ФГУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ»

Перевод № 6994

Автор: Название: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories Infectious Diseases Стандарты качества и руководства МЭБ для ветеринарных лабораторий: Инфекционные болезни

Источник: Париж, 2008

Переводчик: Акминская Е.В.

Редактор:

Дата: апрель 2009

Владимир

2

Стандарты качества и руководства МЭБ для ветеринарных лабораторий:

Инфекционные болезни

3

Вступление Три главных цели МЭБ – способствовать усовершенствованию ветеринарных служб по всему миру, гарантировать безопасность и продвигать международную торговлю животными и продуктами животного происхождения. В Руководстве МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных описаны принятые на международном уровне методы тестирования для выявления инфекционных болезней наземных животных с целью гармонизации методов борьбы с болезнями на национальном уровне, программ надзора и наблюдения, а также для международной торговли. Подобным же образом, в Руководстве по диагностическим тестам для водных животных описаны методы по болезням рыб и водных беспозвоночных. Чтобы обеспечить достоверность результатов тестирования как на национальном, так и на международном уровнях, методы тестирования необходимо надлежащим образом валидировать в отношении их предполагаемого применения; опытный сотрудник лаборатории должен надлежащим образом контролировать проведение тестов. Вкратце, для достижения достоверности результатов, лаборатории должны работать в соответствии с признанным стандартом качества. Признавая необходимость такого стандарта, направленного специально на лаборатории, которые проводят тесты с целью выявления инфекционных болезней животных, Комиссия по биологическим стандартам МЭБ решила разработать интерпретацию общепринятых требований ISO/IEC2 – 17025 – Общие требования к компетентности лабораторий, которые проводят тестирование и калибровку. С момента первого издания данной брошюры (2002) исходный стандарт уже обновили как ISO/IEC 17025:2005, чтобы включить гармонизированный подход, дополняющий также требования серий ISO 9000, особенно ISO 9001:2000 – Системы управления качеством. Требования. Новое издание брошюры МЭБ приводит Стандарт качества МЭБ в соответствие с версией стандарта ISO/IEC 2005 года. Поскольку это интерпретация ISO/IEC 17025, лаборатории, которые соответствуют стандарту качества МЭБ, также будут работать в соответствии с требованиями ISO для испытательных лабораторий. В данной брошюре также содержатся руководства, разработанные Комиссией по биологическим стандартам МЭБ и утвержденные Международным комитетом МЭБ. В удобном формате брошюры здесь предложены практические тексты, дополняющие руководства по наземным и водным животным. Обновлены предыдущие руководства по валидации методов тестирования, подтверждению референтных реактивов и проверке квалификации лабораторного персонала; добавлено новое руководство по валидации тестов с использованием полимеразной цепной реакции. Мы надеемся, что в буклете вы найдете полезное и практическое руководство для лабораторий, которые стремятся улучшить или поддержать приемлемый и признаваемый национальными органами и международными организациями уровень эффективности. Steven Edwards Президент, Комиссия по биологическим стандартам МЭБ 2 Международная организация по стандартизации Международная электротехническая комиссия

4

Содержание Стандарты для управления и технические требования к лабораториям, которые проводят тестирование на инфекционные болезни животных Введение 1. Область действия 2. Ссылки на нормативные документы 3. Термины и определения 4. Требования к управлению 4.1. Организация и управление 4.2. Система качества 4.3. Делопроизводство 4.4. Рассмотрение запросов, тендеров или контрактов 4.5. Заключение субподрядных договоров на испытательные услуги 4.6. Приобретение услуг и снабжение 4.7. Жалобы 4.8. Контроль несоответствующих результатов тестирования 4.9. Постоянное повышение эффективности 4.10. Корректирующие и профилактические меры 4.11. Записи 4.12. Внутренние проверки 4.13. Анализ системы управления 5. Технические требования

5.1. Общие требования 5.2. Персонал 5.3. Размещение и условия окружающей среды 5.4. Методы тестирования 5.5. Оборудование, включая компьютеры и программное обеспечение 5.6. Отслеживаемость измерений 5.7. Пробы 5.8. Обращение с пробами 5.9. Обеспечение качества результатов тестирования 5.10. Отчет о результатах тестирования

6. Ссылки Руководство МЭБ 1: Валидация диагностических тестов для инфекционных болезней 1. Введение

1.1. Цель 1.2. Сфера применения

2. Определение валидированного анализа

5

3. Необходимые предварительные требования для валидации анализа 3.1. Выбор анализа, подходящего для намеченной цели 3.2. Соображения относительно получения рабочих характеристик анализа, подходящих для намеченной цели 3.3. Возможность проведения выбранного типа анализа

4. Валидация анализа – Часть 1

4.1. Стандартизация параметром протокола и оптимальных концентраций реагентов. 4.2. Оценки воспроизводимости 4.3. Аналитическая чувствительность и специфичность

5. Валидация анализа – Часть 2 5.1. Определение технических характеристик анализа 6. Валидация анализов – Часть 3 6.1. Оценки воспроизводимости и повышенной сходимости 7. Валидация анализа – Часть 4

7.1. Применение программы 7.2. Достоверность результатов анализа: прогностическое значение 7.3. Сохранение и усиление критериев валидации

Руководство МЭБ 2: Валидация и контроль качества методов на основе полимеразной цепной реакции, используемых для диагностики инфекционных заболеваний

1. Предпосылки

1.1. Цель 1.2. Область применения 1.3. Анализ, прошедший валидацию 1.4. Предполагаемая пригодность для определенных целей

2. Валидация анализа – Введение

2.1. Принципы первоначальной разработки анализа 3. Валидация анализа – Часть1

3.1. Оптимизация и стандартизация реагентов и определение критических контрольных параметров 3.2. Сходимость 3.3. Определение аналитической специфичности и чувствительности

4. Валидация анализа – Часть 2

4.1. Определение рабочих характеристик анализа 4.2. Определение порога

5. Валидация анализа – Часть 3 5.1. Установление воспроизводимости анализа 6. Валидация анализа – Часть 4

6.1.Внедрение программы 6.2. Валидность мониторинга проведения анализа

6

Руководство МЭБ 3: Международные эталонные стандарты по антителам для анализов с использованием антител

1. Введение 1.1. Цель 1.2. Дефиниции 1.3. Сфера применения 1.4. Подход

2. Отбор материалов для использования в качестве стандартов

2.1. Типы материала 2.2. Безопасность 2.3. Положительные эталонные стандарты 2.4. Отрицательные эталонные стандарты

3. Характеристики международных эталонных стандартов

3.1. Сильноположительный эталонный стандарт 3.2. Слабоположительный эталонный стандарт 3.3. Отрицательный эталонный стандарт

4. Приготовление эталонных стандартов

4.1. Состав стандартов 4.2. Стабильность и хранение 4.3. Контроль партий 4.4. Этикетирование 4.5. Спецификации

5. Утверждение эталонных стандартов МЭБ 6. Список литературы Руководство МЭБ 4: Проверка квалификации лабораторий

1. Введение

1.1. Цель 1.2. Сфера применения 1.3. Межлабораторные сравнительные тестирования 1.4. Квалификационное тестирование 1.5. Аккредитация

2. Орган власти и признание 3. Организация и управление 5. Подбор и состав набора контрольных образцов

5.1. Основные принципы 5.2. Состав набора для квалификационного тестирования

6. Статистический анализ

6.1. Виды данных 6.2. Присвоенные значения

7

6.3. Статистические методы 7. Критерии прохождения/непрохождения испытания 8. Периодичность проведения квалификационного тестирования 9. Признание лаборатории 10. Логистика

10.1. Соответствие критериям и принятие условий 10.2. Уведомление и транспортировка наборов 10.3. Тестирование и возвращение результатов 10.4. Анализ и отчетность

11. Раскрытие информации Глоссарий терминов

8

Введение В данном документе описан Стандарт МЭБ для управления и технической компетенции, который служит основой для аккредитации лабораторий, осуществляющих тестирование с целью выявления инфекционных болезней животных, особенно для лабораторий, которые проводят тесты для международной торговли. В документе содержатся специальные требования для лабораторий, которые проводят тесты с целью обнаружения инфекционных болезней животных. Эти специальные требования представляют собой интерпретацию общепринятых требований ISO/IEC3 17025 – Общие требования к компетенции лабораторий, которые проводят тестирование и калибровку (как описано в Приложении В ISO/IEC 17025). Органы аккредитации, которые признают компетенцию таких испытательных лабораторий, могут пользоваться этим стандартом в качестве основы при проведении аккредитации. Лаборатории, соответствующие Стандарту МЭБ, также будут работать в соответствии с ISO/IEC 17025 в отношении тестирования на инфекционные болезни животных. В Статье 4 указаны определенные требования, которым должна соответствовать лаборатория, чтобы продемонстрировать рациональное управление. В Статье 5 определены требования, необходимые для подтверждения технической компетенции и достоверности результатов по методам тестирования, которые использует лаборатория. Стандарт МЭБ будет также служить базовым документом, на основании которого будут по мере необходимости разрабатываться дальнейшие интерпретации и/или инструкции. В связи с мероприятиями, направленными на борьбу с основными эпизоотиями среди животных или их искоренение и устранение технических барьеров к торговле сельскохозяйственными животными и побочными товарами, возникла необходимость обеспечить, чтобы национальные ветеринарные лаборатории или их делегаты, которые проводят тестирование с целью выявления инфекционных болезней животных, могли работать в соответствии с системой качества серии ISO 9000, а также в соответствии с данным Стандартом. Следовательно, как и в случае с ISO/IEC 17025, сюда включены требования серии ISO 9000, относящиеся к области услуг по проведению испытаний, на которые распространяется лабораторная система качества. Если лаборатории будут соблюдать данный Стандарт и получат аккредитацию органов, вступивших во взаимовыгодные соглашения по признанию с соответствующими органами в других странах, использующих данный Стандарт, это будет способствовать принятию результатов тестирования и интерпретаций диагностических методов между странами. 1.1. В данном Стандарте описаны общие требования, которые должна соблюдать

лаборатория, чтобы быть признанной компетентной для проведения тестов с целью выявления инфекционных болезней животных. Стандарт будет использоваться государствами-членами МЭБ при оценке лабораторий, осуществляющих тесты с целью определения соответствия животных и продуктов животноводства требованиям международной торговли. Стандарт охватывает использование признанных на международном уровне стандартных методов и методов, на которые не распространяются международные стандарты, включая методы, разработанные для собственного использования.

3 Международная организация по стандартизации/ Международная электротехническая комиссия

9

1.2. Этот Стандарт применяется ко всем лабораториям, которые проводят тесты с целью выявления инфекционных болезней животных. Они включают национальные ветеринарные лаборатории, а также государственные и частные лаборатории, заключившие контракт с национальными ветеринарными органами на предоставление таких услуг.

1.3. Данный Стандарт применяется независимо от количества персонала или объема

испытаний с целью обнаружения инфекционных болезней животных. Если лаборатория не проводит один или более тестов, на которые распространяется данный стандарт, требования соответствующих статей не применяются.

1.4. В примечаниях даны пояснения к тексту, примеры и инструкции. Они не содержат

требования и не являются неотъемлемой частью данного Стандарта. 1.5. Этот Стандарт будет применяться лабораториями при разработке системы

управления качеством, административными и техническими операциями. Он также может использоваться клиентами лабораторий, регулирующими органами и органами аккредитации, которые занимаются подтверждением или признанием компетентности лабораторий. Данный международный стандарт не предполагается использовать в качестве основы для сертификации лабораторий.

Примечание 1: Термин «система управления» в этом Международном стандарте

означает систему качества, административную и техническую системы, которые регулируют работу лаборатории.

Примечание 2: Сертификацию системы управления иногда также называют

регистрацией. В следующем документе содержатся положения, которые, путем ссылки на этот текст, составляют положения данного Стандарта. Стороны соглашений, заключенных на основании данного Стандарта, могут изучить возможность использования самых последних изданий документов, указанных ниже. ISO/IEC 17000, Оценка соответствия – Терминология и общие принципы. Руководство МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных

животных, 2008 год Примечание: Другие имеющие отношение к делу стандарты, руководства и т.д. по

теме, включенной в данный Стандарт, указаны в списке литературы. 3. Термины и определения Для целей данного Стандарта применяются соответствующие определения, указанные в ISO/IEC 17000, ISO 9000, Руководстве МЭБ по наземным животным, а также следующие термины и определения. 3.1. Проба: Материал, полученный из образца и используемый для тестирования. 3.2. Образец:

10

Материал, исключительно животного происхождения, представленный для тестирования. 3.3. Валидация: Процесс, посредством которого подтверждают, что метод тестирования пригоден для данной цели. 4.1. Организация и управление 4.1.1. Лаборатория или организация, частью которой является лаборатория, должна

являться юридическим лицом. 4.1.2. Лаборатория должна иметь соответствующую организацию и работать в

соответствии с требованиям данного Стандарта при проведении работ в своих постоянных помещениях, на объектах, находящихся вне постоянных помещений, или на смежных временных или мобильных объектах.

4.1.3. Лаборатория должна иметь четко обозначенную организационную систему и

структуру, описанную в схеме организационной структуры и в должностных обязанностях. В схемах организационной структуры должны быть перечислены ведущие специалисты и место лаборатории внутри организации. Должны быть указаны отношения между административными и техническими структурами, вспомогательными службами и службами обеспечения качества.

4.1.4. Лаборатория должна:

a) иметь административный и технический персонал, который, независимо от других обязанностей, обладает полномочиями и ресурсами, необходимыми для выполнения своих обязанностей, включая создание, поддержку и совершенствование системы управления, для определения отклонений от системы управления или от процедур по проведению тестов и/или калибровок и для инициирования действий по предотвращению или снижению количества таких отклонений;

b) обеспечить, чтобы администрация и сотрудники были свободны от любого

внутреннего или внешнего давления со стороны коммерческих, финансовых и других структур, которое может неблагоприятно отразиться на качестве их работы;

c) иметь стратегии и процедуры по обеспечению защиты конфиденциальной

информации и прав на собственность своих клиентов, включая процедуры по защите информации во время электронной передачи данных;

d) иметь стратегии и процедуры, чтобы избегать участия в любой деятельности,

которая может снизить уверенность в компетентности, беспристрастности, способности выносить суждения и работоспособности лаборатории;

e) определить организационную и административную структуру лаборатории, ее

место в общей организации и отношения между службой обеспечения качества, административными и техническими службами.

11

f) определить обязанности, полномочия и взаимодействия всех сотрудников, которые руководят, выполняют или проверяют работу, влияющую на качество и интерпретацию диагностических тестов;

g) обеспечить, чтобы специалисты, знакомые с тестами, их целью и анализом

результатов осуществляли надлежащий контроль за персоналом, включая практикантов;

h) иметь техническое управление, на которое возложена общая ответственность

за технические операции и наличие ресурсов, необходимых для обеспечения надлежащего качества лабораторной работы;

i) назначить менеджеров по качеству из числа сотрудников, которые независимо

от других своих обязанностей будут отвечать и обладать полномочиями для обеспечения внедрения и соблюдения требований системы управления качеством; менеджер по качеству должен иметь прямой доступ к руководителям высшего звена, которые принимают решения по политике или ресурсам лабораторий;

j) назначить заместителей для ведущих административных сотрудников, таких

как менеджеры по качеству;

k) гарантировать, что сотрудники осведомлены о важности и значимости их работы и о том, какой вклад они вносят в достижение целей административной системы.

4.1.5. Руководство должно обеспечить наличие в лаборатории соответствующей системы

связи и обмен информацией по поводу эффективности системы управления. Примечание: В лабораториях с небольшим количеством сотрудников некоторые

специалисты могут выполнять более одной функции, и поэтому было бы непрактичным назначать заместителей по каждой функции.

4.2. Система управления 4.2.1. Руководитель лаборатории должен создать, внедрить и поддерживать систему

управления, соответствующую сфере деятельности, включая тип, диапазон и объем тестирования, которое проводит лаборатория. Руководитель лаборатории должен документально оформить свои стратегии, системы, программы, процедуры и инструкции, чтобы лаборатория могла обеспечить качество получаемых результатов тестов и интерпретаций диагностических методов. Документацию, используемую в данной системе качества, нужно направлять соответствующему персоналу для ознакомления и использования.

4.2.2. Политика системы управления лаборатории, касающаяся качества, включая

изложение принципов качества, должна быть описана в руководстве по качеству (как бы оно ни называлось). Во время анализа системы управления необходимо определить и проанализировать общие цели. По распоряжению руководства должно быть выпущено изложение политики качества. Оно должно включать, как минимум, следующее:

12

a) изложение намерений руководства лаборатории в отношении стандарта предоставляемых услуг;

b) цель системы управления в отношении качества;

c) требование, чтобы все сотрудники, которые проводят тесты в лаборатории,

ознакомились с документацией по качеству и применяли стратегии и процедуры в своей работе;

d) обязательство руководства лаборатории в отношении надлежащей

профессиональной практики и качества диагностических услуг для своих клиентов;

e) обязательство руководства лаборатории соблюдать данный Международный

стандарт и постоянно повышать эффективность системы управления. Примечание: Изложение политики качества и руководство должны быть краткими. 4.2.3. Руководство должно представить доказательства своей готовности разработать и

применять систему управления и постоянно повышать ее эффективность. 4.2.4. Руководство должно заявить организации о важности соблюдения как требований

клиента, так и установленных законом нормативных требований. 4.2.5. Руководство по качеству должно включать или содержать ссылки на

дополнительные процедуры, включая технические. В руководстве должна быть описана структура документации, используемая в системе качества. Руководство по качеству необходимо постоянно обновлять.

4.2.6. В руководстве по качеству должны быть определены роли и обязанности

технического руководства и менеджеров по качеству, включая их обязанности по обеспечению соответствия данному Стандарту.

4.2.7. Руководство должно обеспечить, чтобы целостность административной системы

сохранялась даже в случае планирования и внесения изменений в систему управления.

4.3. Контроль документооборота 4.3.1. Система документооборота должна обеспечивать, чтобы в лаборатории

использовалась только текущая версия верного документа, и чтобы на рабочем месте имелись все документы, необходимые сотрудникам для выполнения их работы.

4.3.2. Лаборатория должна иметь документально оформленную политику, процедуры

и/или рабочие инструкции, в которых описано, как рассматривают, утверждают, выпускают, обновляют, пересматривают, изменяют, хранят или помещают в архив лабораторную документацию, влияющую на качество тестов, включая методы тестирования. Процедуры должен рассматривать и утверждать квалифицированный уполномоченный персонал.

13

4.3.3. Исправления к документам должны быть четко обозначены в тексте, их должен рассматривать квалифицированный уполномоченный персонал, имеющий доступ к справочной информации, касающейся этих изменений.

4.3.4. Документы должны иметь уникальное обозначение и четкие ссылки друг на друга. Примечание: В данном контексте «документ» означает информацию или

инструкции в любом формате или среде, которые имеют прямое отношение или влияют на качество результатов тестов, и включают не только руководство по качеству, политику, процедуры и инструкции, а также методы тестирования, рабочие планы, формы, международные стандарты и постановления.

4.4. Рассмотрение запросов, тендеров или контрактов 4.4.1. Лаборатория должна иметь документально оформленную политику и процедуры,

описывающие, как лаборатория обеспечивает возможность проведения определенного метода тестирования. Процедуры должны обеспечивать соответствующее обсуждение предполагаемой работы с сотрудниками лаборатории и клиентом. Лаборатория должна хранить записи о проведенном обсуждении и согласии клиента.

4.4.2. Любая работа, на которую лаборатория заключает субподрядный договор, также

должна обсуждаться. 4.5. Заключение субподрядных договоров на испытательные услуги Клиент должен быть проинформирован и дать согласие на заключение субподрядного договора на работу. 4.6. Приобретение услуг и снабжение Лаборатория должна иметь стратегии и процедуры по обеспечению того, чтобы услуги и поставки соответствовали предварительно установленным спецификациям и не оказывали неблагоприятного воздействия на качество результатов тестов. Эти процедуры должны включать описание критериев для отбора, оценки, использования, манипуляций и хранения материалов и реактивов, оказывающих действие или потенциальное действие на результаты тестов. 4.7. Жалобы Лаборатория должна иметь стратегии и процедуры для рассмотрения претензий от клиентов или других сторон. Следует хранить записи обо всех жалобах, о проведенном расследовании и мерах, принятых лабораторией. 4.8. Контроль несоответствующих результатов тестирования 4.8.1. Лаборатория должна иметь стратегии и процедуры, которые обеспечивают, чтобы

несоответствующие результаты тестирования (существующие условия, которые неблагоприятно отразились или могли отразиться на надежности результатов тестирования) вовремя обнаруживали и надлежащим образом исправляли. Лаборатория должна иметь процедуры по информированию клиентов, если

14

результаты тестов вызывают сомнения или являются недостоверными, особенно, если такая вероятность была обнаружена уже после того, как результаты тестов были сообщены клиенту. В процедурах должно быть описано, кто обладает полномочиями задерживать результаты тестов, принимать меры по устранению причин и разрешать возобновление работ.

4.8.2. Если выявлена серьезная проблема или риск для качества результатов тестов,

лаборатория должна обеспечить надлежащее выполнение мер, указанных в пункте 4.10, по устранению причин данной проблемы.

4.9. Постоянное повышение эффективности Лаборатория должна постоянно повышать эффективность системы управления посредством использования политики качества, целей качества, результатов аудита, анализа данных, корректирующих и профилактических мер и анализа системы управления. 4.10. Корректирующие и профилактические меры 4.10.1. Лаборатория должна иметь стратегии и процедуры для принятия корректирующих

мер в случае выявления несоответствующей работы или отклонений от стратегий и процедур в системе управления. Стратегии и процедуры должны обеспечивать:

a) назначение соответствующих органов, ответственных за осуществление

корректирующих мер; b) расследование с целью определения коренной причины данной проблемы;

c) после определения – принятие соответствующих корректирующих мер;

d) документальное оформление необходимых изменений, внесенных в порядок

выполнения работ;

e) после выполнения корректирующих мер – проведение мониторинга с целью обеспечения эффективности решения проблемы;

f) при необходимости, в сферах деятельности, в которых были приняты

корректирующие меры, нужно провести аудит в соответствии с 4.12. Примечание: Специальный внутренний аудит нужно проводить, только если целью

корректирующих меры была серьезная проблема или риск для качества тестов или целостности системы качества.

4.10.2. Лаборатория должна определить потенциальные источники несоответствий и

возможную необходимость усовершенствования, либо с технической точки зрения, либо с точки зрения системы управления. Профилактические меры должны включать:

a) идентификацию и оценку потенциальных несоответствий или возможностей

для совершенствования;

15

b) разработку и осуществление плана действий, включая соответствующие контроли;

c) мониторинг эффективности при снижении вероятности выявления

несоответствий или во время принятия решений по поводу необходимости усовершенствования.

Примечание: Профилактические меры это упреждающий процесс. При определении

определенных технических сфер, требующих принятия профилактических мер, часто нужно проводить мониторинг и анализ достоверности методов тестирования и компетентности лаборатории.

4.11. Записи 4.11.1. Общие требования Лаборатория должна вести записи по системе управления

4.11.1.1. Лаборатория должна создать и проводить процедуры по идентификации, сбору, занесению в указатель, обеспечению доступа, хранению и уничтожению записей по системе качества и техническим процессам. Записи по системе качества должны включать отчеты по внутреннему аудиту и анализы системы управления, а также записи о принятых корректирующих и профилактических мерах.

4.11.1.2. Все записи должны быть удобочитаемыми и храниться таким образом,

чтобы их можно было легко достать и в помещении, в котором обеспечена подходящая среда, предотвращающая порчу и повреждение. Необходимо установить срок хранения записей.

Примечание: Записи можно хранить в любой форме, например, на жестком диске

или на электронном носителе.

4.11.1.3. При хранении записей следует соблюдать правила конфиденциальности. 4.11.1.4. Лаборатория должна иметь процедуры по защите и резервному

копированию данных, которые хранятся на компьютерах, на всех этапах, а также по предотвращению несанкционированного доступа к данным или их изменения.

4.11.2. Технические записи

4.11.2.1. В течение определенного времени лаборатория должна хранить исходные данные, производные данные, протоколы поверки, документацию по кадрам, копию каждого выданного отчета по проведенному тестированию и любую информацию, необходимую для воссоздания осуществленных действий. Записи по каждому тестированию должны содержать достаточное количество информации для того, чтобы можно было определить факторы, влияющие на качество результатов тестов, и чтобы тест можно было повторить в условиях, как можно более приближенных к первоначальным. В записях должны быть указаны сотрудники, которые проводили тестирование.

16

4.11.2.2. Наблюдения, данные и расчеты следует четко и постоянно регистрировать

с указанием теста, к которому они относятся, и в то время, когда они были сделаны.

4.11.2.3. При обнаружении ошибок в записях каждую ошибку следует вычеркивать

(не стирать, не делать неразборчивой и не удалять), а рядом вводить верный показатель. При внесении каждого такого изменения в запись, нужно ставить дату, подпись и инициалы сотрудника, которые сделал исправления. В случае с данными, которые собирают на компьютере, необходимо также принимать меры, чтобы избежать потери или изменения первоначальных данных.

4.12. Внутренние аудиты 4.12.1. Лаборатория должна периодически и в соответствии с предварительно

утвержденным планом и процедурой проводить внутренние аудиты своих действий с целью подтверждения, что действия осуществляются в соответствии с требованиями системы управления и данным Стандартом. Программы внутреннего аудиты должны быть направлены на всех элементы системы управления, включая тестирование. Менеджер по качеству должен отвечать за планирование и организацию аудитов в соответствии с планом и по требованию руководства. Такие аудиты должен проводить обученный и квалифицированный персонал, который, если это позволяют ресурсы, не касается проверяемой деятельности. Сотрудники не могут проводить аудит своей собственной деятельности за исключением случае, когда можно продемонстрировать, что будет проведен эффективный аудит.

Примечание: В лабораториях с небольшим количеством сотрудников эффективный

аудит может быть невозможен. В таких случаях две или более лаборатории могут начать сотрудничество с целью проведения аудита друг у друга.

4.12.2. Если по результатам аудита возникают сомнения в эффективности действий или

в качестве результатов лабораторного тестирования, лаборатория должна своевременно принять корректирующие и профилактические меры и уведомить клиентов в письменной форме, если расследование показало, что это могло повлиять на результаты лабораторных тестов (см. 4.8.).

4.12.3. Необходимо регистрировать область деятельности, аудит которой проводится,

результаты аудита и принятые корректирующие меры. Руководство лаборатории должно обеспечить, чтобы корректирующие меры принимались в течение соответствующего и согласованного периода времени.

4.13. Анализ системы управления 4.13.1. Не реже одного раза в год руководство должно проводить анализ системы

управления и деятельности, связанной с тестированием. При проведении анализа следует учитывать:

a) пригодность стратегий и процедур;

17

b) отчеты административного и контролирующего персонала; c) отчеты по недавно проведенным внутренним аудитам;

d) корректирующие и профилактические меры;

e) оценки внешних органов власти;

f) результаты межлабораторных сравнений или квалификационных испытаний;

g) изменения в объеме и виде работ;

h) обратную связь с клиентами;

i) жалобы;

j) рекомендации по усовершенствованию;

k) другие имеющие отношение к делу факторы, например, действия по

контролю качества, ресурсы и обучение персонала. 4.13.2. Необходимо регистрировать результаты анализа системы управления и принятые

меры. Руководство должно обеспечивать, чтобы эти меры принимались в течение соответствующего и согласованного периода времени.

4.13.3. Анализ и последующие действия должны обеспечивать непрерывную

стабильность и эффективность системы управления качеством и внесение необходимых изменений и усовершенствований.

5. Технические требования 5.1. Общие требования 5.1.1. Несколько факторов могут повлиять на надежность результатов тестирования.

Степень, в которой эти факторы влияют на надежность результатов тестирования, отличается в зависимости от вида теста. Лаборатория должна учитывать эти факторы при разработке или утверждении методов тестирования и процедур для регулярного использования, при обучении и повышении квалификации персонала, при выборе и калибровке оборудования, а также при оценке материалов и реактивов для использования в тестировании.

5.2. Персонал 5.2.1. Лаборатория должна обеспечить первоначальное и непрерывное обучение всех

сотрудников лаборатории по их непосредственным обязанностям. 5.2.2. Лаборатория должна составить должностные обязанности для

административного, технического и обслуживающего персонала, который проводит тестирование и интерпретацию диагностических методов, а руководство должно допускать к работе только тех сотрудников, которые имеют документы о соответствующей квалификации и компетенции для проведения тестирования и другой работы, связанной с этим.

18

5.2.3. Лаборатория должна иметь систему, которая обеспечивает создание и поддержку

программы обучения по существующим в настоящий момент и ожидаемым потребностям лаборатории. Эффективность обучения должна оцениваться.

5.3. Размещение и условия окружающей среды 5.3.1. Лабораторные помещения для тестирования, включая, но не ограничиваясь

энергетическими ресурсами, освещением и условиями окружающей среды, должны способствовать правильному проведению тестирования. Лаборатория должна обеспечивать, чтобы окружающая среды не делала недействительными результаты и не оказывала бы неблагоприятное воздействие на требуемое качество тестирования.

5.3.2. Лаборатория должна осуществлять мониторинг, контроль и регистрировать

условия окружающей среды, как требуется в соответствии со спецификациями, или если они могут отразиться на надежности результатов. Следует уделять должно внимание, например, биологической стерильности, пыли, электромагнитной интерференции, радиации, влажности, воздушным потокам, электропитанию, температуре и уровню звука и вибрации в соответствии с данными техническими операциями. Действия, связанные с тестированием, нужно останавливать, если условия окружающей среды подвергают опасности результаты теста.

5.3.3. Между соседними зонами, в которых проводят несовместимые действия,

должное быть соответствующее разделение. Для предотвращения перекрестной контаминации нужно принимать соответствующие меры.

5.3.4. Доступ к зонам, которые влияют на результаты тестирования, и их

использование должны быть контролируемыми. 5.4. Методы тестирования 5.4.1. Общие требования

5.4.1.1. Лаборатория должна использовать соответствующие методы тестирования и надлежащие процедуры для проведения всех мероприятий, связанных с диагностикой инфекционных болезней животных. Необходимо учитывать все факторы, которые влияют на релевантность метода тестирования и результаты тестирования, а также на интерпретацию диагностического метода или его применения. Эти факторы включают пригодность метода тестирования, признание научным и нормативными сообществами, признание клиентом, а также его выполнимость, учитывая имеющиеся лабораторные ресурсы. Насколько это возможно методы тестирования нужно выбирать из тех, которые одобрены или опубликованы уважаемыми техническими организациями или источниками.

5.4.1.2. Методы тестирования должен утверждать квалифицированный

уполномоченный персонал в соответствии с установленной процедурой. 5.4.1.3. Проведение тестов нужно контролировать надлежащим образом.

19

5.4.1.4. Лаборатория должна иметь письменные инструкции по всем тестам и соответствующие процедуры, используемые в регулярных мероприятиях, по калибровке и работе всего оборудования, а также по сбору, манипуляциям, транспортировке и хранению проб и подготовке образцов для тестирования.

5.4.1.5. Лаборатории, использующие методы тестирования, подготовленные

национальными и международными органами, устанавливающими стандарты, и другими внешними техническими организациями должны иметь систему, обеспечивающую своевременное автоматическое получение обновлений всех этих методов.

Примечание: Международные, региональные и национальные стандарты или

другие признанные спецификации, которые содержат необходимую и точную информацию по вышеуказанным темам, не нужно переписывать как внутренние процедуры, если эти стандарты опубликованы так, что их можно использовать как опубликованные сотрудниками лаборатории. Возможно, потребуется рассмотреть вопрос по поводу предоставления дополнительной документации или дополнительной информации по необязательным этапам анализа. Как и в случае с методами тестирования, международные стандарты должны быть включены в документальный контроль (см. 4.3).

5.4.2. Выбор методов

5.4.2.1. Клиента следует информировать о выбранном методе тестирования, и, при необходимости, лаборатория должна объяснить клиенту причины сделанного выбора (см. 5.4.1.1.).

5.4.2.2. Специалисты должны иметь документы, подтверждающие наличие у них

специальной подготовки для проведения теста. Специальную подготовка необходимо постоянно документально подтверждать через определенные промежутки времени. Оценка профессиональной пригодности должна быть основана на объективных данных с использованием контрольных проб соответствующего количества и состава. Эти пробы должны быть хорошо охарактеризованы.

5.4.2.3. Лаборатория должна проводить тесты, только если можно

продемонстрировать, что процесс находится под статистическим контролем.

5.4.2.4. Описание метода тестирования должно содержать достаточное количество

важной и описательной информации, чтобы опытный специалист мог провести тест надлежащим образом в рамках предварительно установленных контрольных пределов без ссылки на другие источники информации. Кроме этого, оно должно включать:

a) доказательство проведенного контроля документов и конфигурации; b) ссылки на соответствующие документы; c) описание предполагаемого анализируемого вещества (например,

антитела) и количество или диапазон, который нужно определить (например, титр);

20

d) необходимые эталонные стандарты или эталонные материалы

(например, эталонные штаммы, эталонные стандарты по антителам);

e) описание соответствующей матрицы или образца для тестирования, включая вид (например, сыворотка КРС);

f) соображения в отношении безопасности, включая необходимый

уровень сдерживания биологической угрозы;

g) список и спецификации для оборудования, материалов и реактивов, включая программное обеспечение;

h) условия для принятия образцов как пригодных для тестирования;

i) условия для идентификации, сбора, манипуляций, транспортировки и

хранения образцов;

j) условия для подготовки проб;

k) описание используемых контролей и их допустимых пределов;

l) проверки, которые должны быть сделаны до начала процедуры тестирования (например, проверка и калибровка оборудования);

m) критерии принятия для результатов тестирования;

n) данные, которые нужно регистрировать, и метод

анализа/трансформации, презентации и/или интерпретации (например, как трансформируется коэффициент поглощения и интерпретируется как положительный или отрицательный результат относительно точки раздела) и записи;

o) самое последнее описание процедуры теста.

5.4.2.5 Метод тестирования должен быть валидирован до того, как он будет включен

в деятельность лаборатории по рутинной диагностике. То же предварительное условие применяется к существующему анализу, который был изменен, в том случае, если изменение затронуло технические характеристики анализа (см. 5.4.3).

5.4.3 Валидация методов тестирования

5.4.3.1 Метод тестирования, как международный, так и национальный стандартный метод, гармонизированный метод или метод, разработанный на месте, считается подходящим для целей рутинной диагностики только в том случае, если он был валидирован в соответствии принципами, указанными в Руководстве МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных, а также в других справочных руководствах, имеющих отношение к МЭБ. Кроме того, предпочтительно, чтобы все методы, разработанные на местах или полученные из авторитетных собраний стандартных методов, подвергались валидации на местах с использованием соответствующего

21

количества образцов от представляющего интерес поголовья. От пользователя не требуется проводить повторную валидацию международных или национальных стандартных методов, но он должен иметь возможность определить, по крайней мере, посредством обращения к общественной или частной документации, аналитическую чувствительность и специфичность, точность и прецизионность, диагностическую чувствительность и специфичность, а также другие параметры, относящиеся к использованию метода тестирования в лаборатории пользователя. Пользователь должен предоставить задокументированное подтверждение данных и статистически значимую оценку сравнительного анализа в отношении тех анализов, которые гармонизированы в ходе межлабораторных сравнительных испытаний в соответствии с принятым и валидированным стандартным методом. Пользователь должен проводить полную валидацию всех методов тестирования, разработанных на местах, в соответствии с Руководством МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных.

5.4.3.2 Данные валидации, включая все первоначальные наблюдения, расчеты,

отчеты по мониторингу и поверке оборудования, а также заархивированные процедуры, использованные для формулировки аналитических характеристик теста, должны храниться и пересматриваться лабораторией, по крайней мере, на протяжении периода использования теста для рутинных диагностических целей или, по крайней мере, в течение семи лет после прекращения использования анализа.

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от требований потребителя, лаборатория может потребовать определить другие указания на диагностические характеристики, такие как прогностическая ценность положительных и отрицательных результатов теста. На практике данные указания могут быть важными для определенных диагностических целей или в отношении тестируемого поголовья. 5.4.4. Контроль данных

5.4.4.1. Используя соответствующие процедуры, лаборатория должна гарантировать, что все данные, полученные в результате валидации тестов и все данные, относящиеся к результатам тестов, безопасны, восстановимы и санкционированы к использованию специальным, квалифицированным персоналом.

5.4.4.2. Расчеты и передача данных основе должны подвергаться

надлежащей систематической проверке. 5.4.4.3. При использовании компьютеров или автоматического

оборудования для получения, обработки, регистрации, отчетности, хранения и восстановления данных тестирования лаборатория должна гарантировать, что:

a) компьютерное программное обеспечение, модифицированное

или разработанное пользователем, достаточно детально задокументировано и соответствующим образом валидировано

22

или проверено иным способом на предмет пригодности для использования, т.е. лаборатория должна применять и документально оформлять изменения в процедурах контроля такие, при которых эти действия можно было бы восстановить и оформить журнал учета;

b) устанавливаются и выполняются процедуры по защите

безопасности, целостности и восстанавливаемости данных; данные процедуры должны включать, но не ограничиваться, целостностью и конфиденциальностью ввода и сбора данных, хранения данных, передачи данных и обработки данных;

c) проводится техническое обслуживание компьютеров и

автоматизированного оборудования для обеспечения надлежащего функционирования, а также отводится место с соответствующими условиями окружающей среды и рабочими условиями, необходимыми для поддержания целостности данных тестирования.

ПРИМЕЧАНИЕ: Общепринятое коммерческое программное обеспечение, используемое в предусмотренной для него области применения, может считаться в достаточной степени валидированным. 5.5. Оборудование, включая компьютеры и программное обеспечение 5.5.1. Лаборатория должна быть оборудована всеми единицами оборудования для

тестирования, а также вспомогательным оборудованием, необходимым для правильного выполнения тестов. В тех случаях, когда лабораториям необходимо использовать оборудование за пределами ее постоянного контроля, она должна гарантировать соответствия настоящему Стандарту.

5.5.2. Оборудование и программное обеспечение к нему, используемые в деятельности по

диагностике, должно обладать возможностями для достижения необходимой точности и должно отвечать техническим характеристикам, соответствующим используемым процедурам. Программы поверки должны устанавливаться для ключевого оборудования в тех случаях, когда их свойства оказывают значительное воздействие на результаты.

5.5.3. Оборудование должно управляться санкционированным, квалифицированным

персоналом. Современные инструкции по использованию и техническому обслуживанию оборудования (включая все соответствующие руководства, предоставленные производителем оборудования) должны быть легкодоступны для использования надлежащим лабораторным персоналом.

5.5.4. Каждый используемый в деятельности по тестированию предмет оборудования,

оказывающий воздействие на результат проведенного теста, должен быть однозначно идентифицирован.

23

5.5.5. В отношении каждого предмета оборудования, значимого при проведении теста, необходимо вести отчетность. Отчетность должна включать, как минимум, следующее:

a) идентификацию предмета оборудования; b) имя производителя, идентификацию типа и серийный номер или другой вид

уникальной идентификации;

c) верификацию того, что оборудование соответствует техническим характеристикам;

d) при необходимости, местоположение на настоящий момент;

e) при наличии, инструкции производителя или указания на их местоположение;

f) даты, результаты и копии отчетов и сертификатов всех поверок, настроек, критериев приемок и дата следующей поверки или верификации поверки;

g) техническое обслуживание, проведенное на настоящий момент, а также план

технического обслуживания;

h) повреждения, неполадки, модификации или план технического обслуживания. 5.5.6. Следует установить правила технического обслуживания. 5.5.7. Поверки оборудования должны проводиться квалифицированным персоналом,

использующим процедуры, соответствующие целевому назначению, необходимой точности и прецизионности, а также с надлежащим интервалом, что подтверждается статистическими данными.

5.5.8. Оборудование, которое подвергалось либо перегрузке, либо неправильному

использованию, или которое представляет подозрительные результаты, или в отношении которого доказано его дефективность или выход за пределы нормативных пределов, должно быть выведено из эксплуатации, четко промаркировано и должно надлежащим образом храниться до починки и демонстрации правильного функционирования. Лаборатория должна исследовать воздействие дефекта или отклонения от указанных пределов на результаты предыдущих тестов и должна установить процедуру «Контроля не соответствующих работ» (4.8.).

5.5.9. Если это практически возможно, все оборудование, контролируемое лабораторией и

требующее поверки, должно быть промаркировано, снабжено кодами или идентифицировано другим способом в целях указания статуса поверки или верификации, а также должна быть проставлена предполагаемая дата следующей поверки или верификации.

5.5.10. Если, независимо от причины, оборудование на какой-либо период времени

выводится из-под непосредственного контроля лаборатории, лаборатория должна гарантировать, что перед возвратом оборудования к работе проверены функциональный статус и статус поверки оборудования, и они являются удовлетворительными.

24

5.5.11. Если компьютеры или автоматическое аналитическое оборудование используются для сбора, обработки, регистрации, отчетности, хранения или восстановления данных тестирования, лаборатория должна гарантировать, что выполнены требования пункта 5.4.4.3.

5.5.12. Оборудование для проведения тестирования, включая как аппаратное

оборудование, так и программное обеспечение, должно быть предохранено от установки настроек, которые могут сделать результаты тестирования недействительными.

5.6. Отслеживаемость измерений 5.6.1. При наличии указаний и если возможно, лаборатория должна иметь возможность

для отслеживания всех измерений, включая поверку оборудования, до единиц СИ. 5.6.2. В тех случаях, когда отслеживание до единиц СИ невозможно, наилучшим

способом, используемым для обеспечения уверенности в результатах, является следующее:

a) использование соответствующих эталонных стандартов или материалов,

сертифицированных для предоставления достоверного описания материала; b) взаимно согласованные стандарты или методы, которые четко описаны и

согласованы между заинтересованными сторонами;

c) участие в соответствующей программе межлабораторных сравнительных или квалификационных испытаний.

5.6.3. Эталонное оборудование, стандартны или материалы, используемые наряду с

деятельностью по проведению тестов, должны использоваться, обслуживаться и храниться таким образом, чтобы гарантировать надлежащее функционирование и/или точность.

5.6.4. Биологические эталонные материалы должны, по возможности, отслеживаться до

общепринятых международных стандартов или до эталонных материалов МЭБ (например, международные эталонные сыворотки).

5.6.5. Проверки, необходимые для поддержания уверенности в статусе рабочих

стандартов или эталонных материалов, должны проводиться в соответствии с определенными процедурами и графиками.

5.6.6. В лаборатории должна использоваться процедура для безопасного использования,

транспортировки, хранения и использования эталонных стандартов и материалов в целях предотвращения их контаминации или разрушения, или в целях защиты их целостности.

5.7. Пробы 5.7.1. Общая информация

25

В лаборатории должны использоваться процедуры для отбора проб с тем, чтобы гарантировать, что они соответствуют используемому тесту и подходят для тестирования. 5.7.1.1. В лаборатории должны использоваться процедуры для отбора, обработки, в

случае указаний, и обеспечения сохранности проб. Отбор и связанные с ним процедуры должны проводиться месте отбора проб.

5.7.1.2. В лаборатории должны использоваться процедуры для регистрации

соответствующих данных и операций в отношении отбора проб, образующего составную часть проводимого теста, а именно, проводится ли отбор проб сотрудниками лаборатории или клиентом. Регистрируемые данные должны включать используемую процедуру отбора, идентификацию лица, отобравшего пробу, условия окружающей среды (если имеют значение) и, при необходимости, диаграммы или другие способы определения места отбора проб (например, в случае образцов тканей) и, если целесообразно, статистика, на которой основаны процедуры отбора проб.

5.7.1.3. В том случае, когда за отбор проб отвечает лаборатория, у нее должен быть

статистически определенный и документально оформленный план отбора образцов для отбора проб от исследуемого поголовья или для исследований. План должен находиться в том месте, где проводится отбор проб.

ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как лаборатория может предоставить соответствующие научные и/или статистические данные для разработки планов отбора образцов для проведения тестов в отношении поголовья животных, разработка таких планов не включена в настоящий Стандарт. 5.8. Обращение с пробами 5.8.1. В лаборатории должны применяться процедуры, которые обеспечивают целостность

проб. Они должны включать транспортировку, получение, манипуляции, защиту, удержание и/или уничтожение проб.

5.8.2. В лаборатории должна использоваться система идентификации проб, которая

обеспечит отсутствие путаницы между пробами и полученными образцами. Идентификация должна сохраняться в течение всего существования в лаборатории пробы и полученных из нее образцов, и на нее должно быть указание в отчете о тестировании (5.10.).

5.8.3. После получения пробы следует зарегистрировать все нарушения или отклонения от

нормальных или указанных условий, описанных в отношении надлежащего метода тестирования. При наличии отклонений от технических характеристик образцы не должны считаться пригодными для проведения тестирования.

5.8.4. При наличии каких-либо сомнений относительно пригодности пробы для целей

тестирования или в случае несоответствия пробы предоставленному описанию, или в том случае, если требуемый метод тестирования недостаточно детально указан, перед продолжением действий лаборатория должна проконсультироваться с

26

клиентом в отношении дальнейших инструкций и зарегистрировать факты и результаты обсуждения.

5.9. Обеспечение качества результатов тестирования 5.9.1. В лаборатории должны использоваться процедуры мониторинга достоверности

результатов теста. Настоящий мониторинг планируется, пересматривается и может включать, но не ограничиваться следующим:

a) схемы внутреннего контроля качества с использованием методов статистики

(например, карты контроля); b) где применимо, использование международных стандартных реагентов для

подготовки национальных и/или рабочих стандартов для внутреннего контроля качества;

c) при необходимости, повтор теста с использованием того же или другого метода;

d) соотнесение результатов, полученных в отношении различных характеристик

пробы или образца;

e) повторное тестирование удержанных проб или образцов;

f) участие в межлабораторных программах сравнительных или квалификационных испытаний.

ПРИМЕЧАНИЕ: На достоверность результатов тестирования влияют как техническая компетентность, так и аналитические характеристики теста. Если достоверность результатов тестирования сомнительна, важно иметь возможность провести различие между этими двумя факторами. В ходе теста могут быть продемонстрированы соответствующий контроль процесса, но плохие диагностические показатели, и наоборот. 5.10. Отчет о результатах тестирования 5.10.1. Результаты каждого теста, проведенного лабораторией, должны сообщаться точно,

четко, однозначно и объективно, а также в соответствии с любыми специальными инструкциями метода тестирования или контракта.

5.10.2. За исключением случаев наличия веских доводов против, каждый отчет о

тестировании должен включать, по крайней мере, следующую информацию:

a) название (например, «Отчет о проведении тестирования») b) название и адрес лаборатории и, если отличается, места, где проводилось

тестирование;

c) уникальную идентификацию (см. 5.8.2.) в начале и на каждой странице отчета о проведении тестирования для того, чтобы гарантировать, что страница является

27

частью отчета о проведении тестирования, а также четкое указание на окончание отчета;

d) название и адрес клиента, разместившего заказ;

e) описание и однозначную идентификацию тестируемой пробы;

f) уникальную идентификацию используемого метода(-в) тестирования, включая

номер версии;

g) данные полученных проб и даты проведения теста в тех случаях, когда это имеет значение для достоверности и применения результатов;

h) результаты тестов;

i) указание процедур отбора проб, используемых лабораторией или клиентом в тех

случаях, когда это имеет значение для достоверности и применения результатов;

j) при необходимости, заключения и диагностические интерпретации результатов тестирования;

k) имя (имена), должность (-и) и подпись (-и) или равнозначные указания на лицо

(лиц), уполномоченных для составления отчета о проведении тестирования; 5.10.3. При необходимости, отчет о проведении тестирования должен также включать:

a) дату отбора проб; b) однозначное указание на источник пробы;

c) место проведения отбора, включая любые диаграммы, наброски или фотографии;

d) указание на используемый план отбора проб (см. 5.7.1.3.);

e) детальное описание всех условий окружающей среды во время отбора проб,

которые могут оказать влияние на интерпретацию результатов тестирования;

f) идентификацию процедуры или технологии отбора. 5.10.4. Если в отчет о проведении тестирования включены заключения и диагностические

интерпретации, лаборатория должна документально подтвердить основания, на которых базируются данные заключения и интерпретации.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если при формулировании заключения или вынесении диагностической интерпретации принимаются во внимание результаты совокупности тестов, может быть необходимо предоставить клиенту описание обоснований последовательности тестов и процесса принятия решений (например, предварительное в противоположность окончательному или скрининг в противоположность подтверждающему тестированию).

28

5.10.5. Если в отчете о проведении тестирования содержатся результаты тестов,

проведенных подрядными организациями, данные результаты должны быть четко идентифицированы.

5.10.6. В случае передачи результатов и/или интерпретации тестов по телетайпу, факсу

или при использовании других электронных или электромагнитных средств, необходимо выполнять требования настоящего Стандарта.

5.10.7. Формат отчета должен быть разработан таким способом, чтобы помещать данные

любого типа проведенных тестов и сводить к минимуму возможность недоразумений или неправильного использования.

5.10.8. Если тесты проводятся в совокупности, а результаты сообщаются по мере

получения, клиенту следует отправлять промежуточные отчеты о проведении тестирования. В этих отчетах должны быть указаны проведенные тесты, а также тесты, в отношении которых результаты ожидаются. Данные отчеты должны быть уникально идентифицированы как промежуточные отчеты, в них должно быть указание на каждый и все предыдущие промежуточные отчеты, а также они должны соответствовать требованиям настоящего Стандарта.

По окончании всех тестов необходимо оформить окончательный отчет, который

должен быть уникально идентифицирован, и в котором должно быть указание на каждый и все предварительные отчеты, которые он замещает.

5.10.9. В случае необходимости внесения в уже выданный отчет о проведении

тестирования существенной поправки, необходимо отправить клиенту приложение к отчету о проведении тестирования. Данные поправки должны быть уникально идентифицированы в качестве приложения, они должны содержать указание на первоначальный тест о результатах тестирования, а также должны соответствовать требованиям настоящего Стандарта.

5.10.10. Если необходимо выдать новый отчет о проведении тестирования, он должен

быть уникально идентифицирован и должен содержать указание на оригинал, который он замещает.

6. ССЫЛКИ

29

30

Руководство МЭБ 1: Валидация диагностических тестов для выявления

инфекционных болезней 1. Введение 1.1. Цель Настоящий документ представляет собой руководство по валидации методов тестирования (анализа) для выявления инфекционных болезней и является приложением к Главе 1.1.3 «Принципы валидации диагностических анализов для инфекционных болезней» Руководства МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных, 2008 и к работе Jacobson R.H. (1998) «Валидация серологических анализов для диагностики инфекционных болезней», Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz., 17 (2), 469-486. 1.2. Сфера применения Данные руководства предназначены для использования странами-членами МЭБ для определения и верификации общих технических характеристик анализов, а также для «валидации» анализов, разработанных для собственного применения согласно указаниям «Стандарта МЭБ по управлению и техническим требованиям к лабораториям, проводящим тесты на выявление инфекционных болезней животных». 2. Определение валидированного анализа Валидированный анализ последовательно представляет результаты тестов, которые позволяют выявить животных, являющихся положительными или отрицательными в отношении определенного аналита или процесса (например, наличие антител или антигенов, или уплотнения в месте кожной пробы) или реакции (например, наличие уплотнения в месте кожной пробы) и, как вывод, точно предсказывает статус инфекции животного с предварительно определенной степенью статистической погрешности. Что касается разработчика анализа, его задача заключается в разработке и верификации аналитических характеристик метода тестирования на определенном уровне статистической достоверности. 3. Необходимые предварительные требования для валидации анализа 3.1. Выбор анализа, подходящего для намеченной цели Диагностические анализы должны разрабатываться только после проведения технико-экономического обоснования. В первую очередь, новые анализы должны обеспечивать возможность для выполнения намеченных целей. Данные цели имеют широкое определение:

i) Демонстрация свободы от инфекции в определенном поголовье (страна/зона/компартмент/стадо) (вероятно, превалентность равна нулю).

a) «Свободна» с использованием и/или без использования вакцинации, b) Историческая свобода,

c) Восстановление свободы после вспышек;

31

ii) Сертификация свободы от инфекции или возбудителя для отдельных животных или продуктов, предназначенных для торговли/ перемещения;

iii) Искоренение инфекции в определенных поголовьях; iv) Подтверждающая диагностика случаев подозрений или клинических случаев

(включая подтверждение положительных результатов скрининг-тестов); v) Оценка превалентности инфекции или воздействия с целью облегчения анализа

риска (обзоры, статус здоровья стада, меры для контроля болезней); vi) Определение иммунного статуса отдельных животных или поголовий (после

вакцинации). 3.2. Соображения относительно достижения технических характеристик анализа,

подходящих для намеченной цели Тип анализа следует выбирать для оценки только в том случае, если предполагается, что он имеет достаточную аналитическую чувствительность (см. определение ниже) в отношении типа и концентрации аналита или уровня подлежащей определению реакции, а аналитическая специфичность в отношении рассматриваемого организма должна соответствовать предполагаемому назначению анализа. Минимальные приемлемые требования к диагностической чувствительности и специфичности необходимо установить предварительно в зависимости от предполагаемого назначения анализа. В отношении предполагаемых целевых видов следует учитывать факторы хозяина. Данные факторы должны включать воздействие возраста, пола, породы, состояние упитанности, беременность и иммунологическую реактивность. Соответствующими должны быть: проект протокола, учитывающий интеграцию в стандартную диагностику, а также требования к реагентам и образцам, контролю качества, воспроизводимости и выражению данных. Не должны являться сдерживающими факторами стоимость и наличие специализированного лабораторного оборудования и услуг, химикатов и лабораторной посуды, включая пластиковую посуду, а также биологических реагентов, включая моноклональные антитела и рекомбинантные антигены. 3.3. Возможность проведения выбранного типа анализа После выбора типа анализа, реагентов и предварительного протокола следует провести анализ возможности проведения с целью определения предварительных физических параметров и рабочих концентраций химических и биологических реагентов. Данные предварительные протоколы зачастую указывают, стоит ли проводить дальнейшую оптимизацию анализа для получения аналитических характеристик, соответствующих намеченной цели. 4. Валидация анализа – Часть 1

32

4.1. Стандартизация параметров протокола и оптимальных концентраций реагентов. Затем проводятся дополнительные опыты для установления оптимальных концентраций химических и биологических препаратов (например, антигенов, антител, контролей, ферментных/субстратных систем и т.д.). Определение диапазона линейной производительности анализа – обязательно. Необходимые физические параметры (например, время реакции и температура инкубации), также как и условия хранения и подготовки всех реагентов определяются и описываются, или указываются в протоколе. Процедуры титрации реагентов и их калибровки относительно эталонных стандартов (если применимо) должны быть включены в руководство по типовым стандартным операционным процедурам в рамках программы обеспечения качества. 4.2. Оценки воспроизводимости Предварительные оценки воспроизводимости устанавливаются посредством оценки степени совпадения повторов, как в рамках одного цикла, так и между циклами анализа. Они должны быть сопоставимы с естественной вариабельностью определенного типа анализа. Чрезмерную вариабельность следует изучить и откорректировать до того, как работа будет продолжена. 4.3. Аналитическая чувствительность и специфичность Аналитическая чувствительность представляет собой наименьшее количество аналита или минимальную выявляемую реакцию. Для определения аналитической чувствительности в абсолютном выражении необходимо использовать очищенные аналиты. В комплексе биологических систем, таких как взаимодействие антиген-антитело, это зачастую невозможно. Косвенные показатели аналитической чувствительности могут быть получены, например, посредством титрации в конечном разведении эталонного стандарта. Аналитическая специфичность может быть определена посредством тестирования панелей образцов, полученных от животных, которые перенесли заражение родственными организмами. Чем ниже уровень перекрестной реакции, тем выше уровень аналитической специфичности. В зависимости от намеченного применения анализа, соответствующий уровень аналитической специфичности может быть специфическим для вида, группы или подгруппы. 5. Валидация анализа – Часть 2 5.1. Определение технических характеристик анализа 5.1.1. Оценки диагностической чувствительности и специфичности Предварительные оценки диагностической чувствительности и специфичности

являются базисом для вычисления других параметров, на основании которых делаются выводы о результатах теста. Следовательно, данные предварительные оценки обязательно должны быть как можно более точными.

В идеале эти предварительные оценки не должны быть получены в результате

тестирования ряда образцов от эталонных животных с известной историей и статусом инфекции. Однако зачастую сложно собрать наборы образцов от известных инфицированных животных. Подтверждение инфекции требует

33

изоляции организма или наличия патогномоничных гистопатологических критериев. В некоторых случаях может быть необходимо иммунизировать или экспериментально инфицировать группу животных и отбирать серийные образцы в ходе развития иммунного ответа или инфекции. Также может быть сложно получить наборы образцов от неизвестных инфицированных животных. Это особенно относится к районам, где болезнь эндемична. В некоторых случаях может быть необходимо протестировать инфицированные группы животных в значительном отдалении от целевого поголовья.

Диагностическая чувствительность (Se) – это количественное соотношение

известных инфицированных животных, результаты тестирования которых положительные. Считается, что инфицированные животные, результаты тестирования которых отрицательные, проявляют ложно отрицательные результаты.

Диагностическая специфичность (Sp) – это количественное соотношение

неинфицированных животных, результаты тестирования которых отрицательные. Считается, что неинфицированные животные, результаты тестирования которых положительные, проявляют ложноположительные результаты.

Количество эталонных образцов, необходимое для определения предварительной

оценки Se и SP можно рассчитать. Для этого следует использовать обоснованное предопределение как для Se, так и для Sp. Должна быть выбрана допустимая погрешность предварительной оценки Se и SP. И наконец, в данном уравнении следует учесть желаемую степень достоверности (обычно 95%).

Однако ни одна формула не может учесть многочисленные факторы

хозяин/организм, которые могут оказать воздействие на результат теста. Общее практическое правило – проводить тестирование не менее 300 инфицированных животных и не менее 1000 неинфицированных животных для определения Se и SP, соответственно.

5.1.2. Выбор точки разделения положительного/отрицательного Для расчета предварительной оценки чувствительности и специфичности

результаты теста следует классифицировать как положительные или отрицательные. Независимо от типа анализа (например, качественный полуколичественный или количественный) критерии точки разделения положительного/отрицательного должны быть определены однозначно.

Для определения точек разделения используются многочисленные методы. Не

один метод не является надежным, и во многих случаях для дальнейшего исследования и подтверждения может быть необходимо выбрать более одной точки разделения.

5.1.3. Расчет диагностической чувствительности и специфичности При условии того, что соответствующие наборы образцов от эталонных

инфицированных и неинфицированных животных собраны, протестированы, и выбрана точка разделения, можно рассчитать диагностическую чувствительность и специфичность.

34

Статус инфекции

Результат теста Инфицированное Неинфицированное Положительный ИП ЛП Отрицательный ЛО ИО

Диагностическая чувствительность = ИП / (ИП + ЛО) Диагностическая специфичность = ИО (ИО + ЛП)

Где ИП обозначает истинно положительные, ИО – истинно отрицательные, ЛП – ложноположительные, а ЛО – ложноотрицательные результаты в соответствии с результатами теста в сравнении со статусом инфекции.

Сравнение предварительных оценок диагностической чувствительности и специфичности одного анализа с другим должно проводиться только после тестирования тех же инфицированных и неинфицированных эталонных образцов. В противном случае, сравнение недействительно.

5.1.4. Прочие стандарты сравнения

Зачастую новые анализы сравнивают с существующими стандартными анализами. Часто это стандарт, который признан имеющим самую высокую диагностическую чувствительность и/или специфичность среди тестов, используемых в настоящее время. Новый анализ можно сравнить с существующим стандартом в контексте «относительной» чувствительности и специфичности. Однако делается критическое предположение, что результаты стандартного анализа являются точным отражением истинного статуса инфекции животного.

Результат стандартного анализа Результат теста Положительный Отрицательный Положительный ИП ЛП Отрицательный ЛО ИО Диагностическая чувствительность = ИП / (ИП + ЛО) Диагностическая специфичность = ИО (ИО + ЛП)

Где ИП обозначает истинно положительные, ИО – истинно отрицательные, ЛП – ложноположительные, а ЛО – ложноотрицательные результаты в соответствии с результатами теста в сравнении со стандартным анализом. Проблема с данным типом сравнения заключается в том, что сложно объяснить разногласия без проведения широкомасштабного повторного обследования этих животных для определения их истинного статуса инфекции. Другим способом рассмотрения этих данных является расчет общего совпадения по формуле (ИП + ИО) / (ИП + ЛО + ИО + ЛП), но вновь очень сложно объяснить любое несоответствие. Для снижения систематической ошибки выборки, введенной внутренними коэффициентами ЛП и ЛО стандартного анализа в вышеуказанном сравнении, будет целесообразнее использовать комплект тестов для определения реакционной способности эталонных образцов.

35

5.1.5. Предварительные оценки DSe и DSp на животных с неопределенным статусом инфекции. DSe и DSp могут быть предварительно определены, когда статус инфекции и аналита животных не определен; однако эти статистические модели латентного класса сложны. Консультацию экспертов следует получить не только при разработке качественных исследований, но также и при интерпретации предварительных оценок DSe и DSp. МЭБ рекомендовано сформировать группу экспертов для рассмотрения применения моделей латентного класса и для разработки руководств для моделей по их применению для проводимых МЭБ валидации и сертификации анализов. 6. Валидация анализов – Часть 3 6.1. Оценки воспроизводимости и повышенной сходимости Прецизионность – это мера измерения разброса результатов для повторно

тестируемого образца. Точность, с другой стороны, - это мера степени согласования между значением теста и предполагаемым значением в отношении эталонного стандарта с известным титром или концентрацией.

Сходимость должна определяться в рамках данной лаборатории. Степень

вариабельности должна определяться для репликатов контролей как в рамках каждого цикла, так и между циклами анализа. Верхние и нижние пределы контроля устанавливаются для каждого положительного и отрицательного контроля в качестве меры измерения прецизионности анализа. Эти пределы будут показывать, не выходит ли определенный цикл за установленные пределы и не нужно ли его забраковать.

Если один из положительных контролей также отражает рабочий стандарт, тогда

каждый цикл анализа становится мерой измерения точности. Воспроизводимость определяется, когда набор образцов с определенной

реактивностью тестируется несколькими лабораториями с использованием идентичных протоколов анализа и реагентов. Масштаб, в котором общие результаты для каждого образца отклоняются от предполагаемого значения, является индикатором воспроизводимости анализа и определяет размеры прецизионности и точности между лабораториями.

В некоторых случаях может быть нецелесообразно предварительно определять

ожидаемый результат, а лучше статистически установить верхний и нижний пределы допустимой активности на основании согласованности результатов лабораторий-участниц. Это особенно важно при разработке международных стандартов.

7. Валидация анализа – Часть 4 7.1. Применение программы Окончательное доказательство полезности анализа - это его успешное применение

(- я). Это включает международные, региональные и национальные программы. По мере разработки и вступления в строй новых и усовершенствованных анализов они окончательно заменят существующие анализы в том случае, если будет доказано

36

лучшее их соответствие назначению. Однако это произойдет только в том случае, если они действительно будут использоваться в рутинной работе, а их пригодность будет со временем документально обоснована. При прогрессивном развитии диагностических и/или технологических усовершенствований некоторые новые анализы станут новым стандартом для сравнения. Как таковые они могут постепенно достичь национального, регионального и международного признания. В качестве признанного стандарта эти анализы также будут использоваться для разработки эталонных реагентов для контроля качества, в целях повышения квалификации и гармонизации. Эти эталонные реагенты могут также стать международными стандартами. Последний уровень валидации в Реестре МЭБ охватывает документацию, относящуюся к фактическому применению и уровням официального признания рассматриваемого анализа. Это предназначено для того, чтобы предоставить потенциальным пользователям полноценный и объективный источник информации.

7.2. Достоверность результатов анализа: прогностическое значение Прогностическое значение положительного теста (PV+) – это соотношение

положительных результатов анализа, которые правильно отражают инфицированных животных.

Прогностическое значение отрицательного теста (PN-) – это соотношение

положительных результатов анализа, которые правильно отражают неинфицированных животных.

Прогностические значения анализа зависят как от предварительной оценки

диагностической чувствительности и специфичности, так и от превалентности болезни в целевом поголовье.

Превалентность болезни в целевом поголовье оказывает критическое влияние на

PV, если предварительные оценки диагностической чувствительности и специфичности остаются постоянными. Диагностические результаты нельзя интерпретировать буквально без знания превалентности болезни. Следовательно, достоверность результатов анализа не просто функция его аналитических характеристик.

7.3. Сохранение и усиление критериев валидации Валидированный анализ требует постоянного мониторинга и технического

обслуживания с тем, чтобы гарантировать надежность. Необходимо постоянно проводить мониторинг данных внутреннего контроля качества в форме измерения прецизионности и точности в рамках лаборатории.

Набор образцов, представляющий полный диапазон реакционных способностей,

прогнозируемых в целевом поголовье, следует использовать для оценки новых партий реагентов с целью обеспечения универсального качества продукции.

Изменения производственных протоколов или параметров анализа потребует

проведения оценки для определения того, есть ли какие-либо изменения технических характеристик анализа. В случае незначительных изменений, которые улучшают воспроизводимость и схожесть, не оказывая влияния на аналитическую

37

производительность анализа, полная повторная оценка диагностической чувствительности и воспроизводимости может не потребоваться.

Любое значительное изменение анализа, такое как введение совершенно нового

производственного протокола или реагента, потребует полной оценки технических характеристик анализа и сравнения с первоначальным протоколом. Это необязательно потребует сравнений с другими анализами, если радикально не изменились чувствительность и специфичность анализа.

Поскольку данные получают при тестировании полевых образцов,

предварительные оценки диагностической чувствительности и специфичности следует уточнить. Чем больше количество образцов, используемых для получения этих цифр, тем больше уверенность в предварительных оценках.

Отклонения в превалентности болезни, сезонные тенденции, появление

родственных организмов или изменений в стратегии вакцинации могут потребовать повторной оценки диагностических аналитических характеристик в отношении соответствия анализа его назначению.

38

Руководство МЭБ 2: Валидация и контроль качества методов на основе полимеразной цепной реакции, используемых для диагностики инфекционных

заболеваний

1. Предпосылки 1.1. Цель Этот документ предоставляет руководства по валидации методов (анализов) на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), используемых при диагностике инфекционных заболеваний, и является приложением к Главе 1.1.4 Валидация и контроль качества методов на основе полимеразной цепной реакции, используемых при диагностике инфекционных заболеваний, Руководства по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных, 2008 года. 1.2. Область применения Эти руководства предназначены для использования странами членами МЭБ при определении и проверке характеристик эффективности анализов на основе ПЦР в общем, а также при «валидации» анализов, разработанных в собственных лабораториях, упоминаемых в Стандарте МЭБ по управлению и техническим требованиям для лабораторий, проводящих анализы для выявления инфекционных заболеваний животных. 1.3. Анализ, прошедший валидацию При проведении диагностических анализов клинического материала, важно получить данные надлежащего качества. Для этого необходимо выполнить некоторые основные условия. Необходимо установление систем обеспечения качества и контроля качества; т.е. набор протоколов по обеспечению качества, включая использование контрольных образцов, которые способствуют надлежащей работе системы и подтверждают воспроизводимость и качество данных. Системы обеспечения и контроля качества, подкрепляемые обученным и компетентным персоналом, были установлены во всем мире. Валидация анализа – это другой важный фактор по обеспечению того, чтобы результаты тестирования отражали достоверный статус образцов. Для прогнозирования диагностической эффективности диагностического анализа необходимо использовать методологию валидации для документальной регистрации ожидаемой аналитических характеристик рассматриваемого анализа. Валидация – это оценка диагностического анализа в целях определения того, подходит ли тот или иной анализ для определенных целей. 1.4. Предполагаемая пригодность для определенных целей Сфера пригодности анализов на основе ПЦР для различных целей довольно широкая. Если не существует необходимости прямого выявления инфекционного агента, то в большинстве случаев возможно применение ПЦР. В течение первых лет разработки ПЦР диагностики многие лаборатории испытывали проблемы с контаминацией и проведением анализа, и, таким образом, ПЦР имела плохую репутацию как методика, подходящая для диагностического применения. Результаты, достигнутые за последние годы, полностью перевернули эту точку зрения. Новая технология (т.е. ПЦР в реальном времени) сделала методику более безопасной и легкой для применения. Автоматизированное экстрагирование и процедуры пипетирования с использованием роботов значительно снизили затраты и сократили объем требуемой работы. В течение первых лет было

39

разработано много собственных анализов, а гармонизация и валидация находились на низком уровне или не существовали вовсе. На сегодняшний день МЭБ и Справочные лаборатории Сообщества играют важную роль в продвижении работ по валидации и гармонизации. Можно честно сказать, что ПЦР, проводимая на данный момент, является безопасной, валидированной и пригодной методикой, предназначенной для диагностических целей. 2. Валидация анализа – Введение 2.1. Принципы первоначальной разработки анализа 2.1.1. Предосторожности и меры контроля

Учитывая неуверенность в безопасности и надежности ПЦР при рутинной диагностике, необходимо применять специальные меры предосторожности в любой лаборатории, применяющей ПЦР для выявления инфекционных агентов во избежание ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Меры предосторожности, наряду с внутренними мерами контроля (напр. мимики), способствуют безопасной оценке результатов.

2.1.2. Предосторожности, применяемые во избежание ложноположительных результатов

Ложноположительные результаты (отрицательные образцы, демонстрирующие положительную реакцию) могут возникнуть либо по причинам, связанным с лабораторией, таким как перекрестная контаминация либо вследствие факторов, связанных с анализом, таких как недостаточная оптимизация или эффективность анализа. Перенос продукта из положительных образцов или, что происходит более часто, от перекрестной контаминации продуктами ПЦР из предшествующих экспериментов является наиболее частой причиной ошибки. Для профилактики ложноположительных результатов ПЦР применялись различные методы и средства. Участки для проведений различных этапов в цепочке анализа должны быть тщательно спланированы и изолированы (Рисунок 1). И положительные, и отрицательные контрольные образцы должны быть рутинно распределены в диагностических образцах для оценки эффективности анализа ПЦР.

Рисунок 1. Типичная схема для диагностики ПЦР в реальном времени

40

3. Валидация анализа – Часть1 3.1. Оптимизация и стандартизация реагентов и определение критических контрольных параметров Отбор, подготовка и транспортировка образцов (см. Руководство по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных, глава 1.1.1) и методы экстрагирования нуклеиновой кислоты (см. Руководство по наземным животным, глава 1.1.8) являются критическими параметрами для эффективности теста, которые необходимо оптимизировать для диагностирования болезни. Подходящие методы варьируются в зависимости от типа образца и организма. В большинстве случаев сыворотка крови, ткани органов и мазки являются подходящими образцами для облегченного экстрагирования нуклеиновых кислот, в то время как с образцами кала и спермы обращаться труднее. Экстрагирование РНК-мишеней отличается от экстрагирования ДНК-мишеней, т.к. РНК более подвержена деградации. И промышленные (роботизированные, центрифужные колонки, экстрагирование, основанное на магнитах и т.д.), и стандартные химические методы используются для экстрагирования ДНК или РНК. Крайне важно определить наиболее воспроизводимый и эффективный метод экстрагирования до дальнейшей валидации проводимого теста. Если метод экстрагирования меняется, необходимо разработать эквивалентные данные и повторить всю процедуру валидации. Все оборудование, используемое в процессе, должно эксплуатироваться надлежащим образом. Аппараты (блоки нагревания, холодильники, морозильники, термоциклеры, пипетки и т.д.), которым необходима калибровка, должны быть откалиброваны в соответствии с лабораторными протоколами по обеспечению качества. Также важно получить разрешение на применение оборудования и используемых протоколов. Хорошим примером является недавнее внедрение роботизированных методов экстрагирования в лабораториях, осуществляющих рутинную диагностику. Недостаточно сравнивать характеристики этого метода с методом экстрагирования, используемого ранее. Также необходимо получить разрешение на использование робота и протокол перекрестной контаминации, напр. посредством проведения анализа набора смешанных положительных и отрицательных образцов. При разработке «классических» ПЦР анализов или ПЦР в реальном времени, все параметры, протоколы и реагенты необходимо оптимизировать. Стандартизированный анализ – это метод, который неизменно дает один и тот же результат для данного образца, при многократном повторении и проведении другими исследователями в других лабораториях. При оптимизации ПЦР анализа также возможно оценить способность метода оставаться невосприимчивым к небольшим изменениям в основных параметрах. Документальная регистрация преднамеренных отклонений во время проведения анализа необходима для получения характеристик критических параметров анализа. Примеры таких параметров включают: время и температуру инкубирования, концентрации буферных растворов, праймеры, MgCl2, и т.д., рН, количество других добавляемых компонентов (напр. дНТФ, сывороточный альбумин КРС и т.д.). Характеристика критических контрольных параметров крайне важна для идентификации критических контрольных точек, которые необходимо тщательно контролировать в течение анализа.

41

3.2. Сходимость На этом этапе необходимо оценить сходство между репликатами во время и между циклами анализа. Это дает важную информацию об анализе до проведения дальнейшей валидации. Если обнаруживается чрезмерная вариабельность, ее необходимо откорректировать до продолжения процесса валидации. 3.3. Определение аналитической специфичности и чувствительности Аналитическая специфичность определяется, как способность анализа отличать агента-мишень от других инфекционных агентов. Эта способность определяется анализом генетически родственных патогенов и клинического материала, полученных от животных с заболеваниями, которые могут имитировать ту болезнь, в отношении которой осуществляется анализ. Приемлемая перекрестная реактивность в большей степени зависит от предназначенной цели анализа, и ее необходимо обсуждать время от времени. Аналитическая чувствительность (или предел выявления) определяется как наименьшее количество агента, выявляемого анализом, и может быть представлено как число копий генома, инфекционной дозы, колониеобразующих единиц, бляшкообразующих единиц, и т.д. агента, которые могут быть выявлены и распознаны из нулевого результата. Для определения аналитической чувствительности, используется конечное разведение до того момента, пока не будет возможным выявить посредством анализа мишень в более чем 5% репликатов (2 стандартных отклонения). Оценки аналитической чувствительности могут значительно варьироваться для одного и того же анализа в различных материалах-образцах.

4. Валидация анализа – Часть 2 4.1. Определение рабочих характеристик анализа

Эталонные популяции животных i) Отрицательные эталонные животные

Подлинно отрицательные животные, т.е. образцы, которые являются на 100% отрицательными, иногда довольно трудно получить. Часто отбор образцов возможен в странах, в которых рассматриваемая болезнь была ликвидирована.

ii) Положительные эталонные животные В большинстве случаев довольно проблематично найти достаточное количество положительных эталонных животных. Необходимы естественно инфицированные или экспериментально инфицированные животные, а их положительный статус наилучшим образом демонстрируется посредством выделения вируса.

iii) Статус эталонного животного, определяемый другими анализами Обычно используется термин «золотой стандарт» для описания любого стандарта для сопоставления, который должен быть приурочен к методам,

42

которые однозначно классифицируют животных как инфицированные или неинфицированные. В целом, ожидается, что новые ПЦР анализы превзойдут любые уже существующие методы «золотого стандарта», и, таким образом, будет довольно трудно использовать «золотой стандарт» в качестве образца для сопоставления, по меньшей мере, для демонстрации того, что отрицательное эталонное животное является действительно отрицательным.

4.2. Определение порога Диагностическая чувствительность (пропорция инфицированных эталонных животных, которые показали положительный результат в анализе) и специфичность (пропорция неинфицированных эталонных животных, которые показали отрицательный результат при исследовании) являются наиболее важными параметрами, получаемыми во время валидации анализа. Они формируют основу для подсчета других параметров, и соответственно являются критическими для всего процесса валидации. Количество эталонных образцов, необходимых для определения величин и допустимой погрешности и чувствительности и специфичности, может быть подсчитано. Для этого необходимо использовать обоснованный прогноз диагностической чувствительности и диагностической специфичности. В общем, достоверность величины установлена на уровень 95 %. Однако невозможно вывести формулу для многочисленных факторов хозяина/организма, которые могут повлиять на результат тестирования. Использование образцов с пиковой концентрацией в ПЦР не целесообразно, так как они не могут быть репрезентативными для естественно инфицированных образцов и, таким образом, весь процесс валидации может быть потенциально поставлен под угрозу. 5. Валидация анализа – Часть 3 5.1. Установление воспроизводимости анализа Воспроизводимость является важным параметром для точности теста. Воспроизводимость определяется в нескольких лабораториях с использованием идентичного анализа (протокол, реагенты и контроли). 6. Валидация анализа – Часть 4 6.1. Внедрение программы Справочные лаборатории играют важную роль во внедрении новых или уже существующих молекулярных анализов. И справочным лабораториям МЭБ, и справочным лабораториям Сообщества настоятельно рекомендуется проводить внедрение новых перспективных анализов болезней, представляющих для них интерес, как это было, например, при внедрении молекулярной диагностики гриппа птиц в Европе. 6.2. Валидность мониторинга проведения анализа 6.2.1. Интерпретация результатов теста – факторы, влияющие на валидность анализа

Оценка превалентности инфекционного агента в популяции необходима для подсчета прогностической величины положительных (PV+) или отрицательных (PV-) результатов теста. Это равным образом применяется и к молекулярным методам анализов, и к другим методам, таким как иммуноферментный твердофазный анализ.

43

Справочные лаборатории должны определять величины диагностической чувствительности и диагностической специфичности как можно более точно, так как это чрезвычайно важно для оценки действительных характеристик анализа при применении в полевых условиях. Также важно оценить прогностические величины (PV+ или РV-) на месте.

6.2.2. Поддержание критериев валидации

Когда анализ используется в качестве рутинного теста, важно проводить внутренний контроль качества. Необходимо постоянно контролировать анализ на воспроизводимость и точность. МЭБ рекомендует, по меньшей мере, 2 раза в год оценивать воспроизводимость среди лабораторий (тест на проверку квалификации), проводимую справочной лаборатории, которая распределяет наборы образцов, получает результаты из лабораторий, анализирует данные и посылает отчеты по результатам обратно в лаборатории. Если анализ необходимо провести в другом географическом регионе и/или популяции, то его необходимо повторно валидировать или документально зарегистрировать его эквивалентность в новых условиях. Повторная валидация также может быть необходима, если тест применяется по другой матрице проб, напр. валидированный для использования на образцах крови, а используемый на образцах другой ткани, или валидированный для использования на образцах такни КРС, а используемый для других видов. Это особенно касается анализов на основе ПЦР, так как в геномах многих инфекционных агентов часто происходят точечные мутации (напр. РНК вирусы). Мутации, которые могут происходить внутри сайтов праймера или зондов могут негативно повлиять на эффективность проведения анализа и, таким образом, установленные критерии проведения не будут больше действительными. Также рекомендуется регулярно подтверждать целевую последовательность в выбранных регионах генома для национальных или региональных изолятов инфекционных агентов. Это особенно касается сайтов праймеров с целью обеспечения того, что они остаются стабильными, и валидация анализа не подвергалась сомнению.

____________

44

Руководство МЭБ 3: Международные эталонные стандарты по антителам для анализов с использованием антител

1. Введение 1.1. Цель Этот документ представляет собой руководства по подготовке, валидации и распространению антител, используемых в качестве Международных эталонных стандартов для анализов с применением антител для выявления инфекционных заболеваний у животных. В этих руководствах термин «Стандарты» относится к антителам, если они не обозначаются иначе. Такие стандартные препараты утверждены МЭБ как первичные эталонные стандарты для использования вместе с тестами, описанными в Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных МЭБ. 1.2. Дефиниции 1.2.1. Стандартный протокол испытаний

Стандартным протоколом испытаний называется валидированная, принятая на международном уровне процедура тестирования, часто являющаяся «Тестом, установленным МЭБ, для применения при международной торговле», который описывается в Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных МЭБ.

1.2.2. Международный эталонный стандарт

Термин международный эталонный стандарт является синонимичным термину первичный эталонный стандарт. Он представляет стандарт, в соответствии с которым, сравниваются или калибруются все остальные стандарты.

1.2.3. Вторичные и рабочие стандарты

Вторичные стандарты создают посредством прямого сопоставления с международным эталонным стандартом, и поэтому должны как можно больше копировать характеристики первичного стандарта, при использовании в Стандартном протоколе испытаний. Вторичный стандарт обычно создается Национальной справочной лабораторией и утверждается как национальный или местный стандарт. Рабочие стандарты могут быть тождественны вторичным стандартам, или они могут быть третичными стандартами, калиброванными в соответствии со вторичным стандартом. Рабочие стандарты должны иметься в достаточном количестве для применения диагностическими лабораториями с целью стандартизации рутинного ежедневного тестирования.

3. Сфера применения

45

Международные эталонные стандарты необходимы для обеспечения того, что данный анализ с использованием антител способен к измерению активности антител до определенного уровня диагностической чувствительности. Диагностическая чувствительность имеет отношение к риску ложной негативной реакции, возникающей в ходе анализа с использованием антител, когда в действительности животное является или было инфицировано. Международные эталонные стандарты обычно необходимы для использования международными, национальными или другими справочными лабораториями при калибровке стандартных анализов и в качестве эталона для приготовления вторичных стандартов. Вторичные или другие рабочие стандарты, а не международный стандарт, должны использоваться ежедневно для стандартизации тестирования. Для ограниченного числа заболеваний существует международное соглашение по системе «Международных единиц» активности антител. В таких случаях международные эталонные стандарты определяют шкалу таких единиц. Для подавляющего большинства болезней животных таких систем не существует, и системы анализа, рабочие стандарты и тестовые образцы определяются относительно международных эталонных стандартов. 1.4. Подход Для большинства анализов должны быть установлены три первичных эталонных стандарта: сильноположительный, слабоположительный и отрицательный стандарт. Эти стандарты должны быть отобраны и охарактеризованы утвержденной Справочной лабораторией, использующей принятый Стандартный протокол испытаний и утвержденные на международном уровне реагенты. Слабоположительный стандарт является критическим при обеспечении диагностической чувствительности теста. Для неколичественных анализов (напр. реакции иммунодиффузии) слабоположительный эталонный стандарт может быть единственным необходимым положительным стандартом. Для количественных анализов без титрования, такие как непрямой ELISA, сильноположительный стандарт должен определять произвольный уровень 100% положительности. Слабоположительным и отрицательным стандартам необходимо присвоить пропорциональное процентное соотношение положительности, соответствующее их реактивности при тестировании в стандартном протоколе испытаний. 2. Отбор материалов для использования в качестве стандартов

2.1. Типы материала Большинство международных эталонных стандартов приготавливают из сыворотки крови. Она должна быть без гемолиза и избыточной липемии. Антисыворотка должна быть по возможности получена от животных, свободных от патогенных факторов или животных - гнотобиотов, видов, соответствующих стандартизируемому анализу. Другие материалы, например обезжиренное молоко, или моноклональные антитела, могут использоваться, если это соответствует стандартизируемому анализу. 2.2. Безопасность

46

Эталонные стандарты должны быть приготовлены таким образом, чтобы они были свободны от инфекционного материала. С целью обеспечения транспортировки между странами, рекомендуется, чтобы стандарты во влажном состоянии были обработаны либо бинарным этиленимином, либо облучены при 25-30 килогрей (2,5 – 3,0 Мрад) и хранились при -78 °С. Облучение лиофилизированных образцов не рекомендуется, так как рекомендуемой дозы может быть недостаточно для полной инактивации патогена. После обработки образцы должны быть подвергнуты соответствующим тестам на безвредность для гарантии того, что они не имеют выявляемых живых агентов. Сыворотка КРС должна происходить от источника, свободного от ГЭ КРС. 2.3. Положительные эталонные стандарты Положительные эталонные стандарты должны быть отобраны от животных, демонстрирующих типичный гуморальный (т.е. с выработкой антител) иммунный ответ на исследуемый организм. Гипериммунные животные не считаются типичными, и использования таких животных необходимо по возможности избегать. Иммунный ответ может быть вызван экспериментальным инфицированием или иммунизацией вакцинами. Время после иммунизации, предназначенное для отбора материала, должно быть определено реакцией животных в соответствии с параметрами в стандартном протоколе испытаний. Оно может варьироваться в соответствии с природой заболевания и используемым анализом. Необходимо предоставить полную информацию по схеме иммунизации и природе иммуногена, чтобы вторичные стандарты могли быть созданы посредством эквивалентных методов. Стандарты не должны иметь антител к организмам, которые могут перекрестно реагировать при стандартном анализе, или необходимо предоставить информацию по такой перекрестной реакции. Стандарт может быть получен от одного животного или из пула образцов от множества животных. В большой степени, естественно инфицированные животные могут быть использованы в качестве источника для получения стандарта, если осуществима контролируемая иммунизация или инфицирование. 2.4. Отрицательные эталонные стандарты Отрицательные эталонные стандарты должны быть отобраны от животных, которые никогда не подвергались воздействию исследуемого организма или вакцинировались от него. Они не должны иметь антител к организмам, которые могут перекрестно реагировать при стандартном анализе. Отрицательный стандарт может быть получен от одной сыворотки или от пула сывороток. 3. Характеристики международных эталонных стандартов 3.1. Сильноположительный эталонный стандарт Для тестов, таких как реакция связывания комплемента, нейтрализация вируса или непрямой ELISA, которые демонстрируют типичную сигмоидальную дозу/кривую чувствительности, сильноположительный эталонный стандарт должен демонстрировать активность антител, которая находится на линейном участке кривой, ниже фазы плато. В других тестах сильноположительный эталонный стандарт должен содержать достаточное количество антител для неизменного продуцирования максимальной реакции в пределах выбранных границ теста, напр. четкой границы идентичности реакции иммунодиффузии или 100 % ингибирования в конкурентном/ингибрующем ELISA. 3.2. Слабоположительный эталонный стандарт

47

Слабоположительный эталонный стандарт должен демонстрировать активность антител, которая также находится на линейном участке кривой, выше положительного/отрицательного порога. Продуцируемая реакция никогда не должна быть двусмысленной. В других тестах слабоположительный эталонный стандарт должен содержать достаточное количество антител для неизменного продуцирования минимальной выявляемой реакции, напр. слабая, но недвусмысленная линия идентичности в реакции иммунодиффузии. Для конкурентных/ингибирующих анализов, которые часто демонстрируют резкий переход от положительного до отрицательного, выбор слабоположительного стандарта может быть особенно затруднительным. Применяются те же принципы, в которых стандарт должен давать неизменную положительную ответную реакцию, выше положительного/отрицательного порога в Стандартном протоколе испытаний. 3.3. Отрицательный эталонный стандарт Этот стандарт должен всегда давать реакцию ниже положительного/отрицательного порога в Стандартном протоколе испытаний. Продуцируемая реакция никогда не должна быть двусмысленной. 4. Приготовление эталонных стандартов 4.1. Составление стандартов При возможности положительные эталонные стандарты должны быть приготовлены из материалов, демонстрирующих желаемый уровень реактивности без дальнейшего разведения. Однако во многих случаях Справочной лаборатории может потребоваться произвести однократное разведение положительной сыворотки в отрицательной сыворотке с целью достижения желаемого уровня реактивности, как указано в пункте 3 выше. В таких случаях слабоположительный эталонный стандарт может быть получен от того же исходного количества положительной сыворотки, используемого для получения сильноположительного эталонного стандарта. Международный эталонный стандарт не должен требовать какого-либо особого обращения (напр. предварительное разведение) от лаборатории-получателя до использования в рассматриваемом анализе. Стандарт должен быть протестирован также как и любой полевой образец в условиях рутинной диагностики (включая любые этапы разведения, которые являются обычной частью процедуры анализа). Это позволяет избежать ошибки или отклонения, связанного с особым обращением или приготовлением. Поэтому степень активности антител в положительном эталонном стандарте должна находиться в пределах границ точного выявления диагностического теста. 4.2. Стабильность и хранение Все материалы должны храниться в замороженном или охлажденном состоянии вплоть до оценки. Необходимо избегать многократных циклов заморозки – оттаивания. Для обеспечения стабильности рекомендуется, чтобы конечный стандарт, после обработки образца с целью инактивации адвентициальных агентов, был лиофилизирован, и предпочтительно, чтобы вместе с лиофилизированным стандартом предоставлялся стерильный разбавитель для восстановления материала. Для долгосрочного хранения предпочтительны запечатанные стеклянные ампулы, а флаконы с резиновыми колпачками. Лиофилизированные исходные материалы необходимо хранить при 4 °С,

48

хотя короткие периоды хранения при комнатной температуре (напр. во время транспортировки) не должны иметь вредного воздействия. Лиофилизированный процесс может влиять на биологическое качество сыворотки, хранение стандартов в криопробирках при -78 °С является рекомендуемым альтернативным решением. После лиофилизирования несколько флаконов со стандартами необходимо восстановить и подвергнуть повторной оценке. Не должно быть никаких признаков перекрестно-реагирующих антител или других неспецифических факторов, которые могут повлиять на результаты анализов. Если существует возможность перекрестного реагирования с близкородственными агентами, то необходимо указать эту информацию. 4.3. Контроль партий Исходный эталонный материал должен представлять собой единичную биомассу в объеме, достаточном, чтобы его хватило на минимум пять лет. Он может храниться в замороженном состоянии (предпочтительно при -70 °С или ниже), а серия может быть лиофилизирована для поставок в течение минимум 2-х лет (около 500 тестов). Для каждой партии, неважно замороженной или лиофилизированной, необходимо распределить эталонные серии, а также хранить данные по контролю качества для каждой серии. Каждую лиофилизированную партию необходимо повторно калибровать. Каждый флакон или ампула должна содержать 0,5 – 1 мл. 4.4. Этикетирование Этикета должна содержать следующую минимальную информацию: логотип МЭБ, международный эталонный стандарт МЭБ для (заболевание), указать является ли он положительным, слабоположительным или отрицательным, метод восстановления и условия хранения. Места на этикетке может не хватить для всех этих пунктов, поэтому можно использовать аббревиатуры, а некоторые из пунктов можно поместить на спецификацию, а не на этикетку. 4.5. Спецификации Справочные лаборатории МЭБ, выпускающие международную эталонную стандартную сыворотку должны обеспечить, чтобы все аликвоты сопровождались соответствующей спецификацией. Необходимо объяснить лабораториям, делающим запрос, что международные эталонные стандарты предназначены для использования в целях калибровки своих собственных анализов и содействия международной гармонизации. Для того чтобы диагностическая лаборатория приготовила вторичный эталонный стандарт для своего собственного использования, Справочной лаборатории МЭБ будет необходимо предоставить специфичные данные по отбору и/или приготовлению первичных эталонных стандартов. Это особенно касается первичных эталонных стандартов, которые были приготовлены посредством разбавления сильно или гипреиммунно- положительных сывороток отрицательной сывороткой. 4.5.1. Необходимые данные

Спецификация должна повторять всю информацию, указанную на этикетке (см. 4.4.). Следующую информацию также необходимо предоставить для облегчения отбора

49

и/или приготовления вторичных эталонных стандартов, которые как можно ближе, копируют первичный эталонный стандарт. i) Описание животного донора положительной или отрицательной сыворотки,

включая вид, возраст, репродуктивный статус и происхождение (т.е. естественное производство, свобода от патогенных факторов, гнотобиот и т.д.)

ii) Природа гуморального иммунного ответа, т.е. на естественное инфицирование, экспериментальное инфицирование, иммунизацию и т.д.

iii) Подробная информация по организму, используемому для индуцирования иммунного ответа, т.е. источник, штамм, серотип и т.д.

iv) Подробная информация по экспериментальному инфицированию или протоколам иммунизации, т.е. путь, доза, схемы иммунизации, метод и время отбора проб и т.д.

v) Эталонные тесты, используемые для отбора подходящих положительных и отрицательных эталонных сывороток и для характеристики гуморального иммунного ответа, напр. ELISA, реакция иммунодифузии в агаровом геле, реакция нейтрализации вируса и т.д.

vi) Образец профилей титрования гипериммунных сывороток и критерии отбора соответствующих разведений определенной активности.

vii) Наличие гетерологичных антител, если это известно, и используемые для выявления тесты.

viii) Подробная информация по любым испытаниям на безвредность, проводимых на материалах

ix) Положение о том, что стандарт предназначен только для использования in vitro.

x) Описание методов стерилизации, включая тип облучения и дозу, и состояние образца во время стерилизации (т.е. жидкий, замороженный, лиофилизированный и т.д.).

xi) Номер партии и дата производства xii) Рекомендуемое восстановление (тип восстанавливающей жидкости и объем),

обращение и условия хранения. xiii) Полный контактный адрес, факс, электронная почта Справочной лаборатории

для получения дополнительной информации. 5. Утверждение эталонных стандартов МЭБ Международный эталонный стандарт не может быть выпущен под именем МЭБ, если он не был одобрен Комиссией по стандартам МЭБ, действующей по распоряжению Международного комитета МЭБ. Полные технические и статистические данные по оценке подходящих эталонных стандартов наряду с полной информацией на спецификации, как указано выше, должны быть переданы в МЭБ. Комиссия по стандартам МЭБ будет рассматривать эту информацию. Если Комиссия по стандартам утверждает информацию, то она будет добавлена к списку доступных международных эталонных стандартов. Этот список будет выдан по запросу всем странам членам МЭБ, а также доступен на веб-сайте МЭБ (http:\\www.oie.int). 6. Список литературы

50

BAHNEMANN H.G. (1975). Bromine ethyleneimine as an inactivant for foot and mouth disease virus and its application for vaccine production. Arch. Virol., 47, 47-56. WORLD HEALTH ORGANIZATION (2002). Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products. WHO Expert Committee on Biological Standardization. WHO, Geneva, Switzerland. WRIGHT P.F. (1998). International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests or antibody detection. In: Veterinary Laboratories for Infectious Diseases, Pearson J.E., ed. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2), 527-533.

51

Руководство МЭБ 4: Проверка квалификации лабораторий

1. Введение 1.1. Цель Этот документ предоставляет руководства по оценке способности ветеринарных лабораторий проводить диагностические тесты для выявления инфекционных заболеваний. 1.2. Сфера применения Эти руководства предназначены для использования странами членами МЭБ как часть оценки лабораторий, которые проводят тесты по квалификации животных и продуктов животного происхождения, предназначенных для международного передвижения. Эти руководства необходимо использовать вместе с Руководствами МЭБ по оценке качества лабораторий для общей оценки качества и возможностей лабораторий. Это руководство основано на соответствующих требованиях ISO1 серии стандартов 9000, ISO/IEC2 17025 и ISO руководство 43. 1.3. Межлабораторные сравнительные тестирования Межлабораторные сравнительные тестирования могут проводиться по множеству причин, которые охватывают:

i) Определение способности лаборатории проведить специфичные диагностические тестирования,

ii) Проверка или сертификация работы отдельных работников, iii) Проверка или сертификация калибровки приборов, iv) Гармонизация существующих методов тестирования, v) Оценка новых методов тестирования, vi) Назначение величин и переделов для стандартных материалов, vii) Разрешение межлабораторных трудностей.

1.4. Квалификационное тестирование Если межлабораторный сравнительный тест проводится с единственной целью определить способность лаборатории проводить специфичные диагностические тесты, т.е. 1.3.i выше, то это называется квалификационным тестированием. Квалификационное тестирование – это составная часть программ аккредитации лабораторий. Схемы квалификационного тестирования основаны на определенных наборах материалов для тестирования с высокой степенью характеризации, которые иногда называются проверочные наборы образцов. Эти наборы одновременно посылаются лабораториям, участвующим в тестировании. Результаты собираются и анализируются в сопоставлении с предопределенным результатом с целью определить способность участвующей лаборатории проводить диагностические тестирования и давать верные результаты.

1 ISO: Международная организация по стандартизации 2 IEC: Международная электротехническая комиссия

52

1.5. Аккредитация Программа по аккредитации – это формальный процесс по признанию качества и возможностей лаборатории независимым органом власти. В соответствии с требованиями этого органа лаборатории должны принимать участие в программе по аккредитации на постоянной основе с целью поддержания статуса признания. Независимый орган власти присваивает или лишает признания, основываясь на предусмотренных требованиях по качеству и возможностям. В начальной стадии аккредитации лабораториям необходимо продемонстрировать предусмотренный и стабильный уровень качества. В идеале это также должно охватывать соответствие Общим требованиям к компетенции лабораторий проводящих калибрование и тестирования (1990) ISO 9000 и ISO/IEC 17025 для получения права на вступление в программу. Однако допускается, что при многих обстоятельствах довольно трудно достичь такой высокий уровень по множеству причин. Были подготовлены Руководства МЭБ по оценке качества лабораторий с целью установить минимальный допустимый уровень качества. Второй этап аккредитации влечет за собой регулярное плановое квалификационное тестирование для оценки способности лаборатории проводить специфичные диагностические тесты. Так как схемы квалификационного тестирования являются формой межлабораторного сравнения, то они должны охватывать две или более лаборатории. Для квалификационного тестирования в ветеринарной диагностике не существует согласованного стандарта, хотя на международном и национальном уровнях действуют несколько схем. Настоящие руководства были подготовлены для использования в совокупности с Руководствами по оценке качества лабораторий. Также эти руководства формируют приемлемую основу для программы обеспечения качества. 2. Орган власти и признание Орган власти должен применять программы по аккредитации и схемы квалификационного тестирования во избежание любой ошибки при присвоении или лишении признания. Участие в международной программе по аккредитации и схеме квалификационного тестирования должно быть добровольным. Неучастие или неполучение признания не должно мешать лаборатории проводить диагностические тесты, а стране вступать в торговые соглашения. Участие и статус признания должен быть предоставлен независимым органом власти торговым партнерам только по запросу или с согласия участвующей в программе лаборатории или органа власти страны. Такая программа или схема может включать стоимость этих услуги для участвующей лаборатории. 3. Организация и управление Подробная информация относительно схемы квалификационного тестирования и его целей, приемлемость участвующих лабораторий и распределение результатов должны

53

быть документально зарегистрированы координирующей организацией для обеспечения защиты прав собственности и конфиденциальной информации. Менеджер по программе должен нести полную ответственность за работу, качество и безопасность схемы квалификационного тестирования. Также в сферу ответственности менеджера по программе входит обеспечение того, чтобы лаборатории, вовлеченные в производство материалов для тестирования, выполняли соответствующие требования серии стандартов ISO 9000 и ISO/IEC 17025. Работники не должны испытывать давления или побуждений, которые могут незаконно повлиять на анализ результатов квалификационного тестирования или статуса признания участвующей лаборатории. Персонал, участвующий либо в производстве и распределении материалов для тестирования, которые будут использоваться в схеме квалификационного тестирования, либо в приеме и анализе результатов теста, передаваемых участвующими лабораториями, должны обеспечить надлежащий надзор и безопасность.

Для характеристики исследуемых материалов, предназначенных для использования в наборах контрольных образцов стандартный метод должен соответствовать или превышать минимальные рабочие характеристики диагностики, требуемые для признания его пригодным в качестве предписанного теста в Руководстве МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных. Калибровку стандартного теста необходимо проводить по международным стандартным материалам, если они имеются в наличии. Участвующие лаборатории также следует побуждать проводить калибровку своих собственных анализов по тем же самым международным образцам. 5. Подбор и состав набора контрольных образцов 5.1. Основные принципы С целью подбора исследуемых материалов для включения их в набор контрольных образцов первоначальная оценка статуса и/или химической активности образца должна быть проведена лабораторией, где они производятся, с применением стандартного метода. Включение исследуемых материалов в набор должно быть основано на повторных тестах, проводимых более чем одним специалистом путем кратных прогонов теста в различные дни. Для того чтобы гарантировать определенный статус исследуемого материала, включая однородность, необходимо выработать достаточные значения. 5.2. Состав набора для квалификационного тестирования Количество исследуемых образцов, составляющих набор контрольных образцов, четко не определено. Это обусловлено видом анализа, который будет проведен на основе результатов, и количеством образцов, необходимых для обеспечения статистической достоверности. Независимо от вида теста необходимо включить как минимум 3 образца:

54

i) Однозначно сильно положительный, ii) Однозначно слабо положительный, iii) Однозначно отрицательный.

Однако использование только трех таких образцов сделает результаты предсказуемыми после нескольких циклов исследования. Поэтому рекомендуется добавлять, по крайней мере, еще два образца в набор контрольных образцов, который может изменяться от одного квалификационного тестирования до следующего. Это не позволит участвующим лабораториям рассчитывать на ожидаемый исход. Дополнительные образцы могут отличаться от упомянутых выше образцов или их репликатов или комбинации. При планировании всего процесса подготовки, исследования и распределения материалов и предметов исследования поставщик должен при необходимости предоставить процедуры и ресурсы для: i) отбор материалов;

ii) поддержание подходящих внешних условий для подготовки и тестирования материалов для исследования;

iii) подготовка материала; iv) измерение и тестирование; v) калибровка/валидация оборудования и методы измерения; vi) оценка однородности материалов для исследования; vii) оценка стабильности материалов для исследования; viii) организация в случае необходимости межлабораторных тестовых

сравнений с сотрудниками; (см. Примечание 1 ниже) ix) обеспечение соответствующего помещения и условий для хранения; х) обеспечение соответствующей упаковки и этикетирования; xi) обеспечение соответствующего транспорта и мероприятий по

распределению; xii) статистический анализ результатов теста и присвоение значений

измеряемым величинам и связанным с ними неточностям; xiii) предоставление участникам надлежащих услуг отчетности. 6. Статистический анализ 6.1. Виды данных Выбор статистического анализа частично должен определяться видом данных, полученных рассматриваемым методом исследования. Качественные данные, такие как ‘положительный’, ‘отрицательный’ и/или ‘подозрительный’, в некоторой степени ограничены в отношении статистических процедур, которые могут к ним применяться. Количественные данные, такие как титры конечной точки, и полуколичественные данные, такие как процентные значение ингибирования, более универсальные в отношении возможных видов статистического анализа. Независимо от вида данных, которые предстоит проанализировать, важно, чтобы данные, полученные от всех участвующих лабораторий, были совместимы. В некоторых случаях может возникнуть необходимость дать указание лабораториям использовать специальную серию разведений или представлять данные в сравнении с общим стандартом. 6.2. Присвоенные значения

55

Может применяться один из этих подходов: а) Присвоение целевого значения перед получением результата При первоначальном отборе исследуемых материалов для набора контрольных

образцов, лаборатория, где осуществляется их производство, должна присвоить образцу предварительное значение, диапазон или статус. В отношении качественных данных присвоенное значение может быть единственным приемлемым значением. Если дело обстоит именно так, лаборатория, производящая образцы, должна проверить статус на серии тестов, чтобы повысить уровень уверенности в том, что присвоенное значение является, действительно, правильным. Однако целью является то, что, по крайней мере, 80% участвующих лабораторий должны получить одинаковый результат в квалификационных тестах. В отношении количественных и полуколичественных данных присвоенное значение необходимо пересчитать после представления результатов квалификационного тестирования и оно должно быть взято за среднее значение после удаления резко отклоняющихся значений.

b) Присвоение целевого значения на основании согласованного значения

возвращенных результатов участников. 6.3. Статистические методы К межлабораторным сравнениям применялись многие статистические процедуры, среди которых были и методы значительно более высокого уровня, чем другие. Как правило, применяемые статистические данные должны быть достоверными, исчерпывающими и убедительными для участвующих лабораторий. Частотный анализ является простым и убедительным методом для того, чтобы участвующие лаборатории увидели, являются ли результаты их работы верными в отношении других лабораторий, участвующих в программе квалификационной проверки. Измерения внутрилабораторных и межлабораторных расхождений с помощью коэффициентов сходимости и воспроизводимости часто дают ценную информацию относительно точности и надежности методов исследования. Анализ Юдена является полезным индикатором источников систематических и случайных ошибок, которые могут приводить к проблемам в отдельных лабораториях. 7. Критерии прохождения/непрохождения тестирования Критерии принятия решений относительно прохождения или непрохождения лабораторией квалификационного тестирования должны быть четко задокументированы. При составлении критериев необходимо учитывать факторы, которые могут отличаться в зависимости от болезни и видов исследований. После того, как критерии были установлены, они должны применяться постоянно. Виды выбранных статистических анализов должны помогать в принятии решений о прохождении/непрохождении тестирования. Лаборатории, представляющие результаты, которые выходят за пределы, установленные статистически, должны быть выявлены. Результаты тестов, которые могут привести к определению зараженного животного как

56

животного с ложноотрицательным результатом, необходимо сравнить с результатами, которые могут привести к определению здорового животного как животного с ложноположительным результатом. В большинстве случаев первый тип ошибки нельзя игнорировать, так как это указывает на проблему в чувствительности диагностики. Однако допускается определенная свобода действий при присвоении временного статуса лабораториям, где наблюдаются проблемы со специфичностью диагностики. 8. Периодичность проведения квалификационного тестирования Рекомендуется при возможности проводить квалификационные тестирования дважды в год. В зависимости от страны и болезни необходимо учитывать периоды максимального объема исследований. По возможности, как минимум один из квалификационных тестов должен быть запланирован так, чтобы он совпадал с периодом максимального объема исследований. Дважды в год необходимо проводить квалификационные тесты с достаточным интервалом для проведения корректирующих действий, которые помогают участвующей лаборатории сохранить статус официального признания. 9. Признание лаборатории Критерии для присвоения статуса, отказа в нем или его аннулирования должны быть четко задокументированы. 10. Логистика 10.1. Соответствие критериям и принятие условий Лабораториям, соответствующим критериям, необходимо разослать подробное содержание программы обеспечения качества и план квалификационного тестирования. В содержание необходимо включить подробную информацию относительно периодичности тестирования, обязательств и сроков, методов анализа данных, структуры отчетности, критериев для официального признания, использования результатов и конфиденциальности. Кроме того, необходимо приложить бланк, который следует подписать и вернуть в координирующую организацию. Это означает, что соответствующая критериям лаборатория принимает условия программы. 10.2. Уведомление и транспортировка наборов Участвующие лаборатории должны быть уведомлены, по крайней мере, за месяц до предстоящего квалификационного теста. Уведомление также должно содержать запланированную дату и метод транспортировки набора контрольных образцов. Более подробное уведомление может потребоваться для лабораторий в странах, где требуется разрешение на импорт наборов контрольных образцов. Материалы для исследования в контрольных образцах должны быть закодированы таким образом, чтобы не был указан ожидаемый результат. Кодирование может быть буквенным или цифровым. Индивидуальный набор кодов помогает предотвратить сговор между лабораториями.

57

Все перевозки должны осуществляться наиболее подходящим прямым методом. Все перевозки должны соответствовать постановлениям IATA3 в отношении транспортировки биологических материалов. После отправки необходимо проинформировать лабораторию-получатель об относящихся к делу подробностях (т.е. метод транспортировки, перевозчик, грузовая накладная воздушного сообщения и т.д.), чтобы обеспечить быстрое возвращение и таможенную очистку партии по прибытию. Наборы контрольных образцов, доставленные в поврежденном или подозрительном состоянии должны быть немедленно заменены. 10.3. Тестирование и возвращение результатов Участвующим лабораториям необходимо предоставлять достаточный объем исследуемого материала и достаточный период времени для завершения исследования набора контрольных образцов. Набор можно тестировать более одного раза и более чем одним человеком в участвующей лаборатории. Однако только один набор результатов может быть возвращен в координирующую организацию для анализа. Обычно для тестирования набора контрольных образцов следует выбирать работника, ответственного за проведение тестов в рабочем порядке. К набору контрольных образцов необходимо прилагать полный набор инструкций относительно восстановления, хранения и обработки, специальные требования к проведению тестирования, информация о способе представления данных и сроке представления результатов. Результаты должны быть возвращены в надлежащем формате и вовремя. Невыполнение этих условий может привести к исключению из цикла квалификационного тестирования, а также потере или понижению статуса официального признания. Координирующая организация должна подтвердить получение результатов и включение их в анализ. 10.4. Анализ и отчетность Проведение анализа и представление отчетов должно быть завершено своевременно после последнего срока получения результатов. Общий отчет, суммирующий результаты всех анализов, должен быть подготовлен для рассылки во все участвующие лаборатории. Участвующим лабораториям произвольно присваивается код, чтобы обеспечить анонимность в общем отчете. Каждую конкретную лабораторию информируют об их индивидуальном коде для этого цикла квалификационных тестов. Каждая конкретная лаборатория получает также сводку о своей продуктивности и статус официального признания. В этой сводке должны быть четко указаны все факторы, влияющие на любое изменение в их статусе. Если статус был понижен, особенно важно указать реальные и потенциальные причины, которые, возможно, повлияли на понижение

3 IATA – Международная ассоциация воздушного транспорта

58

статуса. В некоторых случаях уместным будет выпустить второй, идентичный набор после выполнения корректирующих действий. Документальное подтверждение статуса может быть в виде официального сертификата. Все данные, результаты анализов и статус официального признания участвующих лабораторий должны все время держаться в секрете. 11. Раскрытие информации Основная цель этих руководств – устранить торговые барьеры и не создавать новые. Предполагается, что участвующие лаборатории, получив статус полного официального признания, могут запросить, чтобы их торговые партнеры могли получить официальное подтверждение их статуса от независимого органа или координирующей организации. Это может быть выполнено только по просьбе или с согласия участвующей лаборатории или органа власти страны.

59

ГЛОССАРИЙ ТЕРМИНОВ Анализ синоним слова ‘тест’ или ‘метод тестирования’, например, иммуноферментный анализ,

фиксация комплемента или тест с полимеразным усилением. Точность приближенность значения теста к ожидаемому значению для стандартного реагента с

известной активностью или титром. Аналит специфический компонент тестируемого образца, который выявляется или измеряется

определенным методом тестирования. Валидация в лабораторных условиях см. ‘Валидация (Лабораторные условия)’. Погрешность недостаток в плане проведения теста и/или его оценки, который приводит к пере- или

недооценке параметров проведения диагностики, может включать неверный выбор реагентов/концентраций для теста, физических параметров (например, время инкубации), объекта исследования или неподходящих статистических анализов. См. “Ошибка (систематическая)”

Контрольный образец синоним термина ‘Стандартный реагент (Рабочий)’, образец (образцы), используемый(е)

в каждом цикле анализа, чтобы определить, проводится ли тест в рамках заранее установленных статистических параметров.

Карта контроля

графическое изображение данных, полученных в результате многократных измерений контрольного(ых) образца(ов), исследуемого(ых) в разных циклах в течение какого-то времени.

Сертификация (Техническая)

тестирование и признание того, что технологи обладают знаниями и навыками, необходимыми для проведения конкретного метода тестирования.

Компетенция (Лаборатория) общая оценка возможностей лаборатории проводить определенные тесты

последовательно и качественно; включает внутренние проверки и межлабораторные сравнения.

60

Перекрестная реакция см. ‘Ложноположительная реакция’. Точка раздела/порог значение результатов теста, выбранное для различения отрицательных и

положительных результатов; может включать неопределенную или подозрительную зону.

Предел обнаружения см. ‘Чувствительность (Аналитическая)’. Тестирование на эквивалентность сравнение рабочих характеристик анализа новых и/или независимых методов

тестирования с применением набора контрольных образцов, химическая активность которых была определена с помощью признанного стандартного метода тестирования.

Ошибка (Случайная) не поддающаяся прогнозированию погрешность в результатах теста, выявляемая при

повторном тестировании контрольных или справочных образцов, результаты такого рода ошибки обычно распространяются на значения выше и ниже предполагаемой химической активности образца, часто характерны для данного метода тестирования или связаны с непоследовательностью техники проведения.

Ошибка (Систематическая) поддающаяся прогнозированию неточность в результатах теста, выявляемая при

повторном тестировании контрольных или справочных образцов, результаты такого рода ошибки постоянно наблюдаются выше или ниже предполагаемой химической активности образца, часто связаны с неисправной работой оборудования или распадом реагента.

Внешняя оценка качества см. ‘Квалификационное тестирование’ Ложноотрицательная реакция отрицательная химическая активность при анализе тестируемого образца, полученного

от животного, подвергшегося влиянию или инфицированного исследуемым организмом, может объясняться недостаточной аналитической чувствительностью, ограниченной аналитической специфичностью или распадом аналита и уменьшает чувствительность диагностики.

61

Ложноположительная реакция положительная химическая реакция в анализе, не связанная с подверганием

воздействию или инфицированием исследуемым организмом, и которая может быть вызвана иммунологической перекрестной реакцией, перекрестной контаминацией тестируемого образца или неспецифическими реакциями, и уменьшает чувствительность диагностики.

Валидация в полевых условиях см. ‘Валидация (В полевых условиях)…’ Пригодность к использованию по назначению характеристики метода тестирования и связанных с ним процедур, которые относятся к

их пригодности для применения с одной (или более) специфической диагностической целью.

Гармонизация

результат соглашения между лабораториями проверять аналогичные методы тестирования, устанавливать диагностические пороговые значения или представлять данные по тесту таким образом, чтобы была возможна единообразная интерпретация результатов между лабораториями.

Инцидентность оценка уровня распространения новых инфекций в восприимчивой популяции за

определенный период времени; не путать с превалентностью. Межлабораторное сравнение оценка рабочих характеристик анализа и/или компетенции лаборатории при

тестировании определенных образцов двумя или более лабораториями; одна лаборатория может выступать в качестве справочной при определении свойств тестируемого образца.

Внутренняя оценка качества вся деятельность по обеспечению качества лаборатории, непосредственно связанная с

мониторингом и поддержанием рабочих характеристик анализа и технической квалификации.

Линейность определяет возможность метода получать результаты тестирования пропорциональные

концентрации целевого аналита. Линейный диапазон интервал концентраций аналита, в рамках которого метод обеспечивает приемлемую

точность и достоверность.

62

Матрица все компоненты тестируемого образца за исключением аналита. Контроль матрицы контрольный образец, используемый для оценки аналитической специфичности. Проверочная проба для матрицы искусственный тестируемый образец, приготовленный посредством добавления

определенного количества целевого аналита(ов) к установленному количеству натуральной матрицы и подвергнутый полной процедуре тестирования, чтобы установить, подходит ли метод и/или процедура для выявления или идентификации аналита(ов) в этой конкретной матрице.

Измерение неточности параметр, связанный с результатом измерения, который характеризует разброс

значений, который вполне может быть связан с измеренными концентрациями аналита. Оптимизация процесс оценки и установки всех физических, химических и биологических параметров

анализа для того, чтобы гарантировать, что рабочие характеристики метода тестирования являются наиболее пригодными для предполагаемого применения (т.е. пригодные к использованию по назначению).

Рабочие характеристики показатель метода итестирования, который может включать аналитическую

чувствительность и специфичность, точность и прецизионность, диагностическую чувствительность и специфичность и/или сходимость и воспроизводимость.

Прецизионность степень разброса результатов в отношении неоднократно тестируемого образца,

установленная статистическими методами, такими как среднее квадратичное отклонение или доверительные уровни.

Прогностическое значение (Отрицательное) вероятность, что животное свободно от воздействия или инфекции, при условии что

результаты теста отрицательные; прогностические значения являются функцией DSe и DSp диагностического анализа и превалентности инфекции.

Прогностическое значение (Положительное) вероятность, что животное подвергалось воздействию или инфицированию, при

условии что результаты теста положительные; прогностические значения являются функцией DSe и DSp диагностического анализа и превалентности инфекции.

63

Превалентность оценка пропорции инфицированных животных в популяции в определенный момент

времени; не путать с инцидентностью. Квалификационное тестирование измерение компетенции лаборатории посредством межлабораторного сравнения;

подразумевается, что участвующие лаборатории используют одинаковые или схожие методы тестирования, реагенты и контрольные образцы, и что результаты выражаются качественно.

Случайная ошибка см. ‘Ошибка (Случайная)’. Справочное животное любое животное, у которого статус инфекции может быть определен однозначно; сюда

могут относиться больные, инфицированные, вакцинированные, иммунизированные животные или животные, никогда не подвергавшиеся воздействию.

Справочный материал материал(ы) или вещество(а), свойства которых достаточно однородны и хорошо

установлены для того, чтобы использовать их для калибровки прибора, оценки метода измерения или присвоения материалам значений.

Эталонный стандарт см. ‘Стандарт (Эталонный)’. Справочная лаборатория лаборатория с признанной научной и диагностической компетенцией в отношении

определенной болезни животных и/или методики тестирования; сюда входит возможность характеристики и присвоения значений справочным материалам.

Сходимость уровень совпадения между репликатами образца как в пределах одного цикла, так и

между циклами одного и того же метода тестирования в данной лаборатории. Воспроизводимость возможность с помощью данного метода получить достоверные результаты

применительно к аликвотам одного образца, тестируемого одним и тем же методом в разных лабораториях.

64

Надежность показатель способности анализа не подвергаться незначительным изменениям или

отклонениям в условиях проведения теста для воспроизведения ожидаемой рутинной лабораторной операции, часть исследований оптимизации и отраженный в оценке сходимости (например, время инкубирования, температура реакций, концентрация буфера pH/ ионный, разведения реагента, состояние образца и/или подготовка и т.д.).

Прочность показатель способности анализа не подвергаться значительным изменениям или

заменам в условиях тестирования, предусмотренных в использовании многими лабораториями, часть изучения пригодности и оценки воспроизводимости (например, условия транспортировки, передача технологий, партии реагентов, оборудование, исследовательские площадки и/или внешние условия).

Образец материал, получаемый из пробы и используемый в целях тестирования. Чувствительность (Аналитическая) синоним термина ‘Предел обнаружения’, самое маленькое обнаружимое количество

аналита, которое можно измерить с определенной точностью; аналит может включать антитела, антигены, нуклеиновые кислоты или живые организмы.

Чувствительность (Диагностическая) количественное соотношение известных инфицированных эталонных животных,

которые демонстрируют положительную реакцию при анализе; инфицированные животные, которые демонстрируют отрицательную реакцию, считаются животными с ложно-отрицательными результатами.

Чувствительность (Относительная) количественное соотношение эталонных образцов, определенных как положительные с

помощью одного или нескольких методов, которые также дают положительную реакцию в анализе при сравнении.

Специфичность (Аналитическая) степень, с которой анализ различает целевой аналит от других компонентов в матрице

проб; чем выше аналитическая специфичность, тем ниже уровень ложно-положительных результатов.

Специфичность (Диагностическая) количественное соотношение известных инфицированных эталонных животных,

которые демонстрируют отрицательную реакцию при анализе; неинфицированные эталонные животные, которые демонстрируют положительную реакцию, считаются животными с ложно-положительными результатами.

65

Специфичность (Относительная) количественное соотношение эталонных образцов, определенных как отрицательные с

помощью одного или нескольких методов тестирования, которые также дают отрицательную реакцию в анализе при сравнении.

Проба материал, исключительно животного происхождения, переданный для тестирования. Стандартный реагент (Int’l) стандартный реагент, по которому проводится проверка всех других реагентов и

анализов; приготавливается и распространяется Международной справочной лабораторией.

Стандартный реагент (Национальный) стандартный реагент, проверяемый путем сравнения с Национальным стандартным

реагентом; приготавливается и распространяется Национальной справочной лабораторией.

Стандартный реагент (Рабочий) стандартный реагент, проверяемый путем сравнения с национальным стандартным

реагентом или, при отсутствии Национального стандартного реагента, проверяемый по отношению к хорошо описанному собственному стандартному реагенту; включен в рутинные диагностические тесты в качестве контроля и/или для нормализации результатов теста.

Стандарт (Эталон) стандарт, который, как правило, имеет самое высокое метрологическое качество и

имеется в наличии в данном месте и в данной лаборатории, и по которому получают измерения.

Стандартный метод тестирования метод тестирования, утвержденный в соответствии с принципами валидации МЭБ,

признанный подходящим для конкретной цели и опубликованный в признанном стандарте; как таковой может также считаться эталонным или индексным методом с целью сравнения.

Стандартизация процесс калибровки методов независимого тестирования до единого уровня

аналитической чувствительности и регулировки по соответствующему уровню диагностического согласования по сравнению с признанным стандартным методом тестирования, обычно достигается посредством использования калибровочных

66

реагентов и контрольных панелей, поставляемых в основном международной справочной лабораторией.

Систематическая ошибка см. ‘Ошибка (Систематическая)’ Метод тестирования определенная техническая процедура для выявления аналита, см. ‘Анализ’. Тест (Скрининг) методы тестирования с высокой диагностической чувствительностью, которые подходят

для применения в крупном масштабе. Тест (Подтверждающий) методы тестирования с высокой диагностической специфичностью, которые

применяются для подтверждения результатов, обычно положительных результатов, полученных с помощью других методов тестирования.

Тест (Доказательный) методы тестирования с абсолютной диагностической специфичностью, т.е. без

ложноположительных результатов, которые применяют, чтобы напрямую изолировать/идентифицировать болезнетворные организмы; такие тесты могут быть также известны как патогномоничные тесты.

Тест (Предварительный) методы тестирования, используемые для выявления косвенных или вторичных

признаков инфекции/подвергания воздействию, т.е. антитела, антигены или нуклеиновые кислоты; такие тесты могут также быть известны как суррогатные тесты.

Валидация процесс подтверждения пригодности метода тестирования для намеченных целей или, в

качестве альтернативы, установление и верификация рабочих характеристик метода тестирования при определенном уровне статистической достоверности с оценкой этих характеристик по отношению к установленным требованиям для конкретного диагностического применения; может также включать непрерывный мониторинг и расширение данных по валидации.

Валидация (В лабораторных условиях) процесс оптимизации и стандартизации аналитических рабочих характеристик метода

тестирования, может включать такие критерии как аналитическая чувствительность и специфичность, точность и прецизионность, сходимость и надежность, а также аналитическое сравнение с другими методами тестирования. Примечание – этот процесс обязательно предваряет валидацию в полевых условиях и без последнего анализ не может считаться пригодным для большинства диагностических целей.

67

Валидация (В полевых условиях) процесс установления диагностических рабочих характеристик метода тестирования,

может включать такие критерии как диагностическая чувствительность и специфичность, вопроизводимость и прочность, а также гармонизацию и тестирование на эквивалентность. Примечание – рекомендуется только для анализов, которые прошли тщательную валидацию в лабораторных условиях.