ความเป นพิษและกลไกการเหน...

ความเปนพษิและกลไกการเหน่ียวนําการตาย แบบ apoptosis โดยสารสกัด

จากเปลือกมังคุดในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก

ปริญญานิพนธ

ของ

พิเชษฐ เกยีรติพรศักดา

เสนอตอบัณฑติวิทยาลัย มหาวทิยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ เพื่อเปนสวนหนึ่งของการศึกษา

ตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวชิาเทคโนโลยชีีวภาพ

กันยายน 2553




ของ





ลิขสิทธิ์เปนของมหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ



บทคัดยอ ของ





พิเชษฐ เกียรติพรศักดา. (2553). ความเปนพิษและกลไกการเหน่ียวนําการตายแบบ apoptosis โดย

สารสกัดจาก เป ลือกมั ง คุดใน เซลลมะ เ ร็ งต อม ลูกหมาก .ปริญญานิพนธ วท .ม .

(เทคโนโลยีชีวภาพ) กรุงเทพฯ: บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ.

คณะกรรมการควบคุม: รองศาสตราจารย ดร.รมิดา วัฒนโภคาสิน, ผูชวยศาสตราจารย

ดร.วัลยา ธเนศพงศธรรม.

โรคมะเร็งตอมลูกหมากเปนโรคที่พบไดในผูชาย ซึ่งการรักษาโรคมะเร็งตอมลูกหมากตอง

อาศัยเคมีบําบัด ซึ่งมีขอจํากัด คือ มีคาใชจายสูง และมีผลขางเคียงตอผูปวย ดังนั้นการใชสารสกัดจาก

พืชจึงเปนอีกทางเลือกหนึ่งในการรักษาโรคมะเร็งตอมลูกหมาก งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงคที่จะศึกษา

ถึงความเปนพิษของ สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ตอเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก

PC-3 ซึ่งพบวา สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด สามารถฆา เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก

PC-3 โดยมีคา IC50 ที่ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร จากการวัดจํานวนเซลลที่มีชีวิตอยู พบวา

ความสามารถการยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล ข้ึนอยูกับความเขมขนและเวลาที่ใชของสารสกัด

หยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด และ จากการยอมนิวเคลียส ดวย Hoechst 33342 และการ

ทํา gel-electropheresis แสดงใหเห็นวา สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด สามารถ

เหนี่ยวนําใหเกิดการหดตัวของ chromatin และการแตกหักของช้ิน DNA ซึ่งเปนรูปแบบของ

กระบวนการ apoptosis ยิ่งกวานั้น การทดสอบการทํางานของเอนไซม caspase พบการแสดงออก

ของเอนไซม caspase-3 และ caspase-8 ซึ่ง เกี่ยวของกับกลไกการเกิด apoptosis จึงเปนไปไดวา

กระบวนการเกิด apoptosis ที่พบในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก จากการเหนี่ยวนําของสารสกัดกลุม

xanthone จากเปลือกมังคุด อาจเกิดข้ึนผาน death receptor pathway

CYTOTOXICITY AND APOPTOTIC INDUCTION MECHANISM

BY MANGOSTEEN EXTRACT IN PROSTATE CANCER CELLS

AN ABSTRACT BY

PICHET KIRTTIPORNSAKDA

Presented in Partial Fulfillment of the Requirements for the

Master of Science Degree in Biotechnology

at Srinakharinwirot University

September 2010

Pichet Kirttipornsakda. (2010). Cytotoxicity and apoptotic induction mechanism by

mangosteen extract in prostate cancer cells.Master thesis, M.S. (Biotechnology).

Bangkok : Srinakharinwirot University. Advisor Committee: Assoc. Prof. Dr. Ramida

Watanapokasin, Assist. Prof. Dr. Wanlaya Tanechpongtamb

Prostate cancer is commonly diagnosed in men. Since chemotherapeutic are quite

limited due to high cost and side effect , therefore, phytochemical must to choice for

prostate cancer therapy . the objective in This project was to studied the effect of xanthone

isolated from pericarp of mangosteen(Garcinia mangostana Linn.) on cytotoxicity in prostate

cancer PC-3 cells. The result show that xanthone induced cytotoxic effect with IC50 at 10

μg/ml.The viability assay showed a time-dose dependent growth inhibitory.Hoechst 33342

nuclear staining and nucleosomal DNA-gel electrophoresis revealed that xanthone could

induce nuclear condensation and fragmentation, typically seen in apoptosis. Moreover,

confirmatory caspase activity assay showed cacpase-3 and caspase-8 activities ,then

possible to apoptosis mechanism in PC-3 cells to depending death receptor pathway


เร่ือง



ของ


ไดรับอนุมัติจากบัณฑิตวทิยาลัยใหนับเปนสวนหนึง่ของการศึกษาตามหลักสูตร

ปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาชีววทิยา

ของมหาวทิยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ

..........................................................................คณบดีบัณฑิตวิทยาลัย

(รองศาสตราจารย ดร.สมชาย สันติวัฒนกุล)

วันที่.......เดือน กนัยายนพ.ศ. 2553

คณะกรรมการควบคุมปริญญานพินธ คณะกรรมการสอบปากเปลา

................................................................. ประธาน .................................................. ประธาน

(รองศาสตราจารย ดร.รมิดา วฒันโภคาสิน) (ดร.นุจรี สุวรรณรชต)

................................................................. กรรมการ .................................................. กรรมการ

(ผูชวยศาสตราจารย ดร.วัลยา ธเนศพงศธรรม) (รองศาสตราจารย ดร.รมิดา วฒันโภคาสิน)

.................................................. กรรมการ

(ผูชวยศาสตราจารย ดร.วัลยา ธเนศพงศธรรม)

.................................................. กรรมการ

(ดร.เฟองฉัตร จรินทรธนันต)

ประกาศคุณูปการ

ปริญญานิพนธฉบับนี้สําเร็จสมบูรณไดดวยความชวยเหลือ แนะนํา และใหความอนุเคราะห

อยางดียิ่งจากรองศาสตราจารย ดร.รมิดา วัฒนโภคาสิน อาจารยที่ปรึกษาปริญญานิพนธ และผูชวย

ศาสตราจารย ดร. วัลยา ธเนศพงศธรรม อาจารยที่ปรึกษาวิทยานิพนธรวม ผูซึ่งกรุณาใหคําปรึกษา

และแนะนํา ตลอดจนขอคิดเห็นตางๆ ทําใหงานวิจัยนี้สําเร็จลุลวงไดดวยดี รวมทั้งไดชวยแกไขปริญญา

นิพนธฉบับนี้ใหมีความสมบูรณยิ่งข้ึน ขาพเจาขอขอบพระคุณไว ณ โอกาสนี้

ขอขอบพระคุณ ดร.นุจรี สุวรรณรชต และ ดร.เฟองฉัตร จรินทรธนันต ที่กรุณารับเปน

คณะกรรมการสอบปริญญานิพนธ และชวยแกไขปริญญานิพนธฉบับนี้ใหมีความสมบูรณและเปนที่

ยอมรับในแวดวงวิชาการมากยิ่งข้ึน และขอพระคุณคณาจารยภาควิชาชีวเคมี และภาควิชาชีววิทยา

ทุกทาน ที่ไดประสิทธิ์ประสาทวิชาความรู และใหความเมตตาแกขาพเจามาตลอด

ขอขอบพระคุณ คุณ อังคณา กระจาง และคุณเพียงจันทร โพธิ์ยอย นักวิจัยที่กรุณาชวย

เตรียมวัสดุอุปกรณ ใหคําแนะนําชวยเหลือและถายทอดความรู และเทคนิคตางๆ รวมทั้งขอคิดเห็น

ตางๆ ที่เปนประโยชน ซึ่งมีสวนชวยใหปริญญานิพนธฉบับนี้สําเร็จลงไดดวยดี

ขอขอบพระคุณภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ ที่ได

เอ้ือเฟอสถานท่ี เคร่ืองมือ และอุปกรณตางๆ ใหขาพเจาไดใชตลอดระยะเวลาของการทําปริญญา

นิพนธฉบับนี้

ขอขอบคุณพี่นองและเพื่อนๆทุกคนในหองปฏิบัติการ cells culture คณะแพทยศาสตร

มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ สําหรับคําแนะนํา ชวยเหลืออํานวยความสะดวก และใหกําลังใจแก

ขาพเจา ขาพเจารูสึกซาบซึ้งในความกรุณาและความชวยเหลือตางๆ ที่ขาพเจาไดรับทั้งในทางตรงและ

ทางออม

ขาพเจาขอนอมระลึกถึงพระคุณของบิดา มารดา และครอบครัวของขาพเจาที่ไดใหกําลังใจ

ชวยเหลือ สนับสนุน และ ชื่นชมในความเพียรพยายามของขาพเจา ต้ังแตเร่ิมทําปริญญานิพนธจน

เสร็จส้ินสมบูรณ

คุณคาและประโยชนใดๆที่เกิดข้ึนจากปริญญานิพนธฉบับนี้ ขาพเจาขอมอบแดบิดา มารดา

ครูอาจารยและผูมีพระคุณทุกทาน


สารบัญ

บทที ่ หนา 1 บทนํา...................................................................................................................................... 1

ความมุงหมายของการวิจัย................................................................................................... 4 ความสําคัญของการวิจัย..................................................................................................... 4 ขอบเขตของการวิจัย........................................................................................................... 4 นิยามศัพทเฉพาะ................................................................................................................ 4 สมมติฐานในการวิจัย.......................................................................................................... 6

2 เอกสารและงานวิจัยที่เก่ียวของ...................................................................................... 7 โรคมะเร็ง............................................................................................................. 7

มะเร็งตอมลูกหมาก.............................................................................................. 8

ยาตานมะเร็งที่ไดจากสารสกัดธรรมชาติ........................................................................... 10

Apoptosis................................................................................................................. 10

มังคุด..................................................................................................................................... 12

3 วิธีดําเนินการวิจัย................................................................................................................ 15

เซลลมะเร็งและสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด................................... 15

เคร่ืองมือที่ใชในการทดลอง............................................................................................ 15

สารเคมีที่ใชในการทดลอง......................................................................................... 15

วิธีดําเนินการทดลอง................................................................................................ 16

การเพิ่มจํานวนเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC3………...……...……….....…….… 16

การทดสอบความเปนพิษของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่

สามารถฆาเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ดวยวิธี MTT.................................

16

การทดสอบความเขมขนและเวลาท่ีเหมาะสมของสารสกัดหยาบกลุม xanthone

จากเปลือกมังคุดในการฆาเซลลมะเร็ง..............................................................

17

การศึกษาการเกิด apoptosis ในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ที่ถูกเหนี่ยวนํา

โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด........................................

17

สารบัญ (ตอ)

บทที ่ หนา 4 ผลการทดลอง.................................................................................................... 20 ความเปนพิษของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ตอเซลลมะเร็ง

ตอมลูกหมาก PC-3.......................................................................................... 20

ความเขมขนและเวลาที่เหมาะสมในการฆาเซลลมะเร็งของสารสกัดหยาบกลุมxanthone จากเปลือกมังคุด................................................................................ 21

การศึกษาการเกิด apoptosis ในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ที่ถูกเหนี่ยวนํา

โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด………...........…………....… 22

การเปล่ียนแปลงรูปรางของนิวเคลียส............................................................. 22 การตรวจสอบการแตกหักของ DNA โดยอาศัยเทคนิค agarose gel

electrophoresis DNA fragmentation....................................................... 24

การทํางานของเอนไซม caspase โดยวิธี Western bloting............................. 25 5 สรุป อภิปรายผล และขอเสนอแนะ................................................................... 26 บรรณานุกรม................................................................................................................ 29 ภาคผนวก...................................................................................................................... 34 ประวตัิยอผูวิจัย............................................................................................................. 39

บัญชีตาราง

ตาราง หนา 1 แสดงจํานวนผูปวยโรคมะเร็งชนิดตางๆ ในป ค.ศ. 2007................................................... 8

2 แสดงสวนผสมพอลิอะคริลาไมดของ separating gel และ stacking gel....................... 38

บัญชีภาพประกอบ

ภาพประกอบ หนา 1 โครงสราง MTT………………………………………..................................................... 5

2 ข้ันตอนการเกดิ apoptosis.................................................................................................... 6

3 กลไกการเกิด apoptosis.................................................................................................... 12

4 โครงสราง xanthone…....................................................................................................... 13

5 กราฟผลการทดสอบความสามารถของสารสกัดหยาบกลุม x a n t h o n e ในการฆา

เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก P C - 3........................................................................................

20

6 กราฟผลการทดสอบความเขมขนและเวลาที่ เหมาะสมในการฆาเซลลมะเร็ง

เปรียบเทียบกับความเขมขนของสารสกัดหยาบกลุม xanthone ณ ชวงเวลาตางๆ......

21

7 การศึกษาการเกิด apoptos is โดยดูจากการเปล่ียนแปลงนิวเคลียสของเซลลมะเร็ง

ตอมลูกหมากPC-3 โดยการยอมดวยสี Hoechst ที่ความเขมขนตาง………....………

23

8 การตรวจสอบลักษณะการแตกหักของ DNA (DNA fragmentation) ในเซลลมะเร็ง

ตอมลูกหมาก PC-3………………………..…………………………………...……... 24 9 การตรวจสอบความจําเพาะของเอนไซม caspase ตอ Anti-caspase-3…………….... 25

10 การตรวจสอบความจาํเพาะของเอนไซม caspase ตอ Anti-caspase-8......................... 25

บทที่ 1 บทนํา

ภูมิหลัง ในปจจุบันมะเร็งจัดวาเปนโรคที่เปนปญหาเกี่ยวกับสุขภาพที่สําคัญยิ่งโรคหนึ่ง ซึ่งพบวามี

ผูปวยดวยโรคมะเร็งเพิ่มข้ึนเปน 9 ลานคน และคาดการณวาจะเพิ่มข้ึนเปน 15 ลานคน ในป พ.ศ.

2563 ซึ่งผูปวยสวนใหญเปนประชากรในกลุมประเทศกําลังพัฒนา (American Cancer Society.

2007) และในประเทศไทย โรคมะเร็งจัดวาเปนสาเหตุของการเสียชีวิตที่สําคัญอีกโรคหนึ่ง (Sriplung

H; et al. 2003)

จากรายงานของสถาบันมะเร็งแหงชาติ พบวาจํานวนผูปวยโรคมะเร็งในประเทศไทยมีจํานวน

เพิ่มข้ึนทุกๆ ป โดยโรคมะเร็งจัดเปนโรคที่คราชีวิตคนไทยเปนอันดับตนๆ (Attasara P. 2006)

โรคมะเร็งเปนโรคที่เกิดข้ึนไดกับทุกเพศทุกวัย โดยพบวาการเกิดโรคมะเร็งนั้น เกิดข้ึนไดจาก

หลายๆปจจัย เชน ปจจัยจากส่ิงแวดลอมภายนอกรางกาย เชน สารกอมะเร็งที่ปนเปอน ในอาหาร

อากาศ เคร่ืองด่ืม ยารักษาโรค เปนตน รวมทั้งการไดรับรังสี เช้ือไวรัส เช้ือแบคทีเรีย และ

ปจจัยภายในรางกาย เชน ความผิดปกติทางพันธุกรรม ความบกพรองของระบบภูมิคุมกัน และภาวะ

ทุพโภชนา เปนตน ซึ่งโรคมะเร็งชนิดเดียวกันอาจเกิดไดจากสาเหตุตางๆกัน เนื่องจากในแตละชุมชนมี

ส่ิงแวดลอมที่ตางกัน และการไดรับปจจัยเส่ียงหลายๆอยางรวมกัน จะทําใหเกิดเปนโรคมะเร็งไดเร็วข้ึน

สงผลใหอัตราการเส่ียงตอการเปนโรคมะเร็งเพิ่มมากข้ึนตามไปดวย

ในผูชายมะเร็งที่พบไดบอยไดแก มะเร็งตับ มะเร็งปอดและมะเร็งตอมลูกหมาก โดยเฉพาะ

มะเร็งตอมลูกหมากมีอัตราการเกิดโรคเพิ่มข้ึนอยางรวดเร็วและพบวาการเกิดโรคมีความสัมพันธกับ

อายุ โดยเร่ิมจากอายุ 45 ปข้ึนไป และจะพบจํานวนผูปวยโรคมะเร็งตอมลูกหมากเพิ่มมากข้ึนตามอายุ

(จุฑามาศ แอนเนียน. 2550)

มะเร็งตอมลูกหมากเกิดข้ึนจากการที่เซลลในตอมลูกหมากเกิดการแบงตัวมากผิดปกติจน

กลายเปนกอนมะเร็ง ในระยะแรกๆ ผูปวยจะไมมีอาการของโรคจนเมื่อกอนมะเร็งโตและลุกลามไปอุด

ตันทอปสสาวะทําใหเกิดอาการปสสาวะบอย เจ็บปวดเวลาถายปสสาวะ ในระยะทายๆ เมื่อมะเร็งเกิด

การแพรกระจาย ผูปวยจะมีอาการปวดกระดูก ปวดตามขอ ปวดหลัง น้ําหนักลด ออนเพลีย เบ่ืออาหาร

มีอาการปสสาวะขัด และมีเลือดปนออกมากับปสสาวะ (Narayan P. 1995)

2

การรักษาผูปวยโรคมะเร็งในระยะแรกของการเกิดโรคสามารถรักษาใหหายขาดไดโดยการ

ผาตัดหรือการฉายรังสี (radiotherapy) แตมักไมคอยไดผลเนื่องจากผูปวยสวนใหญจะรูตัววาตนเอง

เปนโรคมะเร็งก็ตอเมื่อมีการแพรกระจายของเซลลมะเร็งไปยังอวัยวะตางๆ แลว ดังนั้นจึงจําเปนตอง

อาศัยการรักษาดวยเคมีบําบัด (chemotherapy) หรือใชการรักษาดวยเคมีบําบัดรวมกับการรักษาวิธี

อ่ืน ยาเคมีบําบัดเมื่อเขาสูรางกายจะไปทําลายเซลลมะเร็ง และทําลายเซลลปกติบางสวน โดยเฉพาะ

เซลลที่มีการเจริญเติบโต และแบงตัวอยางรวดเร็ว เชน เซลลเยื่อบุทางเดินอาหาร,เสนผม,เม็ดเลือด

เปนตน ซึ่งผลขางเคียงของการรักษาดวยเคมีบําบัด พบไดหลายอาการ เชน ผมรวง คล่ืนไส อาเจียน มี

แผลในปาก ปริมาณเม็ดเลือดลดลง ในผูปวยบางราย อาจพบอาการขางเคียงที่รุนแรง เชน มีไข

หนาวส่ัน หายใจลําบาก ปสสาวะหรืออุจาระมีเลือดปน ระบบภูมิคุมกันโรคลดลง ทําใหเพิ่มความเส่ียง

ตอการติดเชื้อซึ่งอาจรุนแรงถึงข้ันเสียชีวิตได (สุมิตรา ทองประเสริฐ และ สิริกุล นภาพันธ. 2545) โดย

ความรุนแรงของอาการขางเคียงจะข้ึนอยูกับชนิดของยาเคมีบําบัด และปฎิกิริยาตอบสนองตอยา ของ

รางกายผูปวยที่รับยาเคมีบําบัด ซึ่งผลขางเคียงที่เกิดข้ึนนั้น สงผลใหผูปวยโรคมะเร็งหลายรายไมยอม

เขารับการรักษา ทําใหโรคมะเร็งแพรกระจายไปเร่ือยๆ และทําใหผูปวยเสียชีวิตในที่สุด

จากปญหาดังกลาว ทําใหปจจุบันนี้มีงานวิจัยหลายช้ินที่มุงเนน ถึงการใชยารักษามะเร็งที่

พัฒนาจาก สารสกัดจากธรรมชาติ เชน จากพืชสมุนไพร ผัก และ ผลไม และเนื่องจากประเทศไทยมี

ความหลากหลายทางชีวภาพ มีพืชหลากหลายชนิด และพืชผัก สมุนไพรไทยถูกนําไปใช ในการ

ประกอบอาหารเปนปกติอยูแลว ซึ่งพืช ผัก และผลไมของไทย บางชนิด มีแนวโนมวาจะสามารถนําสาร

ที่สกัดไดไปพัฒนาเปนยารักษาโรคได เนื่องจากพืชบางชนิดถูกใชเปนยาสมุนไพรรักษาโรคตางๆ มาแต

โบราณ การศึกษาเกี่ยวกับสารสกัดจากพืช เพื่อพัฒนาเปนยาตานมะเร็งจึงเปนที่นาสนใจและมีความ

เปนไปไดสูง โดยจากผลงานวิจัยที่ผานมาพบวามีพืชที่มีสารออกฤทธิ์ตานมะเร็งไดในระดับดี เชน สาร

curcumin, curcuminoid ที่สกัดจากขมิ้นชันมีความสามารถในการตานมะเร็งได (Yegnanarayana R;

Sarat AP; & Balwani JH. 1976.; Kuttan R; et al. 1985.; Rafatullah S; et al. 1990.; Mazumder A;

et al. 1995) สารสกัด allicin ที่ไดจาก กระเทียม ก็พบวาสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลลมะเรง็

ได (Ejaz S; Woong L.C; & Ejaz A.2003) สารสกัดจาก ตะไคร ใบโหระพา รวมทั้ง กระเพรา ก็พบวามี

ฤทธิ์ในการตานมะเร็งได ในสัตวทดลอง (Murakami A; et al. 1993)

จากงานวิจัยขางตน ชี้ใหเห็นวาการรักษามะเร็งโดยการใชสารสกัดจากพืชนับเปนทางเลือก

หนึ่งที่ไดรับความสนใจอยางมากในปจจุบันเพื่อทดแทนการใชยาเคมีบําบัดที่มีพิษตอรางกายคอนขาง

สูง ตัวอยางสารสกัดจากพืชที่ไดมีการนํามาใชแลวในปจจุบัน ไดแก Vincristine และ Vinsblastine ที่

สกัดไดจากตนแพงพวยฝร่ัง (Catharanthus roseus) (Chan JD. 1998) ใชรักษามะเร็งชนิด

Hodgkin’s lymphoma และ non-Hodgkin’s lymphoma สวน Taxol ที่สกัดจากตนยิว (Taxus

3

brevifolia) ก็ถูกนํามาใชเปนยารักษามะเร็งปอดและมะเร็งเตานม (Woo HL; Swenerton KD; &

Hoskins PJ. 1996) เปนตน

สําหรับงานวิจัยนี้ไดใหความสนใจสารสกัดที่ไดจากมังคุด ซึ่งเปนผลไมที่หาไดงายในประเทศ

ไทย จากรายงานในเบ้ืองตนพบวาสารสกัดจากเปลือกมังคุด สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของ

เซลลมะเร็งเตานม SKBR3 โดยอาศัยกระบวนการ apoptosis (Moongkarndi P; et al. 2003)

โดยสารสกัดที่พบไดมากในเปลือกมังคุด คือสาร tannin และ xanthone และพบวา สารกลุม

xanthone ที่สกัดไดจากสวนเปลือกมังคุด มีการออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายอยาง ทั้งการยับยั้งการ

เจริญของแบคทีเรีย (Linuma M; et al. 1996) (Chaiyasothi T; Reksopha W; & Muonwongyarti P.

1975) เช้ือรา (Mahabusarakum W; Phongpaichit S; & Wiriyachitra P. 1983) การเปนสารตาน

อนุมูลอิสระ (Leong LP; & Shui G. 2002) ลดการอักเสบ (Nakatani K; et al. 2002) และยัง

สามารถ ยับยั้งการเจริญเติบโตของ เซลลมะเร็งลําไส DLD-1 โดยอาศัยกระบวนการ apoptosis ผาน

intrinsic pathway (Matsumoto K; et al. 2003) ได เปนตน

ดังนั้นสารสกัดกลุม xanthone นี้จึงมีความนาสนใจและมีความเปนไปไดสูงที่จะมีผลในการ

ตานมะเร็งอ่ืนๆได ซึ่งนอกจากการทดสอบฤทธิ์ในการเปนยาตานมะเร็งแลว ควรศึกษาตอไปดวยวา

กลไกในการออกฤทธ์ิตานมะเร็งนั้นเปนรูปแบบใด เนื่องจากเปาหมายของการพัฒนายาตานมะเร็งนั้น

ตองการใหมีผลกระทบตอเซลลปกติใกลเคียงนอยที่สุด ดังนั้นกลไกที่ไดรับความสนใจในปจจุบันที่

ตองการใหเปนเปาหมายของยา คือ การกระตุนใหเซลลมะเร็งตายดวยกระบวนการ apoptosis ซึ่งจะ

ไมทําใหเซลลขางเคียงเกิดการอักเสบเหมือนกับที่พบในการตายแบบ necrosis (Studzinski GP.

1995) ซึ่งการกระตุนใหเกิดกระบวนการ apoptosis นั้นเกิดข้ึนไดจาก 2 กลไก คือ mitochondrial

pathway หรือ death receptor pathway จากรายงานวิจัยที่ผานมาพบวาสารสกัดจากธรรมชาติมทีัง้ที่

กระตุนผานทางกลไก mitochondrial pathway และ death receptor pathway

ดังนั้นในการศึกษาคร้ังนี้จึงมุงเนนที่จะศึกษาการออกฤทธิ์ของสารสกัดกลุม xanthone ที่ได

จากเปลือกมังคุด ในการเปนสารตานมะเร็งรวมทั้งกลไกท่ีทําใหเซลลมะเร็งตายดวยกระบวนการ

apoptosis โดยเลือกใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมากในการทดลอง เนื่องจากเปนมะเร็งชนิดหนึ่งที่พบไดใน

ประเทศไทย โดยมีอัตราการเกิดโรคเพิ่มมากข้ึนเร่ือยๆ

4

ความมุงหมายของงานวิจัย

1. ทดสอบความเปนพิษของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ตอเซลลมะเร็ง

ตอมลูกหมาก

2. ศึกษากลไกการเกิด apoptosis โดยการเหน่ียวนําดวยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จาก

เปลือกมังคุด ความสําคัญของงานวิจัย 1. เพื่อนําผลที่ไดไปประยุกตใชในการพัฒนายาตานมะเร็งในอนาคต

2. เพื่อเพิ่มมูลคาของมังคุด

ขอบเขตของงานวิจัย 1. ศึกษาความเปนพิษตอเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จาก

เปลือกมังคุดและหาคา IC50 โดยใชโปรแกรม GraphPad Prism

2. ศึกษากลไกการเกิด apoptosis โดยดูจากลักษณะจําเพาะที่เกิดข้ึนกับเซลลที่ถูกกระตุนให

เกิดกระบวนการ apoptosis ไดแก การเปล่ียนแปลงรูปรางของ nucleus การแตกหักของ DNA (DNA

fragmentation) การทํางานของเอนไซม caspase

นิยามศัพทเฉพาะ PC-3 เปน cell line ของมะเร็งตอมลูกหมากที่พัฒนามาจากเซลลของผูปวยชายอายุ 62 ป ที่เปน

มะเร็งตอมลูกหมาก (human prostate adenocarcioma) เปนผลิตภัณฑจากสถาบัน ATCC (Cat.No.

CRL-1435) สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด เปนสารหลักที่พบไดในเปลือกมังคุดที่สกัดดวยตัวทําละลายเอทิล อะซิเตต ซึ่งมีฤทธิ์ทาง

ชีวภาพหลายอยางและเปนโครงสรางแกนหลักของสาร mangostin (Anthony C. 1995). MTT assay เปนวิธีที่บอกถึงปริมาณเซลลที่ยังมีชีวิตอยู โดยอาศัยหลักการเปล่ียนแปลงสี (colorimetric

assay) จากสีเหลืองของ MTT เปนผลึก formazan ที่มีสีมวง โดยอาศัยปฏิกิริยาของเอนไซม

mitochondrial reductase ซึ่งจะพบไดในเซลลที่มีชีวิตเทานั้น (Mosmann T; et al. 1983) โครงสราง

MTT แสดงดังภาพประกอบ 1

5

MTT (สีเหลือง) Formazan(สีมวง)

ภาพประกอบ 1 โครงสราง MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide

ที่มา: American Type Culture Collection ATCC Product. 2002.

50% Inhibitory Concentration(IC50) หมายถึงความเขมขนของสารที่สามารถยับยั้งการเจริญของเซลลได 50 % Apoptosis เปนปรากฏการณการตายของเซลลเมื่อเซลลไดรับความเสียหาย โดยเซลลจะหดตัว มีการ

รวมตัวกันแนนของ chromatin จากนั้นจะเกิด การแตกหักของสาย DNA ในขณะเดียวกัน membrane

จะเหี่ยวฝอลงหุมเอา nucleus และ organelles แลวรวมตัวกันเปน apoptotic bodyจากนั้นจะเกิดการ

สลายตัวหรือถูกจับกินโดย phagocyte หรือ macrophage ซึ่งจะไมเกิดปฏิกิริยาการอักเสบของเซลล

หรือเนื้อเยื่อที่อยูขางเคียง (Majno G; & Joris I. 1995) (ภาพประกอบ 2) Autoradiography เปนวิธีตรวจวิเคราะหขนาดและจํานวนทอน DNA หลังจากแยกดวย Gel electrophoresis

โดยทําใหเกิดเปนภาพเนกาทีฟ บนแผนฟลมเอ็กซเรย ภาพที่เกิดข้ึนเรียกวา autoradiogram (จินตนา

สิรินาวิน; และ ชนินทร ลิ่มวงศ. 2549)

6

ภาพประกอบ 2 ข้ันตอนการเกิด apoptosis

ที่มา: Yau Philip. (2004). Apoptosis. (online)

สมมติฐานในการวิจัย สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด มีความเปนพิษตอเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก

โดยเกิดการเหนี่ยวนําใหเซลลตายแบบ apoptosis ผาน mitochondrial pathway หรือ death

receptor pathway

บทท่ี 2

เอกสารและงานวิจัยท่ีเกี่ยวของ โรคมะเร็ง มะเร็งเปนโรคที่มีความผิดปกติในการแบงตัวของเซลล โดยเซลลจะแบงตัวเพ่ิมจํานวนอยาง

รวดเร็วและไมสามารถควบคุมได ซ่ึงเกี่ยวของกับปฏิกิริยาที่สลับซับซอนของปจจัยการกอโรคหลายๆชนิด

ไมวาจะเปนปจจัยทางพันธุกรรม ส่ิงแวดลอม หรือสารกอมะเร็งตางๆ เชน สารประกอบไฮโดรคารบอนที่

เกิดจากการเผาไหม หรือ การสูบบุหร่ี สารพิษในอาหาร และรังสี เปนตน (Tannoch IF; & Hill RP. 1998)

การเกิดโรคมะเร็งมี 3 ขั้นตอน ขั้นตอนแรกเรียกวา initiation เปนขั้นตอนที่มีการกลายพันธุของยีนที่

เกี่ยวของกับการเปนมะเร็ง ไดแกยีนมะเร็ง (oncogenes) หรือยีนตานมะเร็ง (tumor suppressor genes)

ซ่ึงเปนยีนท่ีมีความสําคัญในการควบคุมความสมดุลของการเจริญเติบโตและแบงเซลล สงผลทําใหเซลลมี

DNA ที่ผิดปกติเกิดขึ้น ขั้นตอนตอไปเรียกวา promotion ในขั้นตอนนี้เซลลมีการแบงตัวเพ่ิมมากขึ้น ดังนั้น

เซลลที่มีความผิดปกติของ DNA จะมีจํานวนเพ่ิมมากขึ้น เซลลที่มีความผิดปกติของ DNA น้ันเม่ือผาน

ขั้นตอน promotion แลวเซลลนั้นจะเปล่ียนเปนเซลลมะเร็งระยะลุกลาม (progression) ผลลัพธสุดทาย

ของการลุกลามของโรคมะเร็งคือการแพรกระจายของเซลลผิดปกติ (metastatic phenotype) ไปยังอวัยวะ

ตางๆ ผานทางกระแสโลหิต(Hanahan D; & Weinberg RA. 2000)

เมื่อเซลลมะเร็งลุกลามเขาสูกระแสเลือดแลวจะเกาะรวมตัวกันเอง (homotypic aggregation)

หรือเกาะกับเซลลอ่ืน (heterotypic aggregation) ซ่ึงการเกาะรวมตัวกันเองหรือเกาะกับเซลลอ่ืนนั้น ทําให

เซลลมะเร็งมีโอกาสรอดชีวิตไดมากขึ้นในระหวางที่ลอยอยูในกระแสเลือด (Gasic GJ. 1984) เม่ือ

เซลลมะเร็งแพรกระจายไปถึงตําแหนงใหมในรางกายแลว เซลลมะเร็งจะกระตุนใหเกิดเสนเลือดมาเล้ียง

เซลลมะเร็งแลวเร่ิมแบงตัวเพ่ิมจํานวนเปนกอนมะเร็งใหมขึ้นมา (Holmgren L; O’Rilly MS; & Folkman J.

1995)

8

มะเร็งตอมลูกหมาก

เกิดจากการแพรกระจายของเซลลมะเร็งผานทางกระแสโลหิตเขาสูตอมลูกหมาก และเมื่อเซล

มะเร็งแพรกระจายเขาสูตอมลูกหมากแลว เซลลมะเร็งจะเร่ิมแบงตัวเพ่ิมจํานวนเกิดเปนมะเร็งตอม

ลูกหมาก ซ่ึงความเส่ียงของการเกิดโรคมะเร็งตอมลูกหมากนั้นจะมีความสัมพันธกับอายุ โดยจะพบวาใน

ผูสูงอายุจะมีโอกาสเปนมะเร็งตอมลูกหมากมากกวาวัยรุน โดยมะเร็งตอมลูกหมากมีประมาณการผูปวย

รายใหมสูงขึ้นในอันดับตนๆ (ตารางที่ 1)

ตาราง 1 แสดงคาประมาณจํานวนของผูปวยโรคมะเร็งชนิดตางๆ ในป ค.ศ. 2007

Cancer Type Estimated New Cases Estimated Deaths

Bladder 67,160 13,750

Breast (Female -- Male) 178,480 -- 2,030 40,460 -- 450

Colon and Rectal (Combined) 153,760 52,180

Endometrial 39,080 7,400

Kidney (Renal Cell) Cancer 43,512 10,957

Leukemia (All) 44,240 21,790

Lung (Including Bronchus) 213,380 160,390

Melanoma 59,940 8,110

Non-Hodgkin Lymphoma 63,190 18,660

Pancreatic 37,170 33,370

Prostate 218,890 27,050

Skin (Nonmelanoma) >1,000,000 <2,000

Thyroid 33,550 1,530

ที่มา: American Cancer Society. (2007)

9

อาการที่พบในผูปวยโรคมะเร็งตอมลูกหมาก อาการที่สําคัญท่ีพบไดในผูปวยโรคมะเร็งตอมลูกหมาก คือ อาการเจ็บ หรือแสบขณะหล่ังอสุจิซ่ึง

มักเปนอาการบงช้ีวาขนาดตอมลูกหมากใหญขึ้น หรือมีอาการอักเสบเกิดขึ้น นอกจากนี้ยังมีอาการอ่ืนๆ

เชน มีการติดเช้ือในระบบปสสาวะ มีนิ่วในไต ในระยะแรกยังไมปรากฏอาการชัดเจน ตอมาผูปวยจะถาย

ปสสาวะลําบาก กล้ันปสสาวะไมอยู มีเลือดปนมากับปสสาวะ ปวดหลัง เจ็บอัณฑะหรืออัณฑะบวม

(Narayan P. 1995) การรักษา ปจจุบันการรักษาผูปวยโรคมะเร็งตอมลูกหมากมีอยูดวยกัน 3 วิธี ไดแก

1. การผาตัดเอากอนมะเร็งออก ซ่ึงเปนวิธีการรักษาที่ใชเพ่ือลดขนาดของกอนมะเร็ง และ

สามารถใชไดกับมะเร็งเกือบทุกชนิด ยกเวนมะเร็งเม็ดเลือด แตพบวาหลังการผาตัดผูปวยอาจมีปญหา

แทรกซอนเกิดขึ้น ไดแก การเกิดภาวะเส่ือมสมรรถภาพทางเพศ ปสสาวะเล็ด หรือมีทอทางเดินปสสาวะตีบ

ตัน (จุฑามาศ แอนเนียน. 2550)

2. การใชรังสีรักษา หรือ การฉายรังสี จะถูกใชเม่ือการผาตัดใชไมไดผล ทําโดยการฉายรังสี

จากภายนอกผานเคร่ืองฉายรังสีโดยสงรังสีตรงไปท่ีตอมลูกหมาก แตการฉายรังสีนั้นสงผลทําลายเนื้อเยื่อ

ปกติของกระเพาะปสสาวะและลําไสใหญดวย หรือการฝงแรในตอมลูกหมากทําไดโดยแพทยจะฝงเม็ดแร

ลงในตอมลูกหมากประมาณ 70-150 เม็ด ผานทางเข็มเขาสูตอมลูกหมากบริเวณที่อยูระหวางลูกอัณฑะ

กับชองทวารหนัก สําหรับอาการขางเคียงของการรักษาโดยการฝงแรในตอมลูกหมากนั้น จะมีอาการคลาย

กับการฉายรังสีจากภายนอกแตมีอาการที่รุนแรงกวา (เรวัฒ พันธุวิเชียร; และวรชัย รัตนธราธร.

2538)(Porter AT; & Chuba PJ. 2000)

3. การใชเคมีบําบัด ซ่ึงเปนการรักษาที่จะถูกนํามาใชในกรณีที่มะเร็งอยูในระยะแพรกระจาย

หรืออาจใชเปนการรักษาเสริมรวมกับการผาตัด หรือใชเปนยานํา กอนการผาตัด หรือการใชรังสีรักษา

สําหรับการใหยาเคมีแกผูปวย ทําไดโดยใหเปนยารับประทาน การฉีดสารเคมีเขาทางกลามเน้ือ,

กระแสเลือด,ชองทอง หรือไขสันหลัง โดยการใชเคมีบําบัดที่ใชในปจจุบันจะใชในรูปของ combination

chemotherapy(การใชยามากกวาหนึ่งตัวรวมกัน) เพ่ือผลในการรักษาและหลีกเล่ียงการด้ือยา แตการใช

เคมีบําบัดน้ันมีขอควรระวังและผลขางเคียงที่สงผลตอหลายระบบในรางกาย เชนระบบยอยอาหาร ระบบ

ภูมิคุมกันเปนตน(Haskell CM. 1985)

10

ยาตานมะเร็งที่ไดจากสารสกัดจากธรรมชาติ การรักษาดวยการผาตัดและการรังสีรักษารวมท้ังการใชเคมีบําบัด มีผลขางเคียงที่รุนแรงและ

นอกจากจะทําลายเซลลมะเร็งแลวยังทําลายเซลลปกติอีกดวย ดังนั้นจึงมีงานวิจัยหลายงานที่ศึกษาหายา

ใหมๆ ที่ใชในการรักษาโรคมะเร็ง โดยงานวิจัยสวนใหญจะมุงเนนไปที่การนําสารสกัดจากสมุนไพรมาใชใน

การศึกษา ซึ่งอาจเนื่องมาจากสารที่ไดจากธรรมชาติมีอยูเปนจํานวนมากและพืชบางชนิดมีสารที่สามารถ

นํามาใชศึกษาเพ่ือพัฒนาไปเปนยาตอไปในอนาคต สารสกัดจากพืชหลายชนิดไดมีการนํามาศึกษาแลว

เชน สารสกัด curcumin จากขม้ินชัน พบวามีฤทธิ์ตานมะเร็งลําไส โดยการเหนี่ยวนําใหเซลลมะเร็งตาย

แบบ apoptosis (Johnstone RW; Ruefli AA; & Lowe SW. 2002) หรือ น้ํามันหอมระเหยที่สกัดจาก

ตะไครหอมก็มีฤทธ์ิในการตานมะเร็งปากมดลูกและมะเร็งชองปาก โดยมีคา IC50 เปน 0.355 มิลลิกรัมตอ

มิลลิลิตร และ 0.166 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ (Manosroi J; et al. 2006) เปนตน ซึ่งมังคุดก็เปน

ผลไมชนิดหน่ึงที่พบวามีฤทธ์ิทางชีวภาพหลายอยางและสารสกัดกลุม xanthone ที่ไดจากเปลือกมังคุดนั้น

สามารถยับยั้งการเจริญของเซลลมะเร็งลําไส โดยการเหน่ียวนําใหเซลลมะเร็งลําไสเกิดการตาบแบบ

apoptosis (Yoshihito N; et al. 2007) และสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลลมะเร็งเตานม SKBR3

ไดโดยอาศัยกระบวนการ apoptosis (Moongkarndi P; et al. 2003) จากงานวิจัยตางๆ จะเห็นไดวายา

รักษาโรคมะเร็งในปจจุบันจะมุงเนนถึงการเหนี่ยวนําใหเซลลมะเร็งเกิดการตายแบบ apoptosis

Apoptosis กระบวนการ apoptosis เปนกลไกสําคัญกลไกหน่ึงที่เกิดขึ้นเมื่อเซลลไดรับอันตราย โดยเมื่อเกิด

apoptosis เซลลจะเร่ิมมีการเปล่ียนแปลงจากเซลลปกติ โดยเซลลจะเกิดการหดตัวและมีการรวมตัวกัน

ของ chromatin (chromatin condensation) จากนั้นจะเกิด nuclear fragment โดยสาย DNA จะถูกยอย

เปนทอนส้ันๆ โดย endonuclease ในขณะเดียวกันเซลลจะคอยๆ เหี่ยวฝอลง เกิด membrance blebbing

โดยที่ membrane ไมแตก แตจะหดตัวและหอหุมเอาสารตางๆ ภายในเซลลไวแลวรวมตัวกันกลายเปน

กอน เรียกวา apoptotic body จากนั้นจะเกิดการสลายตัวหรือถูกจับกินโดย phagocyte หรือ

macrophage ซ่ึงจะไมเกิดปฏิกิริยาการอักเสบของเซลลหรือเน้ือเยื่อที่อยูขางเคียง (Majno G; & Joris I.

1995) สําหรับกลไกการเกิด apoptosis นั้น มีอยู 2 pathway ไดแก mitocondrial pathway และ death

receptor pathway โดยอาศัยการทํางานอยางเปนขั้นตอนของ cysteine protease ที่มีชื่อวา caspase

โดย caspase นั้นเดิมจะอยูในสภาพที่ไมทํางาน (inactive) เรียกวา procaspase เมื่อมีสัญญาณการเกิด

apoptosis เกิดขึ้น procaspase จะมีการตัดเอาสวนของ prodomain ออกไปแลวเปล่ียนเปน caspase

11

ที่พรอมทํางาน (active) ซ่ึงการกระตุน caspase จะเกิดขึ้นอยางเปนลําดับ (Adrain C; Creagh EM; &

Martin SJ. 2002) กลไกการเกิด apoptosis โดย mitochondrial pathway เมื่อ โปรตีนในกลุม Bcl-2 family ซ่ึงเปน proapoptotic ไดรับสัญญาณการเกิด apoptosis จาก

ส่ิงกระตุนตางๆ แลว จะมีการกระตุนให mitocondria ปลอย cytochrome c และ proapoptotic protein

อ่ืนๆ ออกมาทาง permeability transition pore (PT pore) จากนั้น cytochrome c จับกับ apoptotic

protease-activating factor-1 (Apaf-1) แลวเขารวมตัวกันกับ procaspase-9 ทําให procaspase-9 ตัด

เอาสวนของ prodomain ออกแลวเปล่ียนเปน caspase-9 จากน้ัน caspase-9 จะทําการ กระตุน

procaspase-3 ใหเปล่ียนเปน caspase-3 ซึ่ง caspase-3 น้ันเปน caspase ตัวสุดทายที่จะถูกกระตุน

เพ่ือที่จะสงสัญญาณใหเกิดการตายแบบ apoptosis ของเซลล (Sudhir G. 2001) กลไกการเกิด apoptosis โดย death receptor pathway เมื่อมีการกระตุนสัญญาณจาก death ligand ซ่ึงจะจับกับ receptor บน cell membrance

อยางจําเพาะแลว จะทําให adaptor protein เขารวมตัวกับสวน cytosolic part ของ receptor รวมทั้ง

procaspase-8 กลายเปน Death-Inducing Signaling Complex (DISC) สงผลให procaspase-8

เปล่ียนเปน caspase-8 ซึ่ง caspase-8 ท่ีเกิดขึ้นจะไปกระตุน caspase-3 เชนเดียวกันกับ mitocondrial

pathway และทําใหเซลลเกิดการตายขึ้น นอกจาก caspase-8 จะไปกระตุน caspase-3 แลวยังพบวาใน

เซลลบางชนิด caspase-8 ยังไปกระตุนให BH3-interacting domain death agonist (Bid) มีการตัดเอา

สวนของ prodomain ออก กลายเปน tBid ซ่ึง tBid จะไปกระตุน Bcl-2 homologous antagonist/killer

(Bak) ซ่ึงเปนโปรตีนในกลุม Bcl-2 ทําใหมีการปลอย cytochrome c ออกจาก mitochondria ได จึงทําให

เกิดการกระตุนผาน death receptor pathway สามารถเชื่อมตอกับ mitochondrial pathway ได (Rao

RV; et al. 2001) (ภาพประกอบ 3)

12

ภาพประกอบ 3 กลไกการเกดิ apoptosis

ที่มา: Yau Philip. (2004). Apoptosis. (online)

มังคุด (Mangosteen) มังคุด (mangosteen) มีช่ือทางวิทยาศาสตรวา Garcinia mangostana Linn เปนพืชในวงค

Clusiaceae หรือ Guttiferae นิยมปลูกกันมากในประเทศไทย ซ่ึงพบไดในทุกภาคของประเทศไทยและ

เปนพืชสมุนไพรชนิดหนึ่งที่ปรากฎอยูในตํารายาไทยและมีสรรพคุณในการบําบัดรักษาโรค ไดแก รักษาโรค

บิดมูกเลือด แกแผลเปนหนอง แผลเปอย ชวยสมานแผล และรักษาอาการทองรวง (เทพนม; และคณะ.

2533) มีรายงานวาในสวนเปลือกมังคุดมีสาระสําคัญ 2 กลุม คือ กลุม tannin และกลุม xanthone สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดเปนรงควัตถุสีเหลือง จัดอยูในกลุม flavonoid

ซ่ึงเปน secondary metabolite ที่เกิดขึ้นในพืชและส่ิงมีชีวิตบางชนิด (Peres V; Nagem TJ; & Oliveira

FF. 2000) โดย สารสกัดกลุม xanthone มีโครงสราง แสดงดัง ภาพประกอบ 4

13

ภาพประกอบ 4 โครงสรางของสารสกัดหยาบกลุม xanthone

ที่มา: Wikimedia commons. (2009). Xanthone. (online)

ฤทธิ์ทางชีวภาพของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด สารสกัดกลุม xanthone ไดรับความสนใจ เนื่องจากพบวามีฤทธ์ิทางชีวภาพหลายอยาง

ดังตอไปนี ้ 1. ฤทธ์ิในการตานการเจริญของเช้ือ แบคทีเรีย Staphylococcus aureus ท้ัง สายพันธุปกติ

และสายพันธุที่ด้ือตอยา penicillin (Mahabusarakam W; Wiriyrohitra P; & Phongpaichit S. 1986)

นอกจากนั้นยังสามารถตานการเจริญของ S. aureus ที่ด้ือตอยา methicillin ที่แยกไดจากผูปวยของ

โรงพยาบาลสงขลานครินทร โดยมีคา 90 % Minimum Inhibitory Concentration (MIC90) ตอเช้ือ เปน

3.125 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (Phongpaichit; et al. 1994)

2. ฤทธิ์ในการตานการเจริญของเช้ือ HIV โดยการยับยั้งการทํางานของ HIV-1 protease ซ่ึง

เปนเอนไซมที่มีบทบาทในการตัดสายโปรตีนยาวที่ไวรัสสรางขึ้นในขั้นตอนการเพ่ิมจํานวน เพ่ือใหไดโปรตีน

ที่สามารถทํางานได เชน โปรตีนที่ทําหนาเปนเอนไซม หรือโปรตีนที่เปนองคประกอบของไวรัส โดยมีคา

IC50 เปน 5.12 ไมโครโมลาร และเมื่อสารสกัดกลุม xanthone มีสมบัติในการยับยั้งการทํางานของเอนไซม

นี้จึงเทากับยับยั้งการเพ่ิมจํานวนของของไวรัสดวย (Chen S; Wan M; & Loh B. 1996)

3. ฤทธ์ิในการตานเช้ือรากอโรคในพืช ไดแก เช้ือรา Fusarium oxysporium, Fusarium

vasinfectum, Alternaria tenuis และ Dreschlera oryzae โดยวิธี Petri-plate bioassay พบวา

xanthone ท่ีแยกไดจากเปลือกมังคุดมีฤทธ์ิในการตานเชื้อราไดดี โดยสามารถลดการเจริญของเช้ือราทั้ง 3

ชนิดไดถึง 64 % 58% และ 85% ตามลําดับ (Gopalakrishnan G; et al. 1997)

4. ฤทธ์ิในการตานอนุมูลอิสระโดยสามารถลดการเกิด super-oxide anion ไดถึง

72% (Limei Y; et al. 2007)

14

5. ฤทธ์ิในการตานมะเร็งโดยการยับยั้งการแบงตัวในเซลลมะเร็งหลายชนิดเชน มะเร็งตับ

มะเร็งปอด และมะเร็งกระเพาะอาหาร โดยมีคา 50% Lethal Dose (LD50) อยูในชวง 0.5-5.4 ไมโครกรัม

ตอมิลลิลิตร (Ho CK; et al. 2002) และสารสกัดกลุม xanthone ยังสามารถยับยั้งการแบงตัวใน

เซลลมะเร็งเตานมชนิด SKBR3 ได ที่ความเขมขน 0.5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร โดยเหน่ียวนําใหเกิดการ

ตายแบบ apoptosis ซ่ึงสังเกตุไดจากการเปล่ียนแปลงรูปรางของเซลลและการเกิด DNA fragmentation

(Moongkarndi P; et al. 2003) ทั้งยังสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลลมะเร็งลําไสใหญ DLD-1ได

ที่ความเขมขน 20 ไมโครโมลาร (Yoshihito N; et al. 2007) นอกจากนี้สารสกัดกลุม xanthone ที่สกัดได

จากเปลือกมังคุดก็สามารถเหนี่ยวนําใหเซลลมะเร็งเม็ดเลือดขาว HL-60 เกิดการตายแบบ apoptosis ได

ผานทาง mitochondrial pathway ซ่ึงวัดไดจากการสูญเสีย membrane potential ของ mitochondria

สงผลใหมีการปลอย cytochome C ออกมา (Matsumoto K; et al. 2003)

บทท่ี 3

วิธีดําเนินการวิจัย

เซลลมะเร็งและสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ใชในการทดลอง เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 เปนผลิตภัณฑจากสถาบัน ATCC (Cat.No. CRL-1435)

สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดไดรับจากภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร

มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ สกัดดวยเอทธิลอะซิเตต ที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส

เครื่องมือที่ใชในการทดลอง

1. ตูปลอดเช้ือสําหรับทํา culture (Horizontal Laminar Airflow Cabinets) บริษัท NUAIRE

2. ตูเพาะเล้ียงเซลล(5% CO2 Incubator) บริษัท NUAIRE

3. เคร่ืองปนเหวี่ยงควบคุมอุณหภูมิ บริษัท INTERNATIONAL EQUIPMENT COMPANY

4. microplate reader บริษัท Thermo ELECTRON CORPORATION

5. เคร่ือง electrophoresis บริษัท C.B.S. SCIENCTIFIC CORPORATION

สารเคมีที่ใชในการทดลอง

1. Dimethyl sulfoxide (DMSO) บริษัท Sigma 2. Fetal Bovine Serum บริษัท PAA

3. Hank’s BSS (1X) บริษัท PAA

4. Hoechst 33342 trihydrochloride, trihydrate บริษัท Invitrogen

5. MTT บริษัท USB

6. RPMI 1640 บริษัท Gibco

7. Trypan blue บริษัท Sigma

8. Phosphate Buffered Saline(PBS) เขมขน 0.15 โมลาร pH 7.2

9. Tween 20 เขมขน 0.15%

10.น้ํากล่ัน

16

วิธีดําเนินการทดลอง 1. การเพิ่มจํานวนเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 เล้ียงเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ในอาหารเล้ียงเซลล RPMI 1640 ที่เติม Fetal Bovine

Serum เขมขน 10 % ใน culture flask ขนาด 25 ตารางเซนติเมตร บมในตูเพาะเล้ียงเซลล ที่อุณหภูมิ

37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % ตรวจดูการเจริญของเซลลภายใตกลองจุลทรรศน

จนเซลลเจริญเต็ม culture plate แลวจึงขยายเพ่ิมจํานวนเซลล โดยใชสารละลาย Trypsin / EDTA pH 7.3

(ภาคผนวก ก) ทําใหเซลลที่เกาะอยูกับผิวหนา culture flask หลุดออกจาก ผิวหนา culture flask จากนั้น

ปนลางเซลล ที่ 600xg เปนเวลา 5 นาที และนํามาเลี้ยงดังวิธีการขางตน โดยเพ่ิมขนาดของ culture flask

เปน 75 ตารางเซนติเมตร เพ่ือเพ่ิมปริมาณเซลลกอนที่จะนําไปใชในการทดลองในขั้นตอนตอไป

2. การทดสอบความเปนพิษของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่สามารถฆาเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ดวยวิธี MTT (Mosmann T; et al. 1983)

ใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 2x 104 เซลล ในอาหารเล้ียงเซลล

RPMI 1640 ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ตอหลุมของ 96 well culture plate บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลลที่

อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 24 ช่ัวโมง หลังจากนั้นดูด อาหาร

เล้ียงเซลล RPMI 1640 ออก แลวเติมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดใน อาหารเล้ียงเซลล

RPMI 1640 ที่ความเขมขนตางๆ (ภาคผนวก ข) ปริมาตร 100 ไมโครลิตรตอหลุม บมไวในตูเพาะเล้ียง

เซลล ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 24 ช่ัวโมง เมื่อครบเวลาดูด

อาหารเล้ียงเซลล RPMI 1640 ออก แลวเติม MTT ใน อาหารเล้ียงเซลล RPMI 1640 (ภาคผนวก ค)

ปริมาตร 100 ไมโครลิตรตอหลุม บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณ

คารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 2 ช่ัวโมง เมื่อครบเวลาแลวดูด อาหารเล้ียงเซลล RPMI 1640 ออก

จากนั้นเติม DMSO ปริมาตร 100 ไมโครลิตรตอหลุม แลวนําไปวัดความเขมของสีที่เกิดขึ้นดวยเคร่ือง

microplate reader ที่ความยาวคล่ืน 595 นาโนเมตร ซ่ึงความเขมของสีท่ีเกิดขึ้นจะสัมพันธกับจํานวน

เซลลที่ยังมีชีวิต จากน้ันนําคาการดูดกลืนแสงที่ไดไปหาคา IC50 โดยใชโปรแกรม GraphPad Prism

Version 3.03

17

3. การทดสอบความเขมขนและเวลาที่เหมาะสมของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดในการฆาเซลลมะเร็ง ใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 2x 106 เซลล ในอาหารเล้ียงเซลล

RPMI 1640 ปริมาตร 2 มิลลิลิตร ตอหลุมของ 6 well culture plate บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ที่อุณหภูมิ

37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 24 ช่ัวโมง หลังจากนั้นดูด อาหารเล้ียงเซลล

RPMI 1640 ออก แลวเติมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดในอาหารเลี้ยงเซลล RPMI

1640 ที่ความเขมขน 0, 10, 20, 30, 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ที่

อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และปริมาณคารบอนไดออกไซดที่ 5 % เปนเวลา 0, 3, 6, 9, 12 และ 24

ช่ัวโมง เมื่อครบแตละชวงเวลาจึงเก็บเซลลแลวนําไปปนลางดวย 1x PBS (ภาคผนวก ค) ที่ 1,100xg เปน

เวลา 1 นาที ในกรณีท่ีเซลลยังไมหลุดจากผิวหนา 6 well culture plate ใหใชสารละลาย Trypsin / EDTA

pH 7.3 ลางใหหลุดออกจากผิวหนา 6 well culture plate แลวนําไปปนลางดังวิธีการขางตน หลังจากนั้น

นําเซลลมายอมดวยสียอม trypan blue อัตราสวน 1:1 นับจํานวนเซลลที่มีชีวิตซ่ึงจะไมติดสีฟาดวย

hemacytometer ภายใตกลองจุลทรรศน โดยนําคา IC50 ที่ไดจากการทดลองขอ 2 มาเปรียบเทียบกับ

ความเขมขนและเวลาที่ใชทดสอบ เพ่ือที่จะหาความเขมขนและเวลาท่ีเหมาะสมของสารสกัดหยาบกลุม

xanthone จากเปลือกมังคุดที่ใชในการฆาเซลลมะเร็งเพ่ือใชในการทดลองขั้นตอไป

4. การศึกษาการเกิด apoptosis ในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ที่ถูกเหนี่ยวนํา โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด 4.1 การเปล่ียนแปลงรูปรางของ นิวเคลียส ใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 2x 106 เซลล ในอาหารเลี้ยงเซลล


37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 24 ช่ัวโมง เมื่อครบเวลาดูด อาหารเล้ียง

เซลล RPMI 1640 ออก แลวเติมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดใน อาหารเล้ียงเซลล

RPMI 1640 ท่ีความเขมขน, 30, 40, และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ที่อุณหภูมิ

37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % แลวตรวจดูการเปล่ียนแปลงของเซลลภายใตกลอง

จุลทรรศนท่ีเวลา 3 และ 6 ชั่วโมง และทําการเก็บเซลลท่ีชวงเวลานั้นๆ แลวยอมดวยสียอม Hoechst

33342 (Ramonede BM; & Tomas RP. 2002) (ภาคผนวก ค) ปริมาตร 5 ไมโครลิตร นําไปบมไวในตู

18

เพาะเลี้ยงเซลล ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 10 นาที จากนั้น

ปนลางดวย 1X PBS จํานวน 2 คร้ัง แลวจึงตรวจดูรูปรางลักษณะของนิวเคลียส บนแผนสไลดภายใตกลอง

จุลทรรศน fluorescence

4.2 การแตกหักของ DNA (DNA fragmentation) ใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 2x 106 เซลล ในอาหารเลี้ยงเซลล


37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซดที่ 5 % เปนเวลา 24 ช่ัวโมง เมื่อครบเวลาดูด อาหารเล้ียง

เซลล RPMI 1640 ออกแลวเติมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดในอาหารเลี้ยงเซลล RPMI

1640 ที่ความเขมขน 20, 30, 40, และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ท่ีอุณหภูมิ 37

องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 5 ช่ัวโมง แลวตรวจดูการเปลี่ยนแปลงของเซลล

ภายใตกลองจุลทรรศน จากนั้นทําการเก็บเซลล แลวลางดวย 1x PBS 1 คร้ัง โดยปนลางที่ 600xg เปน

เวลา 5 นาที แลวดูด supernatant ทิ้ง แลวลางเซลลดวย TE buffer แลวเติม cold lysis buffer เพ่ือทําให

เซลลแตก จากนั้น บมเซลลที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ขามคืน แลวนําเซลลมาละลายท่ีอุณหภูมิหอง

จากนั้นปนแยกที่ 1,500xg เปนเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส แลวจึงนําเซลลมาสกัด DNA

ดวย phenol chloroform จากนั้น ลางเซลลดวย TE buffer (ภาคผนวก ค) แลวเติม RNase A เพ่ือกําจัด

RNA จากน้ันบมในตูเพาะเล้ียงเซลล ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปน

เวลา 45 นาที หลังจากนั้น ทําการตรวจสอบขนาดของช้ิน DNA โดยการอาศัยเทคนิค agarose gel

electrophoresis (1.7 % agarose gel) (Shim JS; et al. 2001)

4.3 การทํางานของเอนไซม caspase โดยวิธี Western blotting ใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 1x 106 เซลล ในอาหารเลี้ยงเซลล

RPMI 1640 ปริมตร 2 มิลลิลิตร ตอหลุมของ 6 well culture plate บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ที่อุณหภูม ิ37

องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 24 ช่ัวโมง เมื่อครบเวลาดูด อาหารเล้ียงเซลล

RPMI 1640 ออกแลวเติมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดในอาหารเล้ียงเซลล RPMI

1640 ใหมีความเขมขนซ่ึงเหมาะสมสําหรับการฆาเซลลมะเร็ง (คาความเขมขนไดจากการทดลองขอ 2)

บมไวในตูเพาะเล้ียงเซลล ท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปริมาณคารบอนไดออกไซด 5 % เปนเวลา 3

ช่ัวโมง แลวจึงตรวจดูการเปลี่ยนแปลงของเซลลภายใตกลองจุลทรรศน จากนั้นเก็บเซลลแลวลางดวย PBS

19

แลวทําใหเซลลแตกดวยการบด แลวจึงปนแยกที่ 500xg ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที นํา

supernatant สวนหนึ่งมาตรวจดูความเขมขนของโปรตีนโดยวิธี Bradford อีกสวนนําไปแยกโปรตีนบน

15% SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ผานกระแสไฟฟา

ที่ 130 โวลต ยายโปรตีนจาก gel ลงสู PVDF membrane (Polyvinylidene Fluoride ) ผานกระแสไฟฟาที่

100 โวลต เปนเวลา 2 ช่ัวโมง จากนั้นนํา PVDF membrane แช 5% นมใน PBS ที่อุณหภูมิหอง เปนเวลา

1 ช่ัวโมง แลว ลางดวย PBS เปนเวลา 10 นาที PVDF membrane ดวย anti-caspase-3 ที่อุณหภูมิ 4

องศาเซลเซียส นานขามคืน แลวลางดวย PBS จํานวน 3 คร้ัง คร้ังละ 10 นาที นําไปบมใน anti-Mouse

IgG,HRP-linked Antibody เจือจางในอัตราสวน 1 ตอ 10,000 ในสารละลาย 2.5% นมใน PBS ที่

อุณหภูมิหอง เปนเวลา 1 ช่ัวโมง แลวลางดวย PBS จํานวน 3 คร้ัง คร้ังละ 10 นาที จากนั้นตรวจหาแถบ

โปรตีน โดยอาศัยเทคนิค Autoradiography (Ramonede BM; & Tomas RP. 2002) ในกรณีของ

caspase-8 และ caspase-9 ใชวิธีการเดียวกัน เพียงแตเปล่ียน primary Antibody ที่จําเพาะตอ

caspase-8 และ caspase-9

บทท่ี 4

ผลการทดลอง

1. ความเปนพิษของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ตอเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 หลังจากทดสอบความเปนพิษตอเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก ของสารสกัดหยาบกลุม xanthone

พบวา สามารถในการฆาเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 โดยมีคา IC50 ที่ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

(ภาพประกอบ 5) ดังนั้น จึงนําคา IC50 ที่ไดมาหาความเขมขนที่เหมาะสมตอการฆาเซลลมะเร็งตอม

ลูกหมาก

PC-3 cells treated withxanthone

10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 60

50

100

150xanthone

IC 50 = 10 µg/ml

Concentration (ng/ml)

% V

iabi

lity

ภาพประกอบ 5 กราฟผลการทดสอบความสามารถของสารสกัดหยาบกลุม xanthone ในการฆาเซลลมะเร็ง

ตอมลูกหมาก PC-3 ดวยวิธี MTT (MTT assay) โดยใช เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวน

ประมาณ 2x 104 เซลล แลววัดความเขมของสีที่เกิดขึ้นดวยเคร่ือง microplate reader ที่ความยาวคล่ืน

595 นาโนเมตร จากนั้น นําคาการดูดกลืนแสง ที่วัดได ไปหาคา IC50 โดยใชโปรแกรม GraphPad Prism

Version 3.03

21

2. ความเขมขนและเวลาที่เหมาะสมในการฆาเซลลมะเร็งของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลอืกมงัคุด

การทดลองเพ่ือหาความเขมขนและเวลาทีเ่หมาะสมในการฆาเซลลมะเร็งพบวา ที่ความเขมขน

ของสารสกัดหยาบกลุม xanthone ที่ 30, 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร สามารถทาํลายเซลมะเร็งได

ดีในชวงเวลา 3 ถึง 6 ช่ัวโมง (ภาพประกอบ 6) ดังนั้นจึงนําคา ที่ไดมาศึกษา การเกิด apoptosis ใน

เซลลมะเร็งตอมลูกหมากที่ถกูฆา โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

160.00

0 hr 3 hrs 6 hrs 9 hrs 12 hrs 24 hrs

Time

% V

iabi

lity

control 10 μg/ml 20 μg/ml 30 μg/ml 40 μg/ml 50 μg/ml

ภาพประกอบ 6 กราฟผลการทดสอบ ความเขมขน และเวลาที่เหมาะสม ในการฆา เซลลมะเร็งตอม

ลูกหมาก PC-3 สารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ณ ชวงเวลาตางๆ โดยใช

เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 2x 104 เซลล สารสกัดหยาบกลุม xanthone จาก

เปลือกมังคุดในอาหารเล้ียงเซลล RPMI 1640 ท่ีความเขมขน 0, 10, 20, 30, 40 และ 50 ไมโครกรัม

ตอมิลลิลิตร เปนเวลา 0, 3, 6, 9, 12 และ 24 ช่ัวโมง หลังจากนั้น นําเซลลมายอมดวยสียอม trypan

blue อัตราสวน 1:1 นับจํานวนเซลลที่มีชีวิตซ่ึงจะไมติดสีฟาดวย hemacytometer ภายใตกลอง

จุลทรรศน เพ่ือที่จะหาความเขมขนและเวลาท่ีเหมาะสมของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จาก

เปลือกมังคุดที่ใชในการฆาเซลลมะเร็ง

22

3. การศึกษาการเกิด apoptosis ในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ที่ถูกเหนี่ยวนํา โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด

3.1 การเปล่ียนแปลงรูปรางของ นวิเคลียส

หลังจากบมเซลลดวยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ได 3 ช่ัวโมง พบวา

เซลลมะเร็งเร่ิมมีการเปลี่ยนแปลง รูปรางของนิวเคลียส ไปในรูปแบบของการเกิด apoptosis โดยนิวเคลียส

จะเริ่มมีการหดตัวและมีการรวมตัวกันของ chromatin (chromatin condensation) ทําใหเซลลมี ขนาด

เล็กลง และมีการรวมตัวกันของ chromatin เปนจุดๆ ภายในเซลล โดย

ความเขมขนสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตรวจ

พบวา มีเซลลที่มีขนาดเล็กลงและมีการรวมตัวกันของ chromatin เปนจํานวนมาก และเห็นไดชัดเจน ที่

เวลา 3 และ 6 ช่ัวโมง (ภาพประกอบ 7B และ 7C) เมื่อเปรียบเทียบกับ เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ที่

ไมไดรับสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ซ่ึงใชเปน control (ภาพประกอบ 7A )

ความเขมขนสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ 40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ยัง

สามารถตรวจพบ เซลลท่ีมีขนาดเล็กลงและมีการรวมตัวกันของ chromatin เกิดขึ้น แตตรวจพบไดนอย

กวา ความเขมขนสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร โดยที่เวลา

3 ช่ัวโมง ตรวจพบ เซลลที่มีขนาดเล็กลงและมีการรวมตัวกันของ chromatin ได และ เห็นไดชัดเจน

(ภาพประกอบ 7D) แตท่ีเวลา 6 ช่ัวโมง ตรวจพบ เซลลที่มีขนาดเล็กลงและมีการรวมตัวกันของ

chromatin ไดลดลง และเห็นไดไมชัดเจน (ภาพประกอบ 7E)

ความเขมขนสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตรวจ

พบ เซลลท่ีมีขนาดเล็กลงและมีการรวมตัวกันของ chromatin เกิดขึ้น แตตรวจพบได เล็กนอยและเหน็ไดไม

ชัดเจน (ภาพประกอบ 7B และ 7C)

23

ภาพประกอบ 7 การศึกษาการเกิด apoptosis โดยดูจากการ เปล่ียนแปลงนิวเคลียส ของเซลลมะเร็งตอม

ลูกหมาก PC-3 โดยใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวนประมาณ 2x 106 เซลล ยอมดวยสี

Hoechst ที่ความเขมขน และ เวลา ดังนี้ (A) Control (B) ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ที่

เวลา 3 ช่ัวโมง (C) ความเขมขน30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ท่ีเวลา 6 ช่ัวโมง (D) ความเขมขน

40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ที่ เวลา 3 ช่ัวโมง (E) ความเขมขน 40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ที่เวลา

6 ชั่วโมง(F) ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ที่เวลา 3 ช่ัวโมง (G) ความเขมขน

30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ที่เวลา 3 ช่ัวโมง

24

3.2 การตรวจสอบการแตกหักของ DNA (DNA fragmentation) โดยอาศัยเทคนิค agarose gel electrophoresis DNA fragmentation ความเขมขนของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ที่สามารถตรวจพบการแตกหัก

ของ DNA ได คือความเขมขนของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ 30 และ

40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร โดยความเขมขนของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่

30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร พบการแตกหักของ DNA ไดชัดเจนที่สุด (ภาพประกอบ 8)

ภาพประกอบ 8 การตรวจสอบการแตกหักของ DNA (DNA fragmentation) ในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก

PC-3 ซ่ึงทําการสกัด DNA ดวย phenol chloroform จากเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 จํานวน

ประมาณ 2x 106 เซลล จากนั้นนํามาแยกดวย agarose gel electrophoresis โดย (1) คือ Marker ซ่ึง

เปน 1 kb ladder DNA (2) คือ Control ซ่ึงเปน เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ที่ไดรับ DMSO

(3) ความเขมขน 20 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (4) ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (5) ความ

เขมขน 40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร (6) ความเขมขน 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

25

3.3 การทํางานของเอนไซม caspase โดยวิธี Western bloting หลังจากบมเซลลดวยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด จากเปลือก เปนเวลา

3 ช่ัวโมง แลวนําไปตรวจสอบหาความจําเพาะของโปรตีนตอ Anti-caspase-3, Anti-caspase-8 และ Anti-

caspase-9 โดยวิธี Western blotting ตรวจพบ แถบโปรตีนที่มีความจําเพาะตอ ตอ Anti-caspase-3

(ภาพประกอบ 9) และ Anti-caspase-8 (ภาพประกอบ 10) แตตรวจไมพบแถบโปรตีนตอ Anti-caspase-9

ภาพประกอบ 9 การตรวจสอบการทํางานของเอนไซม caspase-3 ใน เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3

ท่ีความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร, 40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

ซ่ึงผานการแยกโปรตีนดวย SDS-PAGE แลว ยายโปรตีนจาก gel ลงสู PVDF membrane จากนั้น

ตรวจหาแถบโปรตีน โดยอาศัยเทคนิค Autoradiography ทําใหเกิดเปนภาพ บน x-ray film

ภาพประกอบ 10 การตรวจสอบการทํางานของเอนไซม caspase-8 ในเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3

ท่ีความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร, 40 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

ซ่ึงผานการแยกโปรตีนดวย SDS-PAGE แลว ยายโปรตีนจาก gel ลงสู PVDF membrane จากนั้น

ตรวจหาแถบโปรตีน โดยอาศัยเทคนิค Autoradiography ทําใหเกิดเปนภาพ บน x-ray film

บทท่ี 5

สรุป อภิปรายผล และขอเสนอแนะ

จากการทดสอบความเปนพิษตอเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก ของสารสกัดหยาบกลุม

xanthone ที่สกัดไดจากเปลือกมังคุด โดยใชเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 เปนตัวแทนของ

เซลลมะเร็งตอมลูกหมาก ไดคา IC50 ที่ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ซ่ึงแสดงใหเห็นวาสารสกัดหยาบ

กลุม xanthone จากเปลือกมังคุดสามารถฆาเซลลมะเร็งตอมลูกหมากไดในระดับที่นาพอใจ และเมื่อ

นําขอมูลคา IC50 ขางตนมาปรับ เพ่ือหาชวงเวลาที่สารสกัดสามารถฆาเซลลมะเร็งไดดีที่สุด พบวาสาร

สกัดสามารถฆาเซลลมะเร็งไดดีที่สุดที่ชวงเวลา 3 ถึง 6 ชั่วโมง ที่ความเขมขน 30, 40 และ

50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เนื่องจากในระยะเวลา 3 ถึง 6 ชั่วโมง จํานวนเซลลลดลงอยางรวดเร็ว

หลังจากเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 ถูกเหนี่ยวนําโดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือก

มังคุด และลดลงอยางชาๆเมื่อผานชวงเวลา 6 ชั่วโมง ไปแลว ดังนั้น ในการทดลอง จึงนําเซลลมะเร็ง

ตอมลูกหมาก PC-3 ท่ีถูกเหน่ียวนําโดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด ท่ีความ

เขมขน 30, 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร มาตรวจสอบรูปแบบการตายของเซลลที่เกิดขึ้นโดย

คาดวาลักษณะการตายที่เกิดขึ้นจะเปนการตายแบบ apoptosis (Majno G; & Joris I. 1995)

ในการตรวจสอบรูปแบบการตายของเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 โดยการตรวจสอบ

ลักษณะการเปลี่ยนแปลงของนิวเคลียส ซ่ึงถูกยอมดวย Hoechst 33342 พบเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก

PC-3 ที่มีขนาดที่เล็กลง เนื่องมาจากการที่มีการหดตัวของ chromatin ในนิวเคลียส และจับตัวกันแนน

จนกลายเปนกอน ซ่ึงเปนผลมาการเหน่ียวนําของสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด

โดยการเปล่ียนแปลงของนิวเคลียสในลักษณดังกลาวเปนขั้นตอนแรกๆของกระบวนการ apoptosis

ซ่ึงในการเปลี่ยนแปลงไปในรูปแบบของการตายแบบ apoptosis ขั้นตอไปคือการที่ membrane

ของเซลลจะเกิดการเห่ียวฝอลง (membrane blebbing) และหอหุม chromatin และสารตางๆ ในเซลล

ที่หดตัวลงแลวรวมตัวกันเปนกอน (apoptotic body) (Majno G; & Joris I. 1995) โดยพบการ

เปล่ียนแปลงของนิวเคลียสไดมากที่สุด ที่ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และพบการ

เปล่ียนแปลงของนิวเคลียสไดบางท่ีความเขมขน 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ซึ่งเปนไปไดวา

ที่ความเขมขน 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เซลลมะเร็งถูกกระตุนใหมีการตายอยางรวดเร็ว

ทําให ณ เวลาเดียวกัน ที่ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร พบเซลลเขาสูระยะแรกๆ ของการ

27

ตายแบบ apoptosis ไดมาก ในขณะท่ีความเขมขน 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร นั้น เซลลได

เขาสูระยะหลังๆของการตายแบบ apoptosis แลว และบางเซลล ไดตายและสลายตัวไปแลว

ในการตรวจสอบรูปแบบการตายของเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3 โดย การตรวจสอบ

ลักษณะการแตกหักของชิ้น DNA (DNA fragmentation) พบวา ความเขมขนของสารสกัดหยาบกลุม

xanthone จากเปลือกมังคุดที่ 30, 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตรวจพบ การแตกหักของ DNA

เปนช้ินๆ ในลักษณะขั้นบันได (DNA ladder) โดยการแตกหักของชิ้น DNA ที่ตรวจพบ อาจเกิดจาก

การที่ DNA ถูกยอยเปนทอนส้ันๆ โดย endonuclease (Majno G; & Joris I. 1995) ซ่ึงเปนขั้นตอน

หน่ึงในการเกิด apoptosis ในระยะแรก ซ่ึงจะเกิดขึ้นเปนระยะท่ีจะเกิดขึ้นพรอมๆกับการหดตัวของ

chromatin โดยที่สาย DNA จะถูก ยอยใหเปนสายส้ันๆ โดย endonuclease ในการตรวจสอบจึง

อาศัยเทคนิค agarose gel electrophoresis เพ่ือแยกเอาสาย DNA ท่ีถูกยอย ออกจากกัน ทําใหเห็น

ลักษณะที่เรียกวา DNA ladder บน gel โดยพบ การแตกหักของชิ้น DNA ไดมาก ที่ความเขมขน

30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และพบไดเล็กนอย ที่ความเขมขน 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

ซ่ึงเปนไปไดวาท่ีความเขมขน 40 และ 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร นั้นเซลลบางสวนไดตายและสลายตัว

ไปแลว จึงไมสามารถตรวจพบช้ิน DNA ได

ในการตรวจสอบกลไกการเกิด apoptosis pathway ของเซลลมะเร็งตอมลูกหมาก PC-3

หลังจากถูกกระตุนใหเกิด apoptosis โดยสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด เปนเวลา

3 ช่ัวโมง แลวตรวจสอบการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม cysteine protease ที่มีช่ือวา caspase (Adrain

C; Creagh EM; & Martin SJ. 2002) ซ่ึงเปนโปรตีนจําเพาะ ที่จะพบไดในขั้นตอนการเกิด apoptosis

เทานั้น โดยอาศัยเทคนิค Western blotting ตรวจพบ ปฏิกิริยาของ caspase-3 ที่จับกับแถบของ

แอนติเจนที่มีนํ้าหนักโมเลกุลประมาณ 32 กิโลดาลตัน ซ่ึงเปน ขนาดของ procaspase-3 และพบ

ปฏิกิริยาของ caspase-3 ที่จับกับแถบของแอนติเจนที่มีนํ้าหนักโมเลกุลประมาณ 19 และ 20 กิโลดาลตัน

ซ่ึงเปน ขนาดของ cleaved caspase-3 โดยที่ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตรวจพบ

ปฏิกิริยาของ caspase-3 ไดมากท่ีสุด

ปฏิกิริยาของ caspase-8 ที่จับกับแถบของแอนติเจนที่มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 55 กิโล

ดาลตัน ซ่ึงเปน ขนาดของ procaspase-8 และพบปฏิกิริยาของ caspase-8 ที่จับกับแถบของ

แอนติเจนท่ีมีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 43 และ 44 กิโลดาลตัน ซึ่งเปน ขนาดของ cleaved caspase-3

โดยที่ความเขมขน 30 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ตรวจพบปฏิกิริยาของ caspase-3 ไดมากที่สุด และ

ที่ความเขมขน 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร พบเพียงปฏิกิริยาของ caspase-8 แตไมพบปฏิกิริยาของ

pro-caspase-8 อาจเปนไปไดวา ณ ที่ความเขมขนดังกลาว กระบวนการเกิด apoptosis เกิดขึ้นอยาง

บรรณานุกรม

บรรณานุกรม จินตนา สิรินาวิน; และ ชนินทร ล่ิมวงศ. (2549). ศัพทานุกรมเวชพันธุศาสตร. พิมพคร้ังที่ 1.กรุงเทพฯ:

สํานักพิมพหมอชาวบาน.

จุฑามาศ แอนเนียน. (2550).ตอมลูกหมากและความผิดปกติอ่ืนๆ. พิมพคร้ังที่ 2. กรุงเทพฯ:สํานักพิมพ

ใกลหมอ.

เทพนม เมืองแมน; และคณะ. (2533). คูมือสมุนไพรรักษากลุมอาการมะเร็ง. คณะเภสัชศาสตร

มหาวิทยาลัยมหิดล.

เรวัฒ พันธุวิเชียร; และ วรชัย รัตนธราธร. (2538). ตํารารักษาโรคมะเร็ง. กรุงเทพฯ: โฮลิสติก พับลิชช่ิง.

สุมิตรา ทองประเสริฐ; และ สิริกุล นภาพันธ. (2545). โรคมะเร็ง: แนวทางการรักษา = Practical

Points in Oncology. พิมพคร้ังที่ 1. เชียงใหม: ธนบรรณการพิมพ.

Adrain, C.; Creagh, E. M.; & Martin, S.J. (2002). Caspase Cascades in ApoptosisCaspases-their

role in cell death and cell survival. Ed. Marek Los and Henning Walczak. Moleculare

Biology Intelligence Unit 24. New York. 41-51.

Anthony, C. (1995). A review of Mangosteen (Garcinia mangostana) Linn. Dweck Data.

American Cancer Society. (2007). Cancer Facts and Figures. Atlanta, Ga: American

Cancer Society.

Attasara, P. (2006). Cancer. National Cancer Institute Department of Medical Service

Ministry of Public Health Thailand.

Chaiyasothi, T.; & Rueaksopaa, V. (1975). Antibacterial activity of some medicinal plants.

Undergraduate Special Project Report, Fac Pharm, Mahidol Univ,:109

Chan, J.D. (1998). Pharmacokinetic drug interactions of vinca alkaloids: summary of case

reports. Pharmacotherapy. 18(6): 1304 -7.

Chen, S.; Wan, M.; & Loh, B. (1996). Active constituents against HIV-1 protease from Garcinia

mangostana. Planta Med. 62(4): 381-382.

Chomnawang, M.T.; et al. (2005). Antimicrobial effects of thai medicinal plant against

acne-inducing bacteria. J Ethnopharmacol. 101(1-3): 330-333.

31

Gasic, G.J. (1984). Role of plasma platelets and endothelial cells in tumor metastasis.

Cancer Metastasis Rev. 3: 99-114.

Gopalakrishnan, G.; et al. (1997). Evalution of the Antifungal Activity of Natural Xanthones from

Garcinia mangostana and their Synthetic Derivatives. J Nat Prod. 60(5): 519-52.

Hanahan, D.; & Weinberg, R.A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell. 100: 57-70.

Haskell, C.M. (1985). Principles of cancer chemotherapy. In: Haskell, C.M. ed. Cancer

treatment. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders :21-42

Ho, C.K. (2002). Garcinone E, a xanthone derivative, has potent cytotoxic effect Against

hepatocellular carcinoma cell lines. Planta Med. 68(11):975-9.

Holmgren, L.; O’Rilly, M.S. ; & Folkman, J. (1995). Dormancy of micrometastases: balanced

proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppres-sion. Nat Med. 1:

149-153.

Johnstone, R.W.; Ruefli, A. A.; & Lowe, S.W. (2002). Apoptosis: a link between cancer

genetics and chemotherapy. Cell : 153-164.

Kuttan, R.; et al. (1985). Potential anticancer activity of tumeric (Curcumin longa). Cancar Lett.

29(2): 197-202.

Leong,L.P.; & Shui, G. (2002). Aninvestigation of antioxidant capacity of fruits in Singapore

markets. Food Chem. 76: 69-75.

Limei Y; et al. (2007).Phenolics from hull of Garcinia mangostana fruit and their Antioxidan

tactivities. Food Chem. 104:176-181

Linuma, M.; et al. (1996). Antibacterial activity of xanthone from guttiferaeous plants against

methicillin resistant Staphylococcus aureus. J Pharm Pharmacol.48(8): 861-865.

Mahabusarakam, W.; Wiriyachitra, P.; & Phongpaichit, S. (1986). Antimicrobial Activities of

Chemical constituents from Garcinia mangostana.Linn. J Sci Soc Thailand. 12(4):,239-

242.

Mahabusarakam, W.; Phongpaichit, S.; & Wiriyachitra, P. (1983). Screening of antifungal of

chemicals from Garcinia mangstana. J Sci Technol. 5(4): 341-342.

32

Majno, G.; & Joris, I. (1995). Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J

Pathol. 146(1): 3–15.

Manosroi, J.; et al. (2006). Principles of surgical oncology. Cancer medicine: 651-664.

Matsumoto, K.; et al. (2003). Induction of apoptosis by xanthones from mangosteen in

human leukemia cell lines. J Nat Prod. 66(8):1124-1127

Mazumder, A.; et al. (1995). Inhibition of human immunodeficiency virus type-1 integrase by

curcumin. Biochem Pharmacol. 49(8): 1165-1170.

Mingxin S; et al. (2006). Antiproliferation and apoptosis induced by curcumin in human

ovarian cancer cells. Cell Biol Int. 30: 221-226.

Moongkarndi, P.; et al. (2003). Cytotoxicity assay of hispidulin and quercetin using colorimetric

technique. J Pharm Sci. 18(2): 25-31.

Mosmann, T.; et al. (1983). Rapid colorimetric for cellular growth and survival:Application to

proliferation and cytotoxicity assay. J Immuno Methods. 65: 55-63.

Nachshon-Kedmi, M.; Yannai, S.; & Fares F.A.(2004). Induction of apoptosis in human prostate

cancer cell line, PC-3, by 3,30’-diindolylmethane through the mitochondrial pathway.

British Journal of Cancer. 91:1358-1363.

Nakatani, K.; et al. (2002). Inhibition of cyclooxygenase and prostaglandin E2 synthesis by γ-

mangostin, a xanthone derivative in mangosteen, in C6 rat glioma cells. Biochem

Pharmacol. 63(1):73-79.

Narayan P. (1995). Neoplasms of the prostate gland. In: Tanagho, E.A.; Mc, Aninch, J.W.

eds. Smith’s General Urology 14th USA: W.B.Saunders : 392-433.

Peres, V.; Nagem, T.J.; & Oliveira, F.F. (2000). Tetraoxygenated naturally occurring xanthones.

Phytochemistry. 55(7): 683-710.

Phongpaichit, S.; et al. (1994). Antibacterial activities of extracts from. Garcinia mangostana

Songklanakarin. J Sci Technol. 16(4): 399-405.

Porter, A.T.; & Chuba,P.J. (2000). Radiothrrapy of prostate cancer: Photon and neutron

treatments. In Prostatic disease. USA. W.B.Saunders : 444-450.

33

Ramonede, B.M.; & Tomas, R.P. (2002). Activation of protein kinase C for protection of cells

against apoptosis induced by the immunosuppressor prodigiosin. Biol Pham. 63: 463-

469.

Rao, R.V.; et al. (2001). Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. J

Biol Chem. 277(26):21836-21842.

Rafatullah, S.; et al. (1990). Evalution of turmeric (Curcumin longa) fo r gastric and duodenal

antiulcer activity in rat. J Ethnopharmacol. 29(1): 25-34.

Rosenberg, S.A. (1989). Principles of surgical oncology. In:Devita, V.T.; Hellman, S.;

Rorenberg, S.A. eds. Cancer: principles and practice of oncology. 3rd ed. Philadelphia:

J.B. Lippincott: 236-246.

Sakai, S.; et al. (1993). The Structure of Garcinone E. Chem Pharm Bull. 41(5): 958-960.

Shim,J.S.; et al. (2001). Curcumin-Induced Apoptosis of A-431 Cells Involves Caspase-3

Activation. J Biochem Mol Biol. 34(3): 189-193.

Sriplung, H.; et al. (2003). Cancer in Thailand .Bangkok : Medical Publisher. 3(2): 7-69.

Studzinski, G. P. (1995). Cell growth and apoptosis: a practical approach. IRL Press.

Sudhir, G. (2001). Molecular steps of death receptor and mitochondrial pathways of apoptosis.

Life science. 69: 2957-2964.

Tannoch, I.F.; & Hill, R.P. (1998).The basic science of oncology. New York. McGraw-Hill :25

Woo, H.L.; Swenerton, K.D.; & Hoskins, P.J. (1996). Taxol is active in platinum resistant

endometrial adenocareinoma. Am J Clin Oncol. 19(3): 290-1.

Yegnanarayana, R.; Sarat, A.P.; & Balwani, J.H. (1976). Comparsion of anti- inflammatory

activity of various extracts of Curcumin longa. Indian J Med Res. 64:601-608.

Yoshihito, N.; et al. (2007). Characterized mechanism of α -mangostin-induced cell death:

Caspase-independent apoptosis with release of endonuclease-G from mitochon-dria

and increased miR-143 expression in human colorectal cancer DLD-1 cells. Bioorg

Med Chem 15:5620-5628

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก สารเคมีสําหรับใชในการเลี้ยงเซลล 1. อาหารเล้ียงเซลล (RPMI medium)

RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 10.4 กรัม

ดี-กลูโคส (D-glucose) (Sigma) 3.6 กรัม

โซเดียมไพรูเวต (C3H3O3Na) (Sigma) 1.1 กรัม

โซเดียมไฮโดรเจนคารบอเนต(NaHCO3) (Sigma) 2.0 กรัม

HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid, Sigma) 5.9 กรัม

เพนนิซิลิน จ ี(Penicillin G)(Gibco) 20,000 units

สเตรปโตมัยซนิ (Streptomycin)(Gibco) 200.0 มิลลิกรัม

น้ํากล่ัน (Milli Q water) 1,000.0 มิลลิลิตร

กรองดวย sterilized Millipore membrane0.22 ไมโครเมตรเก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส

2. อาหารเล้ียงเซลลที่เสริมดวย Fetal bovine serum เขมขน 10 %

RPMI medium (1) 90.0 มิลลิลิตร

Fetal bovine serum (FBS)(Gibco) 10.0 มิลลิลิตร

3. สารละลายสําหรับชะลางเซลลออกจากผิวหนาภาชนะเล้ียงเซลล

Trypsin / EDTA pH 7.3

Trypsin 0.25 กรัม

EDTA 0.04 กรัม

Hanks’ Balomceol salt solution 100.0 มิลลิลิตร

กรองดวย sterilized Millipore membrane0.22 ไมโครเมตรเก็บที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส

4. สารละลายสําหรับแชแข็งเซลล (Preservative RPMI)

ไดเมธินซัลฟอกไซด (Dimethylsulfoxide)(Sigma) 2.0 มิลลิลิตร

RPMI medium (1) 8.0 มิลลิลิตร

Fetal bovine serum (FBS) 10.0 มิลลิลิตร

เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส

36

ภาคผนวก ข

การเจือจางสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุด การเตรียมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดที่ความเขมขนตาง ๆ

เตรียมสารสกัดหยาบกลุม xanthone จากเปลือกมังคุดใหมีความเขมขนเร่ิมตนที่ 100

มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ในสารละลาย DMSO สําหรับใชในการเจือจางใหมีความเขมขนตางๆดังนี้

- ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร เตรียมจากความเขมขน 100 มิลลิกรัม ตอ

มิลลิลิตร ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เจือจางดวย RPMI media ปริมาตร 398 ไมโครลิตร

- 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เตรียมจากความเขมขน 0.5 มิลลิกรัม ตอมิลลิลิตร

ปริมาตร 40 ไมโครลิตร เจือจางดวย RPMI media ปริมาตร 360 ไมโครลิตร

- 5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เตรียมจากความเขมขน 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร


-0.5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร เตรียมจากความเขมขน 5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร


- 50 นาโนกรัมกรัมตอมิลลิลิตร เตรียมจากความเขมขน 0.5 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร


- 5 นาโนกรัมตอมิลลิลิตร เตรียมจากความเขมขน 50 นาโนกรัมตอมิลลิลิตร ปริมาตร

40 ไมโครลิตร เจือจางดวย RPMI media ปริมาตร 360 ไมโครลิตร

37

ภาคผนวก ค

สารเคมีและบัฟเฟอร 1. สารเคมีสําหรับการทดสอบความเปนพิษตอเซลลมะเร็ง ดวยวิธี MTT

การเตรียมสาร MTT (ความเขมขน 0.5 มลิลิกรัมตอ มิลลิลิตร) MTT 5.0 มิลลิกรัม RPMI medium (1) 10.0 มิลลิลิตร

2. สารเคมีสําหรับการยอม นิวเคลียส การเตรียมสียอม Hoechst 33342 Hoechst 33342 17.5 มิลลิกรัม น้ํากล่ัน 17.5 ไมโครลิตร

3. สารเคมีและบัฟเฟอรสําหรับลางเซลล 3.1 Phosphate buffer saline (1x PSB) pH 7.4

โซเดียมคลอไรด (NaCl) 8.0 กรัม โพแทสเซียมคลอไรด (KCl) 0.2 กรัม โพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH2PO4) 0.2 กรัม ไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต (Na2HPO4) 1.15 กรัม น้ํากล่ัน 1,000.0 มิลลิลิตร

3.2 TE buffer pH 8.0 10 mM Tris 1.0 มิลลิลิตร 1 mM EDTA 1.0 มิลลิลิตร

4. สารเคมีและบัฟเฟอรสําหรับ SDS-PAGE และ Western blot 4.1 การเตรียม separating gel และ stacking gel สําหรับ SDS-PAGE

4.1.1 การเตรียม separating gel (12% gel) 40% Acrylamide BIS (1.1) 1.5 มิลลิลิตร Tris-HCl เขมขน 1.5 M pH 8.8 (1.2) 1.25 มิลลิลิตร SDS เขมขน 10 % (1.4) 50.0 ไมโครลิต น้ํากล่ัน 2.17 มิลลิลิตร แอมโมเนียมเปอรซัลเฟตเขมขน 10 % 25.0 ไมโครลิต TEMED 2.5 ไมโครลิต

38

4.1.2 การเตรียม stacking gel(4% gel) 40% Acrylamide BIS (1.1) 0.49 มิลลิลิตร Tris-HCl เขมขน 1.0 โมลาร pH 6.8 (1.3) 0.63 มิลลิลิตร SDS เขมขน 10 % (1.4) 50.0 ไมโครลิตร น้ํากล่ัน 3.8 มิลลิลิตร แอมโมเนียมเปอรซัลเฟตเขมขน 10 % 25.0 ไมโครลิตร TEMED 5.0 ไมโครลิตร

ตารางที่ 4 แสดงสวนผสมพอลิอะคริลาไมดของ separating gel และ stacking gel

สวนผสม Separating 12% gel Stacking 4% gel

40% Acrylamide BIS (1.1) 1.5 มิลลิลิตร 0.49 มิลลิลิตร

Tris-HCl เขมขน 1.5 M pH 8.8 (1.2) 1.25 มิลลิลิตร -

Tris-HCl เขมขน 1.0 M pH 6.8 (1.3) - 0.625 มิลลิลิตร

SDS เขมขน 10 % (1.4) 50 ไมโครลิตร 5 ไมโครลิตร

น้ํากล่ัน 2.17 มิลลิลิตร 3.8 มิลลิลิตร

แอมโมเนยีมเปอรซัลเฟตเขมขน 10 % 25 ไมโครลิตร 25 ไมโครลิตร

TEMED 5 ไมโครลิตร 5 ไมโครลิตร

ผสมและเทอยางรวดเร็วลงในชองระหวางกระจก 4.2 Running buffer( SDS-PAGE Tank buffer)

Tris 12.0 กรัม ไกลซีน 57.6 กรัม SDS เขมขน 10 % (1.4) 40.0 มิลลิลิตร น้ํากล่ัน 1,000.0 มิลลิลิตร

4.3 Towbin transfer buffer pH 8.8 สําหรับการวิเคราะห Western blot Tris 3.0 กรัม ไกลซีน 14.4 กรัม เมธานอล 200.0 มิลลิลิตร น้ํากล่ัน 1,000.0 มิลลิลิตร กอนนําบัฟเฟอรไปใชตองนําไปแชใหเย็นจัด

ประวัติยอผูวิจัย

40

ประวัติยอผูวิจัย ชื่อ ชื่อสกุล นายพิเชษฐ เกียรติพรศักดา

วันเดือนปเกิด 22 สิงหาคม 2522

สถานที่เกิด เชียงราย

สถานที่อยูปจจุบัน บานเลขที่ 236 หมูที่ 10 ตําบลเวียง อําเภอเชียงของ จังหวัด

เชียงราย 57140

ตําแหนงหนาที่การงานปจจุบัน นักเทคนิคการแพทย ระดับ 5

สถานทีท่ํางานปจจุบนั หนวยตรวจโรคติดเช้ือดวยวธิีชวีโมเลกุล ฝายคัดกรองจายโลหิต

และผลิตภัณฑ ศูนยบริการโลหิตแหงชาติ สภากาชาดไทย

ประวัติการศึกษา

พ.ศ. 2545 วท.บ.(เทคนิคการแพทย)

จากมหาวิทยาลัยรังสิต

พ.ศ. 2553 วท.ม.(เทคโนโลยีชีวภาพ)

จากมหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ

ความเป นพิษและกลไกการเหน...

Documents