QUI ĐỊNH VỀ BẢO MẬT

© 2015 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Toàn bộ bản quyền được bảo hộ.

Pioneer Hi-Bred International, Inc. (Pioneer) sở hữu bản quyền và được bảo hộ theo pháp luật

đối với mọi thông tin, dữ liệu hoặc tài liệu khác ("Thông Tin") của Pioneer, được cung cấp như

một phần của hồ sơ này. Bộ Nông nghiệp-PTNT và các thành viên Ủy ban An toàn Sinh học và

Nhóm Cố vấn Kỹ thuật chỉ có thể sử dụng Thông Tin cung cấp trong hồ sơ này trong việc xét

duyệt, đánh giá hồ sơ theo đề nghị của Pioneer. Bất kỳ sử dụng nào khác đối với Thông Tin đều

được coi là vi phạm trừ phi tuân theo bất kỳ điều luật hiện hành nào của Bộ Tư Pháp Việt Nam về

tiết lộ thông tin; tuy nhiên, miễn là Bộ Nông nghiệp-PTNT và Bộ Tư Pháp Việt Nam tuân thủ mọi

yêu cầu bảo vệ hiện hành dành cho Pioneer và Thông Tin trong hồ sơ này để đáp lại một yêu cầu

cụ thể. Sự đồng ý này là có giới hạn và sẽ không được xem là cho phép Bộ Nông nghiệp-PTNT

tham khảo, sử dụng, hoặc xem xét khác đối với Thông Tin nói trên, trực tiếp hay gián tiếp, để hỗ

trợ bất kỳ đơn nào được nộp bởi một đương đơn khác nếu không có sự đồng ý trước bằng văn bản

của Pioneer và không miễn trừ, dưới bất kỳ hình thức nào, các quyền của Pioneer (bao gồm các

quyền về quyền sở hữu và bồi thường) đối với Thông Tin của Pioneer khi các quyền đó liên quan

đến bất kỳ đơn vị nào khác.

MỤC LỤC I. THÔNG TIN CHUNG ................................................................................................................... 3

1. Tổ chứ đ n ấp Giấy xác nhận: ........................................................................................ 3

2. Tên sự kiện chuyển en đ n ấp Giấy xác nhận: .............................................................. 3

II. THÔNG TIN VỀ CÂY CHỦ NHẬN GEN ................................................................................... 3

1. Tên cây chủ nhận gen ................................................................................................................. 3

2. Đặ điểm sinh học của ngô: ........................................................................................................ 4

3. i n ệ i i ư n ự n i n đ n in ọ i iệ n in ậ

n ận ............................................................................................................................................. 4

III. THÔNG TIN VỀ SINH VẬT CHO GEN ...................................................................................... 5

1. Tên sinh vật cho gen ................................................................................................................... 5

2. Thông tin l ch s tự n i n i n n đến an toàn thực phẩm, thứ n n n i ................ 6

3. Thông tin về việc tìm thấy trong tự nhiên các chấ án in ưỡn độc t và chất gây d ứng

7

4. Thông tin về việ đã đ n d ng (nếu có) trong chuỗi thực phẩm, thứ n n n i on

đư n p ơi n iễm khác ngoài s d ng có chủ đí ................................................................ 8

IV. THÔNG TIN LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN .................................................. 9

1. Thông tin liên quan t i đo n DNA chèn. .................................................................................. 9

2. Miêu tả tính tr ng m i á đặ điểm của ngô chuyển gen 59122 khi so sánh v i gi n đ i chứng

không chuyển gen ...................................................................................................................... 10

3. Thông tin về hiện tr ng cấp phép và s d ng sự kiện DAS-59122-7 trên thế gi i .............. 11

V. ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG CỦA NGÔ SỰ KIỆN 59122 ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON

NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI ............................................................................................................ 13

1. So sánh sự khác biệt về thành phần in ưỡng giữa ngô sự kiện ....................................... 13

DAS-59122-7 đ i chứng truyền th ng không biến đổi gen: ................................................... 13

2. Đán iá ả chuyển hóa các thành phần in ưỡn đặc biệt là các chất m i là sản phẩm biểu

hiện của gen chuyển nế được s d ng làm thực phẩ TĂC ........................................... 14

3. Đán iá ả n n độc tính củ p o ein C y34Ab1 C y35Ab1 PAT đã được cấy vào nếu s

d ng làm thực phẩ TĂC ................................................................................................... 14

4. Đán iá khả n n ây ứng của các chất m i là sản phẩm biểu hiện của gen chuyển nế được

s d ng làm thực phẩm, thứ n n n i .......................................................................... 19

VI. ĐỀ XUẤT CÁC BIỆN PHÁP QUẢN LÝ RỦI RO TIỀM ẨN CỦA THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN ĐỐI

VỚI SỨC KHỎE CON NGƯỜI, VẬT NUÔI ............................................................................. 22

VII. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 23

1. Kết luận: .................................................................................................................................... 23

2. Đề ngh : ...................................................................................................................................... 23

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐÁ H GIÁ RỦI RO CỦA NGÔ SỰ KIỆN DAS-59122-7

ĐỐI VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI, VẬT NUÔI

(Theo Phụ lục 03 Thông tư số: 02/2014/TT-BNNPTNT, ngày 24/01/2014

của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)

I. THÔNG TIN CHUNG

1. Tổ chức đ n cấp Giấy xác nhận:

- Tên tổ chức đăng ký: Công ty TNHH Pioneer Hi-Bred Việt Nam;

- Người đại diện của tổ chức: Nguyễn Thanh Sang, Tổng Giám đốc;

- Đầu mối liên lạc của tổ chức: Nguyễn Thanh Sang, Tổng Giám đốc;

- Địa chỉ: Tầng 11, Central Plaza Office Building, 17 Lê Duẩn, Quận 1, TP. Hồ Chí

Minh, Việt Nam.

- Điện thoại: (+84) 8 3825 1610 Fax: (+84) 8 3825 1620

- E-mail: sang.nguyenthanh@pioneer.com

2. Tên sự kiện chuyển en đ n ấp Giấy xác nhận:

- Tên thông thường: Ngô, bắp (tiếng Việt) và Maize/ Corn(tiếng Anh)

- Tên khoa học: Zea mays L.

- Tên thương mại: Herculex®

- Sự kiện chuyển gen: Sự kiện DAS-59122-7

- Tính trạng liên quan đến gen được chuyển: Kháng sâu hại bộ cánh cứng (protein

Cry34Ab1 và protein Cry35Ab1) và kháng thuốc diệt cỏ gốc glyphosate (protein

PAT được sử dụng như chất chỉ thị chọn lọc)

- Mã nhận dạng duy nhất (nếu có): DAS-59122-7

- Tên tổ chức tạo giống: Pioneer Hi-Bred International, Inc.

II. THÔNG TIN VỀ CÂY CHỦ NHẬN GEN

1. Tên cây chủ nhận gen

a. Tên thông thường: Ngô, bắp( tiếng Việt) và Maize/ Corn (tiếng Anh)

b. Tên khoa học: Zea mays L.

c. Vị trí phân loại: Cây ngô (Zea mays L.) thuộc chi ngô (Zea), bộ ngô (Maydeae),

họ phụ hòa thảo (Panicoideae), họ hòa thảo (Poaceae). Chi Zea có 5 loài bao gồm

cả Zea mays. Loài Z. mays có bốn phân loài, trong đó Zea mays ssp. mays là

nhóm duy nhất được thuần hóa (ngô). Ba phân loài còn lại của Z. mays gồm

huehuetenangensis, mexicana và parviglumis, được gọi chung là teosinte. Họ

hàng gần nhất với chi Zea là các loài cỏ thuộc chi Tripsacum.

2. Đặ điểm sinh học của ngô:

Ngô là loài nhị bội thể (2n = 20) với mức độ thuần hóa cao, thuộc bộ Maydeae, họ

hòa thảo, Poaceae. Ngô được canh tác phổ biến trên toàn thế giới và có lịch sử sử

dụng an toàn lâu dài. Hạt ngô và các sản phẩm làm từ ngô là thực phẩm và thức ăn

chính cho một phần lớn dân số trên toàn cầu (CFIA, 1994).

Theo tài liệu sinh vật học về ngô truyền thống của Tổ chức Hợp Tác và Phát Triển

Kinh Tế (OECD, 2003), ngô là một loài cỏ thân cao sinh trưởng quanh năm, thân cây

với các lớp vỏ bọc ngoài xếp chồng lên nhau, bản lá rộng mọc xen kẽ xung quanh

thân. Ngô có một hoặc nhiều hoa cái gồm râu ngô mọc ra trên một lõi ở khoảng giữa

thân cây và nhiều hoa đực được gọi là bông cờ mọc ở đỉnh của thân cây có chức năng

tung phấn. Cây ngô sinh sản lưỡng tính trong đó mỗi râu ngô đều có thể được thụ

phấn để tạo ra một hạt ngô trên bắp. Các hạt ngô xếp thành 8 - 16 hàng dọc theo lõi

ngô và được bao quanh bằng các lớp bảo vệ gọi là bẹ ngô (OECD, 2003).

Ngô là loài thực vật sinh sản lưỡng tính với các cơ quan đực (bông cờ ngô) và cái

(râu ngô) cùng tồn tại trên mỗi cây. Phấn ngô được tạo ra bởi bông cờ, có thể thụ phấn

cho các râu ngô trên chính cây đó (tự thụ phấn) hoặc cho các cây xung quanh (thụ

phấn chéo). Cả hai quá trình tự thụ và thụ phấn chéo đều chịu ảnh hưởng bởi yếu tố

khoảng cách địa lý, sự phát tán phấn hoa và khả năng thụ phấn. Thông thường khoảng

95% noãn được thụ phấn chéo từ các cây lân cận và chỉ 5% được tự thụ phấn (Sleper

và Poehlman, 2006).

3. M i n ệ i i ư n ự n i n đ n in ọ i iệ

n in ậ n ận

Ngô (Zea mays L.) có nguồn gốc từ Mexico và đã được trồng ở đó lấy thực phẩm

từ năm 2.700 Trước Công Nguyên (Salvador, 1997). Khu vực Trung Mỹ và phía nam

Bắc Mỹ (Trung Nam Mexico và Trung Mỹ) được coi là quê hương của loài ngô

(OECD, 2003). Ngày nay, ngô được canh tác toàn cầu ở hơn 166 quốc gia trên diện

tích ước tính là 184 triệu héc-ta (FAOSTAT, 2014).

Ngô có lịch sử lâu đời và an toàn trong sử dụng làm thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu

và thực phẩm, có vai trò quan trọng đối với thị trường toàn cầu. Khi được sử dụng

làm thức ăn chăn nuôi, toàn bộ bắp ngô có thể được nghiền trực tiếp, mà không cần

tách hạt, để làm thức ăn cho động vật nhai lại (OECD, 2002b). Hoặc sau khi bắp ngô

được tách hạt, phần lõi cũng có thể được sử dụng làm thức ăn gia súc (OECD, 2002b).

Có thể cho vật nuôi ăn ngô nguyên hạt hoặc xử lý tối thiểu như xay nghiền hoặc nấu

chín (OECD, 2002b). Ngô hạt được trộn vào thành phần thức ăn chăn nuôi dưới dạng

xay, nghiền, nấu chính hay nén dạng viên (OECD, 2002b). Phần thân lá ngô có thể

được ủ chua sử dụng dưới dạng thức ăn tươi cho vỗ béo vật nuôi và gia súc lấy sữa

(OECD, 2002b). Thân cây ngô chứa khoảng một đến một lần rưỡi tổng lượng chất

dinh dưỡng có trong hạt hạt và quy trình ủ chua giúp bảo toàn được trên 90% lượng

dưỡng chất này (OECD, 2002b).

Ngô cũng là một loại thức ăn có tính chất gây dị ứng rất thấp (OECD, 2002b).

Mặc dù có bằng chứng về nguy cơ gây dị ứng của loại protein 9 kDa có chức năng

trong vận chuyển lipit (Pastorello và cs., 2000; Pastorello và cs., 2003) và protein 50

kDa làm giảm mức độ độ hòa tan có trong thành phần ngô hạt (Pasini và cs., 2002),

ngô không được xem là loại thực phẩm hay nguồn thức ăn gây dị ứng đáng kể (Hefle

và cs., 1996; Moneret-Vautrin, 1998) và không có tên trong danh sách thực phẩm có

chỉ định gây dị ứng của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-

FDA, 2006).

Ngô được sử dụng ở Việt Nam như một nguồn năng lượng chính trong ngành công

nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, sử dụng làm thực phẩm dưới dạng tinh bột ngô và

một phần hạn chế được sử dụng trong các ngành công nghiệp khác như trong sản xuất

bia, dệt và dược phẩm (USDA-FAS, 2014). Trong sử dụng làm thành phần thức ăn

chăn nuôi, ngô hạt chủ yếu được sử dụng trong chăn nuôi lợn và gia cầm, chiếm

khoảng trên 80% tổng lượng ngô hạt sử dụng trên cả nước (USDA-FAS, 2014). Tuy

nhiên, hiện nay còn hạn chế về số liệu về sử dụng thân lá ngô làm thức ăn tươi trực

tiếp hoặc ủ chua.

Ở Việt Nam, diện tích trồng ngô vào khoảng 1.2 triệu ha, trong đó khu vực miền

núi phía Bắc với diện tích gieo trồng ước tính 502.000 ha, chiếm 42% tổng diện tích

trồng ngô. Một diện tích ngô đáng kể được trồng ở Tây Nguyên (khoảng 247.000 ha),

vùng ven biển Bắc Trung bộ và miền Trung (khoảng 202.000 ha), vùng Đông Nam bộ

(79.000 ha), đồng bằng sông Hồng (86.000 ha) và vùng đồng bằng sông Mekong

(40.000 ha) (Tổng cục Thống kê Việt Nam, 2013).

III. THÔNG TIN VỀ SINH VẬT CHO GEN

1. Tên sinh vật cho gen

Sinh vật cho gen cry34Ab1 và cry35Ab1

a. Tên thông thường: Vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) (vi khuẩn đất);

b. Tên khoa học: Vi khuẩn Bacillus thuringensis chủng PS149B1;

c. Vị trí phân loại:

Lớp: Nhóm Bacillus/Clostridium (vi khuẩn Gram dương, ít G + C)

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

Loài: B. thuringiensis

Chủng: PS149B1

Sinh vật cho gen pat

a. Tên thông thường: Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes (vi khuẩn đất)

b. Tên khoa học: Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes.

c. Vị trí phân loại:

Loài vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes: theo thứ tự thuộc Giới: Ngành:

Lớp: Bộ: Họ, Chi lần lượt Vi khuẩn, Actiniobacteria, Actiniobacteria,

Actinomycetales, Streptomycineae, Streptomyces

2. Thông tin l ch s tự n i n i n n đến an toàn thực phẩm, thứ n n

nuôi.

Vi khuẩn Bacillus thuringensis cho gen cry34Ab1 và cry35Ab1

Vi khuẩn Bacillus thuringensis, còn được gọi là Bt, là một loại vi khuẩn đất tự

nhiên. B. thuringiensis thuộc nhóm vi khuẩn tạo nha bào, Gram dương được phát hiện

lần đầu tiên tại Nhật Bản trên con tằm bị bệnh vào năm 1901. Loại vi khuẩn này tồn

tại tự nhiên trong đất và trên các thực vật gồm rau, bông, cây thuốc lá, cây lấy gỗ và

cây rừng (Schnepf và cs., 1998). Vi khuẩn Bt sản sinh ra nhiều loại protein tinh thể

(Cry) có tính độc chọn lọc đối với ấu trùng của côn trùng thuộc một số Bộ nhất định.

Ví dụ protein Cry1 chỉ hiệu quả đối với côn trung bộ cánh màng, Lepidoptera; protein

Cry3 chỉ hiệu quả đối với côn trùng bộ cánh cứng, Coleoptera (Clark và cs., 2005).

Nói chung, protein Cry có nguồn gốc từ vi khuẩn B. thuringensis có một lịch sử sử

dụng an toàn lâu dài trong làm thuốc trừ sâu sinh học và không có bằng chứng ghi

nhận nào về tác hại gây ra bởi protein Cry trên người hay động vật có mạch chính

(US-EPA, 1995, 1996). Trong một đánh giá về tác động của phơi nhiễm của con

người do phun Bt (Otvos và cs., 2005) đã đi đến kết luận Bt là một trong những thuốc

trừ sâu sinh học an toàn nhất được sử dụng, không ghi nhận trường hợp nào nhiễm

độc hay các vấn đề về sức khỏe đối với con người liên quan đến việc sử dụng chúng

làm thuốc trừ sâu kể từ cách đây hơn bốn thập kỷ.

Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes cho gen pat:

Gen pat trong sự kiện DAS-59122-7 là phiên bản có sửa đổi trình tự gen so với

gen pat của sinh vật cho gen, S. viridochromogenes dòng Tü494 (Eckes và cs., 1989).

Đây là loại vi khuẩn đất Gram dương, hình thành bào tử và phổ biến, có khả năng

tổng hợp tripeptide, L-phosphinothricyl-L-alanyl-alanine (L-PPT), là chất được sử

dụng để tạo thuốc diệt cỏ không chọn lọc gốc phosphinothricin (OECD, 1999, 2002c).

Tính an toàn của protein PAT đối với con người và động vật được chứng minh

qua các nghiên cứu độc tính đường miệng cấp tính trên chuột với protein PAT và

nghiên cứu kéo dài 90 ngày đối với động vật gặm nhấm ăn ngô sự kiện DAS-59122-

7(Brooks, 2000; MacKenzie và cs., 2007); Không có sự tương đồng trong trình tự

chuỗi axít amin giữa protein PAT với các chất gây độc hay dị ứng từng được biết đến

(Krauss, 2013a, b; Meyer, 1999; OECD, 1999); sự nhanh chóng bị phân giải của

protein PAT trong dịch dạ dày mô phỏng (OECD, 1999); và tính không bền với nhiệt

của protein PAT (Hérouet và cs., 2005; OECD, 1999). Thông tin chi tiết về protein

PAT có thể được tham khảo trong tài liệu thống nhất của Tổ chức Hợp tác và Phát

triển Kinh tế về các thông tin chung liên quan đến gen và enzym liên quan tới khả

năng kháng thuốc diệt cỏ gốc phosphinothricin (OECD, 1999).

3. Thông tin về việc tìm thấy trong tự nhiên các chấ án in ưỡn độc t

và chất gây d ứng

Vi khuẩn B. thuringiensis cho gen cry34Ab1 và cry35Ab1

Trong khoảng hơn 50 năm qua, nhiều loài vi khuẩn Bt có chứa các protein Cry đã

được sử dụng an toàn làm thuốc trừ sâu trong lĩnh vực nông nghiệp và đã được

thương mại hóa (Siegel, 2001) và các sản phẩm có nguồn gốc từ các cây chuyển gen

có chứa các protein Bt đã được thương mại hóa từ năm 1996 và được sử dụng tương

đối rộng rãi và an toàn làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Hammond và Koch,

2012). Tại thời điểm đó, hoàn toàn không có bất kỳ ghi nhận nào về các tác động bất

lợi đáng kể gây ra bởi các protein Cry đối với người hoặc động vật có mạch chính

(US-EPA, 1995, 1996).

Sản phẩm Bt thương mại đầu tiên đã được thử nghiệm ngoài điều kiện đồng ruộng

tại Hoa Kỳ vào năm 1958 (Faust, 1974) và các công thức có thành phần kết hợp của

một số nhóm protein Cry đã được đăng ký tại Mỹ từ năm 1961 (Betz và cs., 2000;

Schnepf và cs., 1998). Trong lịch sử sử dụng rộng rã và liên tục suốt hơn 50 năm qua,

chưa có báo cáo hay ghi nhận nào về các tác động tiêu cực đáng kể đến con người hay

môi trường môi trường từ việc sử dụng các thuốc trừ sâu sinh học Bt (Betz và cs.,

2000).

Vi khuẩn S. viridochromogenes cho gen pat

Bản thân S. viridochromogenes được xác định không phải tác nhân gây bệnh đối

với con người và nó cũng không liên quan đến các thuộc tính khác (ví dụ tính sinh các

độc tố) được biết có ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Một đánh giá an toàn chi tiết

bao gồm đánh giá tính độc và tính gây dị ứng đã đưa đến kết luận rằng việc đưa

protein PAT từ Streptomyces vào thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi không làm ảnh

hưởng đến tính an toàn đối với con người hay vật nuôi (Hérouet và cs., 2005).

4. Thông tin về việ đã đ n d ng (nếu có) trong chuỗi thực phẩm, thứ n

n n i on đư n p ơi n iễm khác ngoài s d ng có chủ đí

Bacillus thuringensis và Streptomyces viridochromogenes là các vi khuẩn phổ biến

trong đất. B. thuringensis được sử dụng như một tác nhân kiểm soát côn trùng qua

nhiều thập kỷ. Chế phẩm Bt đầu tiên thương mại hóa được sản xuất tại Pháp vào năm

1938 (OECD, 2002a), sau đó đã có rất nhiều sản phẩm đã được sản xuất từ nhiều

công thức khác nhau được bán và sử dụng cho mục đích kiểm soát nhiều loài sâu hại

khác nhau trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Lịch sử lâu dài của việc sử dụng an

toàn có các sản phẩm từ B. thuringensis được sử dụng như trừ sâu sinh học

(Mendelsohn và cs., 2003). Ngoài ra, (Otvos và cs., 2005) đã chứng minh không tồn

tại nguy cơ đáng kể nào đối với sức khỏe của người liên quan đến việc sử dụng sản

phẩm B.thuringensis trên cây trồng. Việc không tồn tại tác động bất lợi đối với động

vật có vú, bao gồm con người, không chỉ bởi do không tồn tại môi trường pH kiềm

trong ruột và các enzym cần thiết để hoạt hóa δ-endotoxin, mà còn là do sự nhanh

chóng bị phân giải (dưới 1 giờ) của độc chất thành các chất không có tính độc (Otvos

và cs., 2005). Ngoài ra, các bào tử hay tinh thể Bt còn lại sau khi đi qua dạ dày sẽ

được bài tiết, thường là trong vòng vài ngày, và không gây nên bất kỳ tác dụng bất lợi

nào. Các kết quả có được từ nghiên cứu thực nghiệm cũng cho thấy trong tế bào của

động vật có vú không có các thụ quan cụ thể để có thể liên kết với độc chất Bt (Otvos

và cs., 2005).

Tương tự, báo cáo của Chương Trình An Toàn Hóa Học Quốc Tế của Tổ Chức Y

Tế Thế Giới (WHO) về các tiêu chí sức khỏe môi trường đối với Bt kết luận rằng:

“Do cách thức hoạt tính đặc trưng, các sản phẩm Bt không có khả năng gây ra bất kỳ

nguy hại nào đối với con người hoặc các loài động vật có mạch chính khác…” và

“Chưa có bằng chứng nào được ghi nhận về tác động tiêu cực của Bt gây ra đối với

sức khỏe con người khi hiện diện trong nước uống hoặc thực phẩm” (IPCS, 1999).

Các loài Streptomyces được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, và là một phần phổ

biến của sinh quyển trên toàn thế giới. Có rất ít loài Streptomyces liên quan đến các

tác nhân gây bệnh ở người, động vật và thực vật. Có nhiều loài Streptomyces tương tự

như với S. viridochromogenes và nhiều loài trong số đó có chứa gen có trình tự tương

đồng với gen pat (Hérouet và cs., 2005). Đặc trưng enzym tương tự như đối với sản

phẩm là biểu hiện của gen pat đã được xác định có trong ít nhất sáu loài vi khuẩn

khác đến từ năm chi vi khuẩn phổ biến trong đất (Bartsch và Tebbe, 1989) và một số

trong các vi khuẩn này có mang các đoạn vật chất di truyền tương đồng với gen pat.

Tuy nhiên, không có bất kỳ gen hay đoạn vật chất di truyền tương đồng nào trong số

này được báo cáo là có nguy cơ gây độc hay gây dị ứng ở người hoặc động vật

(Kutzner, 1981). Kết luận, việc chuyển nạp gen vào một loại cây trồng bằng một đoạn

vật chất di truyền có nguồn gốc từ S. viridochromogenes, mã hóa việc tổng hợp nên

protein PAT, dự kiến sẽ không dẫn đến việc tạo ra một loại cây trồng chuyển gen có

khả năng gây bệnh, gây độc hoặc gây dị ứng cho con người hay động vật (Hérouet và

cs., 2005).

IV. THÔNG TIN LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN

1. Thông tin liên quan t i đo n DNA chèn.

Ngô 59122 được tạo ra nhờ phương pháp chuyển nạp gen cry34Ab1, cry35Ab1 và

gen phosphinothricin acetyltransferase (pat) bằng cách sử dụng chuyển nạp gen qua vi

khuẩn trung gian Agrobacterium với plasmid PHP17662 có kích thước 50.321 bp; vào

dòng ngô Hi-II. Vùng T-DNA của PHP17662 kích thước 7.390 bp có chứa ba tổ hợp

gen.

- Tổ hợp gen thứ nhất có chứa gen cry34Ab1 có nguồn gốc từ Bt được điều khiển

bởi promoter ubiZM1. Vùng promoter ubiZM1 này cũng bao gồm vùng không được

mã hóa 5’ (UTR) và vùng intron liên quan đến promoter ubiZM1 (Christensen et al.,

1992). Terminator của gen cry34Ab1 có trình tự terminator từ gene ức chế proteinase

(pinII) của Solanumtuberosum (An et al., 1989).

- Tổ hợp gen thứ hai có chứa gen cry35Ab1 cũng từ Bt (Hertig et al., 1991) có

promoter là TAperox có nguồn gốc từ Triticum aestivum và terminator là bản sao thứ

hai của terminator pinII.

- Biểu hiện đồng thời của các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 mang lại sự bảo vệ

chống lại sự phá hại của các loài bọ cánh cứng.

- Tổ hợp gen thứ ba có chứa một phiên bản được sửa đổi của gen pat từ

Streptomyces viridochromogenes (Wohlleben et al., 1988) được điều khiển bởi các

vùng promoter và terminator 35S (CaMV) nguồn gốc từ vi rút khảm bông cải (Guilley

et al., 1982). Gen pat đã được tối ưu hóa biểu hiện của phosphinothricin

acetyltransferase (PAT) ở cây, đem lại khả năng kháng L-isomer của phosphinothricin

(L-PPT), thành phần hoạt tính ở thuốc diệt cỏ glufosinate-ammonium.

Plasmid PHP17662 được cấu tạo như sau:

- Trước tiên, các gen cry34Ab1 và cry35Ab1 mã hóa các protein Cry34Ab1 và

Cry35Ab1 có nguồn gốc từ Bt chủng PS149B1. Các trình tự mã hóa cry34Ab1 và

cry35Ab1 gốc được sửa đổi để biểu hiện tối ưu ở ngô. Các gen cry34Ab1 và

cry35Ab1 được tối ưu hóa ở ngô cùng với gen pat được tối ưu hóa thực vật từ

Streptomyces viridochromogenes và các thành phần điều khiển cần thiết sau đó được

tập hợp và cấy vào một vector trung gian để tạo ra plasmid PHP17661.

- PHP17661 có chứa trình tự T-DNA biên phải được liên kết với promoter ubiZM1,

gen cry34Ab1, terminator pinII, promoter TAperox, gen cry35Ab1, bản sao thứ hai

của terminator pinII, promoter CaMV 35S, gen pat được tối ưu hóa biểu hiện ở thực

vật và terminator CaMV 35S được dung hợp với trình tự T-DNA biên trái;

- Vector mạch chính bao gồm gen kháng spectinomycin (spc), một trình tự ADN

ori colE1có nguồn gốc vi khuẩn, các vị trí cos của thể thực khuẩn lambda, các gen

kháng tetracycline (tetA và tetR), một trình tự ADN oriT có nguồn gốc vi khuẩn,

operon ctl điều khiển nhân vi khuẩn, một trình tự ADN oriV có nguồn gốc vi khuẩn

và các gen mang độc tính (virB, virC1, virC2 và virG) từ Agrobacterium tumefaciens.

- Plasmid PHP17661 chứa trong vi khuẩn Escherichia coli chủng HB101 tiếp hợp

với PHP10523 bao gồm gen kháng tetracycline pSB1 (Komari et al., 1996) chứa

trong vi khuẩn Agrobacterium chủng LBA4404 (Hoekema et al., 1983) bằng tái tổ

hợp tương đồng, tạo thành PHP17662 chứa trong vi khuẩn Agrobacterium chủng

LBA4404. Vùng T-DNA từ plasmid PHP17662 được gắn vào bộ gen ngô trong quá

trình chuyển nạp gen để tạo ra ngô 59122.

2. Miêu tả tính tr ng m i á đặ điểm của ngô chuyển gen 59122 khi so sánh

v i gi n đ i chứng không chuyển gen

- Ngô 59122 được tạo ra nhằm kháng lại các loài gây hại bộ cánh cứng bao gồm sâu

đục rễ ngô có tên gọi là western corn rootworm (WCR, Diabrotica virgifera

virgifera). Tính bảo vệ này được tạo ra bằng cách cấy vào các gen cry34Ab1 và

cry35Ab1 phân lập từ vi khuẩn đất Bacillus thuringensis (Bt). Những gen này lần

lượt mã hóa các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 và chúng cùng bao gồm một

protein tinh thể trừ sâu hoạt tính.

- Ngô 59122 cũng có chứa gen pat được phân lập từ Streptomyces

viridochromogenes mà mã hóa protein PAT. Biểu hiện protein PAT ở ngô 59122

là tính kháng thành phần hoạt tính diệt cỏ glufosinate-ammonium và có chức năng

như một yếu tố đánh dấu để chọn ngô được chuyển nạp gen trong phòng thí

nghiệm.

- Phân tích thành phần hạt ngô sự kiện 59122 cho thấy có giá trị dinh dưỡng và

thành phần tương đương với hạt ngô nền truyền thống. Trong nghiên cứu thành

phần này, các thành phần chính của ngô nguyên hạt sự kiện 59122 được phân tích

và so với thành phần ngô hạt từ các dòng ngô không chuyển gen và có xét tới yếu

tố khác biệt tự nhiên về thành phần do tính khác biệt về di truyền cũng như các

yếu tố địa lý, môi trường. Phân tích gần đúng của các mẫu hạt cho thấy hàm lượng

của các thành phần chính trong hạt ngô sự kiện 59122 và hạt mẫu ngô giống nền

đối chứng không chuyển gen là tương đương và đều nằm trong khoảng giới hạn đã

được công bố trước đây đối với ngô hạt.

- Các đặc điểm nông học của ngô sự kiện 59122 cũng đã được đánh giá và chứng

minh là tương đương hay không khác biệt với các đặc điểm nông học của ngô

truyền thống có nền di truyền tương đương ( Pauli et al., 2015a). Ngô 59122 và

ngô đối chứng có nền di truyền tương đương đã được trồng tại bảy điểm trồng ngô

thương phẩm ở Mỹ và Canada trong mùa vụ 2004 (Buffington, 2005). Các địa

điểm này nằm ở Illinois (hai địa điểm), Iowa (hai địa điểm, Indiana và Ontario,

Canada (hai địa điểm). Theo dõi các đặc điểm nông học (mật độ ban đầu, sức sống

cây con, thời gian phun râu, tung phấn, chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, tỷ lệ

gãy đổ, số lượng cây thu hoạch, giá trị xanh, tỷ lệ bệnh, tỷ lệ hại do sâu, ẩm độ

hạt) trong suốt mùa vụ canh tác, dựa trên các so sánh giá trị trung bình của các chỉ

tiêu đánh giá, kết quả là tương đương giữa ngô sự kiện 59122 và ngô nền đối

chứng.

3. Thông tin về hiện tr ng cấp phép và s d ng sự kiện DAS-59122-7 trên thế

gi i

Hồ sơ các phân tích đánh giá tính an toàn của sự kiện DAS-59122-7 được nộp tới các

cơ quan có thẩm quyền của nhiều quốc gia trên thế giới, và cho tới hiện tại sự kiện

DAS-59122-7 được canh tác và/hoặc sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi tại

13 nước (Bảng 1). Các cấp phép đầu tiên của ngô 59122 bắt đầu vào năm 2005 và kể

từ đó các sản phẩm có chứa ngô 59122 đã được tiêu thụ trên toàn cầu với lịch sử hơn

một thập kỷ sử dụng an toàn. Giấy phép đầu tiên cấp cho sự kiện DAS-59122-7 là vào

năm 2005, và từ đó đến nay sự kiện DAS-59122-7 đã và đang tiếp tục nhận được sự

ủng hộ tích cực sau hơn một thập kỷ sử dụng an toàn của sản phẩm

Bản 1: Danh sách các quốc gia cấp phép trồng và/hoặc sử dụng sự kiện 59122

Qu c gia Lo i hình cấp phép

i ư ng Thực phẩm và/hoặc Thứ n n n i

Úc 2005 (Thực phẩm)

Canada 2005 2005

Trung Quốc 2006

Côlômbia 2011 (Thực phẩm)

2010 (Thức ăn Chăn nuôi)

EU (Liên minh

Châu Âu) 2007

Nhật Bản 2006 2005 (Thực phẩm)

2006 (Thức ăn Chăn nuôi)

Hàn Quốc 2005

Mexico 2005

Philippin 2006

Singapore 2010

Nam Phi 2011

Đài Loan 2005 (Thực phẩm)

Mỹ 2005 2004 (Thực phẩm)

2005 ức ăn Chăn nuôi)

V. ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG CỦA NGÔ SỰ KIỆN 59122 ĐỐI

VỚI SỨC KHOẺ CON NGƯỜI VÀ VẬT NUÔI

1. So sánh sự khác biệt về thành phần in ưỡng giữa ngô sự kiện

DAS-59122-7 đ i chứng truyền th ng không biến đổi gen:

Đánh giá và so sánh thành phần của ngô bị biến đổi gen so với thành phần của

ngô chưa bị biến đổi gen có lịch sử sử dụng an toàn làm thực phẩm và thức ăn chăn

nuôi là một phần quan trọng làm bằng chứng được sử dụng để đánh giá an toàn của

các sản phẩm thực phẩm bị biến đổi gen (Codex Alimentarius Commission, 2008;

OECD, 1993). So sánh thành phần được thực hiện giữa ngô 59122 và ngô đối

chứng chưa bị biến đổi gen để đánh giá liệu ngô 59122 có an toàn và dinh dưỡng

như các giống ngô khác hay không và nó có thể được sử dụng thay thế cho ngô đối

chứng mà không có ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi hay

không(Pauli et al., 2015b). Dựa trên cơ chế tác động của tính trạng, nó được dự

đoán là các protein kháng sâu và côn trùng sẽ không làm thay đổi thành phần của

ngô.

Ngô đối chứng chưa biến đổi gen, có tính tương đồng về gen lớn hơn 94% so

với ngô 59122 được lựa chọn làm mẫu so sánh. Ngô 59122 và ngô đối chứng được

trồng tại bảy địa điểm cánh đồng (hai tại Canada và năm tại Mỹ). Ba mẫu hạt (tại

giai đoạn R6) và ba mẫu lá (tại giai đoạn R4) được thu gom tại từng địa điểm cánh

đồng (21 mẫu riêng biệt đối với hạt hoặc thân) từ ngô 59122 và ngô đối chứng. Các

mẫu được xử lý và các phân tích thành phần chính được đo trong hạt (nguyên tố,

axit béo, axit amin, khoáng chất, vitamin, chất trao đổi thứ cấp và chất kháng dinh

dưỡng) và trong thân (nguyên tố và khoáng chất).

Các phân tích được chọn để đánh giá thành phần được hướng dẫn bằng các

khuyến cáo và thông tin trong văn kiện nhất trí của OECD về các xem xét thành

phần đối với các giống ngô mới (OECD, 2002a). Phân tích hạt ngô bao gồm bất kỳ

sản phẩm đã chế biến từ hạt được sử dụng làm thực phảm và thức ăn chăn nuôi;

phân tích thức ăn tươi của ngô bao gồm sử dụng thân lá cũng như xử lý trong ủ

xilô. Thông tin chi tiết liên quan đến vật liệu và các phương pháp được sử dụng để

phân tích thành phần dinh dưỡng được trình bày trong Phụ lục I.

Phân tích dữ liệu thống kê thành phần dinh dưỡng để đánh giá những khác biệt

về các giá trị trung bình đối của ngô 59122 so với ngô đối chứng. Phân tích thống

kê sử dụng mô hình kết hợp tuyến tính đối với mỗi phân tích riêng biệt và đối chiếu

với các kết quả dương sai trên tất cả các phân tích bằng cách sử dụng phương pháp

tỷ lệ phát hiện sai (FDR) (Benjamini and Hochberg, 1995; Westfall et al., 1999).

Tổng cộng có 66 phân tích (10 phân tích từ thân lá cây và 56 phân tích từ hạt) được

sử dụng trong đánh giá thành phần dinh dưỡng. Tổng cộng 63 phân tích được thống

kê phân tích bằng mô hình hỗn hợp tuyến tính. Không có thống kê phân tích nào

được thực hiện đối với vitamin B2, β-tocopherol và furfural ở hạt vì tất cả các giá

trị mẫu đều nằm dưới ngưỡng LLOQ.

Không có sự chênh lệch nào có ý nghĩa thống kê giữa ngô 59122 và ngô đối

chứng đối với 62 trong số 63 phân tích trên các địa điểm. Đối với nguyên tố P ở

thân lá, quan sát được chênh lệch có ý nghĩa thống kê tại các địa điểm giữa ngô

59122 và ngô đối chứng. Tất cả các giá trị mẫu P đối với thân lá ngô 59122 đều

nằm trong khoảng biên độ, điều đó cho thấy rằng ngô 59122 nằm trong khoảng

biến thiên thông thường, và chênh lệch thống kê không có nghĩa liên quan sinh học.

Nhìn chung, các kết quả đánh giá thành phần đã chứng minh rằng thành phần

dinh dưỡng của hạt và lá ngô 59122 tương đương với của ngô chưa bị biến đổi gen

và ngô 59122 cũng an toàn và có giá trị dinh dưỡng như ngô chưa bị biến đổi gen

để sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Pauli et al., 2015b).

2. Đán iá ả chuyển hóa các thành phần in ưỡn đặc biệt là các chất

m i là sản phẩm biểu hiện của gen chuyển nế được s d ng làm thực

phẩ TĂC

Đánh giá tương đương về thành phần của một sản phẩm biến đổi gen so với

của một sản phẩm không biến đổi gen, cùng với lịch sử sử dụng an toàn làm thực

phẩm và TĂCN là một phần rất quan trọng bằng chứng được sử dụng để khẳng

định tính an toàn của các sản phẩm cây trồng chuyển gen (Codex Alimentarius

Commission, 2008; OECD, 1993). Các so sánh thành phần được tiến hành và mô tả

chi tiết tại mục V.1. (Pauli et al., 2015b) giữa ngô sự kiện DAS-59122-7 và ngô

nền đối chứng cho kết quả ngô sự kiện DAS-59122-7 có tính an toàn và có dinh

dưỡng tương đương với các giống ngô truyền thống, hoàn toàn có thể được sử dụng

cho các mục đích thay thế mà không có nhiều hơn bất kỳ nguy cơ ảnh hưởng tiêu

cực nào đối với sức khỏe con người, vật nuôi. Trên cơ sở các hiểu biết về cơ chế

hoạt động của gen đích trong mỗi sự kiện, có thể dự đoán các protein có đặc tính

kháng côn trùng và kháng thuốc diệt cỏ sẽ không làm thay đổi thành phần của ngô.

3. Đán iá ả n n độc tính củ p o ein C y34Ab1 C y35Ab1 PAT đã

được cấy vào nếu s d ng làm thực phẩ TĂC

Độc tính tiềm tàng của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT được đánh

giá bằng cách sử dụng hàng loạt các nghiên cứu bao gồm bằng cách sử dụng các

phân tích độc tính cấp tính đườn miệng, phân tích in silico, cũng như phân tích tính

bền nhiệt

Các kết quả của những nghiên cứu này chứng minh rằng các protein không phải là

các độc tố.

Tính tương đương của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT có nguồn gốc

từ ngô 59122 và các hệ thống vi sinh vật

Để có đủ lượng các protein tinh khiết cho các nghiên cứu cần thiết để đánh giá

tính an toàn của chúng, các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 được tạo ra trong

Pseudomonas fluorescens và protein PAT được tạo ra trong Escherichia coli. Sự

tương đương về các đặc điểm sinh hóa và hoạt tính sinh học giữa các protein

Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT có nguồn gốc từ vi khuẩn và các protein Cry34Ab1,

Cry35Ab1 và PAT được biểu hiện ở ngô 59122 được mô tả bằng cách sử dụng

phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) và các

kỹ thuật phân tích western blot.

Các kết quả của SDS-PAGE và phân tích western blot của protein Cry34Ab1

được biểu hiện ở mô lá ngô 59122 và Pseudomonas fluorescens. Như dự đoán,

protein Cry34Ab1 được phát hiện là một nhóm đơn xấp xỉ 14 kDa và tương đồng

với nhóm protein Cry34A1 đơn xấp xỉ 14kDa từ vi sinh vật (Schafer et al., 2003;

Figure 4b.2). Không có protein miễn dịch được phát hiện trong các mô đối chứng

âm.

Protein Cry35Ab1 phát hiện được bằng SDS-PAGE và phân tích western blot ở

lá ngô 59122 tồn tại ở cả hai nhóm, một nhóm 44-kDa và một nhóm xấp xỉ 40 kDa,

gọi chung là “doublet”. Nghiên cứu của Gao et al. (2000) đã chỉ ra rằng protein

Cry35Ab1 ban đầu được biểu hiện là một protein đầy đủ chiều dài 44 kDa và

protein sau đó được tách tạo thành đoạn bị cắt ngắn 40 kDa. Như đã biết, các nội

độc tố Bt nhạy cảm với protease tách ra, quá trình này có thể tạo ra các dạng bị cắt

ngắn của protein (Schnepf et al., 1998). Phân tích trình tự axit amin đầu N của

protein Cry35Ab1 nguyên và được cắt ngắn đã được loại bỏ khỏi mô ngô chỉ ra

rằng cả hai đều có trình tự đầu N tương tự, điều đó cho thấy rằng quá trình cắt ngắn

đã xảy ra tại đầu C (Gao et al., 2000). Do vậy, doublet tạo ra từ việc cắt đầu C

bằng protease của ngô biểu hiện protein Cry35Ab1.

Phân tích protein vi khuẩn PAT bằng SDS-PAGE đã chứng minh rằng protein

này có trong mẫu, tạo ra một nhóm với khối lượng phân tử mong đợi là xấp xỉ 21

kDA (Hình 4b.4; Schafer và Collins, 2003; Korjagin 2000; (OECD, 1999a). Ngoài

ra, protein PAT có nguồn gốc từ vi khuẩn và tất cả năm chiết xuất lá của mô lá ngô

59122 đều chỉ ra dấu hiệu dương tính bằng phân tích westn blot. Dấu hiệu phản

ứng miễn dịch của mỗi chiết xuất cây là tương tự nhau. Ngoài ra, không quan sát

thấy protein miễn dịch nào trong các mẫu đối chứng và không quan sát thấy protein

kích cỡ tương tự.

Đánh giá độc tính cấp đường miệng của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và

PAT

Các nghiên cứu độc tính cấp đường miệng được thực hiện với các protein

Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT ở chuột.

Protein Cry34Ab1 được đánh giá về độc tính cấp đường miệng và liều lượng

được thử nghiệm là 5.000 mg Cry34Ab1/mỗi kg thể trọng (giá trị quy đổi ra protein

tinh 54% tinh khiết; (54% pure; Brooks and DeWildt, 2000a) liều lượng sử dụng sẽ

là 2.700 mg protein Cry34Ab1 mỗi kg thể trọng. Trong thời gian quan sát 2 tuần,

ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hoặc hành vi của bệnh học cũng như thể

trọng cơ thể được thực hiện trong suốt thời gian nghiên cứu. Các kết quả cho thấy

không ghi nhận trường hợp tử vong nào trong quá trình nghiên cứu. Ngoài ra, cũng

không quan sát thấy có biểu hiện lâm sàng tiêu cực nào trong nghiên cứu và không

ghi nhận bằng chứng bất lợi lưu ý nào từ giải phẫu. Vơi liều lượng tương đối cao

được thử nghiệm trong nghiên cứu này hoàn toàn không gây nên bất kỳ vấn đề nào

về độc tính và do đó không thể xác định được LD50 cấp tính đối với protein

Cry34Ab1 ở chuột ngoài việc ước tính được giá trị cao hơn 2.700 mg Cry34Ab1/

mỗi kg thể trọng (Brooks and DeWildt, 2000a).

Protein Cry35Ab1 được đánh giá về độc tính cấp đường miệng và liều lượng

được thử nghiệm là 5.000 mg /mỗi kg thể trọng (Brooks and DeWildt, 2000b), liều

lượng sử dụng là 1.850 mg protein Cry35Ab1/mỗi kg thể trọng. Trong thời gian

quan sát 2 tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hoặc hành vi của bệnh học

cũng như thể trọng cơ thể được thực hiện trong suốt thời gian nghiên cứu. Các kết

quả cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong nào trong quá trình nghiên cứu.

Ngoài ra, cũng không quan sát thấy có biểu hiện lâm sàng tiêu cực nào trong

nghiên cứu và không ghi nhận bằng chứng bất lợi lưu ý nào từ giải phẫu. Vơi liều

lượng tương đối cao được thử nghiệm trong nghiên cứu này hoàn toàn không gây

nên bất kỳ vấn đề nào về độc tính và do đó không thể xác định được LD50 cấp tính

đối với protein Cry34Ab1 ở chuột ngoài việc ước tính được giá trị cao hơn 1.850

mg Cry35Ab/ mỗi kg thể trọng.

Hỗn hợp protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 được đánh giá về độc tính cấp đường

miệng ở chuột và liều lượng được thử nghiệm là 5.000 mg /mỗi kg thể trọng (giá trị

quy đổi ra protein tinh 54% tinh khiết đối với protein Cry34Ab1 và 37% tinh khiết

đối với protein Cry35Ab1; (Brooks and DeWildt, 2000c), hỗn hợp này gồm 482

mg protein Cry34Ab1/ mỗi kg thể trọng và 1.520 mg protein Cry35Ab1/ mỗi kg

thể trọng. Trong thời gian quan sát 2 tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng

hoặc hành vi của bệnh học cũng như thể trọng cơ thể được thực hiện trong suốt thời

gian nghiên cứu. Các kết quả cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong nào

trong quá trình nghiên cứu. Ngoài ra, cũng không quan sát thấy có biểu hiện lâm

sàng tiêu cực nào trong nghiên cứu và không ghi nhận bằng chứng bất lợi lưu ý nào

từ giải phẫu. Với liều lượng tương đối cao được thử nghiệm trong nghiên cứu này

hoàn toàn không gây nên bất kỳ vấn đề nào về độc tính. Do đó, không thể xác định

LD50 cấp tính đường miệng đối với hỗn hợp các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 ở

chuột và chỉ ước tính được cao hơn 2.000 mg/kg thể trọng của một hỗn hợp đẳng

phân tử của các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1(Brooks and DeWildt, 2000c).

Protein PAT được đánh giá về độc tính cấp đường miệng và liều lượng được

thử nghiệm là 6.000 mg/ mỗi kg thể trọng (giá trị quy đổi ra protein tinh là 84%

tinh khiết; (Brooks, 2000), liều lượng là 5.000 mg protein PAT/ mỗi kg thể trọng.

Trong thời gian quan sát 2 tuần, ghi chép tỷ lệ tử vong và/hoặc lâm sàng hoặc hành

vi của bệnh học cũng như thể trọng cơ thể được thực hiện trong suốt thời gian

nghiên cứu. Các kết quả cho thấy không ghi nhận trường hợp tử vong nào trong

quá trình nghiên cứu. Ngoài ra, cũng không quan sát thấy có biểu hiện lâm sàng

tiêu cực nào trong nghiên cứu và không ghi nhận bằng chứng bất lợi lưu ý nào từ

giải phẫu. Vơi liều lượng tương đối cao được thử nghiệm trong nghiên cứu này

hoàn toàn không gây nên bất kỳ vấn đề nào về độc tính.. Do đó, không thể xác định

được LD50 cấp tính đường miệng đối với protein PAT ở chuột và chỉ ước tính

được hàm lượng cao hơn 5.000 mg PAT/ mỗi trọng lượng cơ thể.

Tóm lại, các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT không có độc tính cấp ở

chuột (Hérouet et al., 2005; Juberg et al., 2009; US-EPA, 2010). Thông tin chi tiết

liên quan đến vật liệu và các phương pháp được sử dụng để phân tích độc tính cấp

đường miệng được trình bày trong Ph l c D.

Đánh giá độc tính in silico (tin sinh học) của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1

và PAT ở ngô 59122

So sánh và sàng lọc với các protein tiềm ẩn độc tính cũng là một tiêu chí quan

trọng được sử dụng trong tìm kiếm bằng chứng chứng minh tính an toàn của các

protein đích trong các sản phẩm cây trồng chuyển gen (Codex Alimentarius

Commission, 2003) . Độc tính tiềm tàng của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và

PAT được thực hiện bằng cách so sánh các trình tự chuỗi của các protein này với

các chuỗi đã biết trong các cơ sở dữ liệu. Ngân hàng dữ liệu về protein chính được

sử dụng thuộc Viện Thông Tin Công Nghệ Sinh Học Quốc Gia (National Institute

for Biotechnology Information, NCBI) (cập nhật tới ngày 2 tháng 1, 2014)

(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Đối với mỗi protein (Cry34Ab1, Cry35Ab1

và PAT), được tiến hành tìm kiếm so sánh bằng sử dụng công cụ phần mềm tìm

kiếm so sánh chuỗi BLASTP (phiên bản 2.2.25) để đưa ra kết quả là số lượng các

chuỗi và mức độ tương đồng giữa protein đích và các protein trong cơ sở dữ

liệu. Chương trình BLASTP được sử dụng với thiết lập ban đầu là các tham số mặc

định, ngoại trừ việc đặt ngưỡng giá trị E là 1.0, thể hiện tính thận trọng cao trong

phép tìm kiếm so sánh (Pearson, 2000). Các kết quả là các chuỗi có trình tự tương

đồng sẽ được kiểm tra thủ công để kiểm chứng lại mối nguy cơ gây độc nếu có

(Baxevanis, 2005; Pearson and Lipman, 1988).

Kết quả tìm kiếm so sánh cho thấy không phát hiện có sự tương đồng đáng kể

nào về trình tự các chuỗi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT với các protein gây

độc đã xác định hay các trình tự đoạn độc tiềm ẩn (ngoại trừ những các kết quả

tương đồng giữa trình tự chuỗi protein Cry1F đích với các trình tự protein Cry như

dự kiến), chứng tỏ không có nguy cơ rõ ràng nào về tính độc của các protein

Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT này (Chang and Mirksy, 2014; Mirsky, 2014).

Phân tích tính bền nhiệt của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT

Sự ngừng hoạt động của các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 dưới tác động

nhiệt đã được kiểm chứng bằng sự mất đi hoạt tính sinh học, chẳng hạn độc tính

với sâu đục rễ southern corn rootworm (Diabrotica undecimpunctata howardi) sau

khi phơi nhiễm với xử lý nhiệt. Trong một nghiên cứu (Herman, 2000) các công

thức ngậm nước của Bt protein tinh thể trừ sâu (ICP) Cry34/35Ab1 được ủ ở nhiệt

độ 60, 75, hoặc 90oC trong 30 phút. Sau khi ủ, southern corn rootworm non dạng

ấu trùng được phơi nhiễm với các chất nền ăn thô nhân tạo đã được xử lý với các

mẫu được ủ ICP. Sự tử vong và trọng lượng côn trùng được đo sau 6 ngày và sự ức

chế sinh trưởng được tính dựa trên so sánh với các đối chứng âm. Các kết quả chỉ

ra rằng ICP bị mất hoạt tính sau khi phơi nhiễm với các nhiệt độ. Nghiên cứu thứ

hai (Herman, 2002) được thực hiện để kiểm chứng sự không ổn định nhiệt của từng

protein thành phần (Cry34Ab1 và Cry35Ab1) bằng cách tăng cường các mẫu được

gia nhiệt của ICP với các mẫu không được gia nhiệt của từng protein thành phần.

Điều này cho phép xác định sự không ổn định nhiệt của protein bổ sung vì cả hai

protein đều cần thiết để có đặc hiệu tối đa với các sâu đục rễ ngô (Herman and

Hunst, 2002). Dựa trên sự tổn thất đáng kể về hoạt tính của ICP khi có và không

có Cry35Ab1 không được gia nhiệt tại các nhiệt độ 60, 75 và 90 oC, Cry35Ab1 và

ICP đã chứng minh sự không ổn định nhiệt đáng kể. Protein Cry34Ab1 cũng cho

thấy sự không ổn định nhiệt tương tự trong nghiên cứu này; tuy nhiên, một số chất

dư Cry34Ab1 âm được nhận thấy ở 60 và 75 oC. Hoạt tính này không thể phân biệt

với các tác động nền sau khi phơi nhiễm với 90 oC, điều đó cũng chỉ ra có sự không

ổn định nhiệt đáng kể đối với protein Cry34Ab1.

Protein PAT được thử nghiệm về tính ổn định lần lượt ở nhiệt độ 60, 75 và 90

°C trong các khoảng thời gian 10, 30 và 60 phút (Hérouet et al., 2005). Các protein

tạo thành được phân tích bằng SDS-PAGE. Protein PAT vẫn có thể phát hiện được

bằng SDS-PAGE, chẳng hạn, không có sự suy giảm protein tại tất cả các nhiệt độ

và thời điểm thử nghiệm. Những kết quả này đã được chứng minh bằng các kết

quả mà Wehrmann et al. (1996) thu được cho thấy rằng protein PAT hoàn toàn

không còn hoạt tính do tác động nhiệt sau 10 phút ở 50 °C hoặc nhiệt độ cao hơn

bất chấp thực tế là protein không bị suy giảm.

Các kết quả từ các đánh giá tính không ổn định nhiệt chứng minh rằng các

protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT không ổn định ở nhiệt độ cao và các protein

Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT sẽ bị mất hoạt tính do nhiều quy trình liên quan đến

chế biến thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi (Herman, 2000; Herman, 2002;

Hérouet et al., 2005).

4. Đán iá ả n n ây ứng của các chất m i là sản phẩm biểu hiện của

gen chuyển nế được s d ng làm thực phẩm, thứ n n n i

Khả năng gây dị ứng của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT được đánh

giá bằng cách sử dụng hàng loạt các nghiên cứu bao gồm phân tích in silico (tin

sinh học), tính dễ bị tiêu hóa, phân tích glycosyl hóa. Các kết quả của những

nghiên cứu này chứng minh rằng các protein không phải là các chất gây dị ứng.

Đánh giá in silico khả năng gây dị ứng của các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1

và PAT ở ngô 59122

So sánh và sàng lọc với các protein tiềm ẩn nguy cơ gây dị ứng cũng là một

trong những cách thức quan trọng được sử dụng trong tìm kiếm bằng chứng chứng

minh tính an toàn của các protein đích trong các sản phẩm cây trồng chuyển gen

(Codex Alimentarius Commission, 2003). Đánh giá nguy cơ gây dị ứng của các

protein Cry1F và PAT được thực hiện bằng cách so sánh các trình tự chuỗi của các

protein này với các chuỗi là tác nhân gây dị ứng đã biết hoặc với chuỗi tiềm ẩn

nguy cơ gây dị ứng trong các cơ sở dữ liệu (Chang and Mirksy, 2014; Krauss,

2014b; Krauss, 2014a).

Đối với mỗi protein (Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT), các bước tìm kiếm so

sánh được tiến hành theo các hướng dẫn về đánh giá khả năng gây dị ứng hiện

hành (Codex Alimentarius Commission, 2003; FAO/WHO, 2001) bao gồm (1)

Mức tương đồng trong trình tự chuỗi của protein đích với các trình tự chuỗi tác

nhân gây dị ứng tối thiểu phải là 35% và chiều dài chuỗi tìm được phải bằng hoặc

lớn hơn 80 a.a; và (2) có sự giống nhau hoàn toàn của ít nhất 8 axit amin liên tục

trong trình tự của cả chuỗi protein đích và chuỗi tác nhân gây dị ứng. Sử dụng

chương trình tìm kiếm so sánh FASTA v35.4.4 với thiết lập là các tham số mặc

định. Phép tìm kiếm kết quả khớp chính xác của trình tự 8 axít amin được tiến bằng

cách sử dụng phần mềm do công ty DuPont Pioneer phát triển, cho phép tìm ra tất

các các đoạn chứa 8 axít amin hoàn toàn giống nhau trên cả protein đích và của tác

nhân gây dị ứng và cho phép so sánh trình tự của từng chuỗi protein đích với toàn

bộ các chuỗi tác nhân gây dị ứng có trong cơ sở dữ liệu.

Kết quả so sánh trình tự của từng chuỗi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT

với trình tự chất gây dị ứng AllergenOnline v14 không cho thấy có các liên kết

vượt quá ngưỡng và cũng không tìm thấy đoạn polypeptide nào chứa đầy đủ trình

tự 8 a.a trùng hợp với trình tự chuỗi protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 hay PAT. Do

vậy, có thể kết luận các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT là sản phẩm biểu

hiện của gen đích không có khả năng hay không phải là nguy cơ gây dị ứng khi

được sử dụng làm thực phẩm, TĂCN (Chang and Mirksy, 2014; Krauss, 2014b;

Krauss, 2014a).

Sự phân giải của protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT trong phản ứng mô

phỏng dịch dạ dày

Khả năng tiêu hóa của các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 được nghiên cứu

thông qua các thí nghiệm phản ứng mô phỏng dịch dạ dày (SGF) (Herman et al.,

2003)

Protein Cry34Ab1 được đánh giá bằng cách cho ủ nhiệt với dịch dạ dày mô

phỏng SGF trong những khoảng thời gian nhất định và sau đó được phân tích bằng

SDS-PAGE (Brussock và Currier, 1990) và phân tích lai Western blot. Lý thuyết

enzim cổ điển phát biểu rằng khi enzim (chẳng hạn: pepsin) tồn tại ở nồng độ cao

hơn đáng kể so với chất nền (chẳng hạn: protein Cry34Ab1), sự thoái biến được dự

đoán được thể hiện ở mô hình bậc 1 và do vậy có thể ước tính thời điểm phân hủy

như các giá trị DT90 (thời gian cho đến khi tiêu hóa 90%) (Rawn, 1989). Như dự

đoán, dữ liệu thực nghiệm thu được từ các thí nghiệm SGF, Cry34Ab1 có khả năng

tái sinh sản cao . Không quan sát thấy đoạn nào được cắt bởi Cry34Ab1 trong SGF

và thu được giá trị DT90 nhỏ hơn 7 phút đối với protein Cry34Ab1 trong SGF.

Phân tích Glycosyl hóa

Các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1

Glycosyl hóa các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 biểu hiện ở ngô 59122

được xác định bằng cách sử dụng các phương pháp nhuộm glycoprotein (Schafer,

et al., 2003). Các mẫu protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1 có nguồn gốc từ ngô

59122, đối chứng dương (horseradish peroxidase) và đối chứng âm (chất ức chế

trypsin đậu nành) được phân tách bằng SDS-PAGE. Gel sau đó được nhuộm bằng

Bộ GelCode Glycoprotein để phát hiện các glycoprotein. Như đã minh họa ở

Hình 4d.6, kết quả phân tích glycosyl hóa không phát hiện dấu hiệu nào chứng tỏ

các protein Cry34Ab1 hoặc Cry35Ab1 có nguồn gốc từ ngô 59122 không bị

glycosyl hoá . Những kết quả này khớp với các kết quả từ một nghiên cứu (Gao et

al, 2000) khi không phát hiện glycosyl hóa ở các protein Cry34Ab1 và Cry35Ab1

có nguồn gốc từ ngô 59122 và Pseudomonas fluorescens.

Protein PAT

Glycosyl hóa protein PAT biểu hiện ở ngô 59122 được xác định bằng cách sử

dụng Bộ Glyco-Profile III (Hérouet et al., 2005). Các protein PAT có nguồn gốc từ

Escherichia coli và các thực vật cũng như các đối chứng dương và âm được phân

tách bằng SDS-PAGE. Gel sau đó được nhuộm bằng Bộ Glyco-Profile III để quan

sát các glycoprotein. Chỉ các protein tiêu chuẩn được glycosyl hóa (α´1-acidic

glycoprotein và avidin) cho dấu hiệu rõ ràng với chất nhuộm màu glycoprotein.

Không phát hiện glycosyl hóa đối với các protein PAT.

Các kết quả từ các thí nghiệm nhuộm glycoprotein đã chứng minh các protein

Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT không bị glycosyl hóa (Hérouet et al., 2005; Schafer

et al., 2003).

5 Đán iá ả n n ìn n á ợp chất m i, khả n n ây bệnh hoặc

á á động bất lợi á đến sức khoẻ on n ư i và vật nuôi

Qua các phân tích đánh giá, phân tích thành phần chứng minh hạt ngô sự kiện

59122 giầu dinh dưỡng và có thành phần và hàm lượng chất tương đương với ngô hạt

(giống nền) truyền thống không chuyển gen; Không có căn cứ hay bằng chứng nào

thể hiện có bất kỳ chất mới nào là sản phẩm của sự kết hợp giữa gen cry34Ab1,

cry35Ab1 và pat trong ngô sự kiện 59122. Kết quả từ các nghiên cứu độc tính cấp

trên chuột sử dụng thức ăn trộn protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT chứng minh

các protein này không có nguy cơ gây độc đối với người hay các loài động vật có

mạch chính (Brooks, 2000; Kuhn, 1998; Shanahan, 1999); Không có sự tương đồng

hay trùng lặp trong trình tự chuỗi axít amin của protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT

khi so với các chất gây độc, hay chất gây dị ứng từng được biết tới. Do vậy, có thể kết

luận các protein Cry34Ab1, Cry35Ab1 và PAT, là sản phẩm biểu hiện của gen

cry34Ab1, cry35Ab1 và pat được chuyển nạp vào trong ngô sự kiện 59122, không có

khả năng hay không phải là nguy cơ gây bệnh hay tác động bất lợi nào khác, nếu có,

đối với sức khỏe con người, vật nuôi khi được sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn

nuôi

VI. ĐỀ XUẤT CÁC BIỆN PHÁP QUẢN LÝ RỦI RO TIỀM ẨN CỦA THỰC

VẬT BIẾ ĐỔI GE ĐỐI VỚI SỨC KHỎE CO GƯỜI, VẬT NUÔI

Phân tích các đặc điểm của ngô 59122 đã chỉ ra rằng rủi ro của tác động tiêu

cực tiềm ẩn đối với sức khỏe con người và vật nuôi từ việc sử dụng ngô 59122 làm

thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là thấp và không cần phải có các chiến lược cụ thể

đối với quản lý rủi ro. Khuyến cáo quản lý ngô 59122 sẽ không khác với ngô

truyền thống, chưa biến đổi gen sau khi được phê duyệt sử dụng làm thương

phẩm.

Công ty TNHH Pioneer Hi-Bred Việt Nam cam kết tuân thủ đầy đủ các quy

định tại Thông tư số 02/2014/TT-BNNPTNT ngày 24/01/2014 của Bộ Nông

nghiệp và PTNT cũng như các quy định hiện hành khác về an toàn sinh học đối

với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen,

các quy định về sản xuất, kinh doanh sản phẩm tại Việt Nam.

Công ty cam kết thực hiện đầy đủ các yêu cầu về xây dựng kế hoạch quản lý

ngay khi nhận được yêu cầu từ các cơ quan quản lý của Việt Nam đối với tất cả

các các sản phẩm chuyển gen kiểm soát côn trùng của công ty, bao gồm sự kiện

59122, trong sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Cụ thể:

- Định kỳ hàng năm báo cáo cập nhật thông tin về cấp phép mới, ra hạn hay thu

hồi cấp phép sử dụng sự kiện 59122 ở các quốc gia trên thế giới, gửi về Bộ Nông

nghiệp và PTNT.

- Báo cáo Bộ Nông nghiệp và PTNT cập nhật thông tin khoa học, kỹ thuật mới

liên quan tới rủi ro hay tính không an toàn, nếu có, trong sử dụng sự kiện 59122

làm thực phẩm, TĂCN.

- Tuân thủ và thực thi đầy đủ các yêu cầu của pháp luật và các quy định hiện

hành của Việt Nam về an toàn sinh học, quản lý rủi ro đối với sinh vật biến đổi

gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen.

- Báo cáo Bộ Nông nghiệp và PTNT khi phát sinh vấn đề liên quan đến an toàn

sức khỏe người, vật nuôi trong sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ ngô sự kiện

59122 và cùng phối hợp xử lý

VII. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận:

Ngô 59122 được phát triển bằng cách sử dụng quá trình chuyển nạp gen gián

tiếp bởi Agrobacterium, tạo ra một sản phẩm chống lại một số loài sâu hại bọ cánh

cứng và kháng glufosinate. Các sinh vật cho gen cung cấp các gen đã được sử

dụng để tạo ra ngô 59122 có lịch sử sử dụng an toàn làm thực phẩm và thức ăn

chăn nuôi. Ngô truyền thống và ngô 59122 có lịch sử sử dụng an toàn và ngô

59122 đã được các cơ quan quản lý chính phủ cấp phép tại 13 nước khác nhau.

2. Đề ngh :

Trên cơ sở các số liệu, phân tích và kết luận tại hồ sơ này, công ty TNHH

Pioneer Hi-Bred Việt Nam kính đề nghị Bộ Nông nghiệp và PTNT thẩm định, phê

duyệt và cấp “Giấy xác nhận thực vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực

phẩm, thức ăn chăn nuôi” đối với sự kiện DAS-59122-7.

Tp Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 12 năm 2015

Tổ chứ đ n : C n y T HH Pionee Hi-Bred Vietnam