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CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDOS
PLANAR COLUMNA
IEC SEC
FLUIDO SUPERCRÍTICO
BPC
TLC PC
GASES
GSC GLC
LSC
BPC-NP GPC GFC BPC-RP
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO-SÓLIDO (LSC)
• Principio: Adsorción de los analitos en la superficie polar, ligeramente ácida de la sílica gel.
• F.E.: Sílica gel (pH 2-8); Alúmina (pH 2-12).• F.M.: Disolventes no-polares como hexano,
CHCl3 (en raras ocasiones agua).• Aplicaciones: Para muestras no-polares y
semi-polares; solubles en hexano; isómeros posicionales.
CROMATOGRAFÍA DE FASE QUÍMICAMENTE UNIDA (BPC)
• Ambas fase normal (F.N.) y fase reversa (F.R.)• Principio: F.R. – Estructura hidrofóbica
responsable de la partición del analito entre la superficie hidrofóbica y metanol (no agua).
• F.E.: Superficies hidrofóbicas en sílica gel -RP-18, RP-8, ODS.
• F.M.: Metanol o acetonitrilo y agua.• Aplicaciones: Compuestos solubles en agua o
metanol, proteínas, péptidos, azúcares, ácidos grasos, fármacos.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (IEC)
• Principio: Adsorción reversible de iones en F.E. Con grupos funcionales de cargas opuestas.
• F.E.: Para cationes - SO32- , CO3
2-
• Para aniones - NH4+, NH3
+
• F.M.: Buffer acuoso con pH y fuerza de buffer cuidadosamente controlados.
• Aplicaciones: Todos los compuestos ionizados, aniones, cationes, azúcares, ácidos carboxílicos, aminas, etc.
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (GPC)
• Principio: Los poros internos de la F.E. excluyen a los analitos solvatados en función de su volumen hidrodinámico. VR se correlaciona con P.M. por calibración.
• F.E.: Estireno, 8% DVB-con diámetros de poro de 80, 100, 150, 300, 500 o 1000 Ao.
• F.M.: Un buen disolvente de polímeros, las mas de las veces Tolueno o THF.
• Aplicaciones: Polímeros orgánicos, poliestirenos, polietilenos, metacrilatos.
HPLC COLUMNA
FASES ESTACIONARIAS Sílica gel - LSCRP-18 - BPCStyragel - SEC
FASE MÓVIL
FASE ESTACIONARIA
COLUMNA CROMATOGRÁFICA: ESQUEMA
Flujo por gravedadSin presión
Muestra
Adsorbente
Columnavidrio
Solvente
Componentesde la muestraseparados
A B
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Detector
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High Performance Liquid Chromatograph
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COLUMNA CROMATOGRÁFICA
VENTAJAS LIMITACIONES
• Barato • Lento
• Simple • Baja Resolución
• Buen Método Prep. • Cuantitativo difícil
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA PRESIÓN: ESQUEMA
Reservoriode disolvente
Bomba
Medidor de presiónInyector
Columna Detector
Desecho
Registrador
Sistema de Datoso Integrador
UN CROMATOGRAMA TÍPICO
.Tiempo de retención (tr)
R )
Área de picoAlturade pico
“pico” delsolvente
Inyección
Res
pues
ta d
el d
etec
tor
Línea Base
Tiempo
• Velocidad - Minutos
• Alta resolución
• Alta precisión
• Alta sensibilidad : 10-9 a 10-12 g
• Sistemas automatizados
VENTAJAS DE HPLC
ANÁLISIS DE PPB DE AFLATOXINAS
Aflatoxinas en mantequilla de maní;Detección por fluorescencia
1. Aflatoxina B1 5 ppb2. Aflatoxina G 1 1 ppb3. Aflatoxina B2 3 ppb
4. Aflatoxina G 2 1 ppb
1
243
0 10 20 30 minutos
ANÁLISIS RÁPIDOS POR HPLC
•
0 5 10
(PARTÍCULAS PEQUEÑAS, COLUMNAS CORTAS, FLUJO ALTO)
COLUMNA : 3 cm3M ODS
FLUJO : 3.5 ml / min
URACILO
FENOLNITROBENCENO
TIEMPO ( SEG )
HPLC DE ALTA RESOLUCIÓN
ORINA HUMANA1 columna, elución por pasos, 65.5 hrs
SEPARATION OF URINE BY ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHYReprinted by permission of Dr. P.B.Hamilton(Handbook of Biochemistry, Selected Data for Molecular Biology, B-47, CRC Press, Cleveland, 1968)
LC ALTA RESOLUCIÓN, RÁPIDA
"HPLC of Naturally Occuring Xanthones", K. Hostetman & H.M. McNair,J. Chromatogr,. 116 (1976) 201.
N = 3200L = 250 mmH = 0.078 mmRS = 4
0 1 2 3 4 5Time [min]
12
3
O
O
MeO
OMe OMe
OMe
O
O
MeO
OMe
OMe
O
O
MeO
OMe OMe
OMe
OMe
1
2
3
• Instrumentación Costosa• Requiere Capacitación: 6-12 meses• No existen detectores universales /sensibles• Consumibles caros• Requiere de espectroscopias para confirmación
LIMITACIONES DE HPLC
.
VERSATILIDAD DE HPLC
DROGAS
VITA MINAS
VENTAJAS DE HPLC• RÁPIDA – Usa partículas pequeñas y columnas
cortas.• ALTA RESOLUCIÓN – N alta, muchas formas de
aumentar , muchos tipos de columnas.• VERSÁTIL – ¡si la muestra se puede disolver, se
puede separar por HPLC! BUENOS ANÁLISIS CUANTITATIVOS – ~1 - 2% RSD• FÁCIL DE ESCALAR – columnas gruesas, muestras
mas grandes y colectores de fracciones.
VENTAJAS DE CG• MAS ALTA RESOLUCIÓN – Columnas capilares
N=400,000.• RÁPIDA, CUANTITATIVA y FÁCIL DE USAR.• COSTO MODERADO - ~$15K – probablemente
el método instrumental mas empleado.• BUENA SENSIBILIDAD – Análisis de trazas.• NO MUY VERSÁTIL – Sólo volátiles.
ANÁLISIS CUALITATIVO (1)
• Técnicas auxiliares (MS, IR, UV-VIS, NMR) permiten una identificación positiva
Tiempo de retención (tr)
Inyección
Tiempo
Seña
li
Cafeina
Teofillina Teobromina
"X"
ANÁLISIS CUALITATIVO (2)
1. Estándar
2. Desconocido
tR(teofilina) = tR(“X”), entonces se sugiere que “X” es teofilina.Para una identificación absoluta se requiere de confirmación por, LC-MS
LC / ESPECTRÓMETRO DE MASASEspectrómetro de masas
Sistema de datos
Espectro de masasMuestra enriquecida
AlVacio
Solvente
Muestra
Efluente de LC
ANÁLISIS CUANTITATIVOSe
ñal
Tiempo
Área depico : Apico: h
Altura de
SÍNTESIS DE EMPAQUES
• La formación de un enlace covalente entre la sílice y la fase proporciona estabilidad térmica y previene la hidrólisis.
Si OH Si O Si
OH
OH
C18
Si C18
H2O
Cl3
+ 3 HCl
Partícula de soporte de sílica Enlace covalente
HPLC con FQU (BPC)
• FASE NORMAL
• Adsorbentes polares: -CN, -NH
• Solventes no-polares: iso-octano, cloruro de metileno
• Muestras no-polares y semipolares
• FASE REVERSA
• Adsorbentes no-polares: RP-18 (ODS), RP-8 (Octil)
• Solventes polares: agua, metanol, acetonitrilo
• Muestras tanto polares como no-polares
EMPAQUES PARA HPLC (1)
REVERSED-PHASE (AND ION-PAIR) METHOD a
C-18 (octadecyl or ODS) Rugged; highly retentive; widely available
C-8 (octyl-) Similar to, but slightly less retentive, than C-18
C-3, C-4 Less retentive; used mostly for peptides and proteins
C-1 (trimethyl-silyl, TMS) Least retentive; least stable
Phenyl Moderately retentive; some selectivity differences
CN (cyano) Moderately retentive; used for both reversed- and normal-phase
NH2-(amino) Weak retention; used for carbohydrates; less stable
Polystyreneb Stable with 1 < pH < 13 mobile phases;better peak shape and longer column life for some separations
NORMAL-PHASE METHOD a
CCN- (cyano) Rugged; fairly polar; general utility
OH- (diol) More polar than CN-
NH2- (amino) Highly polar; less stable
Silicab Very rugged; cheap; less convenient to operate; used in prep LC
EMPAQUES PARA HPLC (2)
SIZE-EXCLUSION METHOD a
Silicab Very rugged; adsorptive
Silanized silica Less adsorptive, wide solvent compatibility;with organic solvents
OH- (diol) Less stable; used in aqueous SEC (gel filtration)
Polystyreneb Used widely for organic SEC (GPC); incompatible with highly polar solvents
ION-EXCHANGE METHOD a
Bonded-phase Less stable and reproducible
Polystyreneb Less efficient; stable; more reproducible
aSilica-based bonded phases, except as noted.bNo bonded phase on these packings.
L.S. Snyder, J.L. Glajch and J.J. Kirkland, "Practical HPLC Method Development",J. Wiley (1988) 80-105.
Inyección
tM
t'R(A)
tR(A)
t'R(B)
tR(B)
Pico de unsoluto no retenido
Soluto A Soluto B
t
TIEMPO
PARÁMETROS DE RETENCIÓN
t'R(A) = tR(A) - tM
K´(A) = t'R(A) / tM
t = tR(B) - tR(A)
Inyección
tM
t'R
tR
W h
Wb
PARÁMETROS DE EFICIENCIA
• Platos teóricos :
• Altura de plato :
HETP H Lc
N
N 16 tR
wb
2
5.545 tR
wh
2
Inyección
tMt'R(A)
t'R(B)
Soluto A Soluto B
TIEMPO
SELECTIVIDAD EN HPLC
mayor de 1.2 es el valor aceptable
=t’R(B)
t’R(A)
kR(B)
kR(A)
=
FACTOR DE RETENCIÓNFACTOR DE CAPACIDAD k´ = t´R / tO
o 1 2 3 4
t =10 t' =1R
k´ = 2 k´ = 3
Solvente
Tiempo (min)• k´ en el intervalo de 2 a 10• Nota: k´ Inversamente proporcional • a la fuerza del solvente
k´ = 1
EFICIENCIA vs SELECTIVIDAD
REFERENCIA
EFICIENCIA INCREMENTADA (>N)MISMA SELECTIVIDAD (
SELECTIVIDAD INCREMENTADA (>)MISMA EFICIENCIA (N)
RESOLUCIÓN:CAPACIDAD, SELECTIVIDAD Y EFICIENCIA
t
Wb(1) Wb(2)
RS t
12 Wb(1) Wb(2)
Wb Wb
ECUACIÓN MAESTRA DE LA RESOLUCIÓN
• LA RESOLUCIÓN (RS) ES UNA FUNCIÓN DE TRES FACTORES
CAPACIDAD SELECTIVIDAD EFICIENCIA
41
'1' Nk
ksR
HPLC 2 10/96 1
Cromatografía de alta presión: esquema
Reservoriodesolventes
Bomba
Medidor depresión
Inyector
ColumnaDetector
Desecho
Registrador
Sistema de datoso integrador
HPLC 2 10/96 2
PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL
• Disuelve la muestra
• k' de 2-10
• Alta pureza
• Costo, viscosidad, toxicidad, punto de ebullición
HPLC 2 10/96 3
SISTEMAS DE SOLVENTES TÍPICOS
•FASE NORMAL – hexano, cloruro de metileno, cloroformo, metanol, acetonitrilo
•FASE REVERSA - metanol/agua,acetonitrilo/agua
•INTERCAMBIO IÓNICO - buffer acuoso
•PERMEACIÓN EN GEL - tetrahidrofurano,tolueno, cloroformo
HPLC 2 10/96 4
FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL
A VACÍO
DISOLVENTE
FILTRO DE 2m
HPLC 2 10/96 5
RAZONES PARA FILTRAR
FUGAPARTÍCULA
VÁLVULA CHECK
PARTÍCULA
ARAÑAZOS
PISTÓN
BOMBA
• Filtrar el disolvente es esencial en HPLC!
HPLC 2 10/96 6
FILTRACIÓN DE LA MUESTRA
Filtro
Émbolo
10ml jeringa
0.5 m Filtro
Malla desoporte
HPLC 2 10/96 7
REQUISITOS DE LAS BOMBAS
1. Químicamente inerte
2. Alta presión (5,000 PSI)
3. Flujos (0.5 - 10 ml/min)
4. Libre de pulsos o amortiguada
5. Reproducibilidad de flujo <1.0%
6. Gradiente, cambio rápido de disolvente
HPLC 2 10/96 8
Materiales de construcción /compatibilidad con disolventes• Completamente resistentes:
Teflón, Rubí, Zafiro, Cerámica, Tefzel, Kalrez, Fluoraz
• Resistencia limitada:Acero Inox. 316 – Cloruros acuosos ácidosPEEK – Ácidos nítrico o sulfúrico conc.Kel-F – disoluciones de THF, hidrocarburoshalogenados Acetal – Ácidos o bases fuertes
HPLC 2 10/96 9
TIPOS DE BOMBAS
• Pistón reciprocante (las más comunes)
• Pistón reciprocante de doble cabeza
• Bombas de jeringa (más empleadas en SFC y micro HPLC)
HPLC 2 10/96 10
Bombas de pistón reciprocanteReservorioexterno
Motor
ValvulasCheck
Pistón
Cámarahidráulica
Cam
HPLC 2 10/96 11
Bombas de pistón reciprocante de doble cabeza
• Mejor estabilidad de flujo que las de una cabeza...• ...produce una línea base más estable
HPLC 2 10/96 12
VALVULAS CHECK DE HPLC
Válvula de bola de salida
Válvula de bola de entrada
Pistón
A la columna
Del reservorio
HPLC 2 10/96 13
BOMBAS DE PISTÓN RECIPROCANTE
VENTAJAS
• Baratas
• 6000 psi
• Reservorio externo
• Diseño mecánico simple
LIMITACIONES
• Ruído de pulso
• Mantenimiento, sello de las válvulas
HPLC 2 10/96 14
BOMBAS DE JERINGA
MOTOR
PISTÓN
GUÍA Y ENGRANE
SELLOS
DISOLVENTE
HPLC 2 10/96 15
20
16
12
8
4
0
0 1 2 3 4 5 6 7
20
16
12
8
4
0
0 1 2 3 4 5 6 7
% S
olve
nte
B
% S
olve
nte
BTIEMPOTIEMPO
ELUCIÓN ISOCRÁTICA vs. GRADIENTE
• En HPLC Isocrático, la composición de la fase móvil permanece igual durante el análisis
• En HPLC Gradiente, la fuerza de la fase móvil se incrementa con el tiempo de análisis.
HPLC 2 10/96 16
1
2
34 5
6
7
0 20 40 60 80 min 0 20 40 60 80 min
1
2
3
4 5
6
7
COMPARACIÓN DE ELUCIÓN ISOCRÁTICAY GRADIENTE
ELUCIÓN ISOCRÁTICA ELUCIÓN GRADIENTE
BIFENILOS CLORADOS
50% Metanol50% Agua
20% MeOH / 80% H2Oa
75% MeOH / 25% H2O
HPLC 2 10/96 17
FORMACIÓN DE GRADIENTES A ALTA PRESIÓN
Bomba
Bomba
Programador
A
B Bomba
Programador
Bomba40:60 90:10
0.4 ml/min
0.6 ml/min
0.9 ml/min
0.1 ml/min
CámaraMezclado
De 40%A - 60%B a 90%A - 10%B
HPLC 2 10/96 18
FORMACIÓN DE GRADIENTES A BAJA PRESIÓN
A B C
Reservorios de disolventes
Programador Válvula Multipuertos
Cámara deMezclado
A LA BOMBA DE HPLC
HPLC 2 10/96 19
OPERACIÓN VÁLVULA DE INYECCIÓN
CARGA INYECCIÓN
DE LA BOMBA
A LA COLUMNA
RIZO DEMUESTRA
JERINGA
HPLC 2 10/96 20
ARREGLO DE PRE-COLUMNA Y GUARDA-COLUMNA
VÁLVULADE
MUESTREO
GUARDA-COLUMNA
COLUMNAANALÍTICA
DETECTOR
PRECOLUMNA
BOMBA
HPLC 2 10/96 21
CONEXIONES PARA HPLC
UPCHURCHWATERS
SWAGELOK
PARKER
VALCO
RHEODYNE
"X"
Distance "X" is critical i n obtaininga low-volume, leak-free seal...
...and varies greatly from onemanufacturer to another.
1. "X" is too long: leaks inevitable2. "X" is too short: adds to extracolumn volume
1. 2.
.130
.090
.090
.090
.080
.170
WATERS UPCHURCH PARKER
WATERS UPCHURCH PARKER
SWAGELOK VALCO RHEODYNE
.320 .250 .210
HPLC 2 10/96 22
CONSTRUCCIÓN DE COLUMNASDEL
INYECTOR2 m FRITADO
POROSO
• LARGO: 3, 5, 10, 15, 25, cm• I.D.: 4 or 4.6 mm• ACERO INOXIDABLE• partículas 3, 5, 10 m
AL DETECTOR
HPLC 2 10/96 23
COLUMNAS CARTUCHO
CARTUCHO
HPLC 2 10/96 24
LC ANALÍTICA vs. LC SEMI-PREP
MUESTRA :0.1 mg in 10 µl 50 mg in 2 ml
COLUMNA :4.6 x 150 mm 10 x 250 mm
FLUJO :1 ml/min 10 ml/min
DETECTOR :Alta sensibilidad, PDA Baja sensibilidad, RI
ANALÍTICA SEMI-PREPARATIVA
HPLC 2 10/96 25
CONTROL DE TEMPERATURA EN HPLC
• TERMOSTATADO DE COLUMNA – Áreas de pico y tiempos de retención más reproducibles.
• CALENTAMIENTO DE COLUMNA :1. Menor viscosidad, menos presión.2. Menor coleo de pico, desorción más rápida.3. Usualmente menor selectividad.
HPLC 2 10/96 26
EFECTO DEL CONTROL DE TEMPERATURA EN LA SEPARACIÓN
40°C
65°C
0 5 10 min
HPLC 2 10/96 27
DETECTORES DE HPLCDETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) • Longitud de onda fija• Longitud de onda variable • Arreglo de diodos
INDICE DE REFRACCIÓN
FLUORESCENCIA
ELECTROQUÍMICA
MS / FTIR / Conductividad/MS
HPLC 2 10/96 28
SISTEMAS DE DATOS
INTEGRADORES. Fácil de usar
. Precio moderado
COMPUTADORA. Flexible, poderosa
. Cara
1.235
1.235
1.235
1.235
1.235
HPLC 2 10/96 29
CROMATOGRAMA DE INTEGRADOR
RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11 SAMPLE# 2AREA% RT AREA TYPE WIDTH AREA% 1.235 22353 VB .060 .16530 1.679 10700 BB .105 .07913 3.197 1761694 PV .095 13.02755 3.289 821053 VB .077 6.07160 4.315 690054 BB .120 5.10288 5.540 639889 BB .157 4.73191 6.235 31558 BB .196 .23337 11.075 9545536 BB .338 70.58825
TOTAL AREA=1.3523E+07MUL FACTOR=1.0000E+00
* RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11
START
1.2351.679
3.1973.289
4.315
5.5406.235
11.075
STOP
HPLC 2 10/96 30
VALORES TÍPICOS PARA HPLCCOMPONENTE VALOR TÍPICO INTERVALOEMPAQUE
Tamaño partícula 10 y 5 m 3 - 10 mTamaño de poro 80 y 100 Å 60-120 Å, hasta 4,000 Å
COLUMNADiámetro Int. 4.6 mm 2 - 5 mmLargo 15 y 25 cm 3 - 30 cm
BOMBAPresión 1500 psi 800 - 5000 psiFlujo Volumétrico 1 ml/min 0.5 - 2 ml/minFlujo lineal 0.1 cm/sec 0.05 - 0.2 cm/sec
MUESTRAVolumen 20 l 2 - 100 l Concentración 0.1 % 1 ppm - 1 %
DETECTORVolumen de celda 5 l 2-15 l to 200 l Constante de tiempo 50 msec 25 msec - 1 sec
1
2
SELECCIÓN DE COLUMNAS
MUESTRA
MW > 1500 MW < 1500
SOLUBLEAGUA
SOLUBLEORGÁNICO
GFC GPC
SOLUBLEAGUA
SOLUBLEORGÁNICO
SOLUBLEHEXANO
SOLUBLEMETANOL
NO-ELECTROLITOS ELECTROLITOS
LSC BPC-NP BPC-RP BPC-RP(ESPECIAL)
IEC IPC
3
LSC : CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
SÍLICA GEL 94%
ALÚMINA 3%
CARBÓN 1%
FLORISIL 2%
4
SÍLICA GEL
A. MACROPOROSAIRREGULAR
B. PELICULARESFÉRICA
C. MICROPOROSA
IRREGULAR
ESFÉRICA
50 - 100 m 37 - 44 m 5 - 10 m
Esfera devidrio
SílicaPorosa
5
USOS DE EMPAQUES LSC
USOS PREPARATIVOS YANALÍTICOS
• MUY EFICIENTE• ALTA CAPACIDAD• ALTA VELOCIDAD• EMPAQUE DIFÍCIL• CAROS
MACROPOROSA PELICULAR MICROPOROSA
SEPARACIONES PREPARATIVAS
• ALTA CAPACIDAD• EMPACADO SENCILLO• BARATOS• BAJA EFICIENCIA
GUARDA-COLUMNAS
• EFICIENTES• EMPACADO SIMPLE• CAROS• BAJA CAPACIDAD
6
LSC : EFECTO DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA
5 m 10 m 20 m
TIEMPO ANÁLISIS 1 minuto 1 minuto 1 minutoPLATOS 6000 4800 3000PRESIÓN 3000 psi 900 psi 500 psi
7
LSC : PRINCIPIO SEPARACIÓN
• Adsorción del analito en sitios polares (silanoles) debido a puentes de hidrógeno Diferencias en afinidad de adsorción resulta en separación
1. Los analitos más polares se retienen más2. Los analitos con un mayor número de
grupos funcionales polares se retienen más .
3. Isómeros posicionales se separan usualmente en el órden p>m>o.
8
SUPERFICIE DE LA SÍLICA GEL
La superficie de la sílica gel es inhomogenea, conformada por diferentes grupos funcionales :
Silanol Normal Puente SiloxanoInerte
Sitio activo"hot spot"
Si
OH
Si O Si
O
Si O Si
O OH H
– +
9
LSC: MECANISMO DE ADSORCIÓNSilanoles Superficiales
Polímero deSílica Gel Amorfo
Las interacciones con analitos se basan en la polaridad del analito y la esteroquímica.
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
SiO
Si Si
O O O O O O
O O O O O O OSi
O O O O O OO O
Si
Si Si Si Si Si Si
O O OH HH
n
OH
O O
10
EFECTO DE POLARIDAD DEL SOLVENTE
100 % HEXANO ELUCIÓN LENTA(No - Polar)
90 % HEXANO, 10% CH2Cl2 RÁPIDA(Mas Polar)
70 % HEXANO, 30 % CH2Cl2 MAS RÁPIDA(Mas Polar)
• Fases móviles más polares desplazan la muestra más rápido
1 2
3
1 2
3
321
11
SOLUBILIDAD DE LA SÍLICA GELEN AGUA.
1 5 10
200
100
pH
02 3 4 6 7 8 9
12
PROBLEMAS DE LA SOLUBILIDAD DE LA SÍLICA GEL
1. A pH >7.5, use una pre-columna para saturar la fase móvil.
2. La adición de solventes orgánicos incrementa el pH; por cada 10% de incremento en el contenido orgánico, el pH se incrementa 0.2 unidades.
3. Incrementos en la fuerza iónica de la fase móvil incrementan la solubilidad.
13
LSC - SÍLICA GEL : RESUMEN• SÍLICA GEL ES: Amorfa, totalmente porosa, polar,
y ácida.
• LAS PARTÍCULAS SON: Macroporosas, peliculares, y microporosas.
• LOS DISOLVENTES USADOS SON: Hexano, cloruro de metileno, cloroformo y metanol.
• Las partículas pequeñas permiten la mayor eficiencia.
• Los puentes de hidrógeno permiten una retención selectiva.
• Los isómeros estructurales pueden ser separados por LSC.
14
ECUACIÓN MAESTRA DE RESOLUCIÓN
CAPACIDAD SELECTIVIDAD EFICIENCIA
• LA RESOLUCIÓN ES FUNCIÓN DE TRES FACTORES.
41
'1' Nk
ksR
15
LSC DESARROLLO DE MÉTODOS - 1
k’ (k’ / 1+k’)0 00.5 0.331.0 0.502.0 0.675.0 0.8310.0 0.91infinito 1.00
• Ajustar la polaridad del solvente para producir 2 < k’ <10.
41
'1' Nk
ksR
0 2 4 6 8 100
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
k’ = factor de capacidad=t’RtO
k’
1+k’( )
k’
16
selectivity t'R (2)t'R(1)
LSC DESARROLLO DE MÉTODOS -2
1.00 01.01 0.011.05 0.051.10 0.091.20 0.171.50 0.33
• Para maximizar selectividad
1. Cambie los disolventes
2. Optimice el material de empaque
3. Cambie el material de empaque
1
Rs k
1 k
1
N4
17
LSC DESARROLLO DE MÉTODOS - 3
100 2.5200 3.5300 4.3400 5.0500 5.6
• Para maximizar efieciencia
1. Use flujos más bajos2. Use una columna más larga3. Use columnas de mejor calidad4. Use columnas empacadas con partículas más chicas
N4N
Rs k
1 k
1
N4
18
1. Columna de 25 cm, 4 mm DI, sílica gel totalmenteporosa de 10 m (o 15 cm, 5 m. de tamaño de partícula)
2. Inyecte un estándar, usando un solvente polar a 2–3 ml/min
3. Si la elución es rápida: Si la elución es lenta:
ir a paso (4) pruebe con HPLC reversa4. Disminuya la polaridad del solvente hasta que 2<k’< 10.
OPTIMIZANDO COLUMNAS DE LSC - 1
19
5. Inyecte una muestra, mida Si > 1.2, ir a paso 6Si < 1.2:
A. Cambie la fase móvilB. Use una sílica gel más activa1. Reactiva o 2. Mayor área superficial
6. Si es necesario, optimice (incremente) eficiencia (N):
A. Flujos bajos C. Partículas mas chicasB. Columnas largasD. Columna nueva
OPTIMIZANDO COLUMNAS DE LSC - 2
Incrementando N
20
SÍNTESIS DE EMPAQUES BPC
• La formación de un enlace covalente en la fase produce una fase químicamente unida, térmica e hidrolíticamente estable.
Si OH Si O Si
OH
OH
C18
Si C18
H2O
Cl3+ 3 HCl
Partícula de soportedeSílica Enlace covalente
21
1. REACCIÓN QUÍMICAa. R Si Cl3 (polimérica)b. R2Si Cl2 (polimérica)c. R3Si Cl (monomérica)
2. HIDRÓLISISR–Cl + H2O ROH + HCl
3. TAPONAMIENTO DE EXTREMOS (END CAPPING)Si–OH + (CH3) 3–Si–Cl Si–O–Si–(CH3)3
PREPARACIÓN DE EMPAQUES BPC
22
EMPAQUES QUÍMICAMENTE UNIDOS FASE REVERSA:
Octadecilo -
Octilo -
FASE NORMAL:
Cianopropil -
Aminopropil -
Si CH3OSi
Si CH3OSi
Si CNOSi
Si NH2OSi
23
HPLC FASE REVERSA :EFECTOS DEL SOLVENTE
75 % MeOH / 25 % H2O RÁPIDO
60 % MeOH / 40 % H2O LENTO
50 % MeOH / 50 % H2O MAS LENTO
EL AGUA NO ES UN COMPONENTE ACTIVO!
24
MECANISMO DE FASE REVERSA
partícula soporte Fase unida no polar
Área Intersticial(fase móvil)
• Menos polar (más hidrofóbica) los analitos son más atraidos a la fase unida hidrofóbica...
• ...más hidrofóbica, pasa más tiempo asociado a la fase unida...
• ...y eluye más tarde. El solvente activo es metanol.
A - analito más polar
B - analito menos polar
A
A
AB
B
B
BB
B
B
B
A
A
A
A
25
OPTIMIZANDO COLUMNAS RP - 1
1. 25 cm, 4 mm DI, 10 µm (o 15 cm, 5 µm) RP-182. Inyecte un estándar, use 95 : 5 [Metanol : Agua] y flujo rápido3. Si es rápido: Si es lento:
ir a paso 4 pruebe HPLC de fase normal
41
'1' Nk
ksR
26
OPTIMIZANDO COLUMNAS RP - 2
4. Añada agua (+20%) hasta k’ ~ 55. Inyecte una muestra, mida y ajuste a > 1.2 cambiando la
composición de la fase móvil6. Si es necesario, optimice (incremente) eficiencia (N):
A. Flujo lento C. Partículas más pequeñasB. Columnas largasD. Una columna nueva
Incrementando N
41
'1' Nk
ksR
27
BPC – FASE NORMAL
MACROPOROSA PELICULARMICROPOROSA
Compuesto unido con una cabeza polar (PHG) :
• Material de soporte de Silica, todos los tipos• La fase unida consiste de un espaciador no polar con
una cabeza polar (PHG)• Los grupos ciano y amino son las cabezas preferidas• Se usan con fases móviles no polares• Los disolventes más empleados son el hexano, cloruro
de metileno y cloroformo
PHG
PHG
PHGPHG
PHG
PHG
PHG
PHGPHG
PHG
PHG
PHG
PHG
PHG
PHG
PHG
PHGPHG
PHG
PHG
PHGPHG
PHGPHG
PHG
PHGPHG
PHG
PHGPHG
PHGPHG
PHG
PHG
PHG
PHGPHG
PHG
PHGPHG PHG
PHG
PHGPHG
PHG
PHG
28
LC FASE NORMAL : EJEMPLO
DIAZEPAM
COMPUESTOSRELACIONADOS
COLUMNA:25 cm x 4.6 cmEmpaqueCianopropil
N
NO
Cl
CH3
29
RESUMEN DE BPC (RP Y NP)• PARTÍCULA SOPORTE: Sílica Gel
• FASE ESTACIONARIA: Covalentemente unida al soporte
• FASE REVERSA (RP):Variedad unida - Octadecilo (C-18, RP-18)
Octilo (C-8, RP-8)
Solventes empleados - Metanol, agua, acetonitrilo
• FASE NORMAL (NP):Variedad unida - Cianopropil (CN)
Aminopropil (NH2)
Solventes empleados - Hexano, cloruro de metileno, cloroformo
• Las fases químicamente unidas son los materiales mas empleados en LC.
30
EMPAQUES PARA COLUMNAS HPLC (1)REVERSED-PHASE (AND ION-PAIR) METHOD a
C-18 (octadecyl or ODS) Rugged; highly retentive; widely available
C-8 (octyl-) Similar to, but slightly less retentive, than C-18
C-3, C-4 Less retentive; used mostly for peptides and proteins
C-1 (trimethyl-silyl, TMS) Least retentive; least stable
Phenyl Moderately retentive; some selectivity differences
CN (cyano) Moderately retentive; used for both reversed- and normal-phase
NH2-(amino) Weak retention; used for carbohydrates; less stable
Polystyreneb Stable with 1 < pH < 13 mobile phases;better peak shape and longer column life for some separations
NORMAL-PHASE METHOD a
CCN- (cyano) Rugged; fairly polar; general utility
OH- (diol) More polar than CN-
NH2- (amino) Highly polar; less stable
Silicab Very rugged; cheap; less convenient to operate; used in prep LC
31
EMPAQUES PARA COLUMNAS HPLC (2)SIZE-EXCLUSION METHOD a
Silicab Very rugged; adsorptive
Silanized silica Less adsorptive, wide solvent compatibility;with organic solvents
OH- (diol) Less stable; used in aqueous SEC (gel f iltration)
Polystyreneb Used widely for organic SEC (GPC); incompatible with highly polar solvents
ION-EXCHANGE METHOD a
Bonded-phase Less stable and reproducible
Polystyreneb Less efficient; stable; more reproducible
aSilica-based bonded phases, except as noted.bNo bonded phase on these packings.
L.S. Snyder, J.L. Glajch and J.J. Kirkland, "Practical HPLC Method Development",J. Wiley (1988) 80-105.
HPLC 4 10/96 1
FORMAS DE PICOIdeal Ancho Cabeceo Coleo Doblete
TIEMPO
HPLC 4 10/96 2
INFORMACIÓN DEL CROMATOGRAMA
1. POSICIÓN DEL PICO – tR función de K(Termodinámica)
2. ANCHO DE PICO – N, H (Cinética) Responsable de ensanchamiento de banda
3. FORMA DEL PICO– Simétrica o asimétrica
HPLC 4 10/96 3
EL TIEMPO DE RETENCIÓN DEPENDE DIRECTAMENTE DEL COEFICIENTE DE
REPARTOtR = tM + t'R
tR = tM (1 + k')
Recuerda que K = k'
tR = tM (1 + K /)
HPLC 4 10/96 4
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
1.
2.
3.
HETP H 2 / tR
N 16 tR / Wb 2 tR / 2
H L / N tR / tR / 2 2 / tR
HPLC 4 10/96 5
DISPERSIÓN DE PICOt0
t1
t2
HPLC 4 10/96 6
ECUACIÓN DE VAN DEEMTER – 1956(PARA COLUMNAS DE CG EMPACADAS)
HETP = H = A + B / + C
HPLC 4 10/96 7
EFECTO MULTICANAL(Difusión de Eddy)
INICIAL CAMA EMPACADA FINAL
1
2
3
1
2
3
lento
rápido
HPLC 4 10/96 8
DIFUSIÓN LONGITUDINAL(FASE MÓVIL )
t1 t2 t3
HPLC 4 10/96 9
TRANSFERENCIA DE MASA LENTA( MÓVIL A ESTACIONARIA )
Moléculas de Soluto
HPLC 4 10/96 10
GRÁFICO DE VAN DEEMTER
C
A
B
Velocidad Lineal promedio ()
H A B C
HPLC 4 10/96 11
HPLC - ECUACIÓN VAN DEEMTER (Modificada)
HETP H A Bu CS CM u
4 fuentes independientes de ensanchamiento de bandaMinimiza cada término, Minimiza“H”, Maximiza Eficiencia
HPLC 4 10/96 12
HPLC – DIFUSIÓN de EDDY
A = 2dp
La clave son partículas pequeñas, empacadas eficientemente.
usualmente 10 y 5 micras
existen de 3 micras
HPLC 4 10/96 13
HPLC – DIFUSIÓN LONGITUDINAL
Un factor muy pequeño en HPLC
La difusión en líquidos despreciable
B / v 2D mobile
v
HPLC 4 10/96 14
HPLC – TRANSFERENCIA DE MASA –FASE ESTACIONARIA
Q = Factor de ConfiguraciónR = Constante; f (K )df = Espesor de fase estacionariaD stat = Coef. difusión en fase estacionariav = velocidad de flujo (cm / sec )
Clave: película delgada
Csv QRDf
2vD stat
HPLC 4 10/96 15
HPLC – TRANSFERENCIA DE MASA –FASE ESTACIONARIA
w = Coeficiente de Columnadp = Diámetro de partículav = Velocidad de flujo (cm / seg )D mov.= Coeficiente de difusión en
fase móvil
Clave: partículas pequeñas
Cmv wdp2vD mobile
HPLC 4 10/96 16
Fase líquidaSílica Fundida
Término C – Transferencia de MasaCOLUMNAS CAPILARES
HPLC 4 10/96 17
ECUACIÓN DE VAN DEEMTER DETALLADA
(HPLC)
H 2dp 2Dmv
QRdf2v
Ds dp2v
Dm
HPLC 4 10/96 18
HET
P
60
40
20
00 2 4 6 8
FLUJO [ml/min]
22 °C : ter-Butil Benceno 10 m
5 m
3 m
ENSANCHAMIENTO DE BANDA vs FLUJOCOMO FUNCIÓN DEL DIÁMETRO DE PARTÍCULA
HPLC 4 10/96 19
0 5 10
ANÁLISIS POR HPLC RÁPIDA( PARTÍCULAS PEQUEÑAS, COLUMNAS CORTAS,
FLUJOS RÁPIDOS )
COLUMNA : 3 cm3M ODS
FLUJO : 3.5 ml / min
URACILO
FENOLNITROBENCENO
TIEMPO ( SEG )
HPLC 4 10/96 20
RELACIÓN ENTREdp, p, LARGO Y tR (1)
dp [mm] p (psi) Largo [cm] tR [min]10 1,000 25 105 4,000 25 10
Pero corte el largo para reducir presión y mantener:
N = 12,500
HPLC 4 10/96 21
RELACIÓN ENTREdp, p, LARGO Y tR(2)
dp [mm] p (psi) Largo [cm] tR [min]
10 1,000 25 105 2,000 12.5 52 5,000 5 2
Asume N = 12,500 ; H = 2.0;
Partículas pequeñas, más eficiente, pero mayor caída de presión
p 1
dp2 ; p L
HPLC 4 10/96 22
LARGO DE COLUMNA
N L; R (L)1/2
Los largos más comunes 15 cm y 25 cm,pero columnas de 5 cm y 10 cm con partículas de 3 m, son eficientes y rápidasDimensiones mayores, difícil debido a p
HPLC 4 10/96 23
DIÁMETRO DE COLUMNA
• 4 mm más popular; fácil de hacer, buenacapacidad
• 2 mm - HPLC rápida a flujos aceptables
• 1 mm - microboro – conexiones especiales, pero mejor sensibilidad, fácil acoplamiento
• tubos abiertos - investigación; N alto; muy lento
• capilares empacados – empleados en LC/MS
HPLC 4 10/96 24
DIÁMETRO DE PARTÍCULA
• Probablemente el factor más importante en HPLC• 10 m ~ 8-10K platos en 25 cm• 5 m ~ 8-12K platos en 15 cm• 3 m ~ 5K platos en 5 cm
Valores altos de # de platos (100K) requiere de instrumentación especial (inyector, detector, electrónica)
HPLC 4 10/96 25
FACTOR DE ASIMETRÍA DE PICO
Factor deAsimetría dePico = BC/BA
Tiempo
10% de altura de pico
A B C
HPLC 4 10/96 26
CAUSAS DE LA ASIMETRÍA DE PICO
• Diseños ineficientes del sistema
• Múltiples mecanismos de retención
• Deterioro de la columna
• Sobrecarga de la columna
1
2
DETECTORES PARA HPLCDETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) - longitud de onda fija- longitud de onda variable - arreglo de fotodiodos
DETECTOR ÍNDICE REFRACCIÓN
DETECTOR FLUORESCENCIA
DETECTOR ELECTROQUÍMICO
MS/FTIR/Conductividad
3
LINEALIDAD DEL DETECTOR
. Seña
l del
det
ecto
r
Concentración de la muestra
Respuesta lineal máxima
Concentración mínima detectable
4
RUIDO Y DERIVA DEL DETECTOR
Ruido de alta frecuencia
Ruido baja frecuencia
Deriva y ruido de baja frecuencia
5
TIPOS DE FUENTES LUMÍNICASFUENTE DE LÍNEAS 253.7 nm
Lámpara deHg
Longitud de ondaFUENTE CONTÍNUA Lámpara de
Deuterio
Longitud de onda
E
E
6
FACTOR DE RESPUESTA
Concentración
PENDIENTE = BD / AB
A B
CPENDIENTE = BC / AB
D
.
Res
pues
ta
Detectores de HPLC
UV-VIS65%RI
LS10%
Electro10%
FLD8%
MS
otros
8
USO DE DETECTORES DE HPLC
Analytical Chemistry, 54 (1982) 323R.
TIPO PORCIENTO DE USOAbsorbancia 70.7
Ultravioleta, fija (28.0)Ultravioleta, filtro (8.7)Espectrofotométrica (34.0)
Fluorescencia 15.0Índice de Refracción 5.5Electroquímico 4.4Otros 4.4
9
DETECTOR UV DE FIJA
Lente de Cuarzo Filtro
ReferenciaFotoDetectores
Registrador
Pre-AmpsFiltro UV
Fuente de mercurio
Muestra
Comparador LOG
10
CELDA DE FLUJO: DOS CANALES
REFERENCIA
SALIDA
DE LA FUENTE
1 mm
AL DETECTOR
VENTANA DE CUARZO
ENTRADA
MUESTRA
SALIDA
ENTRADA
10 mm
1 mm
11
LOS BENEFICIOS DE LA DETECCIÓN CON VARIABLE
Mantequilla hidrolizada 40 nanogramos de Estándar de Vitamina A en Alcohol
Vitamina AAlcohol
0 5 0 5
= 254 nm
= 325 nm
Tiempo de Retención ( Minutos)
Selectividad y sensibilidad mejoradas
12
MUESTRAS IMPOSIBLES A 254nm
• Azúcares • Triglicéridos
• Esteroides • Barbitúricos
• Ésteres Metílicos • Ácidos carboxílicos
• Hidrocarburos • Polímeros
13
DETECTOR DE UV DE VARIABLE : ESQUEMA
14
DETECTOR DE UV DE VARIABLE : ESQUEMA
15
DE ABSORCIÓN DE CROMÓFOROS
CHROMOPHORE FORMULA MAX (nm)
Amine – NH2 195
Ethylene – C C – 190
Ketone > C = O 195
Ester – COOR 205
Aldehyde – CHO 210
Carboxyl – COOH 200-210
Nitro – NO2 310
Phenyl 202, 255
Naphthyl 220, 275
DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS:
ESQUEMADiode Array
Grating
OpticalSlit
DetectorFlow Cell
HomiumFilter
AchromaticLens
UVLamp
VisLamp
17
Gráfico de Isoabsorbancía
La de adquisiciónse puede optimizara partir de los datosespectrales.
Longuituddeonda
18
SALIDA 3-D DE UN DETECTOR PDA
19
USO DEL MODO 3 - D DE PDA
• Número de picos
de máxima sensibilidad
de mínima interferencia
programación en f (tiempo)
20
PDA: PROCESOS CUALITATIVOS
• Confirmación del compuesto - ( max. y tR )• Identificación del compuesto (no es fácil)• Índice de pureza (relación de 1/2, 10 pts)
intervalo : <1.5 puro, > 1.5 impuro
21
VERIFICACIÓN DE PUREZA DE PICO
A C
BEl problema:¿está este pico “puro”?
22
SUPERPOSICIÓN ESPECTRAL
• No, el pico representa al menos dos compuestos coeluyendo.
mAU
nm190 230 270 310
A
B
C
23
DETECTORES DE ARREGLO DE DIODOS
• Ampliamente usados, aceptados
• Principal uso – verificación de pureza de pico
• Ahorra tiempo - no se requiere volver a analizar cuando los picos no han sido bien detectados
A. Se pueden registrar distintas 's B. Se puede re-graficar y re-integrar
24
ABSORBANCIA AL UV DE SOLVENTES LC
n-Hexano
Tetracloruro
Benceno
Clorofromo
Cloruro de metileno
Acetona
Acetonitrilo
Metanol
Agua
UV CORTESOLVENTE
254 nm Fuente Hg
200 250 300
25
DETECTOR UV : RESUMEN
• Buena sensibilidad 10-6 a 10-10 g• Selectivo• Se puede eluir con gradiente• Costo variable
• El más empleado
26
DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN :ESQUEMA
filtro
SOLVENTE PURO
EFLUENTE COLUMNA
27
DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN:- Principio
n0
n
Eluente + Analito
Eluente Referencia
Lámpara
Cero Óptico
Pico
Linea Base
Cualquier compuesto con un índice de refraccióndiferente a la fase móvil se detecta.
28
Diseño del Detector de IR
La detección con IR se ve afectada por:
• Cambios de presión
• Cambios de temperatura
• Pulsos en el flujo
¡ imposible hacer gradient !
29
DETECTOR IR : RESUMEN
• Respuesta universal• Mala sensibilidad ~ 10-6 g• No se pueden gradientes• Se afecta por la temperatura• Básico para GPC
• Empleado en escalas preparativas
30
COMPARACIÓN DE IR Y UV
A B C D E
Inyección
Inyección
Tiempo
IR
UV
31
Detector de Fluorescencia
32
Principio de detección con fluorescencia
S1
S0
S0…. Energía basal de los electrones
S1…Estado excitado promovido por energía externa e.g. Luz UV
Energía de emisión
33
Excitación - Emisión
34
DETECTOR DE FLUORESCENCIA:CROMATOGRAMA DE EJEMPLO
Tiempo
Inyección
CROMATOGRAMA DE FLUORESCENCIA 5 picogramos
benzo(a)pireno
35
DETECTOR AMPEROMÉTRICO DE PELÍCULA DELGADA PARA HPLC
DUALPARALLEL
LOCKINGCOLLAR
AUXILIARYELECTRODE
WORKINGELECTRODEBLOCK
MINIATUREREFERENCEELECTRODE
MOBILE PHASEPREHEATER COLUMN
GASKET
QUICK RELEASEMECHANISM
OUTLET
INLET
TOP VIEW
36
Detector Electroquímico Principio
Modo Oxidación: Transferencia de electrones del compuesto al electrodoElectrodo de trabajo = Cátodo
Modo Reducción : Transferencia de electrones del electrodo al compuestoElectrodo de trabajo = Ánodo
37
EXTRACTOS DE BUPRENORFINADE PLASMA Y ORINA (ECD)
BLANCO DE PLASMA
8 1240
(a) (b)40 ng/ml (STD)
1.5
0 4 8 12 min
(c)
BLANCO DEORINA
0 4 8 12
(d)
ORINA
40 ng/ml
0 4 8 12
38
Detector de Light Scattering
39
Detector de Conductividad
ref.capacitor
cell
variable resistances
fixed resistor
C
r
Balancecontrol A E
F
D
B
~
Schematics Applications
watersoap productsdetergentssoft drinksbloodplating bathsnuclear fuel reprocessingstreams
IonsAcidsBasesSalts
in}
40
DETECTOR ELECTROQUÍMICOENTRADA
SALIDASALIDA
Electrodo deReferencia Ag/AgCl
Electrodo de trabajo de grafito
Contraelectrodo
Tapón de vidrio poroso
B. Fleet, C.T. Little, J.Chrom.Sci, 12 (1974) 747
41
DETECTOR ELECTROQUÍMICOAPLICACIONES
EN REDUCCIÓN• Quinonas• Compuestos nitro,
nitroso y azo • Compuestos
organometálicos• Metales pesados
EN OXIDACIÓN• Hidrocarburos aromáticos• Aminas primarias,
secundarias y terciarias• Aminas aromáticas• Compuestos fenólicos• Compuestos heterocíclicos
42
LC-MS
43
HPLC-MSD API- Electrospray
44
350 400 450 500 550 600 650 700
2000
4000
6000
8000
m/z-->
Abundance
439 467 502
684.65
350 400 450 500 550 600 650 700
2000
4000
6000
8000
m/z-->
Abundance
411
439
467
495
684.65
Fragmentor = 175 volts
Fragmentor = 75 volts
loss of C14 fatty acid
loss of C12 fatty acid
Triglyceride
Información cualitativa a partir del espectro de masas
45
¿porqué mas de un detector?:- Sensibilidad
PAH's extracted from soil; Sup.LC-PAH 150x4.6mm;Solv.: H2O/CH3OH= 10:90
Fluorescence
UV-signal
WL
241/
394
WL
270/
388
WL
248/
411
WL
302/
420
WL
247/
504
Pyrene
Chryse
ne
Benzo
(e)py
rene
Perylen
eBen
zo(k)
fluora
nthen
e
Benzo
(a)py
rene
Benzo
(ghi)p
erylen
e
Inden
o(123
-cd)py
rene
46
¿porqué mas de un detector?:- Selectividad
Flecainide in Serum
Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected
UV and fluorescence signal
FL signal
UV signal
47
¿porqué mas de un detector?:– Información Cualitativa
Qualitative Information
Take peak spectrum (UV)
Chlortoluron ?
44
68
58
96 132 138158
172
215
200
Take peak spectrum (MS)
104
Mass/Charge
Atrazine ?
Wavelength (nm)
60 80 100 120 140 160 180 200 220
48
DERIVADOS SENSIBLES AL UV
Analyte ReagentRNH2 N-Succinimidyle
p-NitrophenylacetateRCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-
DiisopropylisoureaROH 3,5-Dinitrobenzoyl
ChlorideR2CO p-Nitrobenzyloxyamine-
Hydrochloride 2,4-D.N.P.H.
49
DERIVADOS SENSIBLES FLUORESCENCIAAnalyte ReagentRNH2 Dansyl Chloride
FluorescamineRCOOH 4-Bromomethyl-7-
methoxycoumarin
R--OH Dansyl Chloride
R2C = ONH2
Dansyl Hydrazine
RCH-COOH Phthaldehyde
50
DERIVADOS CON PROPIEDADES ELECTROQUÍMICAS
Analyte ReagentROH, R2NH,RNH2
2,4-DinitrobenzoylChloride
R-CH-COOH 2,4-DinitrofluorobenzeneRCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-
DiisopropylisoureaR2C = O 2, 4-Dinitrophenyl-
Hydrazine
51
ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas
Sistema de datos
Espectro de masasMuestra concentrada
AlVacío
Solvente
Muestra
Efluente LC
HPLC 6 10/96 1
ANÁLISISCUALITATIVO vs. CUANTITATIVO
1. CUALITATIVO - ¿qué está presente?
• Cromatografía - compare tR 's
• Espectroscopía - MS, IR, UV
2. CUANTITATIVO - ¿Cuánto está presente?
• Altura de pico
• Área de pico
HPLC 6 10/96 2
Cafeína
TeofilinaTeobromina
"X"
1. Estándar
2. Desconocido
tR(theophylline) = tR(“X”), entonces, se sugiere que “X” es teofilina.Para confirmación positiva, se debe emplear LC-MS
ANÁLISIS CUALITATIVO
HPLC 6 10/96 3
HPLC 5 10/96 34
ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas
Sistema de datos
Espectro de masasMuestra concentrada
AlVacío
Solvente
Muestra
Efluente LC
HPLC 6 10/96 4
EXACTITUD-META ANALÍTICA• Error absoluto:
Diferencia entre valor medido y el valor verdadero.
• Error relativo (%) :(Error / Valor Verdadero) x 100 = % Error
• Ejemplo:Peso verdadero 50.0 gPeso medido 48.0 gError absoluto 2.0 g% Error ( 2 / 50 ) x 100 = 4 %
HPLC 6 10/96 5
PRECISIÓN1. Mide reproducibilidad
2. Depende de la técnica
HPLC 6 10/96 6
MEDIDA DE LA PRECISIÓN:DESVIACIÓN ESTÁNDAR
S.D. x x
2
n 1
RSD S.D.
x 100Desviación estándar relativa =
Chemist X Chemist YData Statistics Data Statistics10.0 n = 5 10.2 n = 512.0 = 10.0 10.6 = 10.0 9.0 = 1.58 9.8 = 0.4811.0 RSD = 15.8% 10.1 RSD = 4.8% 8.0 9.3
x x
HPLC 6 10/96 7
COMPONENTES DE EXACTITUD
CALIBRACIÓN + PRECISIÓN = EXACTITUD
1. Esencial calibración con estándares
2. Precisión (reproducibilidad) necesaria para un procedimiento analítico exacto
HPLC 6 10/96 8
PROCESO CUANTITATIVO HPLC1. Muestreo
2. Preparación de la muestra
3. Cromatografía
4. Integración
5. Cálculos
HPLC 6 10/96 9
1. Objetivo – tomar una pequeña muestra representativa de una población grande
2. Problemas• Contaminación• La muestra no es representativa
MUESTREO
HPLC 6 10/96 10
PREPARACIÓN DE MUESTRA
MolerDisolver Filtrar Extraer
Diluir Concentrar Derivatizar
2. Problemas•Pérdida de muestra•Contaminación
1. Procedimiento
HPLC 6 10/96 11
CROMATOGRAFÍA
Macintosh
Reservorio de solventes
Bomba
Medidor de presión
Inyector
ColumnaDetector
Desecho
Registrador
Sistema dedatos o integrador
HPLC 6 10/96 12
CONVERSIÓN DIGITAL–ALTURA DE PICO
hh
h
D
A
B
C
HPLC 6 10/96 13
INTEGRACIÓN – ÁREA DE PICO
Area
Más difícil que medir altura de pico, pero está menos influenciado por cambios en la temperatura de la columna o el flujo.
HPLC 6 10/96 14
INTEGRADOR DIGITAL ELECTRÓNICO
DETECTOR A / DCONVERTIDOR
MICROPROCESADOR IMPRESORA
REGISTRADOR CINTA
sjhd kahd kjhd kjhd kjhd kjhsd kjhsd kjhs kjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs aljd lkjsd lkjsd lkjsd lkjs dljad ljadlj sljd aljd lkjsd iou fijgf oujfjd iuzdshda,adh fiehkjhd audddehfjsiu dSj.jfldu oejalkjd lkjs dlkj djs 2163216 321 6312
HPLC 6 10/96 15
SISTEMAS DE DATOS
INTEGRADOR. Fácil de usar
. Precio moderado
COMPUTADORA . Flexible/poderosa
. Más caras
1.235
1.235
1.235
1.235
1.235
HPLC 6 10/96 16
VENTAJAS DE LOS INTEGRADORES1. Sensibilidad
2. Intervalo dinámico3. Exactitud/precisión
4. Corrección de línea base5. Identificación de pico (Computadora)
6. Automatización total (Computadora)
• Programación de temperatura
• Integra, cuantifica
• Auto-calibra
• Introducción de la muestra
• Registro impreso
• Regeneración de la columna
• Repetición del programa
HPLC 6 10/96 17
LIMITACIONES DE INTEGRADORES
1. Costo de capital2. Se requiere entrenamiento3. Picos no resueltos - baja
exactitud4. Sobreconfianza
HPLC 6 10/96 18
CÁLCULOS:NORMALIZACIÓN DE ÁREA SIMPLE
1. Cálculos
2. Procedimiento usualmente no válido• Asume que todos los picos responden igual• Asume que la suma de áreas es el 100% de la muestra
Área = 150A 300
B 600C
wgt %A Area A
Total Area100
150150 300 600
100 14.3%
HPLC 6 10/96 19
CÁLCULOS: FACTOR DE RESPUESTA
A
BC
Peso = 10 g 10 g 10 gÁrea = 150 300 600
Los factores de respuesta difieren
HPLC 6 10/96 20
CÁLCULOS DEL FACTOR DE RESPUESTA
Área (Cuentas)
300
200
100
Peso (g)
CB
AA
5 10
W FR Cuentas de área [g]B. 30A. 15C. 60
HPLC 6 10/96 21
CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN CON CORRECCIÓN DE ÁREA
Area RF Corrected AreaA 150 15 10B 300 30 10C 600 60 10
wgt %A = (10/30) x 100 = 33.3%
HPLC 6 10/96 22
CÁLCULOS:ESTÁNDAR EXTERNO
Área
Peso (g)
Desconocido
1. Desarrolla una curva de calibración con estándares, y compara con el desconocido
2. Requiere de una inyección reproducible3. Es más empleado en LC que en GC
HPLC 6 10/96 23
SELECCIÓN DEL ESTÁNDAR INTERNO
Requisitos:1. Estándar puro2 Picos bien resueltos3. Nunca presente en la
muestra4. En el mismo nivel de
concentración
Muestra sola
Muestra + ISTD
HPLC 6 10/96 24
CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (1)
1. Prepare e inyecte muestras de estándar interno y del analito de interés.
2. Prepare una curva de calibración de los datos cromatográficos, graficando la relación de áreas contra la relación de pesos de analito y estándar interno.
IS = EST. INTERNOA = ANALITO A
AA
IS IS IS
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Muestra 1Muestra 2Muestra 3
Área A / Área IS
Peso A / Peso IS
HPLC 6 10/96 25
CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (2)
Desconocido X
1. Añada con precisión el IS a la muestra desconocida2. Cromatografíe la mezcla3. Calcule la relación de áreas4. Determine la relación de pesos de la curva de
calibración5. Encuentre el peso del analito
Peso A / Peso IS
Área A / Área IS
HPLC 6 10/96 26
ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC
Component TrueWeight %
MeasuredWeight %
RelativeError (%)
Et Paraben 11.66 11.54 1.0Pr Paraben 16.94 16.91 0.2Bu Paraben 33.14 33.17 0.1
HPLC 7 10/96 1
CROMATOGRAFÍADE EXCLUSIÓN (SEC)
• PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC- Disolvente - agua- Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros- Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex)
• MOORE - 1962 – Cromatografía Permeación en Gel - GPC- Disolventes - THF, Decalina, Tolueno- Muestras – Polímeros Orgánicos- Empaque – Poliestireno entrecruzado (Styragel)
GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO
HPLC 7 10/96 2
CROMATOGRAFÍADE EXCLUSIÓN (SEC)
•SEC caracterización de polímeros (PM 1000 a 1 millón)
•Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas (GFC)---cadenas de moléculas pequeñas
• Las cadenas de distintos largos y formas•Se puede calcular el peso molecular y su
distribución
HPLC 7 10/96 3
COMPARACIONES
•GPC vs LSC o Fase Reversa
•GPC separa moléculas basada en su tamaño en disolución
•Tamaño en disolución depende de PM y otros factores (disolvente, temperatura, etc.)
• La moléculas más grandes eluyen primero las más pequeñas al final
HPLC 7 10/96 4
VENTAJAS DE SEC
• Trabaja con altos PM y tiene tiempos de corrida cortos
• Tiempos de separación y orden de elución fácilmente predecibles
• No existen pérdidas o reacciónes en la columna
• Desarrollo de métodos relativamente simple, sin gradientes
HPLC 7 10/96 5
GPC DE GOMA DE MASCAR
GPC
Ablandador
Estabilizador
Sabor
COMPONENTES
CHICLE
HPLC 7 10/96 6
PROBLEMAS EN SEC
• Limitada capacidad de pico (baja resolución)
• No puede resolver compuestos de tamaño similar (isómeros)
• Se requiere de una diferente estrategia de optimización
• Debe poder disolver al polímero
HPLC 7 10/96 7
MECANISMO DE SEPARACIÓN
• Las moléculas más pequeñas penetran en los poros más pequeños y se retienen más
• Las moléculas mayores son EXCLUIDAS
• La separación en función del VOLUMEN HIDRODINÁMICO y no el PM
HPLC 7 10/96 8
CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓNV0 VR
Volumen muertoVolumen interno
Inyección.
Res
pues
ta d
el d
etec
tor
Volumen de elución [ml]
grande pequeño
HPLC 7 10/96 9
CURVA DE CALIBRACIÓN
.
3
4
5
6
0 10 20 30 402
Volumen de elución [ml]
Vo Vi
TOTALEXCLUSIÓN
TOTALPERMEACIÓN
logPM
HPLC 7 10/96 10
CURVAS DE CALIBRACIÓN PARAVARIAS COLUMNAS PS-DVB
50 Å
100 Å500 Å
1000 Å
104 Å
105 Å
106 Å
107
106
105
104
103
102
4 5 6 7 8 9 10
MIXED BED
ELUTION VOLUME [min per 30 cm]
POLY
STYR
ENE
MO
LEC
ULA
R W
EIG
HT
HPLC 7 10/96 11
DESARROLLO DE MÉTODOS
•Seleccione un buen disolvente (consulte la literatura)
•Escoja el tamaño de poro adecuado
•Corra estándares; desarrolle una curva de calibración
•Inyecte una disolución diluída (~1%)
HPLC 7 10/96 12
DISOLVENTES PARA GPC•Deben disolver al polímero•Compatible con el empaque y detector
•Baja viscosidad•Toxicidad, costo, punto de ebullición
SOLVENT Viscosity[20°C, cP]
UV cutoff[nm]
BP[°C]
Flash Pt.[°C]
Toxicity
THF 0.55 220 66 14 Slightm-Cresol 20.8 302 203 94 ModeratToluene 0.59 285 111 4 Moderat
Dichloromethane0.44 233 40 None Severe
Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography , 2nd ed., (1979)
HPLC 7 10/96 13
PAPEL DE LA FASE MÓVILDISOLVENTE A: DISOLVENTE B: Polímero completamente solvatado Sin solvatar
HPLC 7 10/96 14
SELECCIONANDO COLUMNAS GPC
PORES SIZES MW RANGE(polystyrene)
50 Å < 1,000100 Å < 4,000500 Å 500 - 2 x10 4
1000 Å 1000 - 4 x10 4
10 4 Å 4 x 10 3 - 4 x10 5
10 5 Å 4 x 10 4 - 4 x10 6
10 6 Å 4 x 10 5 - 4 x10 7
Mixed Bed 500 - 10 7
HPLC 7 10/96 15
REQUERIMIENTOS DE HARDWARE • BOMBA – un control preciso de flujo, esencial
• INYECTOR – mejor automuestreador (10-100µl)
• COLUMNA – empaque estable (no cambie disolventes), control de temperatura
• DETECCIÓN – No-destructivo (trabajo prep.), amplio intervalo lineal
• OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado, cálculos automáticos de Mn, Mw, etc.
HPLC 7 10/96 16
PREPARACIÓN DE MUESTRA•Seleccione un buen disolvente, caliente
si es necesario
•Prepare una disolución diluída (~1%) PM<10K ~1%PM>1Millón ~0.01%
•Siempre filtre (¡No guarda-columnas!)
HPLC 7 10/96 17
DETECTORES PARA SECÍNDICE DE REFRACCIÓN: • Respuesta universal
• Sensibilidad moderada• Mala temp. y estabilidad de flujo
UV/VISIBLE: • Buena estabilidad, muchos polímeros no tienen cromóforos
LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO:• da valores para• resultados de PM ABSOLUTO,ya que se mide el volumen
hidrodinámico
VISCOMETRÍA DIFERENCIAL:• Volumen hidrodinámico = • Útil para calibración universal,
da viscosidad intrínseca
DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA:• Universal, da masa, igual respuesta
(LALLS)
M n, M w
M n, M w
Visc. M n
HPLC 7 10/96 18
APLICACIONES DE GPC
• Separaciones de polímeros de alto peso molecular
• Caracterización de polímeros:Mn, Mw, Mz, polidispersión
• Limpieza de muestra: Remueve materiales de alto PM
HPLC 7 10/96 19
.
3
4
5
6
0 10 20 30 402
log
PM
Volumen de elución [ml]
Buen polímero
Mal polímero
APLICACIONES DE GPCCONTROL DE CALIDAD RÁPIDO
HPLC 7 10/96 20
SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE POLÍMEROS
2
45
1 36
7
15 20 25 30 35
Tiempo de elución [min]
Muestra:1. Irganox 10102. DSTDP3. Irganox 10764. Estearamide5. Desconocido6. Tinuvin 3277. BHT
Columna: G2000 H87.5 mm ID x 60 cm x 2
Eluente: TetrahidrofuranoFlujo: 1.6 ml/minCaida Presión : 54 kg/cm2
Detector: RITemp.: Ambiente
HPLC 7 10/96 21
GPC DE ALTA RESOLUCIÓNC36 C28
C22
C18
C16
C13
C12
C11
C9 C8
C24
C32
C20
C14
30 40 50 60 70 min
MUESTRA: n-ParafinasCOLUMNA: SHODEX a-802 x 4, 2mELUENTE: THFFLUJO: 1 ml/minPRESIÓN: 48 kg/cm2
DETECTOR: IR
HPLC 7 10/96 22
PROPIEDADES FÍSICAS•Número PM promedio cristalinidad, flujo,
compresión
•Peso PM promedio fuerza (tensil, impacto)resistencia
•z PM promedio elongación, flexibilidad
•Z+1 PM promedio “die swell”
HPLC 7 10/96 23
VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC :TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA
A. Incremente la Temperatura para mejorar:- Solubilidad de la muestra- Eficiencia de la columna- Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor
viscosidad)- Carga de muestra (solubilidad incrementada)
B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad - Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm;
VR y HETP se degradan a valores mayores
Intervalo PM Concentración Max [%wt./vol.]a 20K 0.25
34K a 200K 0.10400K a 2,000K 0.05
Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507
HPLC 7 10/96 24
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN RESUMEN
•DOS TIPOS:GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles
HidrofílicosGPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno
•MECANISMOSeparación por tamaño (PM)
•CURVA DE CALIBRACIÓNCorrelaciona PM y Volumen de Elución
•DISOLVENTEDebe disolver al polímero
HPLC 9A 10/96 1
EFECTO DE PARÁMETROS HPLC EN CROMATOGRAFÍA
1. Flujo2. Polaridad de fase móvil3. pH4. Tamaño de muestra5. Dimensiones de
Columna:largo, D.I., dp
tR
k’NR
HPLC 9A 10/96 2
1. tR es inversamente proporcional a vdoble v, corta a la mitad el tR
2. k’ es independiente de vdoble v, corta a la mitad el tR y tM
3. es independiente de v4. N, la ecuación de Van Deemter
relaciona v con HETP o la eficiencia de columna:
Flujos bajos, más platos5. RS = función de k’, y N
En este caso, RS aumenta y v disminuye
FLUJO (v)
H
v
HPLC 9A 10/96 3
POLARIDAD DE LA FASE MÓVIL1. tR - FASE NORMAL -
Más polar, elución más rápida y, tR más cortoFASE REVERSA -
Más polar, elución más lenta, tR más largos2. k – se comporta como tR
FASE NORMAL – Más polar, k’ disminuyeFASE REVERSA – Más polar, k’ aumenta
3. – más difícil : En primera aproximación, independientede tR pero una fase móvil diferente afecta
4. N - En HPLC, menor tR,ligeramente mayor N ;
5. RS - Como k’ aumenta, RS aumenta :2 to 5
k’
R
k’
HPLC 9A 10/96 4
EFECTO DEL pH• Principio de Le Chatelier : HA H+ + A-
• pH afecta el equilibrio de ácidos débiles (HA) o bases débiles(B)• pH no afecta a neutros o ácidos fuertes• pH puede afectar a la muestra y al empaque
1. FASE NORMAL – Debe ser usada para moléculas neutras y semi-polares; pH no es un factor relevante.
2. FASE REVERSA – Si aumenta el pH, HA más ionizado, tR más largos, coleo. Si aumenta el pH, B menos ionizado, tR más cortos, picos más simétricos.
3. INTERCAMBIO IÓNICO – El pH es un factor crítico.Recuerde – Si el pH afecta tR, se trata de un HA o B.
HPLC 9A 10/96 5
TAMAÑO DE MUESTRA•Cada columna tiene una capacidad limitada; si se excede
ese límite y tR disminuye, la forma de pico empeora.•Solución – diluya la muestra 1/10 y re-analice.•Todos los resultados cromatográficos pueden cambiar.
100 mg25 mg
5 mg
1 mg
HPLC 9A 10/96 6
DIMENSIONES DE COLUMNA :Largo
• Se debe asumir que la presión se incrementa al incrementar el largo para mantener v.
• La presión requerida es proporcional al largo:doble largo doble presión.
• Si se duplica el largo de la columna :
1. tR - duplica 2. k - sin efecto
3. - sin efecto 4. N - duplica
5. RS - 2 = 1.41 = 40% aumento
HPLC 9A 10/96 7
DIMENSIONES DE COLUMNA: I.D.• Dimensiones :
4 o 4.6 mm I.D. - normal3, 2 o 1 mm I.D. - disponible0.53 o 0.32 mm - capilar empacado
• El flujo volumétrico [ml/min] es proporcional al cuadrado del radio (i.e. área) :
4 mm - 1 ml/min2 mm - 0.25 misma velocidad lineal (v) 1 mm - 0.06
• tR, k’, , N y RS son independientes de DI si la columna está bien empacada.
• Pero menor DI. : 1. Menos disolvente (barato)2. Mejor sensibili. - A = cl (Lambert-Beer)
Si la muestra es limitada
HPLC 9A 10/96 8
1. tR, k y - independientes de dp
2. N inversamente proporcional a dp :la mitad de dp, doble N
3. RS aumenta con N, 40% aumento
DIMENSIONES DE COLUMNA :Diámetro de partícula (dp)
•5 y 10 m son normales•3 m disponibles y ganando aceptación•Partículas más pequeñas generan mejores
columnas(N y R) pero aumentan la presión, por lo que largos mayores no son posibles.
HPLC 9A 10/96 9
RELACIÓN ENTREdp, p, LARGO Y tR (1)
dp [m] p Largo [cm] tR [min]10 1,000 25 105 4,000 25 10
Reduzca el largo para reducir presión y mantener: N = 12,500
HPLC 9A 10/96 10
RELACIÓN ENTREdp, p, LARGO Y tR (2)
dp [m] p Largo [cm] tR [min]
10 1,000 25 105 2,000 12.5 52 5,000 5 2
Asumiendo N = 12,500 ; h = 2.0
Partículas más pequeñas más eficientes pero mayor caída de presión
p 1
dp2 ; p Lc
HPLC 9A 10/96 11
COMO AUMENTAR LA RETENCIÓN1. COLUMNAS LARGAS (k’ no cambia)2. FLUJOS MENORES (k’ no cambia)3. FASE MÓVIL MÁS DÉBIL
• Fase normal - Menos polar• Fase reversa - Más polar (H2O)
4. MAS FASE ESTACIONARIA• Sílica gel - Más área superficial• Fase reversa - RP-18 en lugar de RP-8
5. INCREMENTAR EL COEFICIENTE DE PARTICIÓN• Mayor solubilidad en fase estacionaria• Menor temperatura en la columna.
HPLC 9A 10/96 12
COMO DISMINUIR ENSANCHAMIENTO
•1. USE UNA COLUMNA MEJOR EMPACADApartículas chicas, empacado compacto
•2. OPTIMICE EL FLUJO•3. REDUZCA EL TAMAÑO DE MUESTRA
para evitar sobrecarga•4. REDUCCIÓN DE VOLUMEN MUERTO
usar conexiones de volumen muerto bajo•5. REDUCIR LA CONSTANTE DE TIEMPO
HPLC Method Development 8/96 1
DESARROLLO DE MÉTODOS HPLC
1. ¿SE PUEDE DISOLVER LA MUESTRA?
2. ¿SE PUEDE HACER EL ANÁLISIS POR HPLC?
3. SI, ¿CON QUE DETECTOR?
4. ¿QUÉ TIPO DE COLUMNA?LSC o RP o IE o SEC?
5. ¿QUÉ COLUMNA?fase estacionaria, largo, DI, dp.
6. ¿QUÉ FASE MÓVIL?polaridad, pH, fuerza iónica.
HPLC Method Development 8/96 2
¿SE PUEDE DISOLVER LA MUESTRA?
1. DESEABLE – solución al 1% en un solvente débil.Pruebe con hexano, metanol, agua
2. ÁCIDO O BÁSICO (¿sal?)0.01 N HAc - pH ~ 3.40.5 N NH4OH - pH ~ 10.6
3. ALGUNOS polímeros deben ser calentados polietileno-tolueno 120° C
HPLC Method Development 8/96 3
¿SE PUEDE ANALIZAR POR HPLC?1. Si es soluble en hexano, pruebe una columna corta y rápida,
5 o 10 cm de silica gel, 2 ml/min acetonitrilo. Si salen picos de la columna baje la fuerza del solvente hasta k’ = 5.
2. Si es soluble en metanol, trate con fases químicamente unidas, bien sea fase normal o reversa.
3. Si es soluble en agua:no-iónico: 5 o 10 cm RP-18, 2 ml/min MeOH (o acetonitrilo).iónico: pruebe ambas SCX y SAX
4. Dependiendo de lo que se busque con el análisis: Pruebe SEC.Seleccione el tamaño de poro basado en PM.
4. Si no salen picos después de 1-4 minutos, no será fácil de analizar por HPLCPuede haber problemas de detección.
HPLC Method Development 8/96 4
SI SÍ, ¿CUÁL DETECTOR?1. UV/VIS (PDA) primera elección.
Obtenga un espectro para definir max.UV disponible, costo moderado, uso ~ 80%No es universal, pero provee buena sensibilidad.
2. IR segunda elección. Universal, detecta todos los compuestos, no es sensible (± 10 ppm). Estándar en GPC.
3. LC/MS, mejor elección.Sensible e universal, muy caro, no muy común.
4. Los detectores de fluorescencia y electroquímico ambos son sensibles y selectivos: los recomendables si se sabe que responden a los analitos.
HPLC Method Development 8/96 5
¿QUÉ TIPO DE COLUMNA?MUESTRA
MW > 1500 MW > 1500
SOLUBLEEN AGUA
SOLUBLEEN ORGÁNICO
GFC GPCSOLUBLEEN AGUA
SOLUBLEEN ORGÁNICO
SOLUBLEHEXANO
SOLUBLEMETANOL
NO-ELECTROLITO
ELECTROLITOS
LSC BCP -NP BPC-RP BPC-RP(SPECIAL)
IEC IPC
HPLC Method Development 8/96 6
¿CUÁL COLUMNA? 1. Escoja de un fabricante confiable.
Pregunte a colegas, llame por teléfono.2. Si es soluble en hexano, muestra no polar. Pruebe:
A. sílica gel–disponibles, baratas, pH 2-8B. alúmina–pH 1-12, más débil que sílica gelC. Fases unidas ciano–pH 2-8, mas versátiles que sílica gel,
solventes más polares.3. Si es soluble en metanol:
A. RP- 18 or ODS–estándar B. RP- 8 más rápida, un poco más eficienteC. Fenil–no muy empleada
4. Si es soluble en agua:A. SCX vs. WCXB. SAX vs. WAXC. Cromatografía de pares de iones
HPLC Method Development 8/96 7
PARÁMETROS DE COLUMNA1. LARGO
A. Empiece 15 cm., 5µ dp.B. Largos mayores, más platos, lentas
N L; tR L2. DIÁMETRO DE PARTÍCULA
10 y 5 µm más comunes, robustoPartículas menores, más platos, mucha más presión (siguiente tabla).
3. DIÁMETRO INTERNO:Si está bien empacada, y mismo dp, R, d, N, tR casi independientes de DI4 mm est. ~ 1 ml/min2 mm–disponible ~ 250 µl/min1 mm–microbore – muy raraCapilares empacados–solo para LC/MS
HPLC Method Development 8/96 8
PARÁMETROS BÁSICOS DE COLUMNA
L (cm) dp (µm) N tR (min) ²P (psi)
25 10 10,000 10 1,000 25 5 20,000 10 4,000 15 5 12,000 6 2,40010 5 8,000 4 1,600
Asume: N L; P L; N 1/dp; h = 2.5; p 1/dp2
HPLC Method Development 8/96 9
¿QUÉ FASE MÓVIL?1. Empiece con un solvente fuerte, un flujo alto
(¡obtenga picos!).Reduzca la fuerza del solvente hasta k ~ 5.
2. Mida de los picos importantes.Optimice si es necesario – si no FÁCIL.Pruebe diferentes disolventes, use Lab. Seco
3. Incremente N.Flujos lentos, menos muestra, más temperatura.Largos mayores, partículas menores.
HPLC Method Development 8/96 10
VARIOS
1. La muestra debe ser soluble en la fase móvil, soluciones diluidas, volúmenes mayores si es necesario.
2. SIEMPRE filtre la muestra y los bufferes.
3. Con temperaturas bajas en la columna (40° C) por lo general N , , R son difíciles de predecir.
4. pH afecta a la muestra (si HA o B) y a la fase estacionaria