos positivos, es importante correr paralelamente con la
prueba de Rh una prueba control, utilizando un reactivo inmunológicamente
inerte preparado por la misma casa comercial del reactivo anti-Rh.
Este control posee los mismos aditivos que están en el reactivo anti-D, pero sin
los anticuerpos. Si las células que están en estudio son aglutinadas por este
control, el resultado de la prueba debe ser invalidado, siendo necesario
analizarlo por otro método.
En caso de ausencia del reactivo control se puede utilizar albúmina bovina al
22% como medio control produciendo incluso menos falsos positivos que el
anterior ya que la albúmina no contiene los potenciadores de alto peso
molecular pero sí su alto contenido proteico.
Reactivos
1- Anti-D, IgG -IgM de alta concentración proteica.
2- Reactivo para el control de Rh, manufacturado según la casa comercial o
Albúmina al 22%.
Materiales y muestras
1. Tubos de pruebas limpios y secos.
2. Pipetas Pasteur.
3. Solución salina 0.9%.
4. Centrífuga serológica (3000 rpm ).
5. Guantes.
6. Gabacha.
7. Recipientes de descarte de material.
8. Tubos de ensayo.
9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
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Método:
1- Marcar dos tubos uno como D ó Rh y otro como control ó Ctrl.
2- Agregar al tubo rotulado como D, 1 gota del reactivo anti-D.
3- Agregar al tubo rotulado como control, 1 gota del reactivo control y en
caso de no disponer de albúmina.
4- Añadir 1 gota de la suspensión entre el 3-5% de los glóbulos del paciente
en estudio.
5- Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm en una centrífuga
serológica.
6- Resuspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.
Interpretación:
Tabla 2: Interpretación de los resultados de Rh
Anti-D Control Interpretación Rh (D)
0 0 Rh negativo
1+ a 4+ 0 Rh positivo
Si el control está positivo el resultado se considera inválido. Si esto ocurre, lave
los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la suspensión de
células y repita la prueba.
Si prevalece el resultado positivo en el control, el resultado del Rh (D) se
considera inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de
reactivos con anti-D salino o químicamente modificado.
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Procedimiento 9
Detección del antígeno D débil
Principio
Algunos glóbulos rojos expresan más débilmente el antígeno D en la membrana,
esta condición puede provocar que en la primera fase del análisis cuando se
trabaja con reactivos de alto contenido proteico se presenten resultados
positivos y con otros una reacción negativa.
Estas discrepancias se resuelven cuando las pruebas con resultados negativos se
llevan a la fase de antiglobulina, detectando el antígeno con expresión débil que
en la primera fase no se logró detectar.
Debido a la trascendencia desde el punto de vista transfusional o en la
prevención de la enfermedad hemolítica del recién nacido, todo estudio
serológico con anti-D proveniente de un donante de sangre o un recién nacido
con una lectura negativa en la primera fase se debe continuar hasta la fase de
antiglobulina para confirmar el resultado.
Método:
1- Si la prueba de Rh da resultado negativo incubar el tubo estudio y el tubo
control por 30 minutos a 37ºC.
2- Lavar 3 veces las muestras con solución salina 0.9%
3- Secar bien la última gota.
4- Añadir dos gotas del reactivo de antiglobulina humana.
5- Mezclar y centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm.
6- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados
7- Confirmar reactividad de reactivo agregando una gota de “Células
Control de Antiglobulina Humana”
8- Mezclar y volver a centrifugar los tubos por 15 segundos a 3500 rpm.
9- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.
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Interpretación de resultados:
La aglutinación en el tubo de anti-D y la ausencia de aglutinación en el tubo
control indican un resultado positivo. La sangre debe de clasificarse como Rh
positivo.
La ausencia de aglutinación en ambos tubos, el estudio y control indican un
resultado negativo y la sangre debe de clasificarse como Rh negativo.
Presencia de aglutinación en el tubo control invalida la prueba y debe de
repetirse. Si esta vuelve a dar positivo, se debe considerar un estudio para
Anemia Hemolítica Autoinmune iniciando con una prueba de antiglobulina
directa.
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Procedimiento 10
Células Control de Antiglobulina Humana.
Principio
Las Células Control de Antiglobulina Humana son glóbulos rojos sensibilizados
con inmunoglobulina tipo IgG, son utilizadas para validar metodologías en
tubo con resultados negativos en la fase de antiglobulina humana.
La presencia de aglutinación después de ser añadidas al medio de reacción
indica que los lavados fueron realizados adecuadamente y todos los restos
proteicos fueron eliminados, no neutralizaron el reactivo de antiglobulina
humana y el resultado de la prueba puede ser validado.
Cuando una prueba de antiglobulina humana da un resultado negativo quiere
decir que no hubo reacción antígeno-anticuerpo, los glóbulos rojos en prueba
no contienen el antígeno especifico para el antisuero que se está probando o el
suero en estudio no tiene anticuerpos contra ninguno de los antígenos
expresados en los eritrocitos utilizados, por tanto, en el tubo de reacción debe
de quedar reactivo anti-IgG activo y funcional presente en el medio.
Al adicionar las Células Control de Antiglobulina Humana las IgG activas
libres reaccionan con las células provocando la aglutinación.
Por otro lado, si se presenta un resultado negativo después de ser añadidas
indica que los lavados fueron realizados incorrectamente, quedaron restos de
inmunogloblinas que neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y la
prueba debe ser invalidada y repetida.
Materiales y Reactivos:
Células Control de Antiglobulina Humana entre el 3 – 5 % obtenidas de casa
comercial o preparadas en el laboratorio.
Tubos de pruebas
Gradillas
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Pipetas
Centrífuga serológica
Procedimiento:
1- Mezcle y resuspenda con suavidad las células del reactivo de Control de
Antiglobulina Humana
2- Añada 1 gota de las Células Control de Antiglobulina Humana a cada
tubo con resultado negativo en la prueba de inmunoglobulina humana
incluyendo al control.
3- Mezcle y centrifugue 15 segundo a 3500 rpm
4- Resuspenda cuidadosamente, lea, anote e interprete los resultados.
Práctica:
Determine el grupo ABO y Rh de al menos 10 muestras sanguíneas.
Conclusión:
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Resultados, discusión y conclusiones:
Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Células Control de AGH
Interpretación
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Nota: No olvide reportar los resultados en cruces en base a la intensidad de aglutinación.
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Procedimiento 11
Conservación de Glóbulos Rojos.
Preservación de la sangre:
Los glóbulos rojos pueden ser preservados con diversos propósitos como por
ejemplo:
- Preservación de hemocomponentes para ser utilizados con fines
terapéuticos.
- Investigación.
- Fuente de reactivos como las células rastreadoras, células control de
Antiglobulina Humana, células A1, B.
- Control de calidad de los antisueros utilizados de manera rutinaria en
los Bancos de Sangre y servicios de Inmunohematología y demás.
Existen diversas soluciones que ayudan a anticoagular y conservar los glóbulos
rojos como son el:
- ACD (adenina, citrato, dextrosa),
- CPD (citrato, fosfato, dextrosa),
- CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).
Otros pueden ser soluciones aditivas que lo que permiten es sólo su
conservación brindando fuente de energía y sustancias precursoras para su
biosíntesis normal, entre los que se encuentra el Alsever, Adsol, y el Alsever
modificado.
La parte más importante de las soluciones para la conservación de células rojas
en estado líquido, es que deben proporcionar el mantenimiento intacto del
fenotipo eritrocitario y reducir los riesgos de contaminación microbiana
durante largo tiempo, lo cual posibilita su uso para pruebas diagnósticas in vitro
y su comercialización.
Soluciones sólo anticoagulantes como el EDTA, alteran a cabo de un tiempo la
morfología normal del glóbulo rojo, por lo que no pueden ser utilizadas para
este propósito.
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Método
Obtener una muestra de su propia sangre siguiendo instrucciones del
procedimiento 1 de este manual.
Recolectar 10 ml y dividirla entre un tubo con EDTA (tapón lila) y un tubo con
solución de Alsever.
Rotular con sus datos personales el tubo con Alsever y colocarlo en la gradilla
para ser guardado en refrigeración a 4ºC.
Es muy importante guardar la muestra pues con ella se trabajará en prácticas
posteriores.
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Procedimiento 12
Determinación del fenotipo Rh
Principio
Aparte del antígeno D se han descrito otros antígenos pertenecientes al sistema
Rh, específicamente más de 50 diferentes, sin embargo, de estos los principales
por su capacidad de inducir una respuesta inmune y por ende implicados en
reacciones transfusionales o en la enfermedad hemolítica del recién nacido son
los antígenos C, E, c y e.
La asociación de estos factores antigénicos indica que la actividad inmunológica
del sistema Rh proviene de un material de superficie con diversos determinantes
antigénicos.
Algunas asociaciones de antígenos incluyen al D y otras no. La composición de
estas combinaciones antigénicas está determinada genéticamente.
Dos genes homólogos y estrechamente ligados son los responsables de la
producción de los cinco antígenos principales del sistema Rh. Uno llamado
RHD determinará la producción o la no producción del antígeno D, mientras
que el otro gen RHCE será el encargado de la producción de los antígenos C, c,
E y e.
Se han reconocido numerosas combinaciones y variantes de estos genes, pero
los cinco antígenos indicados y sus anticuerpos los más frecuentes del sistema.
De igual manera que para el antígeno D, se encuentran disponibles en el
mercado reactivos pobres en proteínas (químicamente modificados o
monoclonales) o ricos en proteínas con anticuerpos específicos para determinar
la presencia de los antígenos C, E, c y e.
Pueden producir reactividad variable con diferentes haplotipos en los eritrocitos
(fenómeno de dosis), por lo que esta debe ser considerada dependiendo de los
antígenos expresados en membrana a la hora de hacer un fenotipo de Rh, por
ejemplo CDE o CE son los responsables de la mayoría de la expresión de C en
los eritrocitos humanos.
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Se ha reportado antígenos variables E y c, pero son considerablemente menos
comunes.
Cualesquiera que sean los reactivos utilizados, las indicaciones del fabricante
deben ser seguidas cuidadosamente. Los concentrados de sueros humanos
usados para preparar reactivos, de los demás antígenos Rh; tienen riesgo
significativo de contener especificidades contaminantes reactivas con la
antiglobulina, anticuerpos irregulares e inducir poliaglutinación.
Para evitar estas y otras situaciones, es recomendable correr en paralelo con la
prueba controles positivo y negativo para los antígenos en estudio.
Los eritrocitos seleccionados para el control positivo deben tener
preferiblemente una sola dosis del antígeno implicado. La frecuencia de estos
antígenos en población caucásica es de:
C: 70%, c: 80%, E: 30% y e: 98% respectivamente.
Materiales y Reactivos:
Anti-C, Anti- c, Anti-E, Anti-e, Anti-D, anti-A, anti-B, anti-AB
Células A1, células B, células control de antiglobulina humana
Reactivo de antiglobulina humana
Albúmina 22%
Solución salina 0.9%
Solución de Alsever
Tubos de ensayo para análisis
Pizetas
Pipetas pasteur
Centrífuga serológica
Guantes
Gabacha
Jeringas
Agujas
Tubos con EDTA
Tubos con solución de Alsever
Algodón
Alcohol al 70%
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Recipientes de descarte de muestras y material
Muestras:
Se puede utilizar muestras de sangre con EDTA o sin anticoagular.
Método:
Preparar una suspensión de células al 3 – 5% en solución salina fisiológica.
Rotular tubos como D, C, E, c, e y control.
Añadir una gota del reactivo a cada tubo rotulado.
Añadir una gota de la suspensión a analizar a todos los tubos.
Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm.
Resuspender, leer, anotar las reacciones
Incubar los tubos que dieron reacción negativa a 37ºC por 15 minutos.
Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm.
Resuspender, leer, anotar e interpretar las reacciones.
Interpretación de resultados:
Una aglutinación de 1+ a 4+ indica que hubo reacción antígeno - anticuerpo,
por lo que la prueba debe ser considerada positiva.
La no presencia de aglutinación en el medio indica la ausencia del antígeno y
por lo tanto la prueba es negativa.
Muchos de estos antisueros son del tipo IgM, o IgG químicamente modificados
por lo que no se debe de llevar hasta la fase de antiglobulina humana, sólo con
la incubación a 37ºC y centrifugación es suficiente.
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Práctica:
Con el tubo de EDTA de su sangre realizar una suspensión entre el 3- 5% y
determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh y el fenotipo C, E, c y e.
Seguir realizando determinaciones de grupo en adulto y recién nacido.
Resultados:
Anti-A Anti-B Células A Células B Anti-D Control Mi grupo sanguíneo
es:
Anti-C Anti-c Anti-E Anti-e Mi fenotipo Rh es:
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Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Células Control de AGH
Interpretación
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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Procedimiento 13
Determinación de la sustancia H en saliva
Principio
El gen Se es el responsable de la expresión del antígeno H en las secreciones.
En las personas secretoras se puede encontrar sustancia H en saliva, orina,
lágrimas, líquido amniótico, leche y fluidos digestivos. La cantidad encontrada
en estas secreciones puede variar dependiendo del grupo ABO.
Si las personas son del grupo A, B o AB y heredaron el gen Secretor, se pueden
detectar sustancias A, B o ambas en las secreciones.
La mayoría de la sustancia H encontrada en secreciones pertenecen a individuos
del grupo O pasando por las secreciones de los individuos A o B, hasta llegar a
individuos del grupo AB donde puede estar ausente debido a que prácticamente
toda ha sido convertida.
El gen Se es de carácter dominante sobre se. El 80% de la población es
secretora debido a que heredó el gen Se.
El gen “se” no se ha asociado con la codificación de algún producto
demostrable, por lo que se dice que es un gen amorfo y representa al 20% de la
población.
Reactivos y materiales
Sets de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, anti H, albúmina 22% y
reactivo de antiglobulina humana
Solución salina fisiológica
Células al 3% de los grupos A1, B y O
Muestras con sangre para analizar.
Beacker de 10 ó 25 ml
Tubos tipo Pirex
Pipeteadores
Pipetas de 10 ml
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Trípodes
Mecheros de bunsen
Chispas para mechero
Cedazos
Centrífugas serológica
Centrífugas de tubos
Pipetas Pasteur
Goteros para pipetas pasteur
Tubos de 12 x 75 mm
Micropipetas de 100-200 ml (en este caso poner puntas de micropipetas)
Pipetas de 1 ml
Papel parafilm
Material de descarte
Gradillas metálicas
Gradillas madera
Puestos de descarte por mesa y material necesario para la limpieza de las
mesas.
Preparación de la muestra:
Colectar aproximadamente 5 ml de saliva fresca en un beaker o frasco de vidrio
de boca ancha.
Transferir la saliva a un tubo 12x75 mm y centrifugue 5 minutos a 3000 rpm.
Transferir el sobrenadante claro a un tubo de vidrio tipo pirex.
Colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos
Transferir nuevamente la saliva a un tubo 12 x 75 mm
Centrifugar la muestra por 5 minutos a 3500 rpm
Utilizar el sobrenadante claro y opalescente inmediatamente para su estudio. Si
no lo va a procesar al momento se puede congelar a -20ºC para su posterior
análisis.
Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos O, A1 y B.
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Preparación de reactivos:
El siguiente procedimiento se va a realizar por mesa de trabajo y de este van a
realizar sus respectivas pruebas.
Realizar diluciones dobles del reactivo anti-A, anti-B y anti-H hasta obtener una
aglutinación de 2+.
Método:
Determinación de la sustancia A, B o H en saliva:
Pipetear 100 ul. del sobrenadante de la saliva en dos tubos de ensayo limpios.
Rotular uno como H y otro como control negativo.
Añadir 50 ul de solución salina al tubo rotulado como control negativo.
Añadir 50 ul de la lectina anti-H diluida al tubo rotulado como H.
A otro tubo rotulado como control positivo añadir 100 ul de la lectina anti-H
diluida con 50 ul de solución salina.
Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
Añadir 50 ul de la suspensión de glóbulos rojos O a los tres tubos de reacción.
Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3500 rpm.
Resuspender, leer e interpretar lo resultados
Realizar el mismo procedimiento cambiando el reactivo diluido anti A o anti B
para determinar la presencia de sustancias A, B o ambas en saliva.
Interpretación de resultados:
Si la sustancia H está presente en la saliva, la lectina anti-H añadida al medio de
reacción es neutralizada y los glóbulos rojos no aglutinan, a estos individuos los
clasificamos como Secretores.
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Si en la muestra no hay sustancia H la lectina anti-H no es neutralizada y los
células pueden aglutinar con el reactivo presente en el medio. A estos
individuos los clasificamos como No Secretores.
El anterior principio lleva al concepto de inhibición de la hemaglutinación.
Para validar la prueba se debe correr un control positivo y negativo en paralelo a
la muestra a analizar.
En estos casos el control positivo debe de aglutinar indicando que el anti-H fue
diluido correctamente y queda libre para reaccionar con los glóbulos.
El control negativo indica que no hay sustancias interferentes en la saliva que
produzcan aglutinación espontánea en el medio.
Práctica:
Determinar estado secretor en saliva.
Seguir realizando determinaciones de grupos sanguíneos.
Resultados:
Reacción de inhibición de la hemaglutinación Estado secretor:
Sustancia H
Control Positivo
Control Negativo
Sustancia A
Control Positivo
Control Negativo
Sustancia B
Control Positivo
Control Negativo
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Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Células Control de AGH
Interpretación
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2
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4
5
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7
8
9
10
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Procedimiento 14
Determinación fenotípica del sistema MNSs
Principio
Los antígenos M y N fueron descubiertos en 1927, cuando Landsteiner y Levine
obtuvieron los anticuerpos que los definían mediante la inmunización de
conejos con glóbulos rojos humanos.
Son dos genes estrechamente ligados uno que codifica para los antígenos MN y
el otro para los antígenos Ss.
En este sistema se agrupan 3 antígenos de alta frecuencia y al menos 30 de baja
frecuencia.
Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo MNSs se encuentran ubicados en
proteínas integrales de membrana del glóbulo rojo de 43 KDa.
Los antígenos MN se localizan en la glicoforina A (GPA) y los Ss en la
glicoforina (GPB), también se han ubicado los antígenos del sistema Gerbich en
las glicoforinas C y D.
Las glicoforinas además de interaccionar con el citoesqueleto del glóbulo rojo
poseen alta cantidad de ácido siálico en su estructura lo que ayuda a brindar la
carga negativa a la membrana.
La diversidad antigénica está basada predominantemente en las
recombinaciones genéticas, recombinaciones homólogas o conversiones
génicas.
Los eritrocitos que carecen de los antígenos S y s son también negativos para el
antígeno del alta frecuencia U.
Los antígenos M y N así como los S y s se comportan como productos de pares
de genes alélicos, manteniendo una clara relación alélica.
Los anticuerpos contra antígenos del sistema MNSs se han involucrado como
causa de reacciones hemolíticas transfusionales, agudas o tardías, especialmente
en pacientes politransfundidos.
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Los anticuerpos anti-M y anti-N pueden mostrar efecto de dosis dando
reacciones significativas más intensas y con altos títulos en presencia de
glóbulos rojos homocigotos para los antígenos que frente a glóbulos rojos
heterocigotos.
El anti-M se detecta en el suero humano como una aglutinina en solución salina
a temperatura ambiente sin antecedentes de transfusión; condición que le
permite su denominación de anticuerpo natural.
El anti-M rara vez produce problemas clínicos, aunque cuando reacciona a 37ºC
o en fase de antiglobulina se puede considerar como significativo,
especialmente si este es del tipo IgG.
El hallazgo de un anti-N es menos frecuente que el anti-M, es una IgM y
típicamente se comporta como crioaglutinina, eventualmente puede presentarse
como una IgG con expresión clínica significativa, como ocurre en los pacientes
bajo hemodiálisis.
En estos pacientes posteriormente se logró asociar la producción del anticuerpo
anti-N con el uso de membranas de diálisis esterilizadas con formaldehido.
Dado que las enzimas destruyen los antígenos, la reactividad anti-M y el anti-N
puede ser eliminada por técnicas enzimáticas habituales.
Los antisueros comerciales anti-M o anti-N debido a que han sido seleccionados
y estandarizados para reaccionar adecuadamente con todos los glóbulos en
estudio en muy raras ocasiones presentan efecto de dosis a diferencia de los
anticuerpos producidos por los pacientes.
Frecuentemente se encuentran casos de anti-M que reaccionan sólo con
glóbulos rojos homocigotos. Por el contrario, los sueros de anti-N rara vez
producen este efecto.
Los anticuerpos anti-S, anti-s y anti-U pueden aparecer posterior a una
estimulación eritrocitaria, se detectan en la fase de antiglobulina e in vivo
muestran una significativa actividad hemolítica.
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La frecuencia de fenotipos del sistema MN en poblaciones caucásicas es de:
MM: 28%, MN: 50% y NN: 22%
Reactivos
Se dispone de reactivos comerciales para determinar los antígenos MNS y s.
Estos se obtienen a partir de inmunización de animales, de origen humano,
anticuerpos monoclonales de ratón y de lectinas.
La lectina más ampliamente utilizada como reactivo análogo del anti-N es el
extraído de las semillas de Vicia gramínea.
En la mayoría de los casos, los reactivos obtenidos de estas distintas fuentes
darán reacciones concordantes, pero pueden a veces hallarse discrepancias por
sutiles diferencias de especificidad, por lo que es imprescindible seguir
estrictamente las indicaciones de la casa comercial.
Materiales y muestras:
1. Tubos de pruebas limpios y secos
2. Pipetas pasteur
3. Solución salina 0.9%
4. Centrífuga serológica (3000 rpm )
5. Guantes
6. Gabacha
7. Recipientes de descarte de material
8. Tubos de ensayo
9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA
Procedimiento para la detección de los antígenos MN:
1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.
2- Identificar los tubos a analizar como M y N.
3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.
4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.
5- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.
6- Resuspender las células e interpretar las reacciones
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Tabla 3: Interpretación de resultados sistema MN
Anti-M Anti-N Interpretación
1+ a 4+ 0 MM
0 1+ a 4+ NN
1+ a 4+ 1+ a 4+ MN
Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos homocigotas para los
antígenos a investigar tanto positivos como negativos.
Si el control no concuerda con el resultado a obtener se considera inválido. Si
esto ocurre, lave los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la
suspensión de células y repita la prueba.
Si prevalece un resultado no conforme en el control, el resultado se considera
inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de reactivos o
técnicas diferentes.
Procedimiento para la detección de los antígenos Ss:
1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.
2- Identificar los tubos a analizar como S y s.
3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.
4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.
5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC
6- Lavar tres veces con solución salina.
7- Añadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana.
8- Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.
9- Resuspender las células e interpretar las reacciones.
10- Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células
control.
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Tabla 4: Interpretación de los resultados sistema Ss
Anti-S Anti-s Interpretación
1+ a 4+ 0 SS
0 1+ a 4+ ss
1+ a 4+ 1+ a 4+ Ss
Práctica:
Con técnica aséptica transfiera una alícuota de la sangre preservada en
ALSEVER a un tubo adecuadamente rotulado.
Guardar el resto de la muestra con solución de Alsever para próximas prácticas.
De la muestra transferida, realizar tres lavados con solución salina fisiológica y
preparar una suspensión al 3-5%.
Determinar el fenotipo para los antígenos M N S y s.
Realizar determinaciones fenotípicas de grupo ABO y Rh de las muestras
provistas en el laboratorio.
Resultados, discusión y conclusiones:
Anti-M Anti-N Anti-S Anti-s Fenotipo MNSs:
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Muestra Anti-A Anti-B Cel.- A Cel.- B Anti-D Control Células Control de AGH
Interpretación
1
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6
7
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9
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Procedimiento 15
Determinación fenotípica de los sistemas de grupo sanguíneo Kell, Duffy y Kidd.
Principio:
Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo Kell se ubican en una proteína de
un solo paso transmembrana de 93 KD; en ella se han podido identificar al
menos 25 antígenos distintos.
Este sistema se caracteriza por estar constituido por antígenos de alta y de baja
incidencia dentro de la población.
Se ha observado que 13 de estos antígenos son de alta frecuencia y al menos 5
de baja incidencia, algunos se encuentran organizados en cinco grupos alélicos,
mientras que otros, principalmente los antígenos de alta frecuencia, pueden ser
expresados independientemente.
El antígeno Kell (K) sólo se expresa en la membrana del glóbulo rojo. El
promedio de sitios antigénicos varía de 2300 a 6100 en eritrocitos homocigotos
para K y de 200 a 3500 en células heterocigotas Kk.
El grupo sanguíneo Kell, es altamente inmunogénico y está completamente
desarrollado al nacer.
Al igual que con otros sistemas de grupo sanguíneo, el anti-K puede ser
adquirido al exponerse a eritrocitos con presencia del antígeno ya sea por una
transfusión de sangre o por un embarazo donde el niña/o hereda el antígeno
paterno.
Con muy poca frecuencia se han descrito casos de anti-K y anti-k (Cellano) de
presentación natural. Estos son del tipo IgM, reaccionan a temperatura ambiente
y se presentan secundarios a infecciones agudas bacterianas, principalmente
cuando el agente causal es una E. coli O125.b15.
Desde el punto de vista inmune, los anti-K y anti-k son muy importantes,
usualmente son anticuerpos del tipo IgG1 con fuerte actividad hemolítica in
vivo.
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El sistema Duffy está constituido por una glicoproteína de 35-43 kDa que se
expresa en la membrana del glóbulo rojo.
El número de sitios antigénicos en células Fy (a+b-) se ha estimado en 6900 y
de 17000.
Los antígenos del sistema Duffy están relacionados cuando menos con siete
receptores diferentes de membrana, entre los que se incluyen al receptor de
quimosinas y al receptor de los parásitos de la malaria.
Un hecho importante y que se ha asociado mucho con procesos de evolución y
adaptación de las especies, es que los glóbulos rojos con fenotipo Fy (a-b-),
muy comunes en individuos de raza negra, son resistentes a la invasión de los
parásitos de las especies de Plasmodium vivax y Plasmodium knowlesi.
Los anticuerpos Duffy pueden causar reacción hemolítica severa, asimismo, su
presencia en mujeres embarazadas debe de ser evaluada cuidadosamente
monitoreando cambios constantes en el título de anti- Fy maternos.
Se ha establecido que títulos de anticuerpos maternos de 1:64 o mayores deben
de ser considerados de alto riesgo fetal y neonatal.
En el sistema Kidd (Jk) se ha observado que sujetos Jk(a-b-) tienen resistencia
a la lisis por la urea 2M, aunque conservan normal su función de permeabilidad
al agua.
Una característica del anticuerpo producido contra antígenos del sistema Kidd
es que muestra destrucción mediada por complemento, dichos anticuerpos se
han observado en pacientes que son Jk(a-b-) en donde el 90% de las células
Jk(a+b+) transfundidas son eliminadas en 30 minutos, mientras que se prolonga
al triple cuando son células Jk(a+b-).
Este anticuerpo también se encuentra asociado con la producción de cuadros de
enfermedad hemolítica severa.
Materiales
1. Tubos de pruebas limpios y secos
2. Pipetas pasteur
3. Solución salina 0.9%
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4. Centrífuga serológica (3000 rpm )
5. Gradillas
6. Guantes
7. Gabacha
8. Recipientes de descarte de material
9. Tubos de ensayo
Muestras:
Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
Muestras preservadas con solución de Alsever.
Reactivos:
Anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fy
b, anti-Jk
a, anti-Jk
b, albúmina al 22%,
antiglobulina humana, Células Control de Antiglobulina Humana.
Método:
1. Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.
2. Identificar los tubos a analizar como K, k, Fya, Fy
b, JK
a, Jk
b, control.
3. Añadir 50ul del antisuero correspondiente a cada tubo rotulado
4. Al tubo control añadir 50 ul de de albúmina al 22%
5. Añadir a todos los tubos 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.
6. Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC
7. Lavar tres veces con solución salina.
8. Añadir dos gotas de reactivo de antiglobulina humana
9. Mezclar y centrifugar a 3500 rpm por 15 segundos.
10. Resuspender las células, leer e interpretar las reacciones.
11. Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células
control.
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Tabla 5: Interpretación de los resultados sistemas Kell, Duffy y Kidd.
Anti-K Anti-k Interpre. Anti-Fya Anti-Fyb Interpre. Anti-Jka Anti-Jkb Interpre. Control
1+ a 4+ 0 KK 1+ a 4+ 0 Fy(a+b-) 1+ a 4+ 0 Jk(a+b-) 0
0 1+ a 4+ kk 0 1+ a 4+ Fy(a-b+) 0 1+ a 4+ Jk(a-b+) 0
1+ a 4+ 1+ a 4+ Kk 1+ a 4+ 1+ a 4+ Fy(a+b+) 1+ a 4+ 1+ a 4+ Jk(a+b+) 0
Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos conocidos, tanto
positivos como negativos, para los antígenos a investigar.
Si el control no concuerda con el resultado a obtener se considera inválido. Si
esto ocurre, lave los eritrocitos con solución salina a 37ºC previo a preparar la
suspensión de células y repita la prueba.
Si prevalece un resultado no conforme con el control, el resultado se considera
inválido y se requiere investigación adicional con la utilización de reactivos o
técnicas diferentes.
Práctica:
Tomar una alícuota de la sangre preservada en ALSEVER y transferir una
muestra a un tubo adecuadamente rotulado.
Realizar tres lavados con solución salina fisiológica y preparar una suspensión
al 3-5%.
Determinar el fenotipo para los antígenos K, k, Fya, Fy
b, Jk
a y Jk
b.
Realizar fenotipo ABO y Rh de las muestras dadas en el laboratorio.
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Resultados, discusión y conclusión:
Anti-K Anti-k Interpretación
Anti-Fya Anti-Fyb Interpretación
Anti-Jka Anti-Jkb Interpretación
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Procedimiento 16
Células rastreadoras o células pantalla
Principio
Parte de la rutina de un Banco de Sangre es la búsqueda constante de
anticuerpos irregulares presentes en el suero de donadores o pacientes que
puedan causar alguna reacción transfusional cuando se administra un
hemocomponente.
Se ha vuelto requisito obligatorio contar con células rastreadoras o pantalla que
permitan establecer la presencia de alguno de estos anticuerpos.
Estas células pueden ser obtenidas tanto comercialmente como realizadas en
nuestro lugar de trabajo, deben ser del grupo O para evitar que los anticuerpos
naturales interfieran en la detección de otros anticuerpos.
Se obtienen a partir de donadores que son fenotipeados y que poseen los
antígenos más comunes dentro de la población y que son reconocidos como de
importancia clínica, es decir, capaces de causar una reacción transfusional o una
enfermedad hemolítica del recién nacido.
Las células seleccionadas deben contar con al menos en una de ellas uno de los
siguientes antígenos: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Le
b, K, k, Fy
a, Fy
b, Jk
a y
Jkb.
Como el objetivo es detectar anticuerpos, la célula rastreadora ideal debe tener
la mayor cantidad de expresión homocigota posible ya que estas células poseen
doble dosis de antígeno en contraposición con las células de individuos
heterocigotas.
Esto es importante pues hay mayor probabilidad de detectar anticuerpos que
reaccionan débilmente o que presentan bajo título con células que expresan más
cantidad de antígeno.
Las células rastreadoras provenientes de tres donadores deberán ser
homocigotas para antígenos del sistema Rh de la siguiente manera R1R1, R2R2
y rr.
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También en combinación deberán tener los antígenos homocigotas Kidd, Duffy
y MNSs, los cuales se ha observado que muestran efecto de dosis.
Otro punto importante que deben de cumplir las células rastreadoras es contar
con al menos una célula Kell positivo ya que el antígeno Kell es altamente
inmunogénico y de baja incidencia pudiendo llegar a producir severas
reacciones transfusionales.
Si un juego de reactivos no contiene un antígeno en particular el
correspondiente anticuerpo no podrá ser detectado cuando se realice la
investigación.
Al interpretar un rastreo de anticuerpos se debe de contar con una tabla
fenotípica en donde se indica cuáles antígenos están presentes en las células y
que deben acompañar al juego de células según el lote del reactivo.
Las células rastreadoras pueden estar disponibles en diferentes presentaciones a
modo de:
- Un único vial, constituido por no menos de dos células de donantes que han
sido mezcladas, a este se le conoce como pool, son menos sensibles y son
utilizadas en el rastreo de anticuerpos en donantes de sangre.
- Dos viales, cada una de un donador diferente, presentan baja sensibilidad.
- Tres viales, proveniente de tres donantes diferentes, poseen una buena
sensibilidad para la detección de anticuerpos y es la más utilizada en el país.
- Seis viales, proveniente de 6 donantes diferentes son las que poseen la mayor
capacidad de detección de anticuerpos.
Para las pruebas pretransfusionales son requeridas la presencia de células
rastreadoras de al menos tres viales para la detección de anticuerpos.
La detección de niveles de anticuerpos muy bajos en el suero del receptor es
importante porque la presencia de un antígeno positivo, puede resultar en una
respuesta inmune secundaria con una rápida producción de anticuerpo y
destrucción del hemocomponente transfundido.
Una vez confirmada la presencia de anticuerpo en un suero se tiene que
investigar cual es el antígeno causante de la producción de este, por lo que se
hace uso de paneles de identificación de anticuerpos que son un grupo de 8 a 16
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células con fenotipo completo y que en conjunto permiten establecer cuál es el
antígeno causante.
Método:
Preparación de células pantalla
• Preparar suspensiones de eritrocitos de donadores O al 3% en solución
salina.
• Las células escogidas de referencia son R1R1, R2R2, rr.
• Hacer fenotipo para los grupos sanguíneos Duffy, MNSs, Kk, Kidd, Lewis y
P.
• Escoger el fenotipo de células I, II, III.
• Separar una cantidad de 150 cc de sangre, con el número de donador, fecha
de extracción y de separación.
• Agregar 150 cc de solución salina a la sangre separada.
• Añadir 2 cc de gentamicina.
• Añadir 1 cc de penicilina y agitar.
• Guardar a 4 ºC en el espacio de sangre en cuarentena.
• Las células se deben de cambiar cada mes.
• Si se considera necesario se puede añadir soluciones preservantes como CPD
o Alsever para mantener la calidad y viabilidad de las células.
Práctica:
Proceder a anotar en la pizarra su fenotipo completo.
Una vez anotados todos los integrantes, seleccionar los mejores perfiles para
una célula rastreadora.
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Anotaciones y comentarios:
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Procedimiento 17
Prueba de inmunoglobulina indirecta.
Principio
En 1945 Coombs y colaboradores describieron una prueba para detectar
anticuerpos no aglutinantes o sensibilizantes contra el antígeno Rh, demostraron
de este modo el recubrimiento in vivo o in vitro de eritrocitos por anticuerpos
del tipo IgG y por componentes del complemento.
En la actualidad a esta prueba se le conoce como la prueba de antiglobulina
humana y ha tenido gran desarrollo en el campo de la inmunohematología y
otras áreas afines.
Este antisuero puesto en contacto con el eritrocito recubierto de anticuerpos no
aglutinantes provocará su aglutinación.
En inmunohematología se utilizan dos tipos de pruebas de antiglobulina, la
prueba directa e indirecta.
La prueba de antiglobulina indirecta demuestra la presencia de anticuerpos no
aglutinantes o irregulares en el suero de los pacientes, se utiliza para demostrar
reacciones in vitro entre eritrocitos y anticuerpos, como en los casos de
detección de anticuerpos, identificación de anticuerpos, fenotipo de grupos
sanguíneos y pruebas de compatibilidad, también resulta positiva en algunas
anemias hemolíticas.
El reactivo de antiglobulina se obtiene al inyectar un conejo con globulinas
humanas (IgG y C3) que estimulan la producción de anticuerpos frente a dichas
proteínas. El suero del animal, se somete a procesos de adsorción para eliminar
los anticuerpos no deseados, de tal manera que reaccionará específicamente
contra las globulinas humanas.
Un aspecto importante de tomar en consideración en el procedimiento es la fase
de los lavados, los cuales se deben de realizarse de forma cuidadosa para evitar
que los anti-anticuerpos reaccionen con anticuerpos libres en el medio y sean
neutralizados.
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Los eritrocitos recubiertos con globulina humana, una vez lavados son
aglutinados por el reactivo de antiglobulina humana. El fragmento Fab de la
molécula de antiglobulina humana reaccionará con el fragmento Fc de la IgG.
Los eritrocitos no recubiertos no son aglutinados. La intensidad de la reacción
de aglutinación observada es proporcional a la cantidad de globulina que
recubre los eritrocitos.
Tipos de reactivos de antiglobulina humana
Existen en el mercado varias modalidades de reactivos de antiglobulina
humana, con diversas propiedades y aplicaciones, los principales son:
- Poliespecífico: Contiene anti-IgG y anti-C3d.
- Poliespecífico: Contiene anti-IgG humano, de conejo y anti C3b y
C3d monoclonal de ratón
- Anti-IgG: Contiene anti-IgG sin actividad anti-complemento
- Anti-IgG (cadenas pesadas): Contiene sólo anticuerpos que reaccionan
con las cadenas gamma humanas
- Anti-C3d y anti-C3b y anti-C3d, C4b, C4d: Contiene solo anticuerpos
que reaccionan con uno o varios componentes del complemento. No tiene
actividad anti-inmunoglobulina.
- Anti-C3d (monoclonal de ratón) y C3b, C3d (monoclonal de ratón)
Contiene sólo anticuerpos reactivos contra el anti- componente designado
del complemento, sin actividad anti-inmunoglobulina.
La mayoría de sueros monoclonales antiglobulina humana poliespecífico
disponibles en el mercado son una mezcla de anti-IgG de conejo y un anti- C3b,
C3d monoclonal. El anti-C3d, C3d monoclonal no contienen anti-C4, por lo
que con este suero produce menos cantidad de reacciones no específicas.
Las desventajas asociadas con el uso de un anti-IgG monoclonal incluyen:
a) Resultados falsos negativos si la prueba no es leída en un estricto período
de tiempo. Una reacción prozona puede ocurrir si la prueba no es
centrifugada y leída en 60 segundos después de añadida la antiglobulina.
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b) No todas las subclases de IgG son detectadas usando este IgG
monoclonal.
Actualmente la técnica en gel para la prueba de antiglobulina directa e indirecta
es la prueba más utilizada y de mayor sensibilidad que la técnica en tubo.
Materiales y Reactivos:
Tubos con muestras de suero para analizar.
Tubos de 12 X 75 mm para realizar los estudios.
Baño maría a 37ºC.
Pipetas Pasteur.
Bulbos de pipetas.
1 Juego de células rastreadoras 3%.
1 Frasco de suero de Coombs.
1 Frasco de albúmina bovina 22%.
1 Dispensador con solución salina fisiológica.
1 Centrífuga serológica.
1 Gradilla para tubos.
1 Frasco con células de control de antiglobulina humana.
1 Papel toalla.
Método
- En dos juegos de 3 tubos rotule el número de muestra a analizar e indicar si se
trata de:
- Células I,
- Células II y
- Células III
- Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de las células
rastreadoras.
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- Añadir al tubo rotulado como células I 50ul de las células reactivo
correspondiente I
- Añadir al tubo rotulado como células II 50ul de las células reactivo
correspondiente II
- Añadir al tubo rotulado como células III 50ul de las células reactivo
correspondiente III
- No confunda los goteros, no deje reactivo en el gotero, cierre bien los
reactivos después de ser utilizados y colóquelos en su lugar.
- Añadir 100ul del suero 1 al juego de tres tubos rotulado como muestra 1.
- Añadir 100ul del suero II al juego de tres tubos rotulado como muestra 2.
- Añadir a todos los tubos 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%.
- Mezclar los tubos.
A partir de este momento iniciamos con las tres fases de la prueba de
antiglobulina humana indirecta.
Fase I, Centrifugación inmediata o prueba rápida:
Centrifugar los tubos 15 segundos a 3000 rpm. En esta fase se detectan
anticuerpos de tipo IgM como los del sistema ABO, auto-anti-I, anti M,
anti N, anti Lewis, etc.
Resuspender con suavidad, leer y realizar las anotaciones.
FASE II, Incubación a 37ºC:
Después de la lectura anterior, colocar los tubos a 37ºC por 30 minutos.
Recuerde que dependiendo de la necesidad o las normativas de
funcionamiento de cada Banco de Sangre se pueden utilizar otros medios
potenciadores de reacción entre los cuales podemos mencionar la
albúmina, solución de baja fuerza iónica (LISS), polietilenglicol (PEG) y
enzimas que facilitan las reacciones antígeno-anticuerpo y que son
escogidos de acuerdo a las características de las técnicas utilizadas.
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Para cada uno de ellos se deben de apegar para su utilización las
instrucciones que el fabricante establezca.
Al concluir la incubación, centrifugar los tubos 10 segundos a 3000 rpm.
Leer y hacer las anotaciones correspondientes.
Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.
FASE III o de antiglobulina:
Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico (suero
de Coombs).
Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm.
Leer y realizar sus anotaciones.
Homogenizar las células reactivos de Control de Antiglobulina Humana.
A las pruebas que dieron negativo, añadir 50ul de las células reactivo de
Control de Antiglobulina Humana.
Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm.
Leer, hacer las anotaciones respectivas e interpretar los resultados
obtenidos.
Resultados
Fase I
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
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Fase II
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Fase III
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Células Control
de AGH
Células Control
de AGH
Interpretación de Resultados:
Muestra I:
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
Muestra II:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Anotaciones y consideraciones finales:
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Procedimiento 18
Prueba de antiglobulina directa
Principio
El principal uso de la prueba de antiglobulina directa es la demostración de
anticuerpos y/o fracciones del complemento que están recubriendo los
eritrocitos in vivo.
Se utiliza para el estudio de anemia hemolítica autoinmune, la hemólisis
inducida por medicamentos, la enfermedad hemolítica del recién nacido y las
reacciones aloinmunes frente a eritrocitos recientemente transfundidos.
Reactivos y Materiales:
Tubos con muestras de eritrocitos a analizar.
Tubos con muestras de suero a analizar.
Tubos de 12 X 75 mm para realizar las reacciones.
Pipetas Pasteur.
Bulbos de pipetas.
Frasco de reactivo de antiglobulina humana.
Pizetas con solución salina fisiológica.
Centrífuga de serológica.
Gradillas.
Frascos con células control de antiglobulina humana.
Baño maría.
Juego de células rastreadoras 3%.
Papel toalla.
Método:
- Rotular tres tubos con el número de muestra a procesar.
- Tomar una alícuota de la muestra y transferir a un tubo rotulado.
- Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.
- En el segundo tubo hacer una suspensión de trabajo al 3-5% a partir de
la muestra de eritrocitos lavada.
- Añadir al tercer tubo 50 ul de la suspensión de trabajo realizada.
- Añadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana.
- Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm
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- Resuspender , leer por aglutinación y hacer las anotaciones respectivas.
- A las pruebas que dieron negativo hacer la corroboración con las células
control de antiglobulina.
Práctica:
Muestras de suero:
- Realizar prueba de inmunoglobulina indirecta.
- Durante el proceso de incubación de 30 minutos realizar las pruebas de
inmunoglobulina directa.
Muestras de glóbulos rojos:
- Realizar la prueba de antiglobulina directa.
Resultados
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA
MUESTRA I MUESTRA II Interpretación
Lectura
Células
Control de
AGH
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PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA
Fase I
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Fase II
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Fase III
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Células Control
de AGH
Células Control
de AGH
Interpretación de Resultados:
Muestra I:
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Muestra II:
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Anotaciones y consideraciones finales:
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Procedimiento 19
Estudio de Anticuerpos Irregulares
Principio
El objetivo de esta prueba es detectar la presencia de anticuerpos clínicamente
significativos fuera del sistema ABO en el plasma de los pacientes/donantes a
los cuales se les realiza el estudio.
Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37ºC y/o
en la prueba de antiglobulina o en ambas, pueden causar reacciones
transfusionales o hemolíticas graves, así como producir un acortamiento de la
sobrevida de las células transfundidas.
Ejemplos de este tipo de anticuerpos son los dirigidos contra los sistemas de
grupo sanguíneo Rh, Kell, Duffy, Kidd, SsU, dentro de otros.
Debe de realizarse rutinariamente en todos los receptores de hemocomponentes
y no sustituye a la prueba cruzada.
La incidencia de anticuerpos fuera del sistema ABO, en diferentes poblaciones
oscila entre 0.78 y 1.64%.
Un paso importante en los protocolos de pruebas pretransfusionales es el
efectuar la determinación del grupo ABO/Rh junto con la detección de
anticuerpos irregulares.
Los métodos empleados en la detección de anticuerpos irregulares pueden
incluir 2 a 3 células pantalla o rastreadoras. Deben de contar con la mayoría de
los antígenos de significancia clínica, ser incubados a 37ºC utilizando el medio
de reacción establecido por el Banco de Sangre como el salino, albúmina,
enzimático o baja fuerza iónica y finalizados con la prueba de antiglobulina
humana de tipo IgG o anti IgG + C3d.
De preferencia cuando la determinación se realiza en tubo se debe utilizar el
reactivo poliespecífico (anti IgG+C3d) debido a que con él se pueden detectar
algunos anticuerpos poco frecuentes demostrados sólo por la actividad del
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complemento como ocurre con los anticuerpos dirigidos contra el sistema de
grupo sanguíneo Kidd.
Cuando un anticuerpo irregular es detectado, la especificidad debe de ser
definida mediante la confrontación del suero/plasma del paciente con las células
del panel de identificación de anticuerpos.
Una vez identificada la especificidad del anticuerpo, se debe de buscar un
hemocomponente que no posea dicho antígeno, realizarle la prueba cruzada y
una vez obtenido un resultado negativo proceder a transfundir al paciente.
Materiales y reactivos
Tubos con muestras de suero a analizar.
Tubos de 12 X 75 mm para realizar las reacciones.
Baño de María a 37ºC.
Pipetas Pasteur.
Bulbos de pipetas.
1 Juego de células rastreadoras 3%.
1 Frasco de suero de antiglobulina humana.
1 Frasco de albúmina bovina al 22%.
1 Pizeta con solución salina fisiológica.
1 Centrífuga serológica.
Gradillas.
1 Frasco con células de control de antiglobulina humana.
1 Papel toalla.
Método: Rotular un juego de 3 tubos donde vaya indicado el número de muestra a
analizar y en uno de ellos lo siguiente.
Células I, Células II y Células III.
Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos de las células
rastreadoras
Añadir 50ul de las células I al tubo rotulado como I.
Añadir 50ul de las células II al tubo rotulado como II.
Añadir 50ul de las células III al tubo rotulado como III.
Añadir 100ul del suero/plasma en estudio a cada uno de los tubos.
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Añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22% a todos los tubos.
Mezclar y realizar las tres fases de la prueba de antiglobulina humana
indirecta.
Leer, hacer las anotaciones respectivas e interpretar los resultados
obtenidos.
Durante el período de incubación de 30 minutos analice los resultados de
los casos presentados en la práctica.
RESULTADOS
Fase I
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Fase II
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Fase III
MUESTRA CELULAS I CELULAS II CELULAS III
Células Control
de AGH
Células Control
de AGH
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Interpretación de Resultados:
Muestra I:
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Muestra II:
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Anotaciones y consideraciones finales:
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Práctica:
Analizar los siguientes casos obtenidos de rastreos de anticuerpos.
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Procedimiento 20
Prueba de compatibilidad sanguínea
Principio
La transfusión sanguínea ha representado una parte importante en la práctica
médica desde hace más de un siglo. En su inicio era utilizada como un
recurso desesperado sin garantía de que el paciente obtuviese algún
beneficio.
Hoy en día, la medicina transfusional es una disciplina médica exitosa y
científica gracias a los conceptos básicos aportados por varios investigadores
dentro de los que se puede mencionar al creador del área de la
inmunohematología Karl Landsteiner y colaboradores, quien en 1900
descubren los antígenos de grupo sanguíneo ABO.
A pesar de este descubrimiento se continuaron reportando éxitos y fracasos a
la transfusión hasta que Ottemberg en 1908 introduce el concepto de realizar
las pruebas cruzadas ABO compatible antes de cualquier transfusión de
sangre.
Posteriormente, en mucho menor cantidad cada ciertos procesos
transfusionales se seguían reportando reacciones transfusionales graves en
pacientes ABO compatibles, hasta que en la década de los 40´s se hace del
conocimiento la presencia de otros tipo de sistemas de grupo sanguíneo
eritrocitarios, motivando el inicio de las investigaciones y métodos de
compatibilidad sanguínea que conocemos hasta hoy en día.
Los pioneros en este campo mezclaron el suero del paciente con las células
rojas del donador y observaron la lisis, la aglutinación o ambas del glóbulo
rojo lo que se conoce como la prueba cruzada mayor.
Actualmente el cruce de sangre para la compatibilidad sanguínea forma parte
de una serie de procedimientos conocidos como pruebas pretransfusionales,
las cuales tienen el propósito de seleccionar los hemocomponentes de la
sangre que tengan una aceptable sobrevida y no causen daño al receptor,
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involucrando procedimientos de identificación, serológicos del donador y del
receptor.
Dentro de los procedimientos obligatorios que estipulan los estándares
internacionales están:
- Solicitud, identificación y colección de la muestra de sangre del
receptor.
- Pruebas del donador las cuales involucran el grupo ABO/Rh,
determinación del fenotipo Rh y Kell, detección de anticuerpos
irregulares y las pruebas serológicas para enfermedades transmisibles por
transfusión sanguínea.
- Determinación del grupo ABO y Rh del receptor.
- Detección de anticuerpos irregulares del receptor.
- Selección de hemocomponentes ABO y Rh apropiados para receptor.
- Prueba cruzada mayor.
- Revisión de la unidad del hemocomponente seleccionado donde se
observan aspectos como la fecha de expiración, realización de estudios
serológicos, detección de anticuerpos irregulares, estado general como
por ejemplo no presencia de coágulos, hemólisis, roturas en la bolsa, etc.
- Comparación entre resultados actuales y el historial de las pruebas
pretransfusionales previas del receptor.
- Reidentificación del receptor antes de la transfusión.
Tomando en cuenta los antígenos del sistema de grupos sanguíneos ABO y
Rh (D) la compatibilidad puede alcanzar hasta un 98%; el resto del
porcentaje restante se logra por medio del estudio de anticuerpos irregulares
clínicamente significativos y la prueba de compatibilidad entre el suero del
receptor y los eritrocitos del donador.
En la actualidad, y a pesar de los procedimientos pretransfusionales, no es
factible tener un 100% de seguridad absoluta de que todos los procesos
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prevengan la sensibilización de los receptores a los aloantígenos
eritrocitarios y que se anulen las reacciones transfusionales tardías,
causadas por la presencia de anticuerpos en cantidades no detectables, en el
suero del receptor antes de la transfusión.
PROCESO DE LAS PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES
La Solicitud, identificación y colección de la muestra de sangre:
Aproximadamente el 50% de las reacciones por transfusión se deben a
reacciones hemolíticas secundarias a errores de tipo clerical por
identificación equívoca del paciente a transfundir, confusión al momento de
extraer la muestra, o en el laboratorio.
Los procedimientos exactos en la identificación del paciente, la muestra
sanguínea y la unidad a transfundir, tienen que estar perfectamente definidos
y escritos en Manuales de Procedimiento de Banco de Sangre, en forma de
rutas críticas para ser consultados cuando sean requeridos.
Antes de realizar la extracción de sangre, el tubo y la solicitud deben de
coincidir con la identificación del paciente, preguntando directamente
cuando sea factible al paciente o corroborando con brazaletes de
identificación; nunca se debe de guiar por los números de cama ya que los
pacientes pueden ser cambiados dependiendo de la necesidad del servicio.
La solicitud debe tener como datos mínimos:
- Identificación del paciente, número de cédula de identidad o pasaporte.
- Nombre completo y edad del receptor.
- Sexo.
- En caso de conocerse se debe de indicar valores como por ejemplo grupo
ABO y Rh, hemoglobina y hematocrito, antecedentes transfusionales,
gestaciones, inmunización materno fetal, reacciones adversas que se
hubieran presentando y medicamentos que se están administrando.
- Diagnóstico de certeza o de probabilidad, así como el motivo de la
indicación transfusional.
- Número de expediente, cama y nombre del servicio donde será
transfundido.
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- Señalar el producto a solicitar incluyendo cantidad de unidades, volumen
o características requeridas.
- Fecha y hora en que se realizará la transfusión y, de ser necesario el
señalamiento de la urgencia de la transfusión.
- Fecha, nombre completo y firma del médico que indica la transfusión.
- Las solicitudes transfusionales deben ser escritas en forma legible para
evitar al máximo la equivocación.
Después de haber realizado una adecuada identificación del receptor, la
muestra de sangre debe ser obtenida, usando técnicas muy cuidadosas para
evitar hemólisis, ya que la misma produce activación del complemento y
algunos anticuerpos pueden ser enmascarados al requerirse del complemento
para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo.
Si no existen problemas serológicos de fondo son suficientes 5 ml de sangre
del receptor para realizar todos los procedimientos inmunohematológicos.
DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUINEO ABO/ Rh EN EL RECEPTOR
Grupo ABO
En la medida de lo posible los receptores deberán recibir hemocomponentes
sanguíneos ABO idénticos, sin embargo, en ciertas situaciones puede ser
necesario hacer selecciones alternativas.
La determinación del grupo ABO es el paso más importante de las pruebas
serológicas pretransfusionales. Se emplean antisueros hemoclasificadores
anti A y anti B para determinar grupo eritrocítico y glóbulos rojos con
antígenos A1 y B para la prueba inversa.
En receptores menores de 4 meses de edad la prueba inversa no se realiza, ya
que en este tipo de pacientes el desarrollo de los anticuerpos naturales
todavía es inmaduro.
En caso de discrepancias entre grupo directo e inverso se emplearán técnicas
adicionales antes de establecer el tipo sanguíneo.
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Cuando se está en presencia de una urgencia extrema, en la que el grupo
ABO no se puede determinar se podrá utilizar glóbulos rojos empacados del
grupo O para transfundir.
ESQUEMA DE SELECCION DE HEMOCOMPONENTES POR ABO:
Si se va a transfundir sangre total o sangre total reconstituida no hay alternativa transfusional, todas deberán de transfundirse grupo ABO idéntico.
Si la solicitud se refiere a Glóbulos Rojos Empacados se pueden utilizar
alternativas como se indican en la tabla 1 dependiendo de las existencias y
reservas del Banco de Sangre.
Tabla 6: Alternativas de selección de unidades de Glóbulos Rojos
Empacados dependiendo del grupo ABO del paciente a transfundir
Grupo del Paciente
Alternativas
Primera Segunda Tercera Cuarta O O - - -
A A O - -
B B O - -
AB AB A * B* O
* Uno u otro de estos grupos sanguíneos pueden ser utilizados en cualquier
momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las
transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo.
Debido a lo anterior, se prefiere la utilización de unidades del grupo A sobre B,
ya que la frecuencia en la población del grupo A es mayor y, por lo tanto, es
más frecuente encontrar más cantidad de sangre A en reservas en los Bancos de
Sangre.
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Grupo Rh
La identificación de antígeno Rh D se realiza usando el hemoclasificador
anti D , la prueba puede realizarse en tubo o en placa de acuerdo a lo
establecido por el fabricante y será validado mediante una prueba de control
en paralelo, que permita demostrar que el eritrocito previamente no tenía
inmunoglobulina tipo IgG adherida en la superficie, si el control es positivo,
el resultado debe ser invalidado.
Cuando la prueba da un resultado negativo, se investigará la expresión débil
del antígeno con la utilización del reactivo de antiglobulina humana, en
neonatos y donadores de sangre.
Las reacciones positivas con anti D, incluyendo el antígeno D expresado
débilmente se clasificarán como Rh POSITIVOS y los restantes como Rh
NEGATIVOS.
Si el grupo Rh no puede ser establecido, dado a que el control también
presenta aglutinación y la transfusión es urgente podrá ser utilizado glóbulos
rojos empacados Rh negativo.
Los hemocomponentes Rh positivos deberán rutinariamente ser enviados a
receptores Rh positivos.
El uso de productos Rh negativos para pacientes Rh positivos es permitido,
aunque en forma ideal, deberán de reservarse exclusivamente para pacientes
o receptores Rh negativos.
De forma inversa, los productos Rh negativos pueden no estar disponibles,
en esta situación se podrá optar por otras medidas alternativas, como
posponer la transfusión o en caso de que el retardo de la transfusión ponga
en peligro la vida del paciente y siempre que el rastreo de anticuerpos del
paciente esté negativo se podría utilizar sangre Rh positiva con un riesgo de
inmunización de un 70%.
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PRUEBA CRUZADA PARA TRANSFUSIÓN DE ERITROCITOS
El cruce de sangre en la actualidad ha sido expuesto a una serie de
interrogantes en cuanto a si debe ser eliminada o no en aquellos pacientes
que no presentan anticuerpos irregulares.
Lo anterior, dado que el rastreo rutinario de anticuerpos en los sueros del
receptor y del donador tiene una alta sensibilidad.
Esto no aplica para cuando la transfusión sea destinada a un paciente que
presente anticuerpos clínicamente significativos.
A estos pacientes, una vez identificado el anticuerpo y seleccionada una
unidad carente del antígeno es obligatorio realizar la prueba cruzada.
La prueba cruzada mayor se refiere a la técnica mediante el cual se
demuestra la ausencia de anticuerpos en el plasma del receptor contra los
antígenos del glóbulo rojo del donador.
Por otro lado, la prueba cruzada menor se refería al cruce entre los eritrocitos
del receptor con el suero del donador y ha sido sustituida en la mayoría de
los bancos de sangre por el rastreo rutinario de anticuerpos clínicamente
significativos en los donantes de sangre.
En caso de existir en el donante un anticuerpo de baja incidencia en su
plasma estos probablemente no causen una reacción transfusional al ser
diluidos en el plasma del receptor.
También se han modificado los medios de reacción, las temperaturas
óptimas y los períodos de incubación, seleccionando procedimientos con un
menor tiempo, costo y un máximo de detecciones de incompatibilidad.
La incubación de la prueba cruzada a temperatura ambiente ha sido siendo
eliminada y se cambió por la fase I de lectura rápida.
La prueba cruzada está constituida por tres fases que se describen en detalle
en la parte del procedimiento y se considera que existe compatibilidad
cuando no se visualiza hemólisis o aglutinación en ninguno de los pasos de
la prueba.
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PRUEBA CRUZADA EN SITUACIONES ESPECIALES
Urgencias.
La necesidad urgente de transfusión en ciertas situaciones clínicas establece
que la sangre sea liberada antes de que la prueba cruzada sea terminada.
El médico tratante debe estar consciente de este riesgo y firmar una hoja de
autorización para que la unidad sanguínea sea liberada, mientras el Banco de
Sangre finaliza la prueba.
En caso de que durante el proceso se determine alguna incompatibilidad en
alguno de los pasos se dará aviso de inmediato al médico encargado para que
se administre el tratamiento oportuno.
De acuerdo a la necesidad de liberación urgente del producto sanguíneo el
Banco de Sangre puede optar por:
- Enviar glóbulos rojos empacados del grupo O Rh negativo y en caso de
no tener en existencia emplear grupo O Rh positivo cuando se
desconozca el grupo sanguíneo del receptor.
- Enviar sangre compatible a grupo ABO y Rh del receptor y donador.
- Siempre que sea posible, realizar la primera fase de centrifugación
inmediata antes de enviar el producto sanguíneo.
- Cuando la transfusión no es de extrema urgencia, pero la sangre se
requiere lo más pronto posible, se puede acortar el tiempo de incubación
de la fase II de la prueba cruzada, empleando diferentes medios de
reacción que requieran un período de incubación más breve a 37ºC para
finalizar con la fase de Antiglobulina Humana.
Prueba de compatibilidad para productos plasmáticos
Deberán ser transfundidos con la corroboración previa del grupo inverso de
acuerdo al esquema transfusional que se indica en la tabla 7.
En el caso de la transfusión de plasma no se debe tomar en consideración el
tipo Rh del paciente o donante debido a que estas unidades no contienen el
antígeno D.
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Para el caso de la transfusión de plaquetas, estas deben de ser transfundidas
bajo el esquema de sangre total pues poseen componentes celulares y
plasmáticos.
También para las plaquetas, dependiendo del tipo de receptor y del volumen
de células transfundidas se puede considerar la administración de
inmunoglobulina Rh a los pacientes Rh negativos transfundidos con
productos Rh positivos.
Tabla 7: Alternativas de selección de unidades de plasma dependiendo del
grupo ABO a transfundir
Grupo del Paciente
Alternativas
Primera Segunda Tercera Cuarta O O A* B* AB
A A AB - -
B B AB - -
AB AB - - -
* Uno u otro de estos grupos sanguíneos pueden ser utilizado en cualquier
momento, pero si se escoge uno debe de mantenerse por el resto de las
transfusiones realizadas, no es recomendable hacer cambio de grupo.
Materiales y reactivos:
Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A1, Reactivo de antiglobulina
humana, albúmina al 22%, células A y B al 3%.
Tubos con muestras de eritrocitos a analizar.
Tubos con muestras de suero a analizar.
Células rastreadoras.
Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones
Solución salina al 0.85% (Pizetas).
Centrífugas Serológicas.
Microscopios.
Frascos con células control de antiglobulina humana.
Pipetas Pasteur.
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Bulbos para pipeta Pasteur.
Baños de María a 37ºC.
Portaobjetos.
Caja de aplicadores.
Gradillas metálicas.
Gradillas madera.
Papel toalla.
Método:
- Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3 y
Paciente 4
- Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4.
- Añadir 50ul de la suspensión del donante 1 al tubo rotulado como Paciente
1.
- Añadir 50ul de la suspensión del donante 2 al tubo rotulado como Paciente
2.
- Añadir 50ul de la suspensión del donante 3 al tubo rotulado como Paciente
3.
- Añadir 50ul de la suspensión del donante 4 al tubo rotulado como Paciente
4.
- Añadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como paciente 1.
- Añadir 100ul del suero del paciente 2 al tubo rotulado como paciente 2.
- Añadir 100ul del suero del paciente 3 al tubo rotulado como paciente 3.
- Añadir 100ul del suero del paciente 4 al tubo rotulado como paciente 4.
- Añadir 100 ul de albúmina bovina al 22% a todos los tubos.
- Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases de
la prueba de antiglobulina humana indirecta.
- Fase I: Centrifugación inmediata o prueba rápida:
Centrifugar los tubos 15 segundos a 3500 rpm. En esta fase se
establece la compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros
anticuerpos (ejemplo: auto-anti-I), pueden también ser detectados
en esta fase. Leer y realizar las anotaciones.
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- Fase II o a 37ºC:
Después de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37ºC por 30
minutos.
Al concluir la incubación sacar los tubos del baño y centrifugar por
10 segundos a 3000 rpm.
Leer y hacer las anotaciones correspondientes.
Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.
Llevar la prueba a la fase de antiglobulina.
- Fase III o antiglobulina:
Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico.
Mezclar y centrifugue 10 segundos a 3000 rpm.
Leer y realizar anotaciones.
Las reacciones con resultado negativo confirmar con las células
control.
Durante el período de incubación realizar las determinaciones de grupo
sanguíneo eritrocitario a cada una de las suspensiones de los pacientes y
donantes.
RESULTADOS
Prueba Cruzada
Paciente 1/
Donante 1
Paciente 2/
Donante 2
Paciente 3/
Donante 3
Paciente 4/
Donante 4
Fase I
Fase II
Fase III
Grupo
ABO/Rh
Donante
Grupo
ABO/Rh
Paciente
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Anti-A Anti-B Anti-D Control Grupo eritrocítico
ABO /Rh
Paciente 1
Paciente 2
Paciente 3
Paciente 4
Anti-A Anti-B Anti-D Control Grupo eritrocítico
ABO /Rh
Donante 1
Donante 2
Donante 3
Donante 4
Interpretación de Resultados:
Paciente 1:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Paciente 2:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Paciente 3:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Paciente 4:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Recomendaciones:
Los resultados de las pruebas deberán ser leídos contra luz blanca.
Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden
con la lectura de las pruebas.
El botón de las células se resuspenderá, se hará la lectura y se asignará los
puntajes en cruces en la hoja de trabajo.
En caso de resultados incompatibles deberán ser investigados en busca de su
causa.
Consideraciones finales:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Procedimiento 21
Identificación de Anticuerpos
Principio
Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular se debe
identificar su especificidad y su importancia clínica.
La determinación de la especificidad de los anticuerpos detectados en los
análisis pretransfusionales es importante para seleccionar unidades que no
posean el antígeno contra el cual va dirigido el anticuerpo.
Los paneles de identificación están compuestos por juegos de 8 a 16 tipos
diferentes de células del grupo O con fenotipo conocido contra los principales
antígenos de grupo sanguíneo.
Estos paneles poseen células positivas y negativas en combinación estratégica
para poder identificar anticuerpos contra alguno de los siguientes antígenos de
grupo sanguíneo:
D, C,E, c, e y usualmente V, VS, f, Cw
M, N, S, s
Fya, Fy
b
Jka, Jk
b
K, k y usualmente Kpa, Kp
b, Js
a, Js
b
Lua, Lu
b
Lea, Le
b
P1
Xga
Otros antígenos con fenotipo poco frecuente pueden ser incluidos dentro del
panel e incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geográfica donde
se encuentre la investigación.
El panel de identificación dispone de una tabla antigénica de reacción donde se
indica la positividad de los diferentes antígenos en relación a la célula que se
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está analizando, así como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar
destinado para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus
interpretaciones.
Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las características de
los anticuerpos como son:
- rango térmico,
- temperatura óptima de reacción,
- sensibilidad o aumento de reacción con enzimas,
- fuerza de reacción de los resultados positivos, tanto aglutinación como
hemólisis.
- Resultado del autocontrol para la detección de autoanticuerpos.
Si se tiene la sospecha que en el estudio están presentes dos o más anticuerpos
se puede hacer uso de diferentes técnicas, procesos y reactivos durante el
análisis.
La aplicación de dos o más técnicas o medios de reacción permite separar los
anticuerpos en base a sus características de reacción con sus antígenos
respectivos, de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor
claridad.
Dentro de estas técnicas se deben considerar la utilización de procedimientos de
absorción/elución, reacciones a diferentes temperaturas y uso de enzimas como
medio de reacción.
La mayoría de pacientes se sensibilizan contra un único antígeno y es fácil
determinar su especificidad, basta con ubicarse en el perfil de reacción dentro de
la tabla antigénica del panel.( 1,2 )
Características de los anticuerpos en las fases de reacción: • Fase de Centrifugación Inmediata:
A 22ºC reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N,
Lewis, y el P.
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El anti I tiene un rango térmico desde 4ºC hasta fase de antiglobulina, sin
embargo, su temperatura óptima es de 4ºC, por lo que para detectarlo
mejor se debe incubar en el refrigerador.
• INCUBACION A 37ºC:
En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la
capacidad de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se
pueden mencionar los anti C, c, E, e, que reaccionan óptimamente al ser
incubados por 30 minutos. También pueden reaccionar a esta
temperatura el anti S, s, D y el Kell.
• FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA:
En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes
como el anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s y Cellano.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solución salina fisiológica
Panel de identificación
Panel de identificación tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reacción.
Centrífugas serológicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Frascos con cloroformo.
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.
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Método:
Panel de identificación
- Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de
identificación según corresponda.
- Rotular un juego de 11 tubos con el número y la muestra a analizar.
- Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado
como células 1.
- Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 2 al tubo rotulado
como células 2 y así sucesivamente hasta completar los 11 tubos.
- Añadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos.
- A todos los tubos añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%.
- Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la
prueba de antiglobulina humana indirecta.
- Anotar los resultados obtenidos en la tabla antigénica que corresponde al
lote del panel.
- Identificar según perfil antigénico obtenido el antígeno contra el cual va
dirigido el anticuerpo en estudio.
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Procedimiento 22
Técnica de adsorción de anticuerpos
Principio
En inmunohematología se habla de adsorción cuando se utilizan células
con fenotipo conocido para provocar que un anticuerpo se pegue a la
superficie del glóbulo rojo.
A partir de un proceso de adsorción se pueden separar a nivel de
laboratorio dos o más anticuerpos mezclados en un suero.
Como primer punto para seleccionar las células a utilizar en la absorción
se deben agrupar las reacciones obtenidas en el panel de identificación y
establecer cuáles eventuales anticuerpos pueden estar presentes.
Seguidamente se debe buscar dentro de las unidades del Banco de Sangre
una unidad cuyo fenotipo posea sólo uno de los antígenos que se
sospecha.
Una vez seleccionada la unidad se toma una alícuota y se realiza el
proceso de adsorción bajo las condiciones óptimas del anticuerpo en
estudio.
La parte final del proceso establece una centrifugación que sirve para
separar los glóbulos rojos sensibilizados del plasma y así obtener los dos
anticuerpos separados.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solución salina fisiológica
Panel de identificación
Panel de identificación tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reacción.
Centrífugas serológicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
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Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Baños a 37ºC
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.
Método:
- Seleccionar una unidad adecuada para adsorción de glóbulos rojos y
tomar estérilmente una alícuota de unos 20 ml.
- Lavar tres veces el paquete con solución salina fisiológica.
- Dejar el paquete el máximo posible sin salina después del último lavado.
- Agregar igual cantidad del suero en estudio.
- Incubar a 37ºC por 30 minutos.
- Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorción.
- Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina
humana directa.
- Mantener en incubación a 37ºC, hasta que se alcance el máximo de
positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una
aglutinación de 3 a 4 cruces.
- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y
los eritrocitos sensibilizados.
- Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo
centrifugado.
- Al suero realizar el panel de identificación de anticuerpos.
- Al paquete globular realizar procedimiento de elución.
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Procedimiento 23
Técnica de Elución de Anticuerpos
Principio
El término elución significa en Inmunohematología liberar los anticuerpos
unidos a la membrana del glóbulo rojo proveniente de un proceso de adsorción.
Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se
puede:
- Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del
glóbulo rojo o se puede
- Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante
agentes químicos como el éter, cloroformo, digitonina o mediante
condiciones físicas extremas como la congelación o el calor.
Una vez liberado el anticuerpo en el eluído se procede a determinar su
especificidad a través del panel de identificación de anticuerpos.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solución salina fisiológica
Panel de identificación
Panel de identificación tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reacción.
Centrífugas serológicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Frascos con cloroformo.
Baños a 37ºC.
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
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Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.
Método:
Técnica de elución con cloroformo
- Tomar el paquete de glóbulos rojos sensibilidados después del proceso
de adsorción. - Lavar una vez con solución salina.
- A un volumen igual de células lavadas agregar un volumen de
cloroformo.
- Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto.
- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m,
- El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo, otra de restos
de membrana y un eluido o hemolizado donde se encuentra el anticuerpo
separado.
- Transferir el eluído a otro tubo y realizar un panel de identificación de
anticuerpos.
Recomendaciones:
Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por
aglutinación así como los negativos deben ser comparados con la tabla
antigénica del panel en su lote respectivo.
Para trabajar procedimientos de adsorción/elución siempre tomar en
consideración la temperatura óptima de reacción. Esta va a ser la temperatura
donde ocurrió la aglutinación más fuerte.
Anotaciones y consideraciones finales:
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Práctica:
Esta práctica incluye los procedimientos del 20 al 22 inclusive.
Se trabajará en grupo de trabajo por mesa en dos sesiones de laboratorio.
La primera sesión realizar la identificación de anticuerpos con panel
corriente y panel con enzima.
Con las muestras indicadas realizar proceso de adsorción y elución de
anticuerpos.
Obtener el suero adsorbido y colocar en la gradilla para trabajarlo en la
siguiente sesión de laboratorio.
Obtener el eluído y colocar en la gradilla para trabajarlo en la siguiente
sesión de laboratorio.
La segunda sesión de laboratorio realizar la identificación de anticuerpos
del suero adsorbido y del eluído.
Hacer el análisis y resolución de los casos de identificación de
anticuerpos propuestos.
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PRACTICA DE CASOS:
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Procedimiento 24
Incompatibilidad materno- fetal
Principio
La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) es una enfermedad en la
cual la madre en gestación produce in vivo aloanticuerpos del tipo IgG contra
antígenos de glóbulo rojo del feto que este heredó del padre.
Debido a esta sensibilización, los glóbulos rojos sufren una destrucción
acelerada tanto antes como después del nacimiento.
Para los recién nacidos que padecen la enfermedad hemolítica la elevación de
los niveles de bilirrubina se convierte en un problema clínico más grave que la
pérdida de la capacidad de transporte de oxígeno como resultado de la
hemólisis.
Los antígenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en
diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal.
Los antígenos contra el sistema de grupo sanguíneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por
mencionar algunos, presentan al nacimiento una potencia antigénica similar a la
observada en los eritrocitos de una persona adulta.
Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ahí que su
expresión antigénica sea menor que los antígenos de un eritrocito de una
persona adulta, ejemplos de estos antígenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y
Lutheran.
También hay antígenos que están muy pobremente expresados al nacimiento y
es hasta después del primer año de vida cuando logran expresarse
completamente, ejemplos de estos antígenos son los del sistema Lewis y el
antígeno I.
El contar con este tipo de información es importante pues a pesar de que la
madre sea portadora de alguno de los anticuerpos de la clase IgG contra algún
antígeno que no esté bien desarrollado al nacimiento, como por ejemplo un anti-
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Lea, la debilidad o ausencia antigénica en el eritrocito del feto, impide que se
inicie o exprese la enfermedad.
En estos casos, puede existir la incompatibilidad eritrocitaria, sin embargo, no
es una evidencia irrefutable del diagnóstico etiológico de la enfermedad
hemolítica.
Las acciones básicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias
en que se ubica el médico y el paciente.
Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres
grupos: el feto o neonato, la madre y el padre.
Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su
estudio:
Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, rastreo
de anticuerpos con las células pantallas y con las células A1 y B procedente del
eluído de la muestra.
Si la muestra lo permite rastreo de anticuerpos con las células A1 y B
procedente del suero de la muestra.
Que se busca con estos análisis?
- Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos del
feto/neonato.
- Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glóbulo del feto
neonato y por consiguiente la reacción hemolítica que se está
produciendo.
Análisis en la madre:
- Determinar grupo ABO/Rh.
- Realizar estudio de anticuerpos.
- Fenotipo
Que se busca con ellos?
- Demostrar la ausencia del antígeno.
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- Demostrar la presencia del anticuerpo.
Análisis al padre:
- Determinar grupo ABO/Rh.
- Determinar el fenotipo eritrocitario.
Que se busca con ellos?
- Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos paternos.
De esta manera se puede contar con un panorama más completo de la situación
y se puede iniciar la evaluación del caso.
La enfermedad hemolítica del recién nacido, desde el punto de vista
inmunohematológico, se puede clasificar en tres categorías principales
dependiendo de la especificidad del anticuerpo sensibilizante:
- Enfermedad Hemolítica por ABO, principalmente por un anti-A,B en
mujeres del grupo O.
- Enfermedad Hemolítica por Rh, debida al anti-D.
- Enfermedad Hemolítica por otros anticuerpos irregulares.
Transfusión intrauterina y del neonato
La sangre para transfusión intrauterina debe ser seleccionada compatible con
los anticuerpos maternos capaces de cruzar la placenta.
Los glóbulos rojos empacados seleccionados para la transfusión intrauterina
deberán ser de preferencia O Rh negativo, y utilizando el suero de la madre
para realizar las pruebas de compatibilidad.
Para las unidades de exanguíneotransfusión deberán ser compatibles con
cualquier anticuerpo materno que hubiera entrado a la circulación fetal.
Todas las unidades seleccionadas para estos procedimientos deberán ser del
grupo sanguíneo O, filtradas, irradiadas, de menos de 5 días de recolectada y
en el caso para las exanguíneotransfusión el plasma para su reconstitución
deberá ser compatible con el grupo ABO del recién nacido.
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Materiales y Reactivos:
Tubos 12 x 75 mm de reacción.
Pipetas Pasteur.
Bulbos pipetas.
Muestras de suero y eritrocitos a analizar
Solución salina fisiológica.
Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albúmina bovina al
22%, reactivo de antiglobulina hunana.
Panel de identificación de anticuerpos.
Frascos con células control de AGH.
Juego de células rastreadoras 3%.
Baños maría a 37°C.
Centrífugas serológicas.
Gradillas de madera.
Gradillas de metálicas.
Microscopios.
Papel toalla.
Método:
- Realizar a la muestra de sangre rotulada como niño una prueba de
inmunoglobulina directa.
- Determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh del niño.
- Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificación de
anticuerpos.
- Realizar una prueba cruzada entre la muestra del niño y el plasma del
donador.
RESULTADOS:
Tipo de incompatibilidad materno fetal analizada:
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Rastreo de anticuerpos materno:
________________________________________________________________
Identificación de anticuerpo materno:
________________________________________________________________
Prueba cruzada:
________________________________________________________________
Anotaciones y consideraciones finales:
________________________________________________________________
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Procedimiento 25
Anemia Hemolítica Autoinmune
Principio
La anemia hemolítica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida
del glóbulo rojo debido a/o a través del sistema inmune, específicamente por los
autoanticuerpos.
Las anemias hemolíticas autoinmune se clasifican en:
- Anemia Hemolítica Autoinmune por anticuerpos calientes
- Síndrome de aglutininas frías
- Hemoglobunuria paroxística al frío
- Anemia Hemolítica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fríos y
calientes)
- Anemia Hemolítica Inmune inducida por drogas
- Anemia Hemolítica Inmune inducida por alloanticuerpos
Cada una de estas se subclasifica en grupos de enfermedades dependiendo de la
causa que desencadena la enfermedad, es decir, si es primaria o secundaria.
La Anemia Hemolítica Autoinmune es designada como primaria si se considera
como una entidad idiopática, es decir, si no está asociada con alguna
enfermedad demostrable que la desencadene.
En contraste, la secundaria está asociada con un desorden primario y con
razones suficientes para sospechar que su asociación es más que meramente
fortuita.
Estos desordenes son diagnosticados en base a las características serológicas de
reacción.
La mayoría de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya
reacción es en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los
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glóbulos rojos humanos es a 37ºC y que por lo general es una inmunoglobulina
de la clase IgG.
El Síndrome de Aglutininas frías es generalmente causado por un
autoanticuerpo de la clase IgM y que exhibe una reactividad máxima a 4ºC.
El anticuerpo causante de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna es una
inmunoglobulina IgG bifásica que difiere en su modo de acción. Este anticuerpo
se detecta in vitro por su habilidad de causar hemólisis de los glóbulos rojos
normales en un procedimiento que lleva dos pasos, una incubación en frío
seguido por una incubación a 37ºC en presencia del complemento.
Finalmente, la ingesta de ciertos medicamentos pueden causar anemia
hemolítica pero aquí el anticuerpo siempre posee una especificidad por la droga
o sus metabolitos.
Reactivos y materiales:
Tubos 12 x 75 mm de reacción
Pipetas Pasteur.
Bulbos pipetas.
Muestras de suero y eritrocitos a analizar
Solución salina.
Reactivo de antiglobulina humana poliespecífico.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico IgG.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico C3
Panel de identificación eritrocitos.
Frascos con células control de AGH.
Juego de células rastreadoras 3%.
Baños maría a 37°C.
Centrífugas serológicas.
Gradillas de madera.
Gradillas de metálicas.
Microscopios.
Papel toalla.
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Método:
De la muestra en estudio:
Hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5% y:
- Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el
reactivo poliespecífico.
- Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el
reactivo monoespecífica IgG.
- Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el
reactivo monoespecífico C3.
Realizar un rastreo e identificación de anticuerpos.
RESULTADOS
Prueba de antiglobulina humana directa:
MUESTRA Poliespecífico Monoespecífico
IgG
Monoespecífico
C3
Rastreo de anticuerpos: _________________________________________
Identificación: ___________________________________________________
Interpretación de Resultados:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Anexo 1
Reactivos anti-A y anti-B
Los antisueros para ser utilizados en inmunohematología pueden ser obtenidos
de diferentes fuentes.
Cada una de estas fuentes involucra distintos costos de producción así como
distintas especificidades y sensibilidades.
Este tipo de variación de los reactivos puede ser utilizada de manera secuencial
y escalonada a ser requerida según el estudio que se está realizando, por
ejemplo, en el estudio de subgrupos, fenotipo pocos frecuentes y en las anemias
hemolíticas inmunes.
REACTIVOS:
Reactivos anti-A y anti-B:
A partir de aloanticuerpos: Con anticuerpos del tipo IgM en su mayoría con pequeñas
concentraciones de IgG, los cuales son dirigidos contra antígenos
ABH que no posee la fuente de obtención. La reactividad anti-A y
anti-B observada en secreciones como leche, saliva, lágrimas,
fluido cervical y ascítico son del tipo IgA.
Isoaglutininas con especificidad anti-A1 se encuentran en
individuos fenotipeados como A2B.
Anticuerpos de origen natural se pueden encontrar en sueros de
donadores fenotipeados como A1 y A1B son de baja potencia y
presentan dos especificidades: anti-H y anti. HI.
A partir de Anticuerpos Inmunes: Los anticuerpos obtenidos son en su mayoría del tipo IgG. Las
especificidades anti-A y anti-B encontradas en sujetos O
generalmente no pueden ser separadas por absorción, en tal forma
que se dice que tienen una especificidad anti-A+B. La presencia de
antígenos Ii son esenciales para optimizar la reacción de este tipo
de sueros, siendo su especificidad del tipo anti-AI, anti-BI, anti
(A+B) I y anti-HI.
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Los anti H con mayor potencia se encuentran en individuos con
fenotipo Bombay. Se ha reportado su presencia natural en animales
como perros, gatos, cerdos, conejos y pollos.
Además se puede preparar por inmunización de conejos, cabras o
pollos con eritrocitos O.
A partir de Hibridomas: Se han producido una gran variedad de anticuerpos monoclonales
con especificidades anti-A, anti-B y anti-A+B aplicando la
tecnología de hibridomas, algunos ejemplos son:
1) anti-A del tipo IgM del hibridoma AH21, del tipo IgG el
hibridoma AH16;
2) anti-B del tipo IgM del hibridoma 3E-7;
3) anti-H del tipo IgM, del hibridoma BE2, del tipo IgG del
hibridoma 101.
4) Anti A 1 hibridoma la clona S12
Lectinas: Se ha descrito un gran número derivadas de semillas de
leguminosas.
1) Con especificidad anti-A, ejemplos Dolichos biflorus, Vicia
cracca, Phaseolus lunatus limensis y Helio promatia.
2) Lectinas específicas anti-B se han encontrado sólo en hongos,
tales como Polyporus formentarius y Marasmius oreades.
3) Lectinas con especificidad anti-A+B, la lectina 1 de la
Bandeirae simplicifolia.
4) Ulex europaeus, otras semillas con la misma especificidad son
Cytitus sessilifolius y Laburnum alpinum.
Pueden presentarse discrepancias en la realización de la prueba. Estas son
inherentes a los eritrocitos, el suero, la técnica o a errores humanos. En
cualquiera de los casos se debe resolver primero esta discrepancia antes de
cualquier otro procedimiento adicional.
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Cuando las discrepancias se asocian a problemas inherentes al paciente se debe
solicitar información necesaria para resolver la misma como pueden ser la
edad, diagnóstico, historia transfusional, historia de medicación, niveles de
inmunoglobulinas, historia ginecológica.
Aspectos a estudiar y resolver cuando se presentan incongruencias de grupo
son:
1- Prueba inversa débil (concentración de anticuerpos baja ) a. Recién nacidos
b. Ancianos
c. Hipogammaglobulinemias
d. Neoplasias
e. Tratamiento con inmunosupresores
f. Síndrome de inmunodeficiencias
g. Trasplante de médula ósea
h. Se recomienda la incubación de la prueba inversa a temperatura
ambiente por 15 minutos, si es negativa incubar 15-30 minutos a
4ºC.
2- Prueba directa débil (concentración de antígenos baja ) a. Subgrupo de A o de B
b. Depresión de antígenos por diseritropoyesis
c. Antígeno B adquirido como consecuencia de una obstrucción
intestinal, carcinoma de colon o recto.
d. Anticuerpos contra antígenos de baja incidencia presentes en
reactivos anti-A o anti-B.
e. Se recomienda el cambio de lote de reactivos.
3- Discrepancias entre la prueba directa e inversa asociada a concentraciones anormales de proteínas. a. Mieloma múltiple
b. Uso de expansores como dextrán y polivinilpirrolidona
c. Gelatina de Wharton.
d. La recomendación inicial es lavar la muestra de eritrocitos con
solución salina y repetir el grupo. Diluir el suero 1:2 con solución
salina y repetir la prueba con la dilución.
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Anexo 2
Procedimientos para eliminar anticuerpos interferentes.
2.1 Uso de reactivos Thiol para separar autoaglutinación
Principio
Los reactivos Thiol tienen la capacidad de romper las uniones disulfuro de la
molécula pentamérica de IgM.
Los autoanticuerpos que reaccionan en frío son en su mayoría de esta clase, por
lo que se puede hacer uso de estos para separar la aglutinación causada por un
autoanticuerpo reactivo al frío.
La presencia de autoanticuerpos en un suero puede entorpecer o anular la
realización de otras pruebas serológicas que queremos como puede ser la
determinación del grupo sanguíneo, pruebas de compatibilidad, así como
enmascarar la presencia de alloanticuerpos clínicamente significativos.
Es en estas situaciones donde hacemos uso de ellos y así poder realizar las
pruebas que se necesiten sin interferentes.
Estos reactivos se encuentran disponibles como 2-mercaptoetanol (2-ME) o
ditiotreitol (DTT) y pueden ser utilizados para el tratamiento de glóbulos rojos
que aglutinan espontáneamente debido a la presencia de autoanticuerpos fríos.
Materiales:
DTT 0.01 M ó 2-ME 0.1 M
Buffer de PBS a Ph 7.3
Glóbulos rojos empacados para ser tratados, lavados tres o cuatro veces.
Método:
- Diluir los glóbulos rojos a un 50 % de concentración en PBS.
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- Añadir un volumen igual de DTT 0.01 M en PBS o 2-ME al 0.1 M en
PBS a los glóbulos rojos.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 15 minutos si utiliza DTT o 10 minutos si
utiliza el 2-ME.
- Lavar los glóbulos rojos tres veces con solución salina fisiológica.
- Diluir los glóbulos rojos tratado a un 3-5% de concentración en solución
salina fisiológica y utilizar esta suspensión para realizar las pruebas de
grupo sanguíneo.
2.2 Autoadsorción en frío
Principio
La autoadsorción puede ser utilizada para remover autoanticuerpos reactivos al
frío, seguida por la detección de alloanticuerpos de importancia clínica.
Materiales:
Ficina al 1% ó papaína al 1%
2 ml de suero a ser adsorbido
3 ml de glóbulos rojos empacados
Método
- Lavar los glóbulos rojos 4 veces con solución salina a 37ºC y divídala en
tres alícuotas iguales en tubos 13 x 100 mm.
- Remover completamente el sobrenadante después de cada lavado.
- Añadir un volumen igual de ficina al 1% o de papaína al 1% a cada
alícuota de glóbulos rojos lavados.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 15 minutos.
- Lavar los glóbulos rojos tres veces en solución salina fisiológica.
- Centrifugar el último lavado por 5 minutos a 1000 xg y remover el
máximo sobrenadante como sea posible.
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- A uno de los tubos tratado con enzima añadir 2ml del suero autólogo
- Mezclar e incubar a 4ºC por 30 a 60 minutos
- Centrifugar a 1000 x g por 5 minutos y transferir el suero a un segundo
tubo de glóbulos rojos tratado con enzima.
- Mezclar e incubar a 4ºC por 30 a 40 minutos.
- En muchos casos, dos adsorciones son más que suficientes para remover
los autoanticuerpos. Si el autoanticuerpo es particularmente fuerte, repetir
una nueva adsorción con un tercer tubo de glóbulos rojos tratados con
enzima.
- Después de la adsorción final, utilizar el suero para ver la actividad de
alloanticuerpos.
Nota:
La dilución del suero en estos procesos puede provocar una pérdida de reacción
de los alloanticuerpos, por lo que es importante remover el máximo de salina
residual en el cada paso.
La autoadsorción no puede ser utilizada si el paciente ha sido transfundido
recientemente. En estos casos se recomienda la absorción con estroma de
eritrocitos de conejo.
2.3 Técnica de precalentamiento para sueros que contienen aglutininas frías
Principio
La reactividad de un autoanticuerpo frío de la clase IgM puede ser reducida o
eliminada utilizando las pruebas precalentadas.
Muchos problemas encontrados en las pruebas de compatibilidad, detección de
anticuerpos y pruebas de identificación pueden ser causados por aglutininas
frías los cuales pueden ser resueltos a través de esta técnica.
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Materiales:
Solución salina fisiológica calentada a 37ºC
Suero del paciente
Albúmina bovina al 22%
Células reactivo ( rastreadoras, panel o para donador)
Método:
- Rotular adecuadamente los tubos que se van a utilizar.
- Añadir una pequeña cantidad de la suspensión de células al tubo
correspondiente, reactivos, solución salina y colocarlos en el baño a 37ºC.
- Realizar el procedimiento deseado siempre dentro del baño de maría
guardando la temperatura apropiada.
2.4 Adsorción de autoanticuerpos fríos utilizando estroma de eritrocitos de conejo.
Principio
Los procedimientos de autoadsorción no son recomendados cuando el paciente
ha sido recientemente transfundido.
Los eritrocitos de conejo son conocidos porque son ricos en el antígeno I, el
estroma hecho de eritrocitos de conejo es ideal para realizar estas adsorciones.
Materiales
Estroma de eritrocitos de conejo
Suero del paciente que contiene el autoanticuerpo
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Método
- Centrifugar al menos 2 minutos una muestra del reactivo de eritrocitos de
conejo y remueva completamente el sobrenadante.
- Añadir 1 ml del suero a adsorber.
- Mezclar fuertemente preferiblemente utilizando un vortex.
- Incubar a 4ºC por 15 a 60 minutos y mezclar ocasionalmente.
- Centrifugar al menos 2 minutos y transferir el suero adsorbido a un tubo
limpio.
- Realizar el rastro de anticuerpos, identificación o prueba de
compatibilidad con este suero acorde a los procedimientos de rutina.
Nota:
Además del antígeno I, los eritrocitos de estroma de conejo poseen antígeno B,
antígenos del sistema P y antígenos del sistema H.
Tenga presente que el suero adsorbido con estroma de eritrocitos de conejo no
puede ser utilizado para realizar el tipeo sérico para el sistema ABO.
Algunos alloanticuerpos incluyendo el anti-D, anti-E y el anti-Leb, se han
reportado que también son adsorbido con el estroma de eritrocitos de conejo.
2.5 Disociación de IgG utilizando cloroquina
Principio
La mayoría de las anemias hemolíticas autoinmunes poseen una reactividad en
caliente (37ºC), donde se presentan autoanticuerpos de la clase IgG.
Este tipo de muestra presenta una prueba de antiglobulina humana directa
positiva.
En ocasiones se requiere hacer análisis adicional como la determinación de
grup o fenotipo, las cuales son de difícil realización debido a la interferencia de
los autoanticuerpos que recubren a los glóbulos rojos.
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Bajo condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de los
glóbulos rojos con el mínimo daño a la membrana.
Utilizando este procedimiento se puede realizar fenotipo completo de los
glóbulos rojos que poseen una prueba de antiglobulina humana directa positiva.
Materiales:
Solución de difosfato de cloroquina.
Glóbulos rojos sensibilizados por una IgG
Glóbulos rojos control heterocigotos para el antígeno de la prueba a ser
fenotipeado.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico anti-IgG
Método:
- A un volumen de los glóbulos rojos sensibilizados lavados añadir 4
volúmenes de la solución de difosfato de cloroquina.
- Tratar el control de la misma forma.
- Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
- Remuever una pequeña alícuota de los glóbulos tratados y lavarlos 4
veces con salina fisiológica.
- Pruebar los glóbulos lavados con el reactivo de antiglobulina humana
monoespecífico anti-IgG
- Si la prueba da negativo, lavar el resto de la muestra y el control tres
veces y utilizarlos para las pruebas de fenotipo.
- Si la prueba da positiva seguir incubando por espacios de 30 minutos por
un máximo de 2 horas hasta que la prueba de un resultado negativo.
Nota:
El difosfato de cloroquina no disocia moléculas del complemento, por lo que
sólo se puede utilizar el reactivo monoespecífico IgG.
Incubaciones mayores de dos horas o a 37ºC pueden resultar en hemólisis, daño
o pérdida de antígenos del glóbulo rojo.
Puede haber desnaturalización de antígenos Rh.
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2.6 Adsorción autóloga de autoanticuerpos con reactividad caliente
Principio
Los autoanticuerpos con reactividad caliente pueden enmascarar la presencia de
alloanticuerpos coexistentes en el suero.
La adsorción del suero con glóbulos rojos autólogos puede remover los
autoanticuerpos, permitiendo la detección de los alloanticuerpos.
Células autólogas circulantes, sin embargo, también están cubiertas por
autoanticuerpos.
Algunos de los autoanticuerpos pueden ser removidos de la superficie de
glóbulos rojos autólogos.
La autoadsorción no se puede realizar si se ha realizado una transfusión
reciente.
Procedimiento enzima y calor:
Materiales:
Albúmina bovina al 6%, preparada por dilución con salina.
Ficina al 1% o papaína activada con cisteína al 1%.
Muestra de sangre que contiene un autoanticuerpo caliente.
Método:
- Lavar al menos 4 veces 2 ml de los glóbulos rojos y descartar el
sobrenadante final.
- Añadir al paquete celular un volumen igual de albúmina a 6%.
- Mezclar e incubar a 56ºC por 3 a 5 minutos.
- Agitar la mezcla durante este tiempo.
- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y separar el sobrenadante.
- Lavar los glóbulos tres veces en solución salina y descartar el
sobrenadante final.
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- Añadir 1 ml de ficina al 1% o papaína a los glóbulos rojos.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 15 minutos
- Lavar los glóbulos 3 veces con solución salina.
- Centrifugar el último lavado 5 minutos a 1000 xg.
- Utilizar succión para remover el máximo posible de sobrenadante.
- Dividir los glóbulos en dos alícuotas iguales.
- A una alícuota añadir 2 ml de suero del paciente.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 30 minutos.
- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y transferir el suero a la segunda
alícuota de glóbulos tratados con enzima.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 30 minutos.
- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y obtener el suero absorbido.
- Probar el suero absorbido por actividad de anticuerpos utilizando la
técnica de la antiglobulina indirecta.
2.7 Técnica utilizando ZZAP
Materiales
Papaína activada con cisteína al 1%
Buffer PBS pH 7.3
Ditiotreitol al 0.2 M
Muestras de sangre que contengan autoanticuerpos calientes.
Métodos
- Preparar reactivo ZZAP mezclando 0.5 ml de papaína activada cisteína
con 2.5 ml de DTT y 2 ml de PBS a pH 7.3.
- Alternativamente puede utilizar 1 ml de ficina, 2.5 ml de DTT y 1.5 ml de
PBS a pH 6.5
- A dos tubos que contengan 1 ml de glóbulos rojos empacados añadir 2 ml
del reactivo ZZAP.
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- Mezclar e incuba a 37ºC por 30 minutos
- Lavar los glóbulos tres veces con salina.
- Centrifugar el último lavado por 5 minutos a 1000 xg.
- Utilizar succión para remover todo el sobrenadante.
- Dividir los glóbulos en dos alícuotas iguales.
- A una alícuota añadir 2 ml de suero del paciente.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 30 minutos.
- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y transferir el suero a la segunda
alícuota de glóbulos tratados con enzima.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 30 minutos.
- Centrifugar a 1000 xg por 2 minutos y obtener el suero absorbido.
- Probar el suero absorbido por actividad de anticuerpos utilizando la
técnica de la antiglobulina indirecta.
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Anexo 3
Técnicas de elución de anticuerpos
Principio
La liberación del anticuerpo adsorbido a los antígenos del glóbulo rojo en
una prueba de antiglobulina humana directa es utilizado por los
investigadores para determinar si los anticuerpos asociados son
autoanticuerpos calientes o alloanticuerpos de importancia clínica y para la
separación de mezclas de anticuerpos de la clase IgG.
En estos procedimientos, a diferencia de la utilización de cloroquina, se
pretende separar el o los anticuerpos manteniendo la integridad de estos para
ser identificados sin importar la membrana del glóbulo rojo.
3.1 Elución ácida con digitonina
Materiales:
Digitonina al 0.5 %
Glicina al 0.1 M, pH 3.0
Buffer de fosfato 0.8 M, pH 8.2
Suero de albúmina bovina al 30%
1 ml de glóbulos rojos empacados lavados 6 veces en salina fisiológica
Resupender en salina en el último lavado.
Método:
- Calientar los reactivos a 37ºC antes de su uso.
- Mezclar 1 ml del paquete de glóbulos lavados con 9 ml de salina
fisiológica en un tubo 16 x 100 mm.
- Añadir 0.5 ml de digitonina y mezclar 1 minuto por inversión hasta que
los glóbulos sean hemolizados.
- Centrifugar a 1000 xg por 5 minutos y descartar el sobrenadante.
- Lavar el estroma al menos 5 veces hasta que este aparezca de color
blanco.
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- Centrifugar al menos 2 minutos a 1000 g durante el proceso de lavado.
- Descartar el sobrenadante final y añadir 0.2 ml de glicina al estroma.
- Mezclar por inversión al menos por 1 minuto.
- Centrifugar el tubo a 1000 xg por 5 minutos.
- Transferir el eluato del sobrenadante a un tubo limpio y añadir 0.2 ml de
buffer de fosfato.
- Mezclar y centrifugar a 1000 xg por 2 minutos.
- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y añadir un tercio de volumen
de albúmina bovina al 30%.
- Realizar las pruebas de identificación de anticuerpo con el eluído.
Nota:
El pH bajo de la solución del buffer ácido aumenta la elución de los anticuerpos
del estroma de los glóbulos rojos.
El buffer de fosfato es añadido para restaurar la neutralidad del eluído ácido.
La acidificación persistente puede causar lisis de los glóbulos rojos añadidos al
eluído.
La adición de la albúmina bovina al eluído protege contra la hemólisis.
3.2 Técnica de Rubin modificada
Método:
- Lavar un paquete de eritrocitos en estudio 3 veces con solución salina,
descartar la salina en cada lavado.
- Agregar 0.5 ml de solución salina fisiológica.
- Agregar éter a la mitad del volumen anterior , tapar y agitar fuertemente
por 30 segundos.
- Destapar, colocar el tubo en un beaker con una corriente continua de agua
a 50ºC y girar constantemente durante 5 minutos a 56ºC en un baño de
maría.
- Centrifugar un minuto a 3400 r.p.m y pasar el sobrenadante a otro tubo.
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- La mezcla contiene el anticuerpo eluído de los eritrocitos, hacer el estudio
de anticuerpos para conocer su especificidad.
3.3 Técnica de eluído de Lui
Método:
- Lavar los glóbulos rojos tres veces con salina.
- Agregar 0.5 a 1.0 ml de solución salina congelada a 1ºC.
- Incubar por 15-30 minutos a -20ºC.
- Descongelar la muestra.
- Centrifugar 5 minutos a 3400 r.p.m y pasar el sobrenadante a otro tubo.
- Hacer el estudio de anticuerpos para conocer su especificidad.
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Anexo 4
Procedimientos para estudio de anemias hemolíticas inducidas por medicamentos
4.1 Demostración de la formación de complejos inmunes inducidos por droga
Principio
Ciertos tipos de medicamentos y sus respectivos anticuerpos pueden formar
complejos inmunes que atacan a los glóbulos rojos. Estos no son específicos
contra los antígenos del glóbulo rojo, pero su unión inespecífica a la membrana
puede activar el complemento, lo cual va a producir hemólisis in vivo.
Este procedimiento provee los mecanismos para demostrar la formación del
complejo inmune asociado con la interacción del complejo droga-antidroga.
Materiales
Medicamento bajo investigación, en la misma forma que el paciente lo recibe.
(tabletas, soluciones o cápsulas)
PBS a pH 7.0-7.4
Suero del paciente
Suero normal fresco como fuente de complemento y conocido que carezca de
anticuerpos.
Glóbulos rojos O tratados y no tratados con enzimas proteolíticas
Método
- Preparar 1 mg/ml de la suspensión del medicamento en buffer de PBS.
- Centrifugar y ajustar el pH del líquido supernatante a 7.0 con NaOH 1N o
HCL 1N.
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- Utilizar 0.2 ml de cada reactante como sigue:
- Suero del paciente + medicamento
- Suero del paciente + complemento (suero normal) + medicamento
- Suero del paciente + complemento (suero normal) + PBS
- Suero normal + medicamento
- Suero normal + PBS
- A 150 ul de cada mezcla de prueba añadir 50 ul de una suspensión al 5%
de glóbulos rojos O.
- A otro juego de tubos de cada mezcla de prueba añadir 50 ul de una
suspensión al 5% de glóbulos rojos O tratados con enzima.
- Mezclar e incubar a 37ºC por 1 o 2 horas, mezclar cada cierto tiempo.
- Centrifugar y examinar por aglutinación y hemólisis.
- Lavar los glóbulos 4 veces con solución salina fisiológica y realizar la
prueba de antiglobulina directa utilizando el reactivo poliespecífico.
Interpretación:
Hemólisis, aglutinación o recubrimiento puede ocurrir.
Cualquier actividad en las pruebas que poseen el suero del paciente y ausencia
en los controles indican interacción de la droga-antidroga.
4.2 Detección de anticuerpos contra penicilina o cefalotina
Principio
Los glóbulos rojos pueden ser cubiertos con la penicilina o cefalosporinas. Este
recubrimiento puede estar asociado con la positividad de la prueba de
antiglobulina humana directa.
Materiales
Buffer de salina barbital (BBS) a pH 9.6
Penicilina (1 x 106 U por 600 mg)
Solución de cefalotina (Keflin) – 400 mg
2 ml de glóbulos rojos lavados del grupo O
Suero o eluato aprobar.
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Método
- Preparar células cubiertas con penicilina incubando 1 ml de glóbulos
rojos con 600 mg de penicilina en 15 ml de BBS por 1 hora a temperatura
ambiente.
- Lavar 3 veces con solución salina y almacenar en solución de Alsever a
4ºC.
- Preparar glóbulos rojos sensibilizados con cefalotina incubando 1 ml de
glóbulos rojos con 400 mg de cefalotina de sodio en 10 ml de BBS por 2
horas a 37ºC.
- Lavar 3 veces con solución salina fisiológica y almacenar en solución de
Alsever a 4ºC.
- Mezclar 100 ul del suero o eluato con 50 ul de la suspensión del 5% de
las células sensibilizadas.
- Diluir el suero 1:20 con solución salina fisiológica las células cubiertas
con cefalotina.
- Pruebar en paralelo con eritrocitos sin sensibilizados y el suero del
paciente.
- Incubar la prueba a 37ºC por 30 a 60 minutos. Centrifugar y examinar
macroscópicamente por aglutinación.
- Lavar los glóbulos 4 veces en solución salina fisiológica y realizar la
técnica de antiglobulina directa utilizando el reactivo poliespecífico y
monoespecífico IgG.
Nota:
Todos los sueros normales reaccionan con los glóbulos rojos cubiertos con
cefalotina debido a la adsorción de proteínas no inmunológicas.
Esta reactividad se logra eliminar si el suero es diluído 1:20 antes de usar.
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