Jurnal Mikrobiologi Indonesia, September 2005, him. 75-78 ISSN0853-358X

Vol. 10, No. 2

Dinamika Populasi Acetobacter Selama Proses Fermentasi Nata de Coco

Pqpulation Dynamics ofAcetobacter During Nata de Coco Fermentation

CECILlA A. SEUMAHU'j, ANTONIUS SUWANT02' & MAGGY T. SUHARTON03

'Program Pascasnrjana Bioteknologi, Instilul Pertnnian Bogor, Knmpus Darmngn, Bogor 16680 'Deportemen BioIogi, FMIPA, Instilul Pertaninn Bogor, Jnlnn Rayn Pnjnjaran, Bogor I6144

IDepartemen Teknologi Pnngpn dnn Gizi, InslitnlPertnninn Bogor, Knmpus Dnrmngn, Bogor 16680

One of the important problems in traditional nara de coco (nala) fermentation is production inconsistency due to strain composition. This research was aimed to examine population dynamics o f Acefobacler community during fermentation processes. We also examined genetic diversity of Acelobocfer xylinum strains employing pulsedfield gel electrophoresis. Samples were collected everyday for six days from fermentation media derived from "good" and "bad" natn fermentation. We compared the levels of bacterial community diversity through amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). DNA was extracted directly from fermentation media. The amplicons were cloned into pGEM-T Easy vector, and restriction enzymes HneIII and RsnI were used to generate ARDRA profiles. 16s-rRNA gene from single colony was amplified employing specific Acefobacler primers. Phylotype profiles demonstrated unique Acerobocter community profiles for different condition of nafa quality. The dynamics of Acelobocfer population involved in noln fermentation are crucial factor for determining traditional nala quality.

Key words: nata de coco, bacterial community dynamics, ARDRA, Acetobacterxylinum

Dinamika dan aktivitas komunitas bakteri selama produksi keju dan fermentasi sour cassava telah dipelajari dan ditemukan adanya perubahan dinamika populasi mikroorganisme selama proses fermentasi (Ampe et al. 2001; Randazzo et al. 2002). Dinamika populasi mikroorganisme ini dipelajari untuk melihat peranan masing-masing mikroorganisme dalam proses fermentasi sehingga dapat dirancang suatu kultur starter yang cukup baik. Keberadaan mikroorganisme ini akan mempengaruhi kualitas hasil fermentasinya. Marsh et al. (2000) menyatakan bahwa dinamikapopulasi perlu dipahami melalui analisis komunitas untuk memahami struktur dan fungsi suatu komunitas. Analisis komunitas memberi peluang untuk mengidentifikasi galur-galur tertentu yang unik dan dominan dalam lingkungan yang terkontrol.

Kendala yang dibadapi dalam mempelajari komunitas mikroorganisme pada makanan ialah sulitnya mengultivasi miboorganisme tersebut pada media standar laboratorium dan ha1 ini menjadi penyebab sangat sedikitnya bakteri yang teramati dari bahan makanan. Padahal keragaman mikroorganisme karma adanya tekanan proses pengolahan makanan itu sendiri tinggi (Giraffa & Neviani 2001). Proses fermentasi nata de coco (nata) saat ini belum banyak dipelajari dan dipahami, padahal proses tersebut memiliki aspek yang

tAlamat kini: FMIPA, Universitas Pattimura, Jalan Ir. M. Putuhena, Kampus Poka, Ambon 97233

'Penulis untuk korespondensi, TelFax. +62-251-315107, E-mail: asuwanto@indo.net.id

cukup menarik dan penting dari aspek komersial maupun penelitian dasar untuk dikaji. Kondisi medianya bersifat sangat asam (pH 2-3) sehingga tidak semua bakteri dapat dikulturkan. Ampe et al. (1999) menyatakan teknik yang tidak bergantung pada proses kultivasi, dapat menggambarkan dinamikapopulasi secara lebii baik. Amplilikasi gen yangmenyandikan 16s rRNA, kloning, dan sekuensing mempakan salah satu metode untuk mengidentifkasi mikroorganisme tanpa harus mengulturkan (Weisburg et a[. 1991).

Penelitian ini bertujuan mengetahui dinamika keragaman populasi bakteri selama proses fermentasi nata menggunakan teknik amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Keragaman di antara galurA.xylinum sampai saat ini belum pernah dilaporkan. Keragaman galur A. xylinum dianalisis menggunakan teknikpulsedfieldgel electrophoresis (PFGE) (Suwanto 1994) untuk memberikan gambaran skisotipe masing-masing galur secara lebih spesifik.

BAHAN DAN METODE

Bahan. Sampel berupa cairan media fermentasi nata dari proses fermentasi dengan hasil yang baik dan jelek diambil pada bari 5,6,7,8,9, dan 1 1 untukanalisis ARDRA. Pengambilan . sampel ini dilakukan setelab mulai jelas teramati nata yang dikategorikan baik dan jelek. Sampel cairan media fermentasi nata yang dikategorikan baik ialah yang menghasilkan nata dengan tekstur tebal dan mulus sedangkan yang dikategorikan jelek menghasilkan nata dencan tekstur bergelembung dan

76 SEUMAHU ETAL.

agak keras. Galur yang digunakan untukmengetahui keragaman A. xylinum adatujuh yaitu 5 galur koleksi: galur M, G4IK, M*, IB-1, RMlC; dan 2 galur hasil isolasi dari media fermentasi nata: galur B dan K-1. Keragaman galur A. xylinum dianalisis menggunakan PFGE. Sampel cairan media fermentasi dan galur A. xylinum yang digunakan diambil dari salah satu perusahaan nata di Jakarta (nama perusahaan tidak dipublikasikan).

Pembuatan GelInsert dan PFGE. Pembuatan gel insert dan PFGE dilakukan mengikuti Suwanto dan Kaplan (1989) menggunakan piranti CHEF-DRII (Biorad, Richmond, CA). Sel A. xylinum terlebih dahulu diberi enzim pendegradasi selulosa untuk memudahkan proses h i s sel. Sel selanjutnya dijerap dalam low melting agarose (Sigma). Gel insert diberi larutan pelisis sel dan dicuci untukmenghilangkan sisa-sisamateri sel yang lisis sehingga banya genom total A. xylinum terjerab yang ada di dalam gel insert. Genom A. xylinum selanjutnya dipotong dengan enzim SpeI dan selanjutnya dilarikan pada PFGE dengan kondisi elektroforesis: waktu pulsa awal (It) = 4 detik, waktu pulsa akhir (Ft) = 40 detik, waktu elektroforesis (Rt) = 24 jam, dan voltase = 5.4 V. Sebagai penanda molekuler digunakan Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 yang dipotong dengan AseI (Suwanto & Kaplan 1989).

Isolasi DNA. Isolasi DNA dari sampel dilakukan menggunakan metode Ampe et al. (1999).

Amplifikasi dan Kloning Gen 16s rRNA. Amplifikasi gen 16s rRNA dilakukan menggunakan pasangan primer spesifk bagi kelompok Acetobacter Xyl-f dan Xyl-r (sekuen primer tidak dipublikasikan) dengan kondisi polymerase chain reaction (PCR): jumlah siklus 30; denaturasi 92 "C, 30 detik; penempelan primer 55 OC, 30 detik; dan pemanjangan 75 OC, I menit.

Gen 16s-rRNA hasil amplifikasi dimumikanmenggunakan WizarPSV Gel andPCR Clean Up System. Hasil pernumian diligasikan ke vektor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA) dan ditransformasikan ke dalam Escherichia coli DHSa. Transforman diseleksi pada media agar-agar Luria (AL) yang dibubuhiampisilii(100 p g d ' ) danx-Gal(40 pgml-'). Gen 16s- r-RNA pada plasmid rekombinan selanjutnya diamplifhsi lagi menggunakan pasangan primer M13f dan M13r (Moffett et al . 2000). Penggunaan primer ini dimaksudkan untuk mengamplifikasi gen 16s-rRNA yang hanya terdapat pada plasmid rekombinan.

AmplifiedRibosomal DNA Restriction Analysis. Analisis ARDRA dilakukan terhadau Zen 16s-rRNA hasil amnlifikasi . - dari plasmid rekombinan menggunakan enzim RraI dan HaeIII. Gen 16s-rRNA hasil amplifkasi dari plasmid rekombiian yang dipotong dengan enzim restriksi akan menghasilkan sejurnlah pola pita spesifik yang mewakili genotipe Acetobacter yang ada dan dikodekan dengan profil 1, profil2, dan seterusnya. Pola pita yang muncul selanjutnya dihitung persentasinya per hari fermentasi dan dibuat kurva dinamika populasinya.

SkisotipeSpeIdari Sejnmlah IsolatAceiobacierxylinum. Galur koleksi Acetobacter maupun biakan murni hasil isolasi dari contoh cairan media fementasi nata menunjukkan ada

JMikrobiol Indones

enam galur yangmemiliki profil berbeda sedangkan satu profil menunjukkan kesamaan dengan salah satu dari ketujuh profil yang ada. Dua galur Acetobacter xylinum yang menunjukkan skisotipe SpeI yang sama ialab galur G4IK dan galur B. Selain itu ditemukan pula galur Acetobacter yang baru, galur K-1 yang berbeda dari galur koleksi perusahaan (Gambar 1).

Galur B dan galur K-l digolongkan sebagai kelompok Acetobacter karena gen 16s-rRNA keduanya hanya dapat diamplifikasi menggunakan primer spesifik untuk kelompok Acetobacter, dan memiliki profil ARDRA yang sama dengan isolat kultur koleksi yang lain. Selain itu, galur B mampu membentuk pelikel selulosa walaupun kemampuan ini tidak terlihat pada galur K-1 .

Profi l Acetobacier yang Terl ibat dalam Proses Fermentasi. Hasil analisis ARDRA dari gen 16s-rRNA yang dipotong dengan RsaI dan HaeIII menunjukkan adanya tiga belas pola pita kelompok Acetobacter yang berbeda (Gambar 2). Masing-masing profil ARDRA yang ditemukan pada proses fermentasi selanjutnya dihitung persentasi keberadaannya setiap hari fermentasi dimulai dari hari ke-5 sampai hari ke-1 1. Tiga profil ARDRA dianggap unik keberadaannya karena ditemukan pada setiap bari fermentasi dan adanya cukup menonjol, ketigaprofil ARDRA tersebut ialahprofil 1,2, dan 3 (Gambar 3). Kurva pola pertumbuhan Acetobacter profil 2 cenderung berfluktuasi secara ekstrem pada proses fermentasi dengan hasil nata yang jelek (Gambar 3a) sedangkan pada fermentasi dengan hasil nata yang baik cenderung stabil (Gambar 3b). Profil4-13 tidak digambarkan pada kurva pola pertumbuhan karena hanya dijumpai pada hari-hari tertentu saja dan tidak berada dalam persentasi yang cukup besar (data tidak disajikan).

PEMBAHASAN

SkisotipeSpeI dari Sejnmlah IsolatAcetobacterxylinum. Hasil skisotipe DNA genom Acetobacter yang dipotong dengan SpeI menunjukkan bahwa galur M, M*, G41K, K-1, IB- 1, dan RMlC memiliki profil berbeda (Gambar 1). GalurB memiliki kemiripan profil dengan galur G4IK, berarti galur ini sebenarnya merupakan galur G4IK ditinjau dari sisi total genomnya.

Hasil isolasi Acetobacter pada media agar-agar memang sering menunjukkan adanya penampakan koloni yang sama. Hal ini terutama terjadi karena bakteri ini merupakan genus yang sama bahkan dalam spesies yang sama. Penampilan koloni yang sama tidakselalumenjamin bahwa koloni tersehut benar- benar sama. Pulsed field g e l electrophoresis dapat menunjukkan sidikjari setiap isolat yang menjadi ciri khasnya. Hasil di atas menunjukkan bahwa galur yang tadinya diduga sebagai galur B ternyata merupakan galur G4IK sedangkan galur K-1 memang merupakan isolat yang benar-benar berbeda dari kultur koleksi.

Dalam proses fermentasi, dinamika populasi bakteri yang tumbuh memang sulit diduga. Hal ini terutama terjadi karena kondisi lingkungan yang tidak dapat dikontrol dengan baik selama fementasi berlangsung. Skisotipe SpeI di atas tidak hanya menggambarkan ciri khas masing-masing galur saja,

78 SEUMAHU ETAL.

media. Hasil profil ARDRA yang diperoleh mengindikasikan bahwa dalam suatu proses fermentasi nata secara hadisional, A. xylinum yang ditambahkan pada awal fermentasi sebagai bibit dapat juga bersimbiosis dengan Acetobacter lain yang muncul selamaproses fermentasi berlangsung. Keberadaannya dapat saja bersifat menguntungkan maupun memgikan bagi proses fermentasi tersebut.

Acetobacter profil 2 memiliki kesamaan profil ARDRA dengan kultur koleksi (data tidak disajikan). Acetobacter profil 2, yang sering digunakan sebagai bibit, cenderung berfluktuasi secara ekstrem pada proses fermentasi dengan hasil nata yang jelek, demikian pula dengan profil Acterobocter yang lain. Selain itu jumlah profil lain yang tidak dominan cenderung lebih banyak muncul pada fermentasi dengan hasil nata yang jelek(data tidak disajikan).

Hal yang dapat dijelaskan dari hasil ini ialah keberadaan isolat inokulum haruslah stabil selama proses fermentasi. Fluktuasi populasi inokulum selama proses fermentasi akan berpengaruh terhadap banyaknya serat selulosa yang dihasilkan. Selain itu padaproses fermentasi dengan hasil yang baik, keragaman spesies Acetobacter yang ada dalam media hams terkontrol, karena isolat Acetobacter yang berbeda akan menghasilkan karakter serat selulosa yang berbeda pula. Beragamnya galur-galur Acetobacter yang tidak terkonhol dalam suatu proses fermentasi nata diduga akan menghasilkan tekstur nata yang tidak terlalu baik.

Fluktuasi Acetobacter yang cukup besar pada media fermentasi dengan hasil yang jelek diduga karena adanya pengaruh simbiosis dengan bakteri lain. Pada fermentasi dengan hasil yang baik, dijumpai jenis bakteri dalam Domain Bacteria yang cukup beragam dihandingkan dengan pada fermentasi dengan hasil yangjelek. Padafermentasi yangjelek jenis bakteri dari Domain Bacteria tidak terlalu heragam dan relatif sedikit jumlahnya. Keberadaan bakteri-bakteri lain ini diduga dapat menunjang kebutuhan galur inokulum yang mungkin tidak tersedia pada media fermentasi dengan komposisi yang tidak terdefinisi dan terukur konsentrasinya secara tepat. Faktor lain yang mungkin juga berpengamb ialah pH cairan media fermentasi selama proses fermentasi berlangsung. Profil ARDRA pada hari ke-6 fermentasi tidak teramplifikasi, ha1 ini dapat disebabkan karena konsentrasi DNA yang diperoleh sangat sedikit.

Secara keseluruhan dapat terlihat bahwa suatu proses fermentasi yang pada awalnya dimulai dengan galur yang mumi pada akhimya mempakan kultur campuran. Keberadaan galur tertentu dalam jumlah yang kecil penting untuk keberhasilan fermentasi, namun dalam jumlah yang terlalu

JMilirobiol Indones

tinggi jushu memgikan. Meskipun demikian, ada pula bakteri yang keberadaannya tidak terlalu berpengaruh dalam menghasilkan nata. Bakteri-bakteri kelompok ini dapat ditemukan pada nata yang baik atau jelek. Untuk mempertahankan stabilitas fermentasi perlu adanya pengontrolan pertumbuhan kultur yang mungkin dapat memberikan hasil negatif. Faktor-faktor pengonhol itu sendiri perlu dipelajari lebih lanjut.

UCAPAN TERIMA KASM

Penelitian ini didanai oleh Research Centerfor Microbial Diversity. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor dan PT Niramas Utama Jakarta. Penelitian ini mempakan bagian dari tesis CAS.

D m A R PUSTAKA

Ampe F, Ben Omar N, Moizan C, Wacher C, Guyot 1. 1999. Polyphasic study of the spatial distribution of microorganisms in mexican pozol, a fermented maize dough, demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations. Appl Environ Microbiol 65:5467-5473.

Ampe F. Silvent A, Zakhia N. 2001. Dynamics of microbial community responsible for traditional sour cassava starch fermentation studied by denaturing gradient gel electrophoresis and quantitative rRNA hybridisation. In1 J Foad Microbiol 65:45-54.

Giraffa G, Neviani E. 2001. DNA-based, culture independent strategies for fvaluating microbial communities in food-associated ecosystems. In1 J Food Microbiol 67:19-34.

Marsh TL, Saxman P, Cole J, Tiedje 1. 2000. Terminal restriction fragment length polymorphism analysis program, a web-based research tool for microbial community analysis. Appl Environ Microbiol 66:3616-3620.

Moffet BF, Walsh KA, Harris JA, Hill TCJ. 2000. Analysis of bacterial community structure using 16s rDNA analysis. Anaerobe 6:129- 131.

Moschetti G, Blaiotta G Villani F, Copola S. 2001. Nisin-producing organisms during traditional 'Fior di lane' cheese-making monitored by multiplex-PCR and PFGE analyses. In1 JFoad Microbiol 63:109- 116.

Randazzo CL, Toriani S, Akkermans DADL, de Vos WM, Vaughan EE. 2002. Diversity, dynamics and activity of bacterial communities during production of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16s rRNA analysis. Appl Environ Microbiol 68:1882-1892.

Suwanto A. 1994. Pulsed field gel electrophoresis : A revolution in microbial genetics. AsPac J Mol Biol Biotechnol 2:78-85.

Suwanto A, Kaplan S. 1989. Physical and genetic mapping of the Rhodobacler sphoeroides 2.4.1 genome : presence of two unique circular chromosome. J Bacleriol 171:5850-5859.

Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Jane DJ. 1991. 16s Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacreriol 173~697- 703.