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CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDOS

PLANAR COLUMNA

IEC SEC

FLUIDO SUPERCRÍTICO

TLC PC

GSC GLC

BPC-NP GPC GFC BPC-RP

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO-SÓLIDO (LSC)

• Principio: Adsorción de los analitos en la superficie polar, ligeramente ácida de la sílica gel.

• F.E.: Sílica gel (pH 2-8); Alúmina (pH 2-12).• F.M.: Disolventes no-polares como hexano,

CHCl3 (en raras ocasiones agua).• Aplicaciones: Para muestras no-polares y

semi-polares; solubles en hexano; isómeros posicionales.

CROMATOGRAFÍA DE FASE QUÍMICAMENTE UNIDA (BPC)

• Ambas fase normal (F.N.) y fase reversa (F.R.)• Principio: F.R. – Estructura hidrofóbica

responsable de la partición del analito entre la superficie hidrofóbica y metanol (no agua).

• F.E.: Superficies hidrofóbicas en sílica gel -RP-18, RP-8, ODS.

• F.M.: Metanol o acetonitrilo y agua.• Aplicaciones: Compuestos solubles en agua o

metanol, proteínas, péptidos, azúcares, ácidos grasos, fármacos.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (IEC)

• Principio: Adsorción reversible de iones en F.E. Con grupos funcionales de cargas opuestas.

• F.E.: Para cationes - SO32- , CO3

• Para aniones - NH4+, NH3

• F.M.: Buffer acuoso con pH y fuerza de buffer cuidadosamente controlados.

• Aplicaciones: Todos los compuestos ionizados, aniones, cationes, azúcares, ácidos carboxílicos, aminas, etc.

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (GPC)

• Principio: Los poros internos de la F.E. excluyen a los analitos solvatados en función de su volumen hidrodinámico. VR se correlaciona con P.M. por calibración.

• F.E.: Estireno, 8% DVB-con diámetros de poro de 80, 100, 150, 300, 500 o 1000 Ao.

• F.M.: Un buen disolvente de polímeros, las mas de las veces Tolueno o THF.

• Aplicaciones: Polímeros orgánicos, poliestirenos, polietilenos, metacrilatos.

HPLC COLUMNA

FASES ESTACIONARIAS Sílica gel - LSCRP-18 - BPCStyragel - SEC

FASE MÓVIL

FASE ESTACIONARIA

COLUMNA CROMATOGRÁFICA: ESQUEMA

Flujo por gravedadSin presión

Muestra

Adsorbente

Columnavidrio

Solvente

Componentesde la muestraseparados

Slide #8

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

High Performance Liquid Chromatograph

Slide #9

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #10

SeparationsInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #11

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #12

SeparationsInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #13

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #14

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #15

SeparationsInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #16

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #17

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #18

SeparationsInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #19

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #20

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #21

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #22

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

Slide #23

SeparaciónInjector

Detector

Column

Solvents

Chromatogram

Start Injection

COLUMNA CROMATOGRÁFICA

VENTAJAS LIMITACIONES

• Barato • Lento

• Simple • Baja Resolución

• Buen Método Prep. • Cuantitativo difícil

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA PRESIÓN: ESQUEMA

Reservoriode disolvente

Medidor de presiónInyector

Columna Detector

Desecho

Registrador

Sistema de Datoso Integrador

UN CROMATOGRAMA TÍPICO

.Tiempo de retención (tr)

Área de picoAlturade pico

“pico” delsolvente

Inyección

Línea Base

Tiempo

• Velocidad - Minutos

• Alta resolución

• Alta precisión

• Alta sensibilidad : 10-9 a 10-12 g

• Sistemas automatizados

VENTAJAS DE HPLC

ANÁLISIS DE PPB DE AFLATOXINAS

Aflatoxinas en mantequilla de maní;Detección por fluorescencia

1. Aflatoxina B1 5 ppb2. Aflatoxina G 1 1 ppb3. Aflatoxina B2 3 ppb

4. Aflatoxina G 2 1 ppb

0 10 20 30 minutos

ANÁLISIS RÁPIDOS POR HPLC

0 5 10

(PARTÍCULAS PEQUEÑAS, COLUMNAS CORTAS, FLUJO ALTO)

COLUMNA : 3 cm3M ODS

FLUJO : 3.5 ml / min

URACILO

FENOLNITROBENCENO

TIEMPO ( SEG )

HPLC DE ALTA RESOLUCIÓN

ORINA HUMANA1 columna, elución por pasos, 65.5 hrs

SEPARATION OF URINE BY ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHYReprinted by permission of Dr. P.B.Hamilton(Handbook of Biochemistry, Selected Data for Molecular Biology, B-47, CRC Press, Cleveland, 1968)

LC ALTA RESOLUCIÓN, RÁPIDA

"HPLC of Naturally Occuring Xanthones", K. Hostetman & H.M. McNair,J. Chromatogr,. 116 (1976) 201.

N = 3200L = 250 mmH = 0.078 mmRS = 4

0 1 2 3 4 5Time [min]

OMe OMe

• Instrumentación Costosa• Requiere Capacitación: 6-12 meses• No existen detectores universales /sensibles• Consumibles caros• Requiere de espectroscopias para confirmación

LIMITACIONES DE HPLC

VERSATILIDAD DE HPLC

DROGAS

VITA MINAS

VENTAJAS DE HPLC• RÁPIDA – Usa partículas pequeñas y columnas

cortas.• ALTA RESOLUCIÓN – N alta, muchas formas de

aumentar , muchos tipos de columnas.• VERSÁTIL – ¡si la muestra se puede disolver, se

puede separar por HPLC! BUENOS ANÁLISIS CUANTITATIVOS – ~1 - 2% RSD• FÁCIL DE ESCALAR – columnas gruesas, muestras

mas grandes y colectores de fracciones.

VENTAJAS DE CG• MAS ALTA RESOLUCIÓN – Columnas capilares

N=400,000.• RÁPIDA, CUANTITATIVA y FÁCIL DE USAR.• COSTO MODERADO - ~$15K – probablemente

el método instrumental mas empleado.• BUENA SENSIBILIDAD – Análisis de trazas.• NO MUY VERSÁTIL – Sólo volátiles.

ANÁLISIS CUALITATIVO (1)

• Técnicas auxiliares (MS, IR, UV-VIS, NMR) permiten una identificación positiva

Tiempo de retención (tr)

Inyección

Tiempo

Cafeina

Teofillina Teobromina

ANÁLISIS CUALITATIVO (2)

1. Estándar

2. Desconocido

tR(teofilina) = tR(“X”), entonces se sugiere que “X” es teofilina.Para una identificación absoluta se requiere de confirmación por, LC-MS

LC / ESPECTRÓMETRO DE MASASEspectrómetro de masas

Sistema de datos

Espectro de masasMuestra enriquecida

AlVacio

Solvente

Muestra

Efluente de LC

ANÁLISIS CUANTITATIVOSe

Tiempo

Área depico : Apico: h

Altura de

SÍNTESIS DE EMPAQUES

• La formación de un enlace covalente entre la sílice y la fase proporciona estabilidad térmica y previene la hidrólisis.

Si OH Si O Si

Si C18

+ 3 HCl

Partícula de soporte de sílica Enlace covalente

HPLC con FQU (BPC)

• FASE NORMAL

• Adsorbentes polares: -CN, -NH

• Solventes no-polares: iso-octano, cloruro de metileno

• Muestras no-polares y semipolares

• FASE REVERSA

• Adsorbentes no-polares: RP-18 (ODS), RP-8 (Octil)

• Solventes polares: agua, metanol, acetonitrilo

• Muestras tanto polares como no-polares

EMPAQUES PARA HPLC (1)

REVERSED-PHASE (AND ION-PAIR) METHOD a

C-18 (octadecyl or ODS) Rugged; highly retentive; widely available

C-8 (octyl-) Similar to, but slightly less retentive, than C-18

C-3, C-4 Less retentive; used mostly for peptides and proteins

C-1 (trimethyl-silyl, TMS) Least retentive; least stable

Phenyl Moderately retentive; some selectivity differences

CN (cyano) Moderately retentive; used for both reversed- and normal-phase

NH2-(amino) Weak retention; used for carbohydrates; less stable

Polystyreneb Stable with 1 < pH < 13 mobile phases;better peak shape and longer column life for some separations

NORMAL-PHASE METHOD a

CCN- (cyano) Rugged; fairly polar; general utility

OH- (diol) More polar than CN-

NH2- (amino) Highly polar; less stable

Silicab Very rugged; cheap; less convenient to operate; used in prep LC

EMPAQUES PARA HPLC (2)

SIZE-EXCLUSION METHOD a

Silicab Very rugged; adsorptive

Silanized silica Less adsorptive, wide solvent compatibility;with organic solvents

OH- (diol) Less stable; used in aqueous SEC (gel filtration)

Polystyreneb Used widely for organic SEC (GPC); incompatible with highly polar solvents

ION-EXCHANGE METHOD a

Bonded-phase Less stable and reproducible

Polystyreneb Less efficient; stable; more reproducible

aSilica-based bonded phases, except as noted.bNo bonded phase on these packings.

L.S. Snyder, J.L. Glajch and J.J. Kirkland, "Practical HPLC Method Development",J. Wiley (1988) 80-105.

Inyección

t'R(A)

t'R(B)

Pico de unsoluto no retenido

Soluto A Soluto B

TIEMPO

PARÁMETROS DE RETENCIÓN

t'R(A) = tR(A) - tM

K´(A) = t'R(A) / tM

t = tR(B) - tR(A)

Inyección

PARÁMETROS DE EFICIENCIA

• Platos teóricos :

• Altura de plato :

HETP H Lc

N 16 tR

5.545 tR

Inyección

tMt'R(A)

t'R(B)

Soluto A Soluto B

TIEMPO

SELECTIVIDAD EN HPLC

mayor de 1.2 es el valor aceptable

=t’R(B)

t’R(A)

FACTOR DE RETENCIÓNFACTOR DE CAPACIDAD k´ = t´R / tO

o 1 2 3 4

t =10 t' =1R

k´ = 2 k´ = 3

Solvente

Tiempo (min)• k´ en el intervalo de 2 a 10• Nota: k´ Inversamente proporcional • a la fuerza del solvente

k´ = 1

EFICIENCIA vs SELECTIVIDAD

REFERENCIA

EFICIENCIA INCREMENTADA (>N)MISMA SELECTIVIDAD (

SELECTIVIDAD INCREMENTADA (>)MISMA EFICIENCIA (N)

RESOLUCIÓN:CAPACIDAD, SELECTIVIDAD Y EFICIENCIA

Wb(1) Wb(2)

12 Wb(1) Wb(2)

ECUACIÓN MAESTRA DE LA RESOLUCIÓN

• LA RESOLUCIÓN (RS) ES UNA FUNCIÓN DE TRES FACTORES

CAPACIDAD SELECTIVIDAD EFICIENCIA

'1' Nk

HPLC 2 10/96 1

Cromatografía de alta presión: esquema

Reservoriodesolventes

Medidor depresión

Inyector

ColumnaDetector

Desecho

Registrador

Sistema de datoso integrador

HPLC 2 10/96 2

PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL

• Disuelve la muestra

• k' de 2-10

• Alta pureza

• Costo, viscosidad, toxicidad, punto de ebullición

HPLC 2 10/96 3

SISTEMAS DE SOLVENTES TÍPICOS

•FASE NORMAL – hexano, cloruro de metileno, cloroformo, metanol, acetonitrilo

•FASE REVERSA - metanol/agua,acetonitrilo/agua

•INTERCAMBIO IÓNICO - buffer acuoso

•PERMEACIÓN EN GEL - tetrahidrofurano,tolueno, cloroformo

HPLC 2 10/96 4

FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL

A VACÍO

DISOLVENTE

FILTRO DE 2m

HPLC 2 10/96 5

RAZONES PARA FILTRAR

FUGAPARTÍCULA

VÁLVULA CHECK

PARTÍCULA

ARAÑAZOS

PISTÓN

• Filtrar el disolvente es esencial en HPLC!

HPLC 2 10/96 6

FILTRACIÓN DE LA MUESTRA

Filtro

Émbolo

10ml jeringa

0.5 m Filtro

Malla desoporte

HPLC 2 10/96 7

REQUISITOS DE LAS BOMBAS

1. Químicamente inerte

2. Alta presión (5,000 PSI)

3. Flujos (0.5 - 10 ml/min)

4. Libre de pulsos o amortiguada

5. Reproducibilidad de flujo <1.0%

6. Gradiente, cambio rápido de disolvente

HPLC 2 10/96 8

Materiales de construcción /compatibilidad con disolventes• Completamente resistentes:

Teflón, Rubí, Zafiro, Cerámica, Tefzel, Kalrez, Fluoraz

• Resistencia limitada:Acero Inox. 316 – Cloruros acuosos ácidosPEEK – Ácidos nítrico o sulfúrico conc.Kel-F – disoluciones de THF, hidrocarburoshalogenados Acetal – Ácidos o bases fuertes

HPLC 2 10/96 9

TIPOS DE BOMBAS

• Pistón reciprocante (las más comunes)

• Pistón reciprocante de doble cabeza

• Bombas de jeringa (más empleadas en SFC y micro HPLC)

HPLC 2 10/96 10

Bombas de pistón reciprocanteReservorioexterno

ValvulasCheck

Pistón

Cámarahidráulica

HPLC 2 10/96 11

Bombas de pistón reciprocante de doble cabeza

• Mejor estabilidad de flujo que las de una cabeza...• ...produce una línea base más estable

HPLC 2 10/96 12

VALVULAS CHECK DE HPLC

Válvula de bola de salida

Válvula de bola de entrada

Pistón

A la columna

Del reservorio

HPLC 2 10/96 13

BOMBAS DE PISTÓN RECIPROCANTE

VENTAJAS

• Baratas

• 6000 psi

• Reservorio externo

• Diseño mecánico simple

LIMITACIONES

• Ruído de pulso

• Mantenimiento, sello de las válvulas

HPLC 2 10/96 14

BOMBAS DE JERINGA

PISTÓN

GUÍA Y ENGRANE

SELLOS

DISOLVENTE

HPLC 2 10/96 15

0 1 2 3 4 5 6 7

BTIEMPOTIEMPO

ELUCIÓN ISOCRÁTICA vs. GRADIENTE

• En HPLC Isocrático, la composición de la fase móvil permanece igual durante el análisis

• En HPLC Gradiente, la fuerza de la fase móvil se incrementa con el tiempo de análisis.

HPLC 2 10/96 16

0 20 40 60 80 min 0 20 40 60 80 min

COMPARACIÓN DE ELUCIÓN ISOCRÁTICAY GRADIENTE

ELUCIÓN ISOCRÁTICA ELUCIÓN GRADIENTE

BIFENILOS CLORADOS

50% Metanol50% Agua

20% MeOH / 80% H2Oa

75% MeOH / 25% H2O

HPLC 2 10/96 17

FORMACIÓN DE GRADIENTES A ALTA PRESIÓN

Programador

B Bomba

Programador

Bomba40:60 90:10

0.4 ml/min

0.6 ml/min

0.9 ml/min

0.1 ml/min

CámaraMezclado

De 40%A - 60%B a 90%A - 10%B

HPLC 2 10/96 18

FORMACIÓN DE GRADIENTES A BAJA PRESIÓN

Reservorios de disolventes

Programador Válvula Multipuertos

Cámara deMezclado

A LA BOMBA DE HPLC

HPLC 2 10/96 19

OPERACIÓN VÁLVULA DE INYECCIÓN

CARGA INYECCIÓN

DE LA BOMBA

A LA COLUMNA

RIZO DEMUESTRA

JERINGA

HPLC 2 10/96 20

ARREGLO DE PRE-COLUMNA Y GUARDA-COLUMNA

VÁLVULADE

MUESTREO

GUARDA-COLUMNA

COLUMNAANALÍTICA

DETECTOR

PRECOLUMNA

HPLC 2 10/96 21

CONEXIONES PARA HPLC

UPCHURCHWATERS

SWAGELOK

PARKER

RHEODYNE

Distance "X" is critical i n obtaininga low-volume, leak-free seal...

...and varies greatly from onemanufacturer to another.

1. "X" is too long: leaks inevitable2. "X" is too short: adds to extracolumn volume

WATERS UPCHURCH PARKER

SWAGELOK VALCO RHEODYNE

.320 .250 .210

HPLC 2 10/96 22

CONSTRUCCIÓN DE COLUMNASDEL

INYECTOR2 m FRITADO

POROSO

• LARGO: 3, 5, 10, 15, 25, cm• I.D.: 4 or 4.6 mm• ACERO INOXIDABLE• partículas 3, 5, 10 m

AL DETECTOR

HPLC 2 10/96 23

COLUMNAS CARTUCHO

CARTUCHO

HPLC 2 10/96 24

LC ANALÍTICA vs. LC SEMI-PREP

MUESTRA :0.1 mg in 10 µl 50 mg in 2 ml

COLUMNA :4.6 x 150 mm 10 x 250 mm

FLUJO :1 ml/min 10 ml/min

DETECTOR :Alta sensibilidad, PDA Baja sensibilidad, RI

ANALÍTICA SEMI-PREPARATIVA

HPLC 2 10/96 25

CONTROL DE TEMPERATURA EN HPLC

• TERMOSTATADO DE COLUMNA – Áreas de pico y tiempos de retención más reproducibles.

• CALENTAMIENTO DE COLUMNA :1. Menor viscosidad, menos presión.2. Menor coleo de pico, desorción más rápida.3. Usualmente menor selectividad.

HPLC 2 10/96 26

EFECTO DEL CONTROL DE TEMPERATURA EN LA SEPARACIÓN

0 5 10 min

HPLC 2 10/96 27

DETECTORES DE HPLCDETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) • Longitud de onda fija• Longitud de onda variable • Arreglo de diodos

INDICE DE REFRACCIÓN

FLUORESCENCIA

ELECTROQUÍMICA

MS / FTIR / Conductividad/MS

HPLC 2 10/96 28

SISTEMAS DE DATOS

INTEGRADORES. Fácil de usar

. Precio moderado

COMPUTADORA. Flexible, poderosa

. Cara

HPLC 2 10/96 29

CROMATOGRAMA DE INTEGRADOR

RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11 SAMPLE# 2AREA% RT AREA TYPE WIDTH AREA% 1.235 22353 VB .060 .16530 1.679 10700 BB .105 .07913 3.197 1761694 PV .095 13.02755 3.289 821053 VB .077 6.07160 4.315 690054 BB .120 5.10288 5.540 639889 BB .157 4.73191 6.235 31558 BB .196 .23337 11.075 9545536 BB .338 70.58825

TOTAL AREA=1.3523E+07MUL FACTOR=1.0000E+00

* RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11

1.2351.679

3.1973.289

5.5406.235

11.075

HPLC 2 10/96 30

VALORES TÍPICOS PARA HPLCCOMPONENTE VALOR TÍPICO INTERVALOEMPAQUE

Tamaño partícula 10 y 5 m 3 - 10 mTamaño de poro 80 y 100 Å 60-120 Å, hasta 4,000 Å

COLUMNADiámetro Int. 4.6 mm 2 - 5 mmLargo 15 y 25 cm 3 - 30 cm

BOMBAPresión 1500 psi 800 - 5000 psiFlujo Volumétrico 1 ml/min 0.5 - 2 ml/minFlujo lineal 0.1 cm/sec 0.05 - 0.2 cm/sec

MUESTRAVolumen 20 l 2 - 100 l Concentración 0.1 % 1 ppm - 1 %

DETECTORVolumen de celda 5 l 2-15 l to 200 l Constante de tiempo 50 msec 25 msec - 1 sec

SELECCIÓN DE COLUMNAS

MUESTRA

MW > 1500 MW < 1500

SOLUBLEAGUA

SOLUBLEORGÁNICO

GFC GPC

SOLUBLEAGUA

SOLUBLEORGÁNICO

SOLUBLEHEXANO

SOLUBLEMETANOL

NO-ELECTROLITOS ELECTROLITOS

LSC BPC-NP BPC-RP BPC-RP(ESPECIAL)

IEC IPC

LSC : CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

SÍLICA GEL 94%

ALÚMINA 3%

CARBÓN 1%

FLORISIL 2%

SÍLICA GEL

A. MACROPOROSAIRREGULAR

B. PELICULARESFÉRICA

C. MICROPOROSA

IRREGULAR

ESFÉRICA

50 - 100 m 37 - 44 m 5 - 10 m

Esfera devidrio

SílicaPorosa

USOS DE EMPAQUES LSC

USOS PREPARATIVOS YANALÍTICOS

• MUY EFICIENTE• ALTA CAPACIDAD• ALTA VELOCIDAD• EMPAQUE DIFÍCIL• CAROS

MACROPOROSA PELICULAR MICROPOROSA

SEPARACIONES PREPARATIVAS

• ALTA CAPACIDAD• EMPACADO SENCILLO• BARATOS• BAJA EFICIENCIA

GUARDA-COLUMNAS

• EFICIENTES• EMPACADO SIMPLE• CAROS• BAJA CAPACIDAD

LSC : EFECTO DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA

5 m 10 m 20 m

TIEMPO ANÁLISIS 1 minuto 1 minuto 1 minutoPLATOS 6000 4800 3000PRESIÓN 3000 psi 900 psi 500 psi

LSC : PRINCIPIO SEPARACIÓN

• Adsorción del analito en sitios polares (silanoles) debido a puentes de hidrógeno Diferencias en afinidad de adsorción resulta en separación

1. Los analitos más polares se retienen más2. Los analitos con un mayor número de

grupos funcionales polares se retienen más .

3. Isómeros posicionales se separan usualmente en el órden p>m>o.

SUPERFICIE DE LA SÍLICA GEL

La superficie de la sílica gel es inhomogenea, conformada por diferentes grupos funcionales :

Silanol Normal Puente SiloxanoInerte

Sitio activo"hot spot"

Si O Si

O OH H

LSC: MECANISMO DE ADSORCIÓNSilanoles Superficiales

Polímero deSílica Gel Amorfo

Las interacciones con analitos se basan en la polaridad del analito y la esteroquímica.

O O O O O O

O O O O O O OSi

O O O O O OO O

Si Si Si Si Si Si

O O OH HH

EFECTO DE POLARIDAD DEL SOLVENTE

100 % HEXANO ELUCIÓN LENTA(No - Polar)

90 % HEXANO, 10% CH2Cl2 RÁPIDA(Mas Polar)

70 % HEXANO, 30 % CH2Cl2 MAS RÁPIDA(Mas Polar)

• Fases móviles más polares desplazan la muestra más rápido

SOLUBILIDAD DE LA SÍLICA GELEN AGUA.

1 5 10

02 3 4 6 7 8 9

PROBLEMAS DE LA SOLUBILIDAD DE LA SÍLICA GEL

1. A pH >7.5, use una pre-columna para saturar la fase móvil.

2. La adición de solventes orgánicos incrementa el pH; por cada 10% de incremento en el contenido orgánico, el pH se incrementa 0.2 unidades.

3. Incrementos en la fuerza iónica de la fase móvil incrementan la solubilidad.

LSC - SÍLICA GEL : RESUMEN• SÍLICA GEL ES: Amorfa, totalmente porosa, polar,

y ácida.

• LAS PARTÍCULAS SON: Macroporosas, peliculares, y microporosas.

• LOS DISOLVENTES USADOS SON: Hexano, cloruro de metileno, cloroformo y metanol.

• Las partículas pequeñas permiten la mayor eficiencia.

• Los puentes de hidrógeno permiten una retención selectiva.

• Los isómeros estructurales pueden ser separados por LSC.

ECUACIÓN MAESTRA DE RESOLUCIÓN

CAPACIDAD SELECTIVIDAD EFICIENCIA

• LA RESOLUCIÓN ES FUNCIÓN DE TRES FACTORES.

'1' Nk

LSC DESARROLLO DE MÉTODOS - 1

k’ (k’ / 1+k’)0 00.5 0.331.0 0.502.0 0.675.0 0.8310.0 0.91infinito 1.00

• Ajustar la polaridad del solvente para producir 2 < k’ <10.

'1' Nk

0 2 4 6 8 100

k’ = factor de capacidad=t’RtO

1+k’( )

selectivity t'R (2)t'R(1)

LSC DESARROLLO DE MÉTODOS -2

1.00 01.01 0.011.05 0.051.10 0.091.20 0.171.50 0.33

• Para maximizar selectividad

1. Cambie los disolventes

2. Optimice el material de empaque

3. Cambie el material de empaque

LSC DESARROLLO DE MÉTODOS - 3

100 2.5200 3.5300 4.3400 5.0500 5.6

• Para maximizar efieciencia

1. Use flujos más bajos2. Use una columna más larga3. Use columnas de mejor calidad4. Use columnas empacadas con partículas más chicas

1. Columna de 25 cm, 4 mm DI, sílica gel totalmenteporosa de 10 m (o 15 cm, 5 m. de tamaño de partícula)

2. Inyecte un estándar, usando un solvente polar a 2–3 ml/min

3. Si la elución es rápida: Si la elución es lenta:

ir a paso (4) pruebe con HPLC reversa4. Disminuya la polaridad del solvente hasta que 2<k’< 10.

OPTIMIZANDO COLUMNAS DE LSC - 1

5. Inyecte una muestra, mida Si > 1.2, ir a paso 6Si < 1.2:

A. Cambie la fase móvilB. Use una sílica gel más activa1. Reactiva o 2. Mayor área superficial

6. Si es necesario, optimice (incremente) eficiencia (N):

A. Flujos bajos C. Partículas mas chicasB. Columnas largasD. Columna nueva

OPTIMIZANDO COLUMNAS DE LSC - 2

Incrementando N

SÍNTESIS DE EMPAQUES BPC

• La formación de un enlace covalente en la fase produce una fase químicamente unida, térmica e hidrolíticamente estable.

Si OH Si O Si

Si C18

Cl3+ 3 HCl

Partícula de soportedeSílica Enlace covalente

1. REACCIÓN QUÍMICAa. R Si Cl3 (polimérica)b. R2Si Cl2 (polimérica)c. R3Si Cl (monomérica)

2. HIDRÓLISISR–Cl + H2O ROH + HCl

3. TAPONAMIENTO DE EXTREMOS (END CAPPING)Si–OH + (CH3) 3–Si–Cl Si–O–Si–(CH3)3

PREPARACIÓN DE EMPAQUES BPC

EMPAQUES QUÍMICAMENTE UNIDOS FASE REVERSA:

Octadecilo -

Octilo -

FASE NORMAL:

Cianopropil -

Aminopropil -

Si CH3OSi

Si CNOSi

Si NH2OSi

HPLC FASE REVERSA :EFECTOS DEL SOLVENTE

75 % MeOH / 25 % H2O RÁPIDO

60 % MeOH / 40 % H2O LENTO

50 % MeOH / 50 % H2O MAS LENTO

EL AGUA NO ES UN COMPONENTE ACTIVO!

MECANISMO DE FASE REVERSA

partícula soporte Fase unida no polar

Área Intersticial(fase móvil)

• Menos polar (más hidrofóbica) los analitos son más atraidos a la fase unida hidrofóbica...

• ...más hidrofóbica, pasa más tiempo asociado a la fase unida...

• ...y eluye más tarde. El solvente activo es metanol.

A - analito más polar

B - analito menos polar

OPTIMIZANDO COLUMNAS RP - 1

1. 25 cm, 4 mm DI, 10 µm (o 15 cm, 5 µm) RP-182. Inyecte un estándar, use 95 : 5 [Metanol : Agua] y flujo rápido3. Si es rápido: Si es lento:

ir a paso 4 pruebe HPLC de fase normal

'1' Nk

OPTIMIZANDO COLUMNAS RP - 2

4. Añada agua (+20%) hasta k’ ~ 55. Inyecte una muestra, mida y ajuste a > 1.2 cambiando la

composición de la fase móvil6. Si es necesario, optimice (incremente) eficiencia (N):

A. Flujo lento C. Partículas más pequeñasB. Columnas largasD. Una columna nueva

Incrementando N

'1' Nk

BPC – FASE NORMAL

MACROPOROSA PELICULARMICROPOROSA

Compuesto unido con una cabeza polar (PHG) :

• Material de soporte de Silica, todos los tipos• La fase unida consiste de un espaciador no polar con

una cabeza polar (PHG)• Los grupos ciano y amino son las cabezas preferidas• Se usan con fases móviles no polares• Los disolventes más empleados son el hexano, cloruro

de metileno y cloroformo

PHGPHG

PHGPHG PHG

PHGPHG

LC FASE NORMAL : EJEMPLO

DIAZEPAM

COMPUESTOSRELACIONADOS

COLUMNA:25 cm x 4.6 cmEmpaqueCianopropil

RESUMEN DE BPC (RP Y NP)• PARTÍCULA SOPORTE: Sílica Gel

• FASE ESTACIONARIA: Covalentemente unida al soporte

• FASE REVERSA (RP):Variedad unida - Octadecilo (C-18, RP-18)

Octilo (C-8, RP-8)

Solventes empleados - Metanol, agua, acetonitrilo

• FASE NORMAL (NP):Variedad unida - Cianopropil (CN)

Aminopropil (NH2)

Solventes empleados - Hexano, cloruro de metileno, cloroformo

• Las fases químicamente unidas son los materiales mas empleados en LC.

EMPAQUES PARA COLUMNAS HPLC (1)REVERSED-PHASE (AND ION-PAIR) METHOD a

C-18 (octadecyl or ODS) Rugged; highly retentive; widely available

C-8 (octyl-) Similar to, but slightly less retentive, than C-18

C-3, C-4 Less retentive; used mostly for peptides and proteins

C-1 (trimethyl-silyl, TMS) Least retentive; least stable

Phenyl Moderately retentive; some selectivity differences

CN (cyano) Moderately retentive; used for both reversed- and normal-phase

NH2-(amino) Weak retention; used for carbohydrates; less stable

Polystyreneb Stable with 1 < pH < 13 mobile phases;better peak shape and longer column life for some separations

NORMAL-PHASE METHOD a

CCN- (cyano) Rugged; fairly polar; general utility

OH- (diol) More polar than CN-

NH2- (amino) Highly polar; less stable

Silicab Very rugged; cheap; less convenient to operate; used in prep LC

EMPAQUES PARA COLUMNAS HPLC (2)SIZE-EXCLUSION METHOD a

Silicab Very rugged; adsorptive

Silanized silica Less adsorptive, wide solvent compatibility;with organic solvents

OH- (diol) Less stable; used in aqueous SEC (gel f iltration)

Polystyreneb Used widely for organic SEC (GPC); incompatible with highly polar solvents

ION-EXCHANGE METHOD a

Bonded-phase Less stable and reproducible

Polystyreneb Less efficient; stable; more reproducible

aSilica-based bonded phases, except as noted.bNo bonded phase on these packings.

L.S. Snyder, J.L. Glajch and J.J. Kirkland, "Practical HPLC Method Development",J. Wiley (1988) 80-105.

HPLC 4 10/96 1

FORMAS DE PICOIdeal Ancho Cabeceo Coleo Doblete

TIEMPO

HPLC 4 10/96 2

INFORMACIÓN DEL CROMATOGRAMA

1. POSICIÓN DEL PICO – tR función de K(Termodinámica)

2. ANCHO DE PICO – N, H (Cinética) Responsable de ensanchamiento de banda

3. FORMA DEL PICO– Simétrica o asimétrica

HPLC 4 10/96 3

EL TIEMPO DE RETENCIÓN DEPENDE DIRECTAMENTE DEL COEFICIENTE DE

REPARTOtR = tM + t'R

tR = tM (1 + k')

Recuerda que K = k'

tR = tM (1 + K /)

HPLC 4 10/96 4

ENSANCHAMIENTO DE BANDA

HETP H 2 / tR

N 16 tR / Wb 2 tR / 2

H L / N tR / tR / 2 2 / tR

HPLC 4 10/96 5

DISPERSIÓN DE PICOt0

HPLC 4 10/96 6

ECUACIÓN DE VAN DEEMTER – 1956(PARA COLUMNAS DE CG EMPACADAS)

HETP = H = A + B / + C

HPLC 4 10/96 7

EFECTO MULTICANAL(Difusión de Eddy)

INICIAL CAMA EMPACADA FINAL

rápido

HPLC 4 10/96 8

DIFUSIÓN LONGITUDINAL(FASE MÓVIL )

t1 t2 t3

HPLC 4 10/96 9

TRANSFERENCIA DE MASA LENTA( MÓVIL A ESTACIONARIA )

Moléculas de Soluto

HPLC 4 10/96 10

GRÁFICO DE VAN DEEMTER

Velocidad Lineal promedio ()

H A B C

HPLC 4 10/96 11

HPLC - ECUACIÓN VAN DEEMTER (Modificada)

HETP H A Bu CS CM u

4 fuentes independientes de ensanchamiento de bandaMinimiza cada término, Minimiza“H”, Maximiza Eficiencia

HPLC 4 10/96 12

HPLC – DIFUSIÓN de EDDY

A = 2dp

La clave son partículas pequeñas, empacadas eficientemente.

usualmente 10 y 5 micras

existen de 3 micras

HPLC 4 10/96 13

HPLC – DIFUSIÓN LONGITUDINAL

Un factor muy pequeño en HPLC

La difusión en líquidos despreciable

B / v 2D mobile

HPLC 4 10/96 14

HPLC – TRANSFERENCIA DE MASA –FASE ESTACIONARIA

Q = Factor de ConfiguraciónR = Constante; f (K )df = Espesor de fase estacionariaD stat = Coef. difusión en fase estacionariav = velocidad de flujo (cm / sec )

Clave: película delgada

Csv QRDf

2vD stat

HPLC 4 10/96 15

HPLC – TRANSFERENCIA DE MASA –FASE ESTACIONARIA

w = Coeficiente de Columnadp = Diámetro de partículav = Velocidad de flujo (cm / seg )D mov.= Coeficiente de difusión en

fase móvil

Clave: partículas pequeñas

Cmv wdp2vD mobile

HPLC 4 10/96 16

Fase líquidaSílica Fundida

Término C – Transferencia de MasaCOLUMNAS CAPILARES

HPLC 4 10/96 17

ECUACIÓN DE VAN DEEMTER DETALLADA

(HPLC)

H 2dp 2Dmv

QRdf2v

Ds dp2v

HPLC 4 10/96 18

00 2 4 6 8

FLUJO [ml/min]

22 °C : ter-Butil Benceno 10 m

ENSANCHAMIENTO DE BANDA vs FLUJOCOMO FUNCIÓN DEL DIÁMETRO DE PARTÍCULA

HPLC 4 10/96 19

0 5 10

ANÁLISIS POR HPLC RÁPIDA( PARTÍCULAS PEQUEÑAS, COLUMNAS CORTAS,

FLUJOS RÁPIDOS )

COLUMNA : 3 cm3M ODS

FLUJO : 3.5 ml / min

URACILO

FENOLNITROBENCENO

TIEMPO ( SEG )

HPLC 4 10/96 20

RELACIÓN ENTREdp, p, LARGO Y tR (1)

dp [mm] p (psi) Largo [cm] tR [min]10 1,000 25 105 4,000 25 10

Pero corte el largo para reducir presión y mantener:

N = 12,500

HPLC 4 10/96 21

RELACIÓN ENTREdp, p, LARGO Y tR(2)

dp [mm] p (psi) Largo [cm] tR [min]

10 1,000 25 105 2,000 12.5 52 5,000 5 2

Asume N = 12,500 ; H = 2.0;

Partículas pequeñas, más eficiente, pero mayor caída de presión

dp2 ; p L

HPLC 4 10/96 22

LARGO DE COLUMNA

N L; R (L)1/2

Los largos más comunes 15 cm y 25 cm,pero columnas de 5 cm y 10 cm con partículas de 3 m, son eficientes y rápidasDimensiones mayores, difícil debido a p

HPLC 4 10/96 23

DIÁMETRO DE COLUMNA

• 4 mm más popular; fácil de hacer, buenacapacidad

• 2 mm - HPLC rápida a flujos aceptables

• 1 mm - microboro – conexiones especiales, pero mejor sensibilidad, fácil acoplamiento

• tubos abiertos - investigación; N alto; muy lento

• capilares empacados – empleados en LC/MS

HPLC 4 10/96 24

DIÁMETRO DE PARTÍCULA

• Probablemente el factor más importante en HPLC• 10 m ~ 8-10K platos en 25 cm• 5 m ~ 8-12K platos en 15 cm• 3 m ~ 5K platos en 5 cm

Valores altos de # de platos (100K) requiere de instrumentación especial (inyector, detector, electrónica)

HPLC 4 10/96 25

FACTOR DE ASIMETRÍA DE PICO

Factor deAsimetría dePico = BC/BA

Tiempo

10% de altura de pico

HPLC 4 10/96 26

CAUSAS DE LA ASIMETRÍA DE PICO

• Diseños ineficientes del sistema

• Múltiples mecanismos de retención

• Deterioro de la columna

• Sobrecarga de la columna

DETECTORES PARA HPLCDETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) - longitud de onda fija- longitud de onda variable - arreglo de fotodiodos

DETECTOR ÍNDICE REFRACCIÓN

DETECTOR FLUORESCENCIA

DETECTOR ELECTROQUÍMICO

MS/FTIR/Conductividad

LINEALIDAD DEL DETECTOR

. Seña

Concentración de la muestra

Respuesta lineal máxima

Concentración mínima detectable

RUIDO Y DERIVA DEL DETECTOR

Ruido de alta frecuencia

Ruido baja frecuencia

Deriva y ruido de baja frecuencia

TIPOS DE FUENTES LUMÍNICASFUENTE DE LÍNEAS 253.7 nm

Lámpara deHg

Longitud de ondaFUENTE CONTÍNUA Lámpara de

Deuterio

Longitud de onda

FACTOR DE RESPUESTA

Concentración

PENDIENTE = BD / AB

CPENDIENTE = BC / AB

Detectores de HPLC

UV-VIS65%RI

Electro10%

USO DE DETECTORES DE HPLC

Analytical Chemistry, 54 (1982) 323R.

TIPO PORCIENTO DE USOAbsorbancia 70.7

Ultravioleta, fija (28.0)Ultravioleta, filtro (8.7)Espectrofotométrica (34.0)

Fluorescencia 15.0Índice de Refracción 5.5Electroquímico 4.4Otros 4.4

DETECTOR UV DE FIJA

Lente de Cuarzo Filtro

ReferenciaFotoDetectores

Registrador

Pre-AmpsFiltro UV

Fuente de mercurio

Muestra

Comparador LOG

CELDA DE FLUJO: DOS CANALES

REFERENCIA

SALIDA

DE LA FUENTE

AL DETECTOR

VENTANA DE CUARZO

ENTRADA

MUESTRA

SALIDA

ENTRADA

LOS BENEFICIOS DE LA DETECCIÓN CON VARIABLE

Mantequilla hidrolizada 40 nanogramos de Estándar de Vitamina A en Alcohol

Vitamina AAlcohol

0 5 0 5

= 254 nm

= 325 nm

Tiempo de Retención ( Minutos)

Selectividad y sensibilidad mejoradas

MUESTRAS IMPOSIBLES A 254nm

• Azúcares • Triglicéridos

• Esteroides • Barbitúricos

• Ésteres Metílicos • Ácidos carboxílicos

• Hidrocarburos • Polímeros

DETECTOR DE UV DE VARIABLE : ESQUEMA

DE ABSORCIÓN DE CROMÓFOROS

CHROMOPHORE FORMULA MAX (nm)

Amine – NH2 195

Ethylene – C C – 190

Ketone > C = O 195

Ester – COOR 205

Aldehyde – CHO 210

Carboxyl – COOH 200-210

Nitro – NO2 310

Phenyl 202, 255

Naphthyl 220, 275

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS:

ESQUEMADiode Array

Grating

OpticalSlit

DetectorFlow Cell

HomiumFilter

AchromaticLens

UVLamp

VisLamp

Gráfico de Isoabsorbancía

La de adquisiciónse puede optimizara partir de los datosespectrales.

Longuituddeonda

SALIDA 3-D DE UN DETECTOR PDA

USO DEL MODO 3 - D DE PDA

• Número de picos

de máxima sensibilidad

de mínima interferencia

programación en f (tiempo)

PDA: PROCESOS CUALITATIVOS

• Confirmación del compuesto - ( max. y tR )• Identificación del compuesto (no es fácil)• Índice de pureza (relación de 1/2, 10 pts)

intervalo : <1.5 puro, > 1.5 impuro

VERIFICACIÓN DE PUREZA DE PICO

BEl problema:¿está este pico “puro”?

SUPERPOSICIÓN ESPECTRAL

• No, el pico representa al menos dos compuestos coeluyendo.

nm190 230 270 310

DETECTORES DE ARREGLO DE DIODOS

• Ampliamente usados, aceptados

• Principal uso – verificación de pureza de pico

• Ahorra tiempo - no se requiere volver a analizar cuando los picos no han sido bien detectados

A. Se pueden registrar distintas 's B. Se puede re-graficar y re-integrar

ABSORBANCIA AL UV DE SOLVENTES LC

n-Hexano

Tetracloruro

Benceno

Clorofromo

Cloruro de metileno

Acetona

Acetonitrilo

Metanol

UV CORTESOLVENTE

254 nm Fuente Hg

200 250 300

DETECTOR UV : RESUMEN

• Buena sensibilidad 10-6 a 10-10 g• Selectivo• Se puede eluir con gradiente• Costo variable

• El más empleado

DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN :ESQUEMA

filtro

SOLVENTE PURO

EFLUENTE COLUMNA

DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN:- Principio

Eluente + Analito

Eluente Referencia

Lámpara

Cero Óptico

Linea Base

Cualquier compuesto con un índice de refraccióndiferente a la fase móvil se detecta.

Diseño del Detector de IR

La detección con IR se ve afectada por:

• Cambios de presión

• Cambios de temperatura

• Pulsos en el flujo

¡ imposible hacer gradient !

DETECTOR IR : RESUMEN

• Respuesta universal• Mala sensibilidad ~ 10-6 g• No se pueden gradientes• Se afecta por la temperatura• Básico para GPC

• Empleado en escalas preparativas

COMPARACIÓN DE IR Y UV

A B C D E

Inyección

Tiempo

Detector de Fluorescencia

Principio de detección con fluorescencia

S0…. Energía basal de los electrones

S1…Estado excitado promovido por energía externa e.g. Luz UV

Energía de emisión

Excitación - Emisión

DETECTOR DE FLUORESCENCIA:CROMATOGRAMA DE EJEMPLO

Tiempo

Inyección

CROMATOGRAMA DE FLUORESCENCIA 5 picogramos

benzo(a)pireno

DETECTOR AMPEROMÉTRICO DE PELÍCULA DELGADA PARA HPLC

DUALPARALLEL

LOCKINGCOLLAR

AUXILIARYELECTRODE

WORKINGELECTRODEBLOCK

MINIATUREREFERENCEELECTRODE

MOBILE PHASEPREHEATER COLUMN

GASKET

QUICK RELEASEMECHANISM

OUTLET

TOP VIEW

Detector Electroquímico Principio

Modo Oxidación: Transferencia de electrones del compuesto al electrodoElectrodo de trabajo = Cátodo

Modo Reducción : Transferencia de electrones del electrodo al compuestoElectrodo de trabajo = Ánodo

EXTRACTOS DE BUPRENORFINADE PLASMA Y ORINA (ECD)

BLANCO DE PLASMA

8 1240

(a) (b)40 ng/ml (STD)

0 4 8 12 min

BLANCO DEORINA

0 4 8 12

40 ng/ml

0 4 8 12

Detector de Light Scattering

Detector de Conductividad

ref.capacitor

variable resistances

fixed resistor

Balancecontrol A E

Schematics Applications

watersoap productsdetergentssoft drinksbloodplating bathsnuclear fuel reprocessingstreams

IonsAcidsBasesSalts

DETECTOR ELECTROQUÍMICOENTRADA

SALIDASALIDA

Electrodo deReferencia Ag/AgCl

Electrodo de trabajo de grafito

Contraelectrodo

Tapón de vidrio poroso

B. Fleet, C.T. Little, J.Chrom.Sci, 12 (1974) 747

DETECTOR ELECTROQUÍMICOAPLICACIONES

EN REDUCCIÓN• Quinonas• Compuestos nitro,

nitroso y azo • Compuestos

organometálicos• Metales pesados

EN OXIDACIÓN• Hidrocarburos aromáticos• Aminas primarias,

secundarias y terciarias• Aminas aromáticas• Compuestos fenólicos• Compuestos heterocíclicos

HPLC-MSD API- Electrospray

350 400 450 500 550 600 650 700

m/z-->

Abundance

439 467 502

684.65

350 400 450 500 550 600 650 700

m/z-->

Abundance

684.65

Fragmentor = 175 volts

Fragmentor = 75 volts

loss of C14 fatty acid

loss of C12 fatty acid

Triglyceride

Información cualitativa a partir del espectro de masas

¿porqué mas de un detector?:- Sensibilidad

PAH's extracted from soil; Sup.LC-PAH 150x4.6mm;Solv.: H2O/CH3OH= 10:90

Fluorescence

UV-signal

Pyrene

Chryse

Perylen

fluora

(ghi)p

erylen

-cd)py

¿porqué mas de un detector?:- Selectividad

Flecainide in Serum

Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected

UV and fluorescence signal

FL signal

UV signal

¿porqué mas de un detector?:– Información Cualitativa

Qualitative Information

Take peak spectrum (UV)

Chlortoluron ?

96 132 138158

Take peak spectrum (MS)

Mass/Charge

Atrazine ?

Wavelength (nm)

60 80 100 120 140 160 180 200 220

DERIVADOS SENSIBLES AL UV

Analyte ReagentRNH2 N-Succinimidyle

p-NitrophenylacetateRCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-

DiisopropylisoureaROH 3,5-Dinitrobenzoyl

ChlorideR2CO p-Nitrobenzyloxyamine-

Hydrochloride 2,4-D.N.P.H.

DERIVADOS SENSIBLES FLUORESCENCIAAnalyte ReagentRNH2 Dansyl Chloride

FluorescamineRCOOH 4-Bromomethyl-7-

methoxycoumarin

R--OH Dansyl Chloride

R2C = ONH2

Dansyl Hydrazine

RCH-COOH Phthaldehyde

DERIVADOS CON PROPIEDADES ELECTROQUÍMICAS

Analyte ReagentROH, R2NH,RNH2

2,4-DinitrobenzoylChloride

R-CH-COOH 2,4-DinitrofluorobenzeneRCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-

DiisopropylisoureaR2C = O 2, 4-Dinitrophenyl-

Hydrazine

ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas

Sistema de datos

Espectro de masasMuestra concentrada

AlVacío

Solvente

Muestra

Efluente LC

HPLC 6 10/96 1

ANÁLISISCUALITATIVO vs. CUANTITATIVO

1. CUALITATIVO - ¿qué está presente?

• Cromatografía - compare tR 's

• Espectroscopía - MS, IR, UV

2. CUANTITATIVO - ¿Cuánto está presente?

• Altura de pico

• Área de pico

HPLC 6 10/96 2

Cafeína

TeofilinaTeobromina

1. Estándar

2. Desconocido

tR(theophylline) = tR(“X”), entonces, se sugiere que “X” es teofilina.Para confirmación positiva, se debe emplear LC-MS

ANÁLISIS CUALITATIVO

HPLC 6 10/96 3

HPLC 5 10/96 34

ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas

Sistema de datos

Espectro de masasMuestra concentrada

AlVacío

Solvente

Muestra

Efluente LC

HPLC 6 10/96 4

EXACTITUD-META ANALÍTICA• Error absoluto:

Diferencia entre valor medido y el valor verdadero.

• Error relativo (%) :(Error / Valor Verdadero) x 100 = % Error

• Ejemplo:Peso verdadero 50.0 gPeso medido 48.0 gError absoluto 2.0 g% Error ( 2 / 50 ) x 100 = 4 %

HPLC 6 10/96 5

PRECISIÓN1. Mide reproducibilidad

2. Depende de la técnica

HPLC 6 10/96 6

MEDIDA DE LA PRECISIÓN:DESVIACIÓN ESTÁNDAR

S.D. x x

RSD S.D.

x 100Desviación estándar relativa =

Chemist X Chemist YData Statistics Data Statistics10.0 n = 5 10.2 n = 512.0 = 10.0 10.6 = 10.0 9.0 = 1.58 9.8 = 0.4811.0 RSD = 15.8% 10.1 RSD = 4.8% 8.0 9.3

HPLC 6 10/96 7

COMPONENTES DE EXACTITUD

CALIBRACIÓN + PRECISIÓN = EXACTITUD

1. Esencial calibración con estándares

2. Precisión (reproducibilidad) necesaria para un procedimiento analítico exacto

HPLC 6 10/96 8

PROCESO CUANTITATIVO HPLC1. Muestreo

2. Preparación de la muestra

3. Cromatografía

4. Integración

5. Cálculos

HPLC 6 10/96 9

1. Objetivo – tomar una pequeña muestra representativa de una población grande

2. Problemas• Contaminación• La muestra no es representativa

MUESTREO

HPLC 6 10/96 10

PREPARACIÓN DE MUESTRA

MolerDisolver Filtrar Extraer

Diluir Concentrar Derivatizar

2. Problemas•Pérdida de muestra•Contaminación

1. Procedimiento

HPLC 6 10/96 11

CROMATOGRAFÍA

Macintosh

Reservorio de solventes

Medidor de presión

Inyector

ColumnaDetector

Desecho

Registrador

Sistema dedatos o integrador

HPLC 6 10/96 12

CONVERSIÓN DIGITAL–ALTURA DE PICO

HPLC 6 10/96 13

INTEGRACIÓN – ÁREA DE PICO

Más difícil que medir altura de pico, pero está menos influenciado por cambios en la temperatura de la columna o el flujo.

HPLC 6 10/96 14

INTEGRADOR DIGITAL ELECTRÓNICO

DETECTOR A / DCONVERTIDOR

MICROPROCESADOR IMPRESORA

REGISTRADOR CINTA

sjhd kahd kjhd kjhd kjhd kjhsd kjhsd kjhs kjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs aljd lkjsd lkjsd lkjsd lkjs dljad ljadlj sljd aljd lkjsd iou fijgf oujfjd iuzdshda,adh fiehkjhd audddehfjsiu dSj.jfldu oejalkjd lkjs dlkj djs 2163216 321 6312

HPLC 6 10/96 15

SISTEMAS DE DATOS

INTEGRADOR. Fácil de usar

. Precio moderado

COMPUTADORA . Flexible/poderosa

. Más caras

HPLC 6 10/96 16

VENTAJAS DE LOS INTEGRADORES1. Sensibilidad

2. Intervalo dinámico3. Exactitud/precisión

4. Corrección de línea base5. Identificación de pico (Computadora)

6. Automatización total (Computadora)

• Programación de temperatura

• Integra, cuantifica

• Auto-calibra

• Introducción de la muestra

• Registro impreso

• Regeneración de la columna

• Repetición del programa

HPLC 6 10/96 17

LIMITACIONES DE INTEGRADORES

1. Costo de capital2. Se requiere entrenamiento3. Picos no resueltos - baja

exactitud4. Sobreconfianza

HPLC 6 10/96 18

CÁLCULOS:NORMALIZACIÓN DE ÁREA SIMPLE

1. Cálculos

2. Procedimiento usualmente no válido• Asume que todos los picos responden igual• Asume que la suma de áreas es el 100% de la muestra

Área = 150A 300

B 600C

wgt %A Area A

Total Area100

150150 300 600

100 14.3%

HPLC 6 10/96 19

CÁLCULOS: FACTOR DE RESPUESTA

Peso = 10 g 10 g 10 gÁrea = 150 300 600

Los factores de respuesta difieren

HPLC 6 10/96 20

CÁLCULOS DEL FACTOR DE RESPUESTA

Área (Cuentas)

Peso (g)

W FR Cuentas de área [g]B. 30A. 15C. 60

HPLC 6 10/96 21

CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN CON CORRECCIÓN DE ÁREA

Area RF Corrected AreaA 150 15 10B 300 30 10C 600 60 10

wgt %A = (10/30) x 100 = 33.3%

HPLC 6 10/96 22

CÁLCULOS:ESTÁNDAR EXTERNO

Peso (g)

Desconocido

1. Desarrolla una curva de calibración con estándares, y compara con el desconocido

2. Requiere de una inyección reproducible3. Es más empleado en LC que en GC

HPLC 6 10/96 23

SELECCIÓN DEL ESTÁNDAR INTERNO

Requisitos:1. Estándar puro2 Picos bien resueltos3. Nunca presente en la

muestra4. En el mismo nivel de

concentración

Muestra sola

Muestra + ISTD

HPLC 6 10/96 24

CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (1)

1. Prepare e inyecte muestras de estándar interno y del analito de interés.

2. Prepare una curva de calibración de los datos cromatográficos, graficando la relación de áreas contra la relación de pesos de analito y estándar interno.

IS = EST. INTERNOA = ANALITO A

IS IS IS

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Muestra 1Muestra 2Muestra 3

Área A / Área IS

Peso A / Peso IS

HPLC 6 10/96 25

CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (2)

Desconocido X

1. Añada con precisión el IS a la muestra desconocida2. Cromatografíe la mezcla3. Calcule la relación de áreas4. Determine la relación de pesos de la curva de

calibración5. Encuentre el peso del analito

Peso A / Peso IS

Área A / Área IS

HPLC 6 10/96 26

ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC

Component TrueWeight %

MeasuredWeight %

RelativeError (%)

Et Paraben 11.66 11.54 1.0Pr Paraben 16.94 16.91 0.2Bu Paraben 33.14 33.17 0.1

HPLC 7 10/96 1

CROMATOGRAFÍADE EXCLUSIÓN (SEC)

• PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC- Disolvente - agua- Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros- Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex)

• MOORE - 1962 – Cromatografía Permeación en Gel - GPC- Disolventes - THF, Decalina, Tolueno- Muestras – Polímeros Orgánicos- Empaque – Poliestireno entrecruzado (Styragel)

GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO

HPLC 7 10/96 2

CROMATOGRAFÍADE EXCLUSIÓN (SEC)

•SEC caracterización de polímeros (PM 1000 a 1 millón)

•Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas (GFC)---cadenas de moléculas pequeñas

• Las cadenas de distintos largos y formas•Se puede calcular el peso molecular y su

distribución

HPLC 7 10/96 3

COMPARACIONES

•GPC vs LSC o Fase Reversa

•GPC separa moléculas basada en su tamaño en disolución

•Tamaño en disolución depende de PM y otros factores (disolvente, temperatura, etc.)

• La moléculas más grandes eluyen primero las más pequeñas al final

HPLC 7 10/96 4

VENTAJAS DE SEC

• Trabaja con altos PM y tiene tiempos de corrida cortos

• Tiempos de separación y orden de elución fácilmente predecibles

• No existen pérdidas o reacciónes en la columna

• Desarrollo de métodos relativamente simple, sin gradientes

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GPC DE GOMA DE MASCAR

Ablandador

Estabilizador

COMPONENTES

CHICLE

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PROBLEMAS EN SEC

• Limitada capacidad de pico (baja resolución)

• No puede resolver compuestos de tamaño similar (isómeros)

• Se requiere de una diferente estrategia de optimización

• Debe poder disolver al polímero

HPLC 7 10/96 7

MECANISMO DE SEPARACIÓN

• Las moléculas más pequeñas penetran en los poros más pequeños y se retienen más

• Las moléculas mayores son EXCLUIDAS

• La separación en función del VOLUMEN HIDRODINÁMICO y no el PM

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CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓNV0 VR

Volumen muertoVolumen interno

Inyección.

Volumen de elución [ml]

grande pequeño

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CURVA DE CALIBRACIÓN

0 10 20 30 402

TOTALEXCLUSIÓN

TOTALPERMEACIÓN

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CURVAS DE CALIBRACIÓN PARAVARIAS COLUMNAS PS-DVB

100 Å500 Å

1000 Å

104 Å

105 Å

106 Å

4 5 6 7 8 9 10

MIXED BED

ELUTION VOLUME [min per 30 cm]

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DESARROLLO DE MÉTODOS

•Seleccione un buen disolvente (consulte la literatura)

•Escoja el tamaño de poro adecuado

•Corra estándares; desarrolle una curva de calibración

•Inyecte una disolución diluída (~1%)

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DISOLVENTES PARA GPC•Deben disolver al polímero•Compatible con el empaque y detector

•Baja viscosidad•Toxicidad, costo, punto de ebullición

SOLVENT Viscosity[20°C, cP]

UV cutoff[nm]

BP[°C]

Flash Pt.[°C]

Toxicity

THF 0.55 220 66 14 Slightm-Cresol 20.8 302 203 94 ModeratToluene 0.59 285 111 4 Moderat

Dichloromethane0.44 233 40 None Severe

Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography , 2nd ed., (1979)

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PAPEL DE LA FASE MÓVILDISOLVENTE A: DISOLVENTE B: Polímero completamente solvatado Sin solvatar

HPLC 7 10/96 14

SELECCIONANDO COLUMNAS GPC

PORES SIZES MW RANGE(polystyrene)

50 Å < 1,000100 Å < 4,000500 Å 500 - 2 x10 4

1000 Å 1000 - 4 x10 4

10 4 Å 4 x 10 3 - 4 x10 5

10 5 Å 4 x 10 4 - 4 x10 6

10 6 Å 4 x 10 5 - 4 x10 7

Mixed Bed 500 - 10 7

HPLC 7 10/96 15

REQUERIMIENTOS DE HARDWARE • BOMBA – un control preciso de flujo, esencial

• INYECTOR – mejor automuestreador (10-100µl)

• COLUMNA – empaque estable (no cambie disolventes), control de temperatura

• DETECCIÓN – No-destructivo (trabajo prep.), amplio intervalo lineal

• OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado, cálculos automáticos de Mn, Mw, etc.

HPLC 7 10/96 16

PREPARACIÓN DE MUESTRA•Seleccione un buen disolvente, caliente

si es necesario

•Prepare una disolución diluída (~1%) PM<10K ~1%PM>1Millón ~0.01%

•Siempre filtre (¡No guarda-columnas!)

HPLC 7 10/96 17

DETECTORES PARA SECÍNDICE DE REFRACCIÓN: • Respuesta universal

• Sensibilidad moderada• Mala temp. y estabilidad de flujo

UV/VISIBLE: • Buena estabilidad, muchos polímeros no tienen cromóforos

LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO:• da valores para• resultados de PM ABSOLUTO,ya que se mide el volumen

hidrodinámico

VISCOMETRÍA DIFERENCIAL:• Volumen hidrodinámico = • Útil para calibración universal,

da viscosidad intrínseca

DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA:• Universal, da masa, igual respuesta

(LALLS)

M n, M w

Visc. M n

HPLC 7 10/96 18

APLICACIONES DE GPC

• Separaciones de polímeros de alto peso molecular

• Caracterización de polímeros:Mn, Mw, Mz, polidispersión

• Limpieza de muestra: Remueve materiales de alto PM

HPLC 7 10/96 19

0 10 20 30 402

Buen polímero

Mal polímero

APLICACIONES DE GPCCONTROL DE CALIDAD RÁPIDO

HPLC 7 10/96 20

SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE POLÍMEROS

15 20 25 30 35

Tiempo de elución [min]

Muestra:1. Irganox 10102. DSTDP3. Irganox 10764. Estearamide5. Desconocido6. Tinuvin 3277. BHT

Columna: G2000 H87.5 mm ID x 60 cm x 2

Eluente: TetrahidrofuranoFlujo: 1.6 ml/minCaida Presión : 54 kg/cm2

Detector: RITemp.: Ambiente

HPLC 7 10/96 21

GPC DE ALTA RESOLUCIÓNC36 C28

30 40 50 60 70 min

MUESTRA: n-ParafinasCOLUMNA: SHODEX a-802 x 4, 2mELUENTE: THFFLUJO: 1 ml/minPRESIÓN: 48 kg/cm2

DETECTOR: IR

HPLC 7 10/96 22

PROPIEDADES FÍSICAS•Número PM promedio cristalinidad, flujo,

compresión

•Peso PM promedio fuerza (tensil, impacto)resistencia

•z PM promedio elongación, flexibilidad

•Z+1 PM promedio “die swell”

HPLC 7 10/96 23

VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC :TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA

A. Incremente la Temperatura para mejorar:- Solubilidad de la muestra- Eficiencia de la columna- Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor

viscosidad)- Carga de muestra (solubilidad incrementada)

B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad - Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm;

VR y HETP se degradan a valores mayores

Intervalo PM Concentración Max [%wt./vol.]a 20K 0.25

34K a 200K 0.10400K a 2,000K 0.05

Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507

HPLC 7 10/96 24

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN RESUMEN

•DOS TIPOS:GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles

HidrofílicosGPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno

•MECANISMOSeparación por tamaño (PM)

•CURVA DE CALIBRACIÓNCorrelaciona PM y Volumen de Elución

•DISOLVENTEDebe disolver al polímero

HPLC 9A 10/96 1

EFECTO DE PARÁMETROS HPLC EN CROMATOGRAFÍA

1. Flujo2. Polaridad de fase móvil3. pH4. Tamaño de muestra5. Dimensiones de

Columna:largo, D.I., dp

k’NR

HPLC 9A 10/96 2

1. tR es inversamente proporcional a vdoble v, corta a la mitad el tR

2. k’ es independiente de vdoble v, corta a la mitad el tR y tM

3. es independiente de v4. N, la ecuación de Van Deemter

relaciona v con HETP o la eficiencia de columna:

Flujos bajos, más platos5. RS = función de k’, y N

En este caso, RS aumenta y v disminuye

FLUJO (v)

HPLC 9A 10/96 3

POLARIDAD DE LA FASE MÓVIL1. tR - FASE NORMAL -

Más polar, elución más rápida y, tR más cortoFASE REVERSA -

Más polar, elución más lenta, tR más largos2. k – se comporta como tR

FASE NORMAL – Más polar, k’ disminuyeFASE REVERSA – Más polar, k’ aumenta

3. – más difícil : En primera aproximación, independientede tR pero una fase móvil diferente afecta

4. N - En HPLC, menor tR,ligeramente mayor N ;

5. RS - Como k’ aumenta, RS aumenta :2 to 5

HPLC 9A 10/96 4

EFECTO DEL pH• Principio de Le Chatelier : HA H+ + A-

• pH afecta el equilibrio de ácidos débiles (HA) o bases débiles(B)• pH no afecta a neutros o ácidos fuertes• pH puede afectar a la muestra y al empaque

1. FASE NORMAL – Debe ser usada para moléculas neutras y semi-polares; pH no es un factor relevante.

2. FASE REVERSA – Si aumenta el pH, HA más ionizado, tR más largos, coleo. Si aumenta el pH, B menos ionizado, tR más cortos, picos más simétricos.

3. INTERCAMBIO IÓNICO – El pH es un factor crítico.Recuerde – Si el pH afecta tR, se trata de un HA o B.

HPLC 9A 10/96 5

TAMAÑO DE MUESTRA•Cada columna tiene una capacidad limitada; si se excede

ese límite y tR disminuye, la forma de pico empeora.•Solución – diluya la muestra 1/10 y re-analice.•Todos los resultados cromatográficos pueden cambiar.

100 mg25 mg

HPLC 9A 10/96 6

DIMENSIONES DE COLUMNA :Largo

• Se debe asumir que la presión se incrementa al incrementar el largo para mantener v.

• La presión requerida es proporcional al largo:doble largo doble presión.

• Si se duplica el largo de la columna :

1. tR - duplica 2. k - sin efecto

3. - sin efecto 4. N - duplica

5. RS - 2 = 1.41 = 40% aumento

HPLC 9A 10/96 7

DIMENSIONES DE COLUMNA: I.D.• Dimensiones :

4 o 4.6 mm I.D. - normal3, 2 o 1 mm I.D. - disponible0.53 o 0.32 mm - capilar empacado

• El flujo volumétrico [ml/min] es proporcional al cuadrado del radio (i.e. área) :

4 mm - 1 ml/min2 mm - 0.25 misma velocidad lineal (v) 1 mm - 0.06

• tR, k’, , N y RS son independientes de DI si la columna está bien empacada.

• Pero menor DI. : 1. Menos disolvente (barato)2. Mejor sensibili. - A = cl (Lambert-Beer)

Si la muestra es limitada

HPLC 9A 10/96 8

1. tR, k y - independientes de dp

2. N inversamente proporcional a dp :la mitad de dp, doble N

3. RS aumenta con N, 40% aumento

DIMENSIONES DE COLUMNA :Diámetro de partícula (dp)

•5 y 10 m son normales•3 m disponibles y ganando aceptación•Partículas más pequeñas generan mejores

columnas(N y R) pero aumentan la presión, por lo que largos mayores no son posibles.

HPLC 9A 10/96 9

dp [m] p Largo [cm] tR [min]10 1,000 25 105 4,000 25 10

Reduzca el largo para reducir presión y mantener: N = 12,500

HPLC 9A 10/96 10

dp [m] p Largo [cm] tR [min]

10 1,000 25 105 2,000 12.5 52 5,000 5 2

Asumiendo N = 12,500 ; h = 2.0

Partículas más pequeñas más eficientes pero mayor caída de presión

dp2 ; p Lc

HPLC 9A 10/96 11

COMO AUMENTAR LA RETENCIÓN1. COLUMNAS LARGAS (k’ no cambia)2. FLUJOS MENORES (k’ no cambia)3. FASE MÓVIL MÁS DÉBIL

• Fase normal - Menos polar• Fase reversa - Más polar (H2O)

4. MAS FASE ESTACIONARIA• Sílica gel - Más área superficial• Fase reversa - RP-18 en lugar de RP-8

5. INCREMENTAR EL COEFICIENTE DE PARTICIÓN• Mayor solubilidad en fase estacionaria• Menor temperatura en la columna.

HPLC 9A 10/96 12

COMO DISMINUIR ENSANCHAMIENTO

•1. USE UNA COLUMNA MEJOR EMPACADApartículas chicas, empacado compacto

•2. OPTIMICE EL FLUJO•3. REDUZCA EL TAMAÑO DE MUESTRA

para evitar sobrecarga•4. REDUCCIÓN DE VOLUMEN MUERTO

usar conexiones de volumen muerto bajo•5. REDUCIR LA CONSTANTE DE TIEMPO

HPLC Method Development 8/96 1

DESARROLLO DE MÉTODOS HPLC

1. ¿SE PUEDE DISOLVER LA MUESTRA?

2. ¿SE PUEDE HACER EL ANÁLISIS POR HPLC?

3. SI, ¿CON QUE DETECTOR?

4. ¿QUÉ TIPO DE COLUMNA?LSC o RP o IE o SEC?

5. ¿QUÉ COLUMNA?fase estacionaria, largo, DI, dp.

6. ¿QUÉ FASE MÓVIL?polaridad, pH, fuerza iónica.

¿SE PUEDE DISOLVER LA MUESTRA?

1. DESEABLE – solución al 1% en un solvente débil.Pruebe con hexano, metanol, agua

2. ÁCIDO O BÁSICO (¿sal?)0.01 N HAc - pH ~ 3.40.5 N NH4OH - pH ~ 10.6

3. ALGUNOS polímeros deben ser calentados polietileno-tolueno 120° C

¿SE PUEDE ANALIZAR POR HPLC?1. Si es soluble en hexano, pruebe una columna corta y rápida,

5 o 10 cm de silica gel, 2 ml/min acetonitrilo. Si salen picos de la columna baje la fuerza del solvente hasta k’ = 5.

2. Si es soluble en metanol, trate con fases químicamente unidas, bien sea fase normal o reversa.

3. Si es soluble en agua:no-iónico: 5 o 10 cm RP-18, 2 ml/min MeOH (o acetonitrilo).iónico: pruebe ambas SCX y SAX

4. Dependiendo de lo que se busque con el análisis: Pruebe SEC.Seleccione el tamaño de poro basado en PM.

4. Si no salen picos después de 1-4 minutos, no será fácil de analizar por HPLCPuede haber problemas de detección.

SI SÍ, ¿CUÁL DETECTOR?1. UV/VIS (PDA) primera elección.

Obtenga un espectro para definir max.UV disponible, costo moderado, uso ~ 80%No es universal, pero provee buena sensibilidad.

2. IR segunda elección. Universal, detecta todos los compuestos, no es sensible (± 10 ppm). Estándar en GPC.

3. LC/MS, mejor elección.Sensible e universal, muy caro, no muy común.

4. Los detectores de fluorescencia y electroquímico ambos son sensibles y selectivos: los recomendables si se sabe que responden a los analitos.

¿QUÉ TIPO DE COLUMNA?MUESTRA

MW > 1500 MW > 1500

SOLUBLEEN AGUA

SOLUBLEEN ORGÁNICO

GFC GPCSOLUBLEEN AGUA

SOLUBLEEN ORGÁNICO

SOLUBLEHEXANO

SOLUBLEMETANOL

NO-ELECTROLITO

ELECTROLITOS

LSC BCP -NP BPC-RP BPC-RP(SPECIAL)

IEC IPC

¿CUÁL COLUMNA? 1. Escoja de un fabricante confiable.

Pregunte a colegas, llame por teléfono.2. Si es soluble en hexano, muestra no polar. Pruebe:

A. sílica gel–disponibles, baratas, pH 2-8B. alúmina–pH 1-12, más débil que sílica gelC. Fases unidas ciano–pH 2-8, mas versátiles que sílica gel,

solventes más polares.3. Si es soluble en metanol:

A. RP- 18 or ODS–estándar B. RP- 8 más rápida, un poco más eficienteC. Fenil–no muy empleada

4. Si es soluble en agua:A. SCX vs. WCXB. SAX vs. WAXC. Cromatografía de pares de iones

PARÁMETROS DE COLUMNA1. LARGO

A. Empiece 15 cm., 5µ dp.B. Largos mayores, más platos, lentas

N L; tR L2. DIÁMETRO DE PARTÍCULA

10 y 5 µm más comunes, robustoPartículas menores, más platos, mucha más presión (siguiente tabla).

3. DIÁMETRO INTERNO:Si está bien empacada, y mismo dp, R, d, N, tR casi independientes de DI4 mm est. ~ 1 ml/min2 mm–disponible ~ 250 µl/min1 mm–microbore – muy raraCapilares empacados–solo para LC/MS

PARÁMETROS BÁSICOS DE COLUMNA

L (cm) dp (µm) N tR (min) ²P (psi)

25 10 10,000 10 1,000 25 5 20,000 10 4,000 15 5 12,000 6 2,40010 5 8,000 4 1,600

Asume: N L; P L; N 1/dp; h = 2.5; p 1/dp2

¿QUÉ FASE MÓVIL?1. Empiece con un solvente fuerte, un flujo alto

(¡obtenga picos!).Reduzca la fuerza del solvente hasta k ~ 5.

2. Mida de los picos importantes.Optimice si es necesario – si no FÁCIL.Pruebe diferentes disolventes, use Lab. Seco

3. Incremente N.Flujos lentos, menos muestra, más temperatura.Largos mayores, partículas menores.

VARIOS

1. La muestra debe ser soluble en la fase móvil, soluciones diluidas, volúmenes mayores si es necesario.

2. SIEMPRE filtre la muestra y los bufferes.

3. Con temperaturas bajas en la columna (40° C) por lo general N , , R son difíciles de predecir.

4. pH afecta a la muestra (si HA o B) y a la fase estacionaria

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