isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in escherichia coli

TAXOL (PACLITAXEL)

É uma das drogas mais potentes e mais bem

sucedidas comercialmente;

Isolada da casca do teixo;

2 até 4 árvores adultas para extração de dosagem para

1 pessoa

Limitações por síntese química devido à complexidade

estrutural (levedura e bactéria)

TAXOL (PACLITAXEL)

É uma das drogas mais potentes e mais bem

sucedidas comercialmente;

Isolada da casca do teixo;

2 até 4 árvores adultas para extração de dosagem para

1 pessoa

Limitações por síntese química devido à complexidade

estrutural

Outros estudos: ↑expressão do módulo upstream

Baixo rendimento (10mg/L)

Via metabólica de taxol → Via de isoprenóides

Nativa em E. coli (Upstream module)

Parte heteróloga (Downstream module)

ESQUEMA PARA PRODUÇÃO BIOSSINTÉTICA DE

TAXOL

ESQUEMA PARA PRODUÇÃO BIOSSINTÉTICA DE

TAXOL

MULTIVARIATE-MODULAR PATHWAY

ENGINEERING

Idéia: Dividir a via em pequenos módulos e variar

simultaneamente a expressão desses módulos.

Objetivo: Achar o balanço ótimo para a via.

Retirar a idéia de aumento linear da produção.

CONSTRUÇÃO DE BIOBRICKS

Operon dxs-idi-ispDF

Operon GT ou TG

Promotor dxs idi ispD ispF

GGPP

Synthase

Taxadiene

SynthasePromotor

BIOBRICKS CONSTRUÍDOS

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA

Força

Número de

cópias/plasmídeos

Trc

T5

T7

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 1/3

Linhagem K12MG1655 ΔrecA

ΔendA

1 cópia no cromossomo

5 cópias do plasmídeo

10 cópias do plasmídeo

20 cópias do plasmídeo

Promotor Trc Promotor T5

Estirpe pronta!

(Total = 16)

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 1/3

↑ Upstream module

─ Downstream module

ECh1TrcMEP = ↑ 20.000 vezes

Via nativa de MEP

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 1/3

─ Upstream module

↑ Downstream module

GT ou TG aumento = ↑ 2 a 3 vezes

Conclusão: Um controle mais fino e acurado

dos módulos upstream e downstream podem

gerar mudanças substanciais na expressão

de taxol.

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 2/3

Linhagem K12MG1655 ΔrecA ΔendA

com o gene DE3 T7 RNA polimerase no

cromossomo

1 cópia no cromossomo

5 cópias do plasmídeo

10 cópias do plasmídeo

20 cópias do plasmídeo

Promotor Trc Promotor T5

Estirpe pronta!

(Total = 8)

Promotor T7

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 2/3

“Resposta monótona”

Manutenção dos níveis

máximos de taxadiene.

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 3/3

Linhagem K12MG1655 ΔrecA ΔendA

com o gene DE3 T7 RNA polimerase no

cromossomo

1 cópia no cromossomo

5 cópias do plasmídeo

10 cópias do plasmídeo

20 cópias do plasmídeo

Promotor Trc Promotor T5

Estirpe pronta!

(Total = 8)

Promotor T7

Baixa expressão

da via MEP

ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 3/3

Esse aumento pode

estar atribuído à

diminuição da carga

metabólica celular.

EDE3Ch1TrcMEPp5T7TG

QUANTIFICAÇÃO DO MRNA

25 à 32, 17 e 22 (estirpes que mais produziram

taxadiene)

Dxs (upstream pathway)

Taxadiene synthase (downtream pathway)

Houve correlação entre o nível de RNA e os níveis da

via.

ANÁLISE METABÓLICA

Através de GC-MS foi identificado uma substância

(Indol) que inibe a síntese de taxadiene;

A estirpe 26 foi severamente inibida.

EFEITO NO CRESCIMENTO CELULAR

Fig. 6. Effect of externally-introduced indole on cell growth for engineered strains of E. coli.

Data are mean +/- SD for three replicates. Strains devoid of the downstream pathway and

with different strengths of the upstream pathway (1, 2, 6, 21, 40 and 100) were selected.

Strain 26, the high taxadiene producer, exhibits the strongest inhibition.

CRESCIMENTO EM BIORREATORES

Crescimento em batelada das 3 estirpes que mais

produziram taxadiene (22, 17, 26)

~60mg/L, ~125mg/L, ~300mg/L

Posteriormente foi feito um crescimento em meio

definido com alimentação controlada de glicerol.

ESTIRPES USADAS PARA CRESCIMENTO EM

BIORREATOR

CRESCIMENTO EM BATELADA

OXIDATION-CHEMISTRY OF TAXOL

BIOSYNTHESIS

Taxadiene 5α hydroxylase → CYP450

Problemas: falta de maquinaria de transferência de

elétrons, CYP450 reductase e falta de um retículo

endoplasmático.

CRIAÇÃO DE ENZIMAS QUIMÉRICAS

Resultado: Produção de 3 quimeras.

At8T5aOH-tTCPR

At24T5aOH-tTCPR

At42T5aOH-tTCPR

REDUÇÃO NA PRODUÇÃO DE TAXADIENE

Principais fatores da redução:

Introdução de novo plasmídeo

Elevada produção de álcool (2.400x maior que em

leveduras)

CONCLUSÕES

Foi possível construir uma via metabolicamente

viável para formação dos precursores IPP e

DMAPP;

Carotenóide, sesquiterpenóide e diterpenóide

Indole inibe a atividade da via de isoprenóides;

Utilização da abordagem modular multivariada para

o controle fino da via;

Possível utilizar a mesma abordagem para

continuar produzindo enzimas quiméricas para o

restante da via;