Copurification of E.Coli RNAase Copurification of E.Coli RNAase E and PNPase:E and PNPase:

Evidence for a Specific Evidence for a Specific Association between twoAssociation between two

Enzymes Important in RNA Processing Enzymes Important in RNA Processing and Degradationand Degradation

Agamenon J. Carpousis,Agamenon J. Carpousis,

Griet Van Houwe, Claude Ehretsmann and Henry M. Griet Van Houwe, Claude Ehretsmann and Henry M. Krisch. 1994Krisch. 1994

Introducción:Introducción:

Degradación de mRNA Disminución de Degradación de mRNA Disminución de nivel de nivel de

expresiónexpresión

Regulación de Regulación de

la la

Expresión Expresión GénicaGénica

Acción de Endo yAcción de Endo y

ExonucleasasExonucleasas

E.Coli: mRNAE.Coli: mRNA

ExonucleasasExonucleasas Degradación desde Degradación desde

3` produciendo3` produciendo

mononucleótidosmononucleótidos

LLa mayoría de los mensajeros tienen a mayoría de los mensajeros tienen estructuras en sus extremos 3’ que pueden estructuras en sus extremos 3’ que pueden impedir la acción de estas exonucleasas.impedir la acción de estas exonucleasas.

Endonucleasas Endonucleasas adheridas se cree que adheridas se cree que inician la degradación de ARNm por la inician la degradación de ARNm por la creación de la llamada entrada de sitios de creación de la llamada entrada de sitios de 3’ exonucleasas.3’ exonucleasas.

RNAase E: RNAase E: Originalmente identificada como Originalmente identificada como una una endoribonucleasaendoribonucleasa implicada en la maduración implicada en la maduración de ARNr 5Sde ARNr 5S

Subunidad Subunidad 9S 9S Subunidad Subunidad 5S5S ribosomal ribosomalribosomal ribosomal

A cierta temperatura una deformación A cierta temperatura una deformación termo-sensible del gen termo-sensible del gen rnerne no produce no produce el ARN ribosomal 5S y se acumula su el ARN ribosomal 5S y se acumula su precursor (ARN ribosomal 9S).precursor (ARN ribosomal 9S).

RNAaseRNAase E-E- bacteriófago T4bacteriófago T4 Procesamiento y degradación de Procesamiento y degradación de

varios mRNAvarios mRNA

RNAase E- RNAase E- E.coliE.coli MutaciónMutación amsams afecta decaimiento afecta decaimiento

químico de mRNAquímico de mRNA Mutaciones Mutaciones rnerne y y ams ams en el mismo en el mismo

locuslocus Gen rne Gen estructuralGen rne Gen estructural

Resultados:Resultados:

Purificación RNAase EPurificación RNAase E

Método original purificación no homogéneaMétodo original purificación no homogénea ((precipitación con sulfato precipitación con sulfato MM Nativa 70KdMM Nativa 70Kd de amonio, cromatografía de amonio, cromatografía de intercambio iónico yde intercambio iónico y gel filtracióngel filtración).).

Gradiente de Glicerol MM Nativa Gradiente de Glicerol MM Nativa 300 Kd300 Kd

Lysozyme-Edta, Triton, NHLysozyme-Edta, Triton, NH44Cl, detergentes no-iónicos e Cl, detergentes no-iónicos e inhibidores de proteasas mayor rendimiento.inhibidores de proteasas mayor rendimiento.

Ensayo de ActividadEnsayo de Actividad Se estudio una forma truncada del ARNr Se estudio una forma truncada del ARNr

9S como sustrato de la ARNasa E: 9S como sustrato de la ARNasa E: 9Sa 9Sa RNAase ERNAase E

Sitios de corte: c, a, bSitios de corte: c, a, b

Procesamiento de 9Sa RNAProcesamiento de 9Sa RNA Wt HT Wt

HT

Rne

H T

45ºC

Corte en Corte en aa no se ve afectado por el no se ve afectado por el sustratosustrato

Carriles 2 y 3: Carriles 2 y 3: tratamiento con calor tratamiento con calor de RNAase E de cepa de RNAase E de cepa rnerne reduce reduce procesamiento de 9Saprocesamiento de 9Sa

1U de Actividad1U de Actividad: : Cantidad de Cantidad de RNAase E que cliva completamente RNAase E que cliva completamente 9Sa en el 9Sa en el sitio sitio aa en 30 min a 30ºCen 30 min a 30ºC

Ensayo de ACTIVIDAD en cada paso de Ensayo de ACTIVIDAD en cada paso de la purificación (tabla 1)la purificación (tabla 1)

Tabla 1Tabla 1

9

Enz se purifica 130-veces

1200

Figura A: SDS-PAGE Tinción con CoomassieFigura A: SDS-PAGE Tinción con CoomassieFigura B: Western blotFigura B: Western blot

Purificación de la ARNasa E WT

Producto gen rne

Polipéptido detectado similar se observó para enzima mutante

Procesamiento de ARN ribosomal 9SProcesamiento de ARN ribosomal 9S

Gel electroforesis Gel electroforesis desnaturalizantedesnaturalizante

Se detectó p5S: tiene Se detectó p5S: tiene 6nt6nt más que 5Smás que 5S

Identificación productoIdentificación productobasado en tamañobasado en tamaño

Sitio a: GA/AUUSitio a: GA/AUU 5’/a, 5’/c contienen5’/a, 5’/c contienen

extremo 5’ de 9S extremo 5’ de 9S P5, c/a, b/3’, son P5, c/a, b/3’, son

internosinternoso del extremo 3’ de 9So del extremo 3’ de 9S

La enzima mutante es La enzima mutante es inactivada por inactivada por tratamiento con calor tratamiento con calor (carril 3) (carril 3)

45ºC

WT rne

Procesamiento del ARNm por la Procesamiento del ARNm por la ARNasaEARNasaE Mapeo in vitro del clivaje Mapeo in vitro del clivaje

de la ARNasaE  de la ARNasaE  A ) A ) secuencia líder 5’  del secuencia líder 5’  del  bacteriófago T4 en gen 32;  bacteriófago T4 en gen 32; B)-  secuencia líder 5’   E.coli B)-  secuencia líder 5’   E.coli ompA.ompA.

B. secuencias sin enzima B. secuencias sin enzima Carril 1 y 2 digerido con wt Carril 1 y 2 digerido con wt

ARNasa E.ARNasa E. Carril 3 y 4 digestión con Carril 3 y 4 digestión con

ARNasa termosensibleARNasa termosensible + Control: dideoxinuclotidos + Control: dideoxinuclotidos

fueron omitidosfueron omitidos ARN no marcado digerido ARN no marcado digerido

con fracción HT de wt y con fracción HT de wt y sensible a temperatura.sensible a temperatura.

Productos analizados por Productos analizados por extensión de primers.extensión de primers.

Reacción de Reacción de secuenciación permitió secuenciación permitió determinar el sitio de determinar el sitio de clivaje: clivaje: GA/AUUGA/AUU(gen32) (gen32) y y GG/AUU(ompA).(ompA).

Detección de la actividad PNPasaDetección de la actividad PNPasa

La PNPasa, exonucleasa La PNPasa, exonucleasa que degrada que degrada pprrogresivamente el ARN ogresivamente el ARN partirpartir ext ext 3’ produci3’ produciendoendo mononucleotidos mononucleotidos difosfatosdifosfatos..

Digestión del sustrato L168 Digestión del sustrato L168 marcadomarcado (α (α 3232P)UTP, P)UTP, digerido a 50ºdigerido a 50º con fracción con fracción HT de wt en HT de wt en el transcurso el transcurso del tiempodel tiempo..

Producto analizado en Producto analizado en cromatografia de capa fina.cromatografia de capa fina.

Se observa actividad Se observa actividad PNPasa en la fracción HT.PNPasa en la fracción HT.

Sedimentación del complejoARNasaE-Sedimentación del complejoARNasaE-PNPasa sobre gradiente de glicerolPNPasa sobre gradiente de glicerol

PNPasa residual es una forma de la enzima que no PNPasa residual es una forma de la enzima que no esta asociada con la ARNasaE,por eso no es esta asociada con la ARNasaE,por eso no es perturbada por la desnaturalizacion del producto del perturbada por la desnaturalizacion del producto del gen rne.gen rne.

La PNPasa-ARNasaE en 11-13 son parte de un gran La PNPasa-ARNasaE en 11-13 son parte de un gran complejo proteico.complejo proteico.

Dos posibles interpretaciones de la heterogeneidad:Dos posibles interpretaciones de la heterogeneidad:

- ARNasaE-PNPasa normalmente existen como una - ARNasaE-PNPasa normalmente existen como una mezcla de formas libres y complejos.mezcla de formas libres y complejos.

- Las formas libres son un artefacto debido a la - Las formas libres son un artefacto debido a la perturbación parcial del complejo proteico durante perturbación parcial del complejo proteico durante la purificación.la purificación.

Imunoprecipitación del complejo ARNasa E-Imunoprecipitación del complejo ARNasa E-PNPasa e identificación de las proteínas 85 y PNPasa e identificación de las proteínas 85 y 45kd45kd Inmunoprecipitación con Inmunoprecipitación con

anticuerpo anti-hmp1. anticuerpo anti-hmp1.

La coprecipitación de los La coprecipitación de los polipéptidos de 180, 85 polipéptidos de 180, 85 y 48 Kd, podría deberse y 48 Kd, podría deberse a la interacción a la interacción específica entre los específica entre los mismos.mismos.

HT sirve como marcador y la posición de las proteínas de 180, 85, 50, y 48 kd

B: Control sin antígeno

1: muestran la inmunoprecipitación de PNPasa altamente purificada

2: wt de la fracción AP de nuestra preparación de RNAasa E

3: entrada PNPasa

4: entrada de la fracción AP

La migración de los polipéptidos de 85 y 48 kd de La migración de los polipéptidos de 85 y 48 kd de la preparación de PNPasa en el carril 3 es la preparación de PNPasa en el carril 3 es exactamente igual que la de los polipéptidos de exactamente igual que la de los polipéptidos de 85 y 48 kd en la fracción HT. 85 y 48 kd en la fracción HT.

Una comparación de los carriles 2 y 4 muestra Una comparación de los carriles 2 y 4 muestra que el anticuerpo del anti-hmp1 precipitó que el anticuerpo del anti-hmp1 precipitó selectivamente el producto de 180 kd del gen rne selectivamente el producto de 180 kd del gen rne y la subunidad catalítica de PNPasa de 85 kd. y la subunidad catalítica de PNPasa de 85 kd.

Estaba también clara en el gel original que era el Estaba también clara en el gel original que era el polipéptido de 48 kd immunoprecipitado. polipéptido de 48 kd immunoprecipitado.

El carril 1 es un control importante que muestra El carril 1 es un control importante que muestra que el anticuerpo del anti-hmpl no precipita los que el anticuerpo del anti-hmpl no precipita los polipéptidos 85 y 48 kd en la preparación polipéptidos 85 y 48 kd en la preparación altamente purificada de PNPasa. altamente purificada de PNPasa.

La co-precipitación de los polipéptidos de 180, 85, La co-precipitación de los polipéptidos de 180, 85, y 48 kd en el carril 2 debe ser debida a una y 48 kd en el carril 2 debe ser debida a una interacción específica entre el polipéptido de 180 interacción específica entre el polipéptido de 180 kd y los polipéptidos de 85 y 48 kd. kd y los polipéptidos de 85 y 48 kd.

Comparación de la Comparación de la proteólisis limitada del proteólisis limitada del polipéptido de 85 Kd de la polipéptido de 85 Kd de la fracción HT y PNPasa con fracción HT y PNPasa con proteasa V8.proteasa V8.

El polipéptido de 85 Kd es El polipéptido de 85 Kd es aparentemente idéntico a aparentemente idéntico a la subunidad catalítica de la subunidad catalítica de la PNPasa (pnpla PNPasa (pnp))

1 y 2 son controles que muestran las proteínas purificadas

3 y 4 muestran la proteólisis limitada de las proteínas individuales con la proteasa V8

El carril 5 es la proteólisis de una mezcla igual de cada proteína.

El carril 6 es un control que muestra la proteasa solamente

La figura B muestra una comparación de la proteólisis La figura B muestra una comparación de la proteólisis limitada de las proteínas de 85 kd de nuestra fracción limitada de las proteínas de 85 kd de nuestra fracción HT y de PNPasa. HT y de PNPasa.

Estas proteínas fueron purificadas por SDS-PAGE.Estas proteínas fueron purificadas por SDS-PAGE.

En carriles 3-5, el patrón de productos es En carriles 3-5, el patrón de productos es esencialmente igual con solamente diferencias de esencialmente igual con solamente diferencias de menor importancia en la intensidad de algunas menor importancia en la intensidad de algunas bandas. Esto es probablemente debido a variaciones bandas. Esto es probablemente debido a variaciones pequeñas en el grado de la digestión.pequeñas en el grado de la digestión.

Este experimento muestra que la Este experimento muestra que la proteína de 85 kd en nuestra proteína de 85 kd en nuestra preparación es al parecer idéntica a la preparación es al parecer idéntica a la subunidad catalítica de la PNPasa (pnpα). subunidad catalítica de la PNPasa (pnpα). Este resultado fue confirmado usando la Este resultado fue confirmado usando la papaína. papaína.

Proteólisis limitada del Proteólisis limitada del polipéptido de 48 Kd polipéptido de 48 Kd con V8.con V8.

El polipéptido de 48 Kd El polipéptido de 48 Kd es aparentemente es aparentemente idéntico a la subunidad idéntico a la subunidad de la PNPasa (pnp de la PNPasa (pnp ).).

1 y 2 son controles que muestran las proteínas purificadas

3 y 4 muestran la proteólisis limitada de las proteínas individuales con la proteasa V8

El carril 5 es la proteólisis de una mezcla igual de cada proteína.

El carril 6 es un control que muestra la proteasa solamente

Autorradiograma de la Autorradiograma de la Inmunoprecipitación de Inmunoprecipitación de la ARNasaE parcialmente la ARNasaE parcialmente purificada marcada purificada marcada radioactivamente con radioactivamente con 35S35S metionina metionina. . Esta Esta proteína fue purificada proteína fue purificada con cromatografía S-con cromatografía S-Sepharose.Sepharose.

pnppnp, pnp , pnp y una y una proteína de 50 Kd proteína de 50 Kd coprecipitan con el coprecipitan con el producto del gen rne.producto del gen rne.

   1: precipitación del control usando el suero normal del conejo

2: precipitación con el suero del anti-hmpl

3: proteína radiactiva de la entrada.

El carril 1 muestra que no hay precipitación El carril 1 muestra que no hay precipitación significativa de las proteínas de entrada usando significativa de las proteínas de entrada usando el suero del control, mientras que el carril 2 el suero del control, mientras que el carril 2 muestra el pnpα, el pnpβ, y el co-precipitado de muestra el pnpα, el pnpβ, y el co-precipitado de la proteína de 50 kd del producto del gen rne. la proteína de 50 kd del producto del gen rne.

El carril 2 del autorradiograma fue explorado con El carril 2 del autorradiograma fue explorado con densitometría. densitometría.

La única proteína detectada en los niveles La única proteína detectada en los niveles significativos funcionó cerca de 75 kd (carril 2, significativos funcionó cerca de 75 kd (carril 2, banda débil debajo del pnpα). Está presente en banda débil debajo del pnpα). Está presente en alrededor de 10% la cantidad de la subunidad del alrededor de 10% la cantidad de la subunidad del pnpα.pnpα.

CCaracterización de la forma proteolizada aracterización de la forma proteolizada de lade la ARNasa E ARNasa E

Sedimentación de una forma Sedimentación de una forma degradada de la ARNasa E (ARNasa degradada de la ARNasa E (ARNasa E*) en un gradiente de glicerolE*) en un gradiente de glicerol..

ARNasa E purificada es muy sensible ARNasa E purificada es muy sensible a la proteólisisa la proteólisis

ARNasa E* tiene altos niveles de ARNasa E* tiene altos niveles de actividad endonucleasa y la misma actividad endonucleasa y la misma especificidad que la ARNasa E especificidad que la ARNasa E intactaintacta..

Análisis por Western blotting mostró Análisis por Western blotting mostró que los polipéptidos de 73 y 69 Kd que los polipéptidos de 73 y 69 Kd son producto de la degradación del son producto de la degradación del polipéptido de 180 Kd.polipéptido de 180 Kd.

Como no se detecta los pl. de 85, 50 Como no se detecta los pl. de 85, 50 y 48 Kd y no hay actividad PNPasa, y 48 Kd y no hay actividad PNPasa, los resultados indican que la los resultados indican que la proteólisis del producto del gen proteólisis del producto del gen rnerne durante la purificación, puede durante la purificación, puede romper el complejo ARNasa E-romper el complejo ARNasa E-PNPasa.PNPasa.

--              ..

DiscusiónDiscusión

La copurificación y cosedimentación de la PNPasa con la ARNasa E, La copurificación y cosedimentación de la PNPasa con la ARNasa E, sugiere que ambas enzimas son parte de un sugiere que ambas enzimas son parte de un complejo proteico (CP).complejo proteico (CP).

El CP altamente purificado contiene El CP altamente purificado contiene 4 polipéptidos4 polipéptidos de 180, 85, 50 y de 180, 85, 50 y 48 Kd. El de 85 Kd se identificó como 48 Kd. El de 85 Kd se identificó como pnppnp y el de 48 Kd como y el de 48 Kd como pnp pnp ..

El tratamiento con calor de la enzima producto del gen mutado El tratamiento con calor de la enzima producto del gen mutado resulta en una inactivación de la misma. El mismo tratamiento de la resulta en una inactivación de la misma. El mismo tratamiento de la enzima wt no tuvo efecto en la actividad o en el complejo proteico.enzima wt no tuvo efecto en la actividad o en el complejo proteico.

La ARNasa E es muy La ARNasa E es muy sensible a la proteólisissensible a la proteólisis durante la purificación. durante la purificación. ARNasa E* contiene pl. de 73 y 69 Kd que son fragmentos ARNasa E* contiene pl. de 73 y 69 Kd que son fragmentos proteóliticos del pl. de 180Kd.proteóliticos del pl. de 180Kd.

ARNasa E* tenía un tamaño menor al del CP y no estaba asociada a ARNasa E* tenía un tamaño menor al del CP y no estaba asociada a la PNPasa E. Estos resultados indican que el producto del gen la PNPasa E. Estos resultados indican que el producto del gen rnerne puedepuede romper el CPromper el CP ARNasa E-PNPasa y sugieren que el ARNasa E-PNPasa y sugieren que el sitio sitio catalíticocatalítico de la de la ARNasa EARNasa E está localizado en un está localizado en un dominio de la dominio de la proteína rneproteína rne..

La ARNasa E estaría La ARNasa E estaría asociada a membranaasociada a membrana ya que se requieren ya que se requieren detergentes y alta concentración de sales para su solubilización. El detergentes y alta concentración de sales para su solubilización. El análisis de la forma degradada sugiere que la proteólisis podría liberar análisis de la forma degradada sugiere que la proteólisis podría liberar el dominio del producto del gen el dominio del producto del gen rnerne que contiene el sitio catalítico que contiene el sitio catalítico ARNasa E.ARNasa E.

Posibles funciones del resto de la proteína: regulación de la actividad Posibles funciones del resto de la proteína: regulación de la actividad ARNasa e interacción de la ARNasaE con la PNPasa u otras nucleasas.ARNasa e interacción de la ARNasaE con la PNPasa u otras nucleasas.

La asociación física sugiere que las La asociación física sugiere que las dos actividades tal vez actúan de dos actividades tal vez actúan de forma concertadaforma concertada durante el procesamiento y degradación del ARN. durante el procesamiento y degradación del ARN.

La degradación se iniciaría por por la unión del CP. La La degradación se iniciaría por por la unión del CP. La ARNasa E ARNasa E realizaría un endoclivaje y el nuevo extremo 3’ generado sería atacado realizaría un endoclivaje y el nuevo extremo 3’ generado sería atacado por la PNPasapor la PNPasa..

   Una vez que actúa la exonucleasa, la ARNasa E se alejaría del Una vez que actúa la exonucleasa, la ARNasa E se alejaría del

complejo. Esto permitiría la asociación de la ARNasa E con una PNPasa complejo. Esto permitiría la asociación de la ARNasa E con una PNPasa libre, comenzando nuevamente el ciclo. También es posible que libre, comenzando nuevamente el ciclo. También es posible que permanezcan asociadas durante todo el proceso.permanezcan asociadas durante todo el proceso.

FINFIN