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Antonio Siccardi 2004, Swimming Anita Swimming Anita (Siccardi, 2002) 50x70 cm; de-collage on alluminum www.antoniosiccardi.net

22-­‐25  se'embre  2014  

Biotecnologie  Mediche:  la  Terapia  Genica    

Antonio  Siccardi  Università  degli  Studi  di  Milano  

①  Individuazione del difetto genetico ②  Studio della fisiopatologia, ovvero del funzionamento del

gene normale e delle conseguenze delle sue alterazioni ③  Costruzione di modelli animali

trattamenti farmacologici (efficaci, non risolutivi)

terapia genica (risolutiva)

G chr12

A chr12

Mutazione G->A

Gene normale

Gene mutante

G

A chr12 Gene mutante

G chr12 Gene normale riparato

ricombinazione omologa

La ricombinazione omologa viene già utilizzata per ottenere

animali geneticamente modificati (knock-out, knock-in,

transgenici), in cui viene modificata una cellula staminale embrionale (ES) amplificabile e selezionabile in vitro prima di

essere reimpiantata in utero in una blastocisti.

selezione

DNA

Il motivo è che la ricombinazione omologa è un fenomeno molto raro, con passaggi in coltura di selezione e clonazione delle cellule

geneticamente modificate, non attuabili nel setting clinico, in cui bisogna modificare geneticamente molte cellule bersaglio allo stesso

tempo. Questo è ottenibile solo con vettori virali.

La ricombinazione omologa non è stata per ora utilizzabile per la terapia genica dell’uomo, in cui le cellule da modificare sono

ragionevolmente solo cellule somatiche.

Per la terapia genica nell’uomo, il gene “sano”, detto transgene, deve essere espresso nel numero maggiore possibile di cellule

bersaglio e pertanto trasportato da un vettore molto efficente, quale un vettore retrovirale

LTR LTR ψ

CMV transgene X

Plasmide di espressione

Nel caso dei vettori retrovirali, i più usati, il transgene (con un opportuno promotore per la trascrizione) viene clonato in un plasmide

che, di virale, contiene solo le regioni LTR (necessarie per la retrotrascrizione e per l’integrazione nel DNA della cellula bersaglio)

e la regione psi (necessaria per l’incapsidamento nel virione). Tutte le altre funzioni virali, necessarie alla produzione di virioni,

sono codificate da altri plasmidi nella cellula packaging. Questa precauzione evita la possibilità di ricostituire un virus infettivo.

CMV GAG POL PolyA 1.Plasmide di Packaging (geni virali)

CMV VSV-G PolyA 2. Plasmide per l‘Envelope di VSV che si lega a un fosfolipide presente su tutte le memmbrane cellulari (geni virali)

LTR LTR ψ

CMV transgene X 3. Plasmide di espressione (nessun gene virale)

LTR LTR ψ

CMV transgene X

RNA nei virioni vettori

I virioni vettori trasportano nelle cellule bersaglio il transgene e le proteine necessarie per la sua retrotrascrizione e integrazione nel DNA della

cellula bersaglio. Non contengono alcun gene virale.

La cellula packaging viene trasfettata con 3 differenti plasmidi.

e produce virioni vettori (pseudovirioni) completamente difettivi

Non si ottiene la sostituzione del gene mutante con quello sano, ma l‘aggiunta del gene sano a quello mutante,

in molteplici copie che si integrano nel genoma casualmente, cioè in un contesto differente da quello originale.

Infezione

vettore

LTR LTR ψ

CMV Transgene X cromosoma

Integrazione

Dopo terapia genica con un vettore retrovirale, numerose copie del

transgene saranno inserite in più cromosomi

(diversi per ogni cellula transfettata).

Il gene mutante è situato sul cromosoma 12.

Applicabile solo a geni che non richiedano una regolazione fine:  della quantità di proteina (e.g. non applicabile alle

catene della emoglobina)

 della localizzazione cellulare o tissutale (e.g. non applicabile a fattori di trascrizione)

Applicabile solo a geni di dimensioni compatibili con la capacità di trasporto del vettore (e.g. non applicabile al gene distrofina, che è gigantesco)

Prima della terapia F VIII 0% 17’ 11’ 4 mesi post-terapia F VIII 13% 4’40” 4’

Tempo di Coagulazione

Tempo di Sanguinamento

Tempo di Coagulazione

Tempo di Sanguinamento

Approccio ex vivo

vettore

Prelievo di cellule

Reinfusione di cellule

transfettate

Strategie di terapia genica

Approccio in vivo

vettore

- sistemico - in situ

Qui la ricerca di terapia genica si interfaccia con la ricerca sulle

cellule staminali.

L’approccio di terapia genica ex-vivo ha maggiori probabilità

di successo se le cellule prelevate e ingenierizzate

in vitro sono cellule staminali, capaci di proliferazione allo

stato indifferenziato e poi di differenziamento terminale.

Dal midollo osseo adulto, si possono derivare

molti tipi di cellule staminali, non solo quelle della linea

ematopoietica.

Proliferando in vitro allo stato indifferenziato, le cellule

staminali di un soggetto con una malattia genetica possono

essere modificate geneticamente, cioè

transfettate con il gene sano.

Ashanti de Silva SCID-ADA -1990

Ryes Evans X-SCID - 2001

Pho

to c

ourte

sy o

f Van

de

Silv

a

- Trasfezione di stem cell ematopoietiche (HSC) - Conditioning non-mieloablativo con Busulfan

- Trapianto di HSC ADA+ selezionate

- Nessun trattamento palliativo con PEG-ADA

In 6 mesi, ricostituzione immune

Cellule T >>>>>>>>>>>> 100% ADA+

Cellule mieloidi >>>>> 15% ADA+

Aiuti et al. Science 296:2410-2413, 2002

Per la terapia genica ex vivo della ADA-SCID, il gruppo del TIGET-HSR di Milano (Bordignon, Aiuti et al.) è stato all’avanguardia nel mondo.

La dimostrazione che l’integrazione è avvenuta nelle cellule staminali emopoietiche (HSC)

consiste nel dimostrare che lo stesso evento di integrazione è presente in tutte le linee di cellule

ematiche. Per fare questo bisogna preparare primers per la PCR specifici per un particolare

evento di integrazione, e usarli per monitorare la presenza della stessa integrazione nelle cellule

del sangue, a distanza di tempo.

La stessa integrazione è stata dimostrata in cellule T, cellule B, granulociti, etc., indicando che un precursore comune era stato trasfettato e poi si è differenziato nei

vari tipi cellulari

Pt3

Terapia genica mesi 7 9 12

T cells Gran Integrant-

specific PCR

T cells Gran B cells Erythr

Aiuti et al., 2002

- Trasfezione di stem cell ematopoietiche (HSC) - Trapianto di HSC γc+ selezionate

- 10 pazienti

In 6 mesi, ricostituzione immune

Ricostituzione di cellule T, B e NK

Guarigione clinica

Terapia genica ex vivo della X-SCID

Alain Fischer, Hopital Necker, Parigi - 2000

Terapia genica ex vivo della X-SCID

Alain Fischer, Hopital Necker, Parigi - 2000

Due bambini su 10 hanno sviluppato una forma di leucemia di tipo T.

In entrambi è stata ritrovata una integrazione nelle vicinanze dell’oncogene LOM-2 (coinvolto nella

regolazione della divisione cellulare).

Entrambi i bambini sono guariti dopo chemioterapia.

Questo evento (2000), insieme alla morte di Jesse Gelsinger (1999), un ragazzo di Philadelphia affetto da def icenza d i orn i t i na -transcarbamilasi e trattato con un vettore adenovirale, hanno causato un blocco a l i v e l l o m o n d i a l e d e l l a sperimentazione clinica della terapia genica per quasi 10 a n n i , i n a t t e s a c h e appropr i a te m i sure d i s i c u r e z z a f o s s e r o individuate e attuate.

L’analisi approfondita dei siti di inserzione degli LTR dei retrovirus (RV) e dei lentivirus (LV) nel genoma umano ha dimostrato profonde differenze: i secondi sono molto più sicuri e inducono attivazione di oncogeni con frequenza molto minore. Tale attivazione, dovura alla attività dell’enhancer e del promotore virali (situati in nella regione U3 dell’LTR-5’) può essere ulteriormente ridotta utilizzando vettori LV auto-inattivanti, che eliminano tali sequenze. Per la trascrizione del transgene si usa poi un promotore interno più debole e sequenze di terminazione che minimizzano l’overflow della trascrizione ai geni vicini.

I  ve'ori  auto-­‐ina6van7  (SIN)  

Negli LTR virali normali, la regione U3 contiene promotore ed enhancer. Durante la RT la regione U3 al 5’ viene copiata dalla regione U3 al 3’ (che era identica a quella al 5’ originale).

Negli LTR del vettore SIN, la regione U3 al 5’ contiene promotore ed enhancer, mentre quella al 3’ è mutata e non contiene ne’ promotore ne’ enhancer. Durante la RT la regione U3 al 5’ viene copiata dalla regione U3 al 3’ (che è mutata). La copia integrata quindi non può più essere trascritta per intero. Solo il GOI viene trascritto da un promotore interno.

LENTIVIRAL  HEMATOPOIETIC  STEM  CELL  GENE  THERAPY  IN  PATIENTS  WITH  WISKOTT-­‐ALDRICH  SYNDROME  AiuJ  et  al.    Science  23  August  2013:    Vol.  341  no.  6148  1233151  DOI:10.1126/science.1233151        LENTIVIRAL   HEMATOPOIETIC   STEM   CELL   GENE   THERAPY   BENEFITS  METACHROMATIC  LEUKODYSTROPHY  Biffi  et  al.    Science  23  August  2013:    Vol.  341  no.  6148  1233158  DOI:10.1126/science.1233158    

L’espressione dei transgeni è limitata nel tempo, perchè subentra una risposta immunitaria transgene-

specifica (CTL contro il prodotto del transgene, anche se è “self”).

Naldini e coll. (TIGET-HSR) hanno dimostrato che la risposta immunitaria è dovuta all’espressione del transgene da parte delle antigen-presenting cells (APC, monociti-macrofagi e cellule dendritiche).

He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genet. 5:522-31, 2004.

Qui la ricerca sulla terapia genica si

interfaccia con un altro campo della ricerca a sviluppo

esplosivo, quello della funzione dei “piccoli” RNA nella regolazione

della traduzione.

I miRNA si legano alla estremità 3’-non tradotta (UTR) dei messaggeri e bloccano l’attività del ribosoma con un meccanismo ancora non compreso.

Molti miRNA diversi possono legare lo stesso messaggero. Lo stesso miRNA può legare molti (>50) messaggeri diversi.

Un esempio eclatante:

il miRNA let-7 blocca la traduzione del messaggero dell’oncogene RAS

facendo revertire il fenotipo tumorale

He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genet. 5:522-31, 2004.

L’RNA messaggero del transgene contiene quindi la sequenza-bersaglio di un miRNA-APC e viene “silenziato” nelle APC e non negli

epatociti.

CAP AAAAAAA

PROTEINA epatocita

RISC

miRNA-APC

CAP AAAAAAA

PROTEINA APC

Questo permette al transgene di “evadere” la risposta immune e di essere espresso indefinitamente nelle cellule epatiche.

Per evitare la risposta immune contro il transgene, bisogna bloccarne l’espressione nelle cellule che presentano l’antigene (APC), Naldini e coll. (TIGET-HSR, Milano) hanno introdotto

nella estremità 3’ non tradotta del transgene la sequenza-bersaglio di un miRNA che si esprime nelle APC

(e non in altre cellule, quali gli epatociti).

  Chilomicronemia (Iperlipoproteinemia tipo Ia) = carenza dell’enzima lipoproteina lipasi. Terapia: Glybera, l’unica terapia genica approvata dalla Commissione Europea e in vendita sul mercato. Decine di casi guariti.

  ADA-SCID (carenza di adenosina-deaminasi. Causa Immunodeficenza grave). Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti ADA. Circa 20 casi guariti.

    X-SCID (difetto della catena γ di alcuni recettori per le interleuchine. Causa

Immunodeficenza grave). Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti catena γ. 10/10 casi guariti. 2 bambini sviluppano leucemia relata all’oncogene LOM-2.

    Sindrome di Wiskott-Aldrich (difetto di WASP, proteina regolatrice del

citoscheletro. Causa Immunodeficenza grave). Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti WASP. 3/3 casi guariti.

    Leucodistrofia metacromatica ( difetto di ARSA, aril-sulfatasi A; gli

accumuli lisosomiali causano difetti motori e cognitivi). Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti ARSA. 3/3 casi guariti.

  Coroideremia (altra malattia degenerativa della retina). Somministrazione intraoculare di vettori virali con il transgene REP1 (6/9 pazienti migliorano la capacità visiva).

    Adrenoleucodistrofia (la malattia dell’”Olio di Lorenzo”, dovuta a un difetto

del gene X-ALD). Causa la distruzione progressiva della mielina, la sostanza che riveste le cellule nervose, e delle ghiandole surrenali con la conseguente carenza di alcuni ormoni. Terapia ex-vivo su HSC con LV esprimenti ALD.

    Emofilia B (fattore IX). Somministrazione intraepatica (la maggior parte

dei pazienti presenta sanguinamenti più rari e contenibili).  

  CGD. Malattia Granulomatosa Cronica. La terapia genica ex-vivo di HSC seguita da trapianto è efficace solo se le cellule esprimenti il transgene hanno un vantaggio selettivo (ADA-SCID, X-SCID) ma questo non è il caso del CGD (carenza di NADPH ossidasi nei granulociti) che ha dato risultati inizialmente positivi, ma solo transitori.

   Parkinson. Cellule incapaci di produrre dopamina riacquistano tale capacità dopo infezione con RV che producono 3 enzimi (tutti pazienti di un piccolo gruppo riacquisiscono controllo muscolare).

     Leucemia. Terapia ex-vivo di linfociti che vengono resi specifici per un

antigene tumore-associato (26/59 in completa remissione).     AIDS. CD4 autologhe infettate con VRX496 (codificante un RNA

antisenso anti-env). 5/5 pazienti mostrano ridotte cariche virali e miglior risposte immuni anti HIV.

Bibliografia essenziale: http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_therapy

G chr12

A chr12

Mutazione G->A

Gene normale

Gene mutante

Ritorniamo al

G

A chr12 Gene mutante

G chr12 Gene normale riparato

ricombinazione omologa

L’ RNA guida contiene al 5’ 20 basi omologhe al DNA bersaglio. La Nucleasi Cas9 viene posizionata sulla sequenza bersaglio dall’RNA guida e introduce un taglio a doppia elica a monte della sequenza PAM (= NGG)

RNA guida

C  

N  C   cromosoma

Nucleasi Cas9

Nucleasi Cas9

L’ RNA guida contiene al 5’ 20 basi omologhe al DNA bersaglio. La Nucleasi Cas9 viene posizionata sulla sequenza bersaglio dall’RNA guida e introduce un taglio a doppia elica a monte della sequenza PAM (= NGG)

RNA guida

C  

N  C   cromosoma

Nucleasi Cas9

Nucleasi Cas9

Sequenza costante gRNA Scaffold

Sequenza variabile gene bersaglio-specifica

sintetizzata ad hoc

Gene della Nucleasi Cas9

DSB = Rotture a doppia elica NHEJ = riunione non omologa di estremità (causa delezioni) HR = Ricombinazione Omologa (ricostituzione del genotipo wt, oppure inserzione controllata di sequenze desiderate)

gRNA = RNA guida

PAM = sequenza adiacente al sito di taglio

DSB = Rotture a doppia elica NHEJ = Riunione non omologa di estremità (causa delezioni e inattivazione del gene)

gRNA = RNA guida

PAM = sequenza adiacente al sito di taglio

HR = Ricombinazione Omologa >> ricostituzione del genotipo wt

gRNA = RNA guida

PAM = sequenza adiacente al sito di taglio

(sequenza wt)

In alternativa, si possono costruire altri genotipi mutanti, oppure inserire sequenze marker

(e.g. di geni di resistenza o di proteine fluorescenti )

Riparazione in situ del gene mutante

G

A chr12 Gene mutante

G chr12 Gene normale riparato

ricombinazione omologa

La tecnologia CRISP-R / Cas9 permette di affrontare la terapia genica di tutte quelle malattie per le quali era impensabile utilizzate i vettori virali, che aggiungono il gene sano senza riparare quello mutato e che non consentono la fisiologica regolazione della attività del gene, attuabile solo nel contesto genomico naturale

Malattie per le quali è impensabile utilizzare vettori virali

Che cosa manca alla applicazione clinica della nuova tecnologia? Le localizzazioni dell’RNA guida (e quindi della Nucleasi Cas9) non sono ancora totalmente controllabili: seppur raramente, avvengono appaiamenti e tagli a doppia elica anche in altre regioni del DNA, anche non completamente omologhe. La tecnologia deve essere raffinata, per ridurre le localizzazioni aspecifiche o renderle innocue facendo suicidare le cellule in cui queste avvengano.

Antonio Siccardi, 2009 Dance for all (Berlin) www.antoniosiccardi.net