isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in escherichia coli
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TAXOL (PACLITAXEL)
É uma das drogas mais potentes e mais bem
sucedidas comercialmente;
Isolada da casca do teixo;
2 até 4 árvores adultas para extração de dosagem para
1 pessoa
Limitações por síntese química devido à complexidade
estrutural (levedura e bactéria)
TAXOL (PACLITAXEL)
É uma das drogas mais potentes e mais bem
sucedidas comercialmente;
Isolada da casca do teixo;
2 até 4 árvores adultas para extração de dosagem para
1 pessoa
Limitações por síntese química devido à complexidade
estrutural
Outros estudos: ↑expressão do módulo upstream
Baixo rendimento (10mg/L)
Via metabólica de taxol → Via de isoprenóides
Nativa em E. coli (Upstream module)
Parte heteróloga (Downstream module)
ESQUEMA PARA PRODUÇÃO BIOSSINTÉTICA DE
TAXOL
ESQUEMA PARA PRODUÇÃO BIOSSINTÉTICA DE
TAXOL
MULTIVARIATE-MODULAR PATHWAY
ENGINEERING
Idéia: Dividir a via em pequenos módulos e variar
simultaneamente a expressão desses módulos.
Objetivo: Achar o balanço ótimo para a via.
Retirar a idéia de aumento linear da produção.
CONSTRUÇÃO DE BIOBRICKS
Operon dxs-idi-ispDF
Operon GT ou TG
Promotor dxs idi ispD ispF
GGPP
Synthase
Taxadiene
SynthasePromotor
BIOBRICKS CONSTRUÍDOS
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA
Força
Número de
cópias/plasmídeos
Trc
T5
T7
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 1/3
Linhagem K12MG1655 ΔrecA
ΔendA
1 cópia no cromossomo
5 cópias do plasmídeo
10 cópias do plasmídeo
20 cópias do plasmídeo
Promotor Trc Promotor T5
Estirpe pronta!
(Total = 16)
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 1/3
↑ Upstream module
─ Downstream module
ECh1TrcMEP = ↑ 20.000 vezes
Via nativa de MEP
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 1/3
─ Upstream module
↑ Downstream module
GT ou TG aumento = ↑ 2 a 3 vezes
Conclusão: Um controle mais fino e acurado
dos módulos upstream e downstream podem
gerar mudanças substanciais na expressão
de taxol.
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 2/3
Linhagem K12MG1655 ΔrecA ΔendA
com o gene DE3 T7 RNA polimerase no
cromossomo
1 cópia no cromossomo
5 cópias do plasmídeo
10 cópias do plasmídeo
20 cópias do plasmídeo
Promotor Trc Promotor T5
Estirpe pronta!
(Total = 8)
Promotor T7
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 2/3
“Resposta monótona”
Manutenção dos níveis
máximos de taxadiene.
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 3/3
Linhagem K12MG1655 ΔrecA ΔendA
com o gene DE3 T7 RNA polimerase no
cromossomo
1 cópia no cromossomo
5 cópias do plasmídeo
10 cópias do plasmídeo
20 cópias do plasmídeo
Promotor Trc Promotor T5
Estirpe pronta!
(Total = 8)
Promotor T7
Baixa expressão
da via MEP
ABORDAGEM MODULAR MULTIVARIADA 3/3
Esse aumento pode
estar atribuído à
diminuição da carga
metabólica celular.
EDE3Ch1TrcMEPp5T7TG
QUANTIFICAÇÃO DO MRNA
25 à 32, 17 e 22 (estirpes que mais produziram
taxadiene)
Dxs (upstream pathway)
Taxadiene synthase (downtream pathway)
Houve correlação entre o nível de RNA e os níveis da
via.
ANÁLISE METABÓLICA
Através de GC-MS foi identificado uma substância
(Indol) que inibe a síntese de taxadiene;
A estirpe 26 foi severamente inibida.
EFEITO NO CRESCIMENTO CELULAR
Fig. 6. Effect of externally-introduced indole on cell growth for engineered strains of E. coli.
Data are mean +/- SD for three replicates. Strains devoid of the downstream pathway and
with different strengths of the upstream pathway (1, 2, 6, 21, 40 and 100) were selected.
Strain 26, the high taxadiene producer, exhibits the strongest inhibition.
CRESCIMENTO EM BIORREATORES
Crescimento em batelada das 3 estirpes que mais
produziram taxadiene (22, 17, 26)
~60mg/L, ~125mg/L, ~300mg/L
Posteriormente foi feito um crescimento em meio
definido com alimentação controlada de glicerol.
ESTIRPES USADAS PARA CRESCIMENTO EM
BIORREATOR
CRESCIMENTO EM BATELADA
OXIDATION-CHEMISTRY OF TAXOL
BIOSYNTHESIS
Taxadiene 5α hydroxylase → CYP450
Problemas: falta de maquinaria de transferência de
elétrons, CYP450 reductase e falta de um retículo
endoplasmático.
CRIAÇÃO DE ENZIMAS QUIMÉRICAS
Resultado: Produção de 3 quimeras.
At8T5aOH-tTCPR
At24T5aOH-tTCPR
At42T5aOH-tTCPR
REDUÇÃO NA PRODUÇÃO DE TAXADIENE
Principais fatores da redução:
Introdução de novo plasmídeo
Elevada produção de álcool (2.400x maior que em
leveduras)
CONCLUSÕES
Foi possível construir uma via metabolicamente
viável para formação dos precursores IPP e
DMAPP;
Carotenóide, sesquiterpenóide e diterpenóide
Indole inibe a atividade da via de isoprenóides;
Utilização da abordagem modular multivariada para
o controle fino da via;
Possível utilizar a mesma abordagem para
continuar produzindo enzimas quiméricas para o
restante da via;