This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

WIRKUNG VON CARBOXYPEPTIDASE 393

Uber die Wirkung von Carboxypeptidase auf das lamellare Strukturproteid der Chloropiasten von Allium porrum

(2. Mitteilung über lamellare Strukturproteide)

Von W i l h e l m M e n k e und E v a m a r i a J o r d a n

Aus dem Botanischen Institut der Universität zu Köln (Z. Naturforschg. 14 b, 393—394 [1959]; eingegangen am 26. Februar 1959)

Die carboxyl-endständigen Reste des lamellaren Strukturproteids der Chloroplasten von A llium porrum wurden mittels Carboxypeptidase bestimmt. Gefunden wurden 11 verschiedene Aminosäuren.

Durch H ydrazinolyse nach A k a b o r i w urden kürzlich die carboxyl-endständigen Reste des lam el­laren S trukturproteids der Chloroplasten b es tim m t1.

sofort nach Ferment­

zugabe1

nach 4 Stdn.

nach 8 Stdn.

Glycin _ 0,004 0,013Alanin — - 0 , 1 2

Valin — — 0 , 1 1

Leucin — — 0,23Serin — 0,018 0,023Threonin — 0 , 0 1 2 0,019Phenylalanin — 0,024 0,043Asparaginsäure — 0,007 0,014Glutaminsäure — 0,015 0,018Asparagin — 0,024 0,035Glutamin — 0,024 0,036

Summe - 0,128 0,661

Tab. 1. Durch Carboxypeptidase fTeigesetzte Aminosäuren. Verhältnis: Ferment/Substrat = 1 : 188. Ausbeuten in

mMol/100 g.

sofortnach

Ferment­zugabe

nach 1 Stde.

nach 2 Stdn.

nach 4 Stdn.

Glycin 0,007 0,025 0,029 0,032Alanin 0,15 0,23 0,23 0,23Valin 0,16 0,26 0,26 0,26Leucin 0,39 0,46 0,47 0,50Serin 0 , 1 0 0,15 0,14 0,15ThreoninPhenyl­

0,070 0 , 1 0 0 , 1 0 0 , 1 0

alaninAsparagin­

0,13 0,17 0,17 0,18

säureGlutamin­

0 , 0 2 2 0,041 0,042 0,050

säure 0 , 0 2 1 0 , 0 2 1 0 , 0 2 1 0 , 0 2 1

Asparagin 0,039 0,063 0,066 0,065Glutamin 0,062 0,096 0,095 0,097

Summe 1,151 1,616 1,623 1,685

Tab. 2. Durch Carboxypeptidase freigesetzte Aminosäuren. Verhältnis: Ferment/Substrat = 1 : 38. Ausbeuten in

mMol/100 g.

Es konnten 1 1 verschiedene A m inosäuren als carb- oxyl-endständig nachgewiesen werden und die Aus­beute betrug bei dem nicht m it Phenol behandelten P roteid 2,8 mMole A m inosäuren/100 g Proteid.

C arboxypeptidase spaltet nach kurzer E inw irkung11 verschiedene A m inosäuren aus demselben P roteid ab (Tab. 1 und 2 ) . Von den durch Hydrazinolyse gefundenen carboxyl-endständigen Resten wurden H istidin und P ro lin nicht nachgewiesen. P rolin wird durch C arboxypeptidase nicht abgespalten. Zusätz­lich gefunden w urden A sparagin und Glutamin, die durch H ydrazinolyse nicht erfaßt werden können. Die G esam tausbeute an A m inosäuren w ar m it m axi­m al 1,7m Mole A m inosäuren/100 g P roteid n ied ri­ger als bei der H ydrazinolyse. Es ist daher unw ahr­scheinlich, daß die Zahl der Reste durch zusätzliche A bspaltung der vorletzten A m inosäuren erhöht ist. F erner lassen sich keine anderen Am inosäuren nach­weisen, wenn m an ein zweites Mal zum Substrat C arboxypeptidase zusetzt, nachdem die Reaktion nach der ersten Ferm entzugabe praktisch beendet war. Es w urden nach 2 Stdn. lediglich insgesam t 0,2 mMol von denselben A m inosäuren/100 g P ro ­teid gefunden wie bei der ersten Ferm enteinw irkung, die ebenfalls 2 Stdn. dauerte.

Die Versuche m it Carboxypeptidase bestätigen also unsere A uffassung, daß das lam ellare S truk tur­proteid eine größere Anzahl von verschiedenen Poly­peptiden enthält. Nicht auszuschließen ist jedoch die Möglichkeit, daß die Zahl der Endgruppen durch die W irkung einer zell- oder chloroplasten-eigenen Endo- oder Exopeptidase bei der A ufarbeitung verm ehrt worden ist. N un w urde aber gefunden, daß die Aus­beute an carboxyl-endständigen Resten um ein M ehr­faches g rößer ist als die Zahl der am ino-endständigen Reste. Bei E inw irkung einer Endopeptidase w ährend der A ufarbeitung sollte aber die gleiche Anzahl von

1 W. M e n k e u . E. J o r d a n , Z. Naturforschg. 14 b, 234 [1959].

3 9 4 W. MENKE

amino-endständigen und carboxyl-endständigen Re­sten entstehen. Wenn man nun die unwahrscheinliche Annahme macht, daß alle amino-endständigen Reste im ursprünglichen Proteid blockiert, und daß alle gefundenen amino-endständigen Reste durch eine Endopeptidase bei der Aufarbeitung freigelegt wor­den seien, so bliebe immer noch ein großer Über­schuß an carboxyl-endständigen Resten.

E x p e r im e n te lle r T eil

Die präparative Darstellung des lamellaren Struktur­proteids wurde kürzlich beschriebenx. Als Substrat wurde dasselbe nicht mit Phenol behandelte Präparat wie zur Hydrazinolyse verwendet. Die Bestimmung der carboxyl-endständigen Reste erfolgte nach der Vorschrift von H a r r i s 2. 0,08 ml einer Suspension von kristallisier­ter Carboxypeptidase, 6,4 mg Fermentprotein enthal­tend, wurden in 2 ml 1 -proz. Lösung von Natrium- hydrogencarbonat aufgenommen und bis zur vollständi­gen Lösung mit 0,1-n. Natronlauge versetzt. Nachdem sich das Fermentprotein gelöst hatte, wurde die Lösung sofort mit 0,1-n. Salzsäure auf pn 8,0 gebracht. Zur Hemmung der Aktivität etwa im Ansatz vorhandener Endopeptidasen wurden 0,06 ml einer Lösung von 0,02 ml Diisopropylfluorophosphat in 1 ml Isopropanol zugegeben.

2 H . F r a e n k e l - C o n r a t , J. I. H a r r is u . A. L . L e v y , Methods bio- chem. Anal. II, 409. New York, London 1955.

Inzwischen wurden 240 mg Strukturproteid in 50 ml dest. Wasser mit Hilfe eines AHT-Teflon-Homogenisa- tors fein verteilt und mit 0 ,1 -n. Natronlauge auf pn 8 ,0 gebracht. Nach einer Stde. wurden Substrat und Fer­ment vereinigt und der Ansatz auf 60 ml aufgefüllt. Nach gründlichem Mischen wurden 15 ml (I) entnom­men. Der Rest wurde im Wasserbad bei 40 °C gerührt. Nach Ablauf von 1 , 2 und 4 Stdn. wurden jeweils 15 ml (II), (III) und (IV) abpipettiert.

Sofort nach Entnahme wurde (I) — (IV) mit Carbo- nat-Hydrogencarbonat-Puffer auf pn 9,0 gebracht, mit etwa 0,08 ml Dinitrofluorbenzol versetzt und 2 Stdn. bei 40 C gerührt. Dann wurde 20 Min. bei 80 000 g zentrifugiert und der Überstand angesäuert und, wie in der ersten Mitteilung beschrieben, weiterbehandelt. Zur papierchromatographischen Trennung wurde der gesamte Extrakt auf einem Bogen aufgetragen.

Weitere Versuche wurden mit 1/s der hier angegebe­nen Fermentmenge durchgeführt. Ohne Fermentzugabe konnten im Ansatz keine Aminosäuren nachgewiesen werden.

In einem anderen Versuch wurde das ungelöste Sub­strat nach 2-stdg. Einwirkung der oben angegebenen Fermentmenge abzentrifugiert, gewaschen und abermals mit der gleichen Fermentmenge versetzt. Nach 2 Stdn. wurden die freigesetzten Aminosäuren wie oben be­stimmt.

Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t sind wir für ihre Unterstützung zu großem Dank ver­pflichtet.

Zur Entwicklungsgeschichte der Plastiden von Oenothera hookeri

und M orphogenese der Chloroplastenstruktur(2 . Mitteilung zur Entwicklungsgeschichte der Plastiden)

Von W. M e n k e

Aus dem Botanischen Institut der Universität zu Köln (Z. Naturforschg. 14 b, 394— 398 [1959] ; eingegangen am 19. Februar 1959)

An elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Schnitten durch Keimpflanzen von Oenothera hookeri wird folgendes festgestellt: Die Plastiden im Sproßmeristem und in den jüngsten Blattanlagen besitzen Schichtenstruktur. Die Schichten werden von schwach kontrastierbaren Lamellen begrenzt.Der Raum zwischen den Lamellen ist von globulären Teilchen ausgefüllt. Anscheinend können diese Teildien selbst wieder zu Lamellen geordnet sein. Gegen Ende des meristematischen Stadiums beob­achtet man eine Zunahme der Kontrastierbarkeit der Lamellen. In den Schichten werden etwa gleich­zeitig seitlich begrenzte Pakete von ebenfalls stärker kontrastierbaren Lamellen sichtbar, die an­scheinend später zu durchgehenden Lamellenpaketen, den Chloroplastenschichten, zusammenwachsen.Die im einzelnen noch nicht hinreichend bewiesene Auffassung des Verfassers über die Morphogenese der Plastidenstruktur wird dargelegt.

In der ersten Mitteilung1 wurde berichtet, daß nis wurde an isolierten Plastiden gewonnen. ImPlastiden meristematischer Zellen einen Bau erken- folgenden werden einige Beobachtungen an Schnit-nen lassen, der sich mit der Struktur von ausgewach- ten mitgeteilt. Als Untersuchungsobjekt dientensenen Chloroplasten vergleichen läßt. Dieses Ergeb- Keimlinge von O enothera hookeri.

1 W. M e n k e , Z. Naturforchg. 11b, 215 [1956].