РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБАПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,

ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(51) МПКC07K 14/435 (2006.01)

(19) RU (11) 2 422 459(13) C1

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2010122215/10, 01.06.2010

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 01.06.2010

Приоритет(ы):(22) Дата подачи заявки: 01.06.2010

(45) Опубликовано: 27.06.2011 Бюл. № 18

(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске: BROTHERTON-PLEISS C.E. ET AL.,

Discovery and optimization of RO-85, a noveldrug-like, potent, and selective P2X3 receptorantagonist, Bioorg Med Chem Lett., 2010 Feb,v.20, no.3, p.1031-6. US 7,491,821, 17.02.2009.US 7,595,405, 29.09.2009. US 7,589,090,15.09.2009. VIRGINIO С. ET AL.,Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potentantagonists (см. прод.)

Адрес для переписки:117997, Москва, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, ИБХ РАН, патентный отдел

(72) Автор(ы):Василевский Александр Александрович(RU),Савченко Ганна Анатолиевна (UA),Королькова Юлия Владимировна (RU),Бойчук Ярослав Анатолиевич (UA),Плужников Кирилл Андреевич (RU),Крышталь Олег Александрович (UA),Гришин Евгений Васильевич (RU)

(73) Патентообладатель(и):Учреждение Российской академии наукИнститут биоорганической химии им.академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (RU)

(54) ПЕПТИДНЫЙ МОДУЛЯТОР ПУРИНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ(57) Реферат:

Изобретение относится к областибиотехнологии, конкретно к биологическиактивному пептиду. Пептид обладаетмодулирующим действием на участвующие вгенерации нервного сигнала клеточныерецепторы. Данный пептид имеетаминокислотную последовательность: Gly1-Tyr 2-Cys3-Ala4-Glu5-Lys6-Gly7-Ile8-Arg9-

Cys10-Asp11-Asp12-Ile13-His14-Cys15-Cys16-Thr17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Lys22-Cys23-Asn24-Ala25-Ser26-Gly27-Tyr28-Asn29-Cys30-Val31-Cys32-Arg33-Lys34-Lys35. Предложенноеизобретение может быть использовано вмедицине для изучения механизмоввозникновения боли, а также для обнаруженияи тестирования новых модуляторов рецептораР2Х3. 7 ил., 1 табл.

(56) (продолжение):selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors, Mol Pharmacol., 1998, v.53, no.6, p.969-73. FORDK.K. ET AL., The P2X3 antagonist P1, P5-di[inosine-5′] pentaphosphate binds to the desensitized state ofthe receptor in rat dorsal root ganglion neurons, J Pharmacol Exp Ther., 2005, v.315, no.1, p.405-13.

Ñòð.: 1

ru

RU

2422459

C1

1C

95

42

24

2U

R

RUSSIAN FEDERATION

FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY,PATENTS AND TRADEMARKS

(51) Int. Cl.C07K 14/435 (2006.01)

(19) RU (11) 2 422 459(13) C1

(12) ABSTRACT OF INVENTION

(21)(22) Application: 2010122215/10, 01.06.2010

(24) Effective date for property rights: 01.06.2010

Priority:(22) Date of filing: 01.06.2010

(45) Date of publication: 27.06.2011 Bull. 18

Mail address:117997, Moskva, GSP-7, V-437, ul. Miklukho-Maklaja, 16/10, IBKh RAN, patentnyj otdel

(72) Inventor(s): Vasilevskij Aleksandr Aleksandrovich (RU),Savchenko Ganna Anatolievna (UA),Korol'kova Julija Vladimirovna (RU),Bojchuk Jaroslav Anatolievich (UA),Pluzhnikov Kirill Andreevich (RU),Kryshtal' Oleg Aleksandrovich (UA),Grishin Evgenij Vasil'evich (RU)

(73) Proprietor(s): Uchrezhdenie Rossijskoj akademii nauk Institutbioorganicheskoj khimii im. akademikov M.M.Shemjakina i Ju.A. Ovchinnikova RAN (RU)

(54) PEPTIDE PURINOCEPTOR MODULATOR(57) Abstract:

FIELD: medicine, pharmaceutics.SUBSTANCE: invention refers to biotechnology,

particularly to a biologically active peptide. Thepeptide exhibits a modulating action on end-organsinvolved in nerve signal generation. The givenpeptide has an amino acid sequence: Gly1-Tyr2-Cys3-Ala4-Glu5-Lys6-Gly7-lle8-Arg9-Cys10-

Asp11-Asp12-Ile13-His14-Cis16-Thr17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Lys22-Cys23-Asn24-Ala25-Ser26-Gly27-Tyr28-Asn29-Cys30-Val31-Cys32-Arg33-Lys34-Lys35.

EFFECT: invention can be used in medicine forstudying the pain mechanisms, and also for detectionand testing of new P2X3 receptor modulators.

7 dwg, 1 tbl, 7 ex

Ñòð.: 2

en

RU

2422459

C1

1C

95

42

24

2U

R

RU 2 422 459 C1

Изобретение относится к биохимии, конкретно к биологически активнымполипептидам, которые обладают модулирующим действием на участвующие вгенерации болевого сигнала клеточные рецепторы и могут найти применение вмедицине и научных исследованиях.

Согласно современным представлениям мембранные белки, обуславливающиепередачу сигналов (различные рецепторы и ионные каналы), играют важнейшую рольв жизнедеятельности клеток. Нарушение работы рецепторных систем может бытьпричиной заболеваний и патологий. Одной из актуальных проблем современнойфизиологии, биоорганической химии и смежных наук является направленнаярегуляция функции клеточных рецепторов/ионных каналов с помощью селективноговоздействия на эти мембранные белки. Пептидные токсины, содержащиеся вприродных ядах и способные специфично воздействовать на потенциал-зависимыенатриевые, кальциевые, калиевые каналы а также механо-, термо- и хемовозбудимыеканалы, относящиеся к большой группе так называемых болевых рецепторов,являются мощным инструментом для структурных и функциональных исследований, атакже основой для создания новых эффективных обезболивающих средств [Lewis R.J.,Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov., 2003, V.2,P.790-802].

В настоящее время известен ряд компонентов природных ядов, которые оказываютобезболивающее действие, многие из них находятся на стадии клинических илидоклинических испытаний. Так, анальгетической активностью обладают: α-конотоксин Vc1.1, действующий на нейрональные никотиновые ацетилхолиновыерецепторы [dark R.J. et al. The synthesis, structural characterization, and receptorspecificity of the alpha-conotoxin Vc1.1 // J. Biol. Chem., 2006, Vol.281, P.23254-23263; US7,348,400]; ω-конотоксины MVIIA (SNX-111) и CVID (AM-336), являющиесяблокаторами кальциевых каналов [Olivera B.M. et al. Neuronal calcium channelantagonists. Discrimination between calcium channel subtypes using omega-conotoxin fromConus magus venom // Biochemistry, 1987, Vol.26, P.2086-2090; Nielsen K.J. et al. Structure-activity relationships of omega-conotoxins at N-type voltage-sensitive calcium channels // J.Mol. Recognit., 2000, Vol.13, P.55-70; Scott D.A. et al. Actions of intrathecal omega-conotoxinsCVID, GVIA, MVIIA, and morphine in acute and neuropathic pain in the rat // Eur. J.Pharmacol., 2002, V.451, P.279-286; US 7,101,849]; χ-конопептид MrIA-ингибитортранспортера норадреналина [Bryan-Lluka L.J. et al. chi-Conopeptide MrIA partiallyoverlaps desipramine and cocaine binding sites on the human norepinephrine transporter // J.Biol. Chem., 2003, Vol.278, P.40324-40329; US 7,326,682]; контулакин G - агонистрецептора нейротензина [Craig A.G. et al. Contulakin-G, an O-glycosylated invertebrateneurotensin // J. Biol. Chem., 1999, Vol.274, P.13752-13759; US 6,696,408]; ρ-конопептид TIA-антагонист α-адренорецепторов [Sharpe I.A. et al. Allosteric alpha 1-adrenoreceptor antagonism by the conopeptide rho-TIA // J. Biol. Chem., 2003, Vol.278,P.34451-34457; US 6,849,601]. Практическое применение находит, например, указанныйвыше ω-конотоксин MVIIA («Зиконотид», «Приалт») [Miljanich G.P. Ziconotide: neuronalcalcium channel blocker for treating severe chronic pain // Curr. Med. Chem., 2004, V.11,P.3029-3040; US 5,859,186].

Недостатками указанных средств являются:(1) введение в организм таких препаратов, как «Приалт», проводится посредством

инъекции в спинномозговой столб, что во многих случаях трудновыполнимо и требуетприменения специального медицинского оборудования (например, имплантированныхнасосов) и работы высококвалифицированного персонала;

Ñòð.: 3

DE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

(2) анальгетическая активность ряда веществ может сопровождаться побочнымиэффектами ввиду участия рецепторов-мишеней во многих физиологических процессах;

(3) в состав некоторых из указанных полипептидов входят остатки метионина,подверженные окислению, что приводит к снижению терапевтического потенциаласоответствующих препаратов.

Ионотропные пуринергические рецепторы (Р2Х) являются лиганд-управляемымиионными каналами, активируемыми внеклеточным аденозинтрифосфатом (АТФ),некоторыми другими нуклеотидами и их производными. Р2Х рецепторы широкораспространены в теле человека. Так, они характерны для периферических нейронов,иннервирующих различные органы и ткани [Surprenant A., North R.A. Signaling atpurinergic Р2Х receptors // Annu. Rev. Physiol., 2009, Vol.71, P.333-359]. Потенциальнаяважность этих мишеней для разработки медицинских препаратов обусловленаповсеместным присутствием их эндогенного лиганда АТФ в организме иразнообразием состояний, в которых он может реализовать свой активирующийэффект. АТФ - кофермент, участвующий в многочисленных важнейших реакциях,являющийся источником энергии для различных процессов, таких как мышечныесокращения и биосинтез белка. В то же время многочисленные исследования показали,что АТФ, освобожденный из поврежденных или воспаленных тканей, активирует Р2Хрецепторы и инициирует болевые сигналы. Предполагается участие Р2Х рецепторов вболевой чувствительности, связанной с травмами, опухолями, воспалением, мигренью,респираторными заболеваниями. У человека известно семь изоформ Р2Х рецепторов,среди которых изоформы Р2Х2, Р2Х3, Р2Х4 и Р2Х7, как полагают, участвуют всистеме восприятия боли [Donnelly-Roberts D. et al. Painful purinergic receptors // J.Pharmacol. Exp. Ther., 2008, Vol.324, P.409-415]. Р2Х3 рецепторы являются важными ихорошо изученными «участниками» болевых процессов как в центральной, так ипериферической нервной системе, что позволяет рассматривать их как перспективнуюмишень в лечении болевых состояний, а их антагонисты - как потенциальныеанальгетические средства [Wirkner К. et al. Р2Х3 receptor involvement in pain states //Mol. Neurobiol., 2007, Vol.36, P. 165-183].

Специфичные и селективные ингибиторы или модуляторы Р2Х3 рецепторов внастоящее время недостаточно изучены. Известны некоторые низкомолекулярныеантагонисты Р2Х3 рецепторов, например, 2′,3′-O-(2,4,6-тринитрофенил)-АТФ [VirginioС.et al. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, Р2Х3,and heteromeric P2X2/3 receptors // Mol. Pharmacol., 1998, Vol.53, P. 969-973], другиепроизводные моно- и динуклеотидов [Ford K.K. et al. The Р2Х3 antagonist PI, P5-di[inosine-5'] pentaphosphate binds to the desensitized state of the receptor in rat dorsal rootganglion neurons // J. Pharmacol. Exp. Ther., 2005, V. 315, P. 405-413; US 6,881,725], аналогисурамина [Hausmann R. et al. The suramin analog 4,4′,4′′,4′′′-(carbonylbis(imino-5,l,3-benzenetriylbis (carbonylimino)))tetra-kis-benzenesulfonic acid (NF110) potently blocksР2ХЗ receptors: subtype selectivity is determined by location of sulfonic acid groups // Mol.Pharmacol., 2006, V.69, P.2058-2067], спинорфин [Jung K.Y. et al. Structure-activityrelationship studies of spinorphin as a potent and selective human Р2ХЗ receptor antagonist //J. Med. Chem, 2007, V.50, P.4543-4547], A-317491 [Jarvis M.F. et al. A-317491, a novel potentand selective non-nucleotide antagonist of Р2Х3 and P2X2/3 receptors, reduces chronicinflammatory and neuropathic pain in the rat // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2002, V.99,P.17179-17184], производные диаминопиримидина [Carter D.S. et al. Identification andSAR of novel diaminopyrimidines. Part 1: The discovery of RO-4, a dual P2X3/P2X2/3antagonist for the treatment of pain // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, Vol.19, P. 1628-1631;

Ñòð.: 4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

Jahangir A. et al. Identification and SAR of novel diaminopyrimidines. Part 2: The discovery ofRO-51, a potent and selective, dual P2X3/P2X2/3 antagonist for the treatment of pain // Bioorg.Med. Chem. Lett. 2009, Vol.19, P.1632-1635; US 7,589,090; US 7,531,547], тетразола иариламидов [US 7,595,405], а также пиперазина и фенилтиенопиразола [Brotherton-Pleiss C.E. Discovery and optimization of RO-85, a novel drug-like, potent, and selective P2X3receptor antagonist // Bioorg. Med. Chem. Lett, 2010, Vol.20, 1031-1036; US 7,491,821].

Недостатками указанных веществ являются:(1) существование других мишеней, помимо пуринергических рецепторов, у

некоторых соединений;(2) большинство обладают недостаточной селективностью в отношении

гомомерных P2X3 рецепторов;(3) низкий потенциал многих веществ с точки зрения создания лекарств ввиду

неоптимальной химической структуры (например, наличия множества кислотныхгрупп).

Известно наиболее близкое к заявляемому соединение RO-85 - производноепиперазина и фенилтиенопиразола [Brotherton-Pleiss C.E. Discovery and optimization ofRO-85, a novel drug-like, potent, and selective P2X3 receptor antagonist // Bioorg. Med. Chem.Lett, 2010, Vol.20, 1031-1036]. Определенным недостатком известного соединенияслужит его структура: RO-85 может быть получено только с помощьюмногостадийного химического синтеза.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента веществ, специфичновоздействующих на P2X3 рецепторы.

Поставленная задача решается за счет структуры соединения РТ1, модулирующегоактивность пуринергических рецепторов P2X3. РТ1 является веществомполипептидной природы и может быть получен генно-инженерным способом.

РТ1 имеет следующую аминокислотную последовательность:Glyl-Tyr2-Cys3-Ala4-Glu5-Lys6-Gly7-Ile8-Arg9-Cysl0-Asp11-Aspl2-Ilel3-Hisl4-Cys15-

Cys16-Thrl7-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Lys22-Cys23-Asn24-Ala25-Ser26-Gly27-Tyr28-Asn29-Cys30-Val31-Cys32-Arg33-Lys34-Lys35

Заявляемый пептид состоит из 35 аминокислотных остатков, может быть выделенхроматографическими методами из яда паука Geolycosa sp. или получен с помощьюпептидного синтеза, а также генно-инженерными методами.

Заявляемый пептид способен селективно ингибировать токи, опосредованныепуринергическими рецепторами P2X3 в сенсорных нейронах крыс, а также в условияхэкспрессии генов P2X3 рецепторов человека в клетках НЕК 293. Показано, что придействии наномолярных концентраций пептида значительно уменьшаетсяактивирующий эффект природного агониста АТФ, что связано, по-видимому, состабилизацией десенситизированного состояния рецепторов. Концентрация РТ1,вызывающая 50%-ное ингибирование токов, опосредованных P2X3 рецепторами всенсорных нейронах крыс, (IC5 0) составляет 12±2 нМ при коэффициенте Хилла (nH)1,1±0,2 (для RO-85 IC5 0 в отношении рекомбинантных рецепторов крыс составляет ~31нМ). Исследования активности РТ1 в отношении ряда ионных каналов иионотропных рецепторов подтверждают специфичность действия пептида на Р2Х3рецепторы.

Препараты на основе РТ1 могут оказаться эффективными в терапии болейразличной этиологии. РТ1 является первым соединением полипептидной природы,способным оказывать селективное модулирующие действие на Р2Х3 рецепторы.Пептид характеризуется чрезвычайно стабильной структурой (содержит мотив так

Ñòð.: 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

называемого «цистинового узла»), кроме того, не содержит остатков метионина. Этослужит основанием для предположения высокого потенциала РТ1 с точки зрениясоздания лекарственных препаратов.

Изобретение иллюстрируют чертежиФиг.1. Выделение РТ1 из яда паука Geolycosa sp. (А) Эксклюзионная хроматография

цельного яда на колонке TSK 2000SW (7,5×600 мм). Отмечена активная фракция (*).(Б) Обращенно-фазовая ВЭЖХ фракции I на колонке Vydac 218TP54 C1 8 (4,6×250 мм).Отмечена активная фракция (*). (В) Третья стадия очистки активного вещества(повторная хроматография фракции 1) с использованием той же колонки Vydac218TP54. Активная фракция, соответствующая чистому РТ1, отмечена (*).

Фиг.2. Схема конструирования экспрессирующего вектора. Синтез гена РТ1 сиспользованием олигонуклеотидов (таблица 1), обозначенных стрелками, включаетлигирование и ПЦР и сопровождается клонированием в вектор рЕТ-32b. Внизупоказана часть полученного конструкта с функциональными элементами:промотором, геном тиоредоксина (Trx), гексагистидиновойпоследовательностью (6His), целевым геном РТ1, терминатором.

Фиг.3. Получение рекомбинантного РТ1. (А) Электрофоретическое разделениеобразцов, полученных в ходе выделения гибридного белка тиоредоксина с РТ1, в ДСН-ПААГ (12%). (1, 6) - стандарты, слева приведены значения молекулярных масс (кДа);(2) - тотальный клеточный лизат Е. coli BL21(DE3), несущих плазмиду рЕТ-32b совставкой гена РТ1 перед добавлением ИПТГ; (3) - после индукции экспрессии целевогогена 0,2 мМ ИПТГ; (4) - фракция растворимых белков; (5) - слитный белок,очищенный с помощью аффинной хроматографии. (Б) Разделение продуктовгидролиза гибридного белка энтеропептидазой на колонке Jupiter C4 (10×250 мм).Отмечена фракция, соответствующая РТ1 (*).

Фиг.4. Влияние РТ1 на токи, опосредованные Р2Х3 рецепторами в культуренейронов из ганглиев дорсальных корешков спинного мозга крыс. В качествеагониста используется ЦТФ в концентрации 100 мкМ. (А) Запись токов в ответ наприложение агониста в случае, когда РТ1 связывается с Р2Х3 рецепторами в закрытомсостоянии. Приложение 10 нМ РТ1 приводит к увеличению амплитуды тока (чернаякривая) по сравнению с контролем (серая кривая). (Б) Запись токов в случае, когдаРТ1 связывается с Р2Х3 рецепторами в десенситизированном состоянии.Приложение 10 нМ РТ1 приводит к уменьшению амплитуды тока (черная кривая) посравнению с контролем (серая кривая).

Фиг.5. Исследование механизма действия РТ1 на Р2Х3 рецепторы. По абсциссеотложено время приложения агониста от начала эксперимента. По ординатеотложена амплитуда измеренных токов. Доверительные интервалы обозначаютамплитуду шума в каждой конкретной записи ионного тока. Черная горизонтальнаялиния (РТ1, 20 нМ) показывает промежуток времени, в течение которого нейроннаходился в растворе с 20 нМ РТ1. Увеличение периода между аппликациями агонистана фоне РТ1 приводит к ослаблению блокирования ионного тока, опосредованногоР2Х3 рецепторами. При дальнейшем увеличении этого периода блокированиепереходит в потенцирование.

Фиг.6. Концентрационная зависимость эффекта РТ1 на Р2Х3 рецепторы в культуренейронов из ганглиев дорсальных корешков спинного мозга крыс.

Фиг.7. Эффект РТ1 на рекомбинантные Р2Х3 рецепторы человека в клеткахНЕК 293 (НЕЮ) и Р2Х3 рецепторы нейронов заднекорешковых ганглиев (ЗКГ) крыс.На диаграмме показано относительное снижение амплитуды ионного тока,

Ñòð.: 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

вызванного приложением ЦТФ (100 мкМ) на Р2Х3 рецепторы, в присутствии РТ1 вовнеклеточном растворе в концентрации 20 нМ и 50 нМ. Белые столбцы- эффект длянейронов ЗКГ крыс, серые столбцы - для клеток НЕК 293.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.Пример 1. Выделение пептида РТ1Цельный яд паука Geolycosa sp. (SPP код- A267TDLS2-KZARNA) предоставлен ТОО

«Научно-производственное объединение Фауна» (Республика Казахстан).Высушенный лиофильно образец 25 мкл яда растворяют в 0,1 мл 150 мМ NaCl, 30мМ NaH2PO4 и наносят на колонку для гель-фильтрации TSK 2000SW (7,5×600 мм, 125А, 10 мкм; Beckman, США). Элюцию осуществляют тем же раствором соскоростью 0,5 мл/мин. Детекцию проводят по оптическому поглощению элюата придлине волны 214 нм (фиг.1А). Все фракции анализируют на активность в отношенииР2Х3 рецепторов.

Активную фракцию I далее разделяют с помощью обращенно-фазовойвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Vydac 218TP54C1 8 (4,6×250 мм, 300 Å, 5 мкм; Separations Group, США) в линейном градиентеконцентрации ацетонитрила (0-15% за 5 мин, 15-45% за 50 мин, 45-65% за 10 мин)в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (ТФУ) при скорости потока 1 мл/мин (фиг.1Б).Индивидуальный активный пептид РТ1 очищают в результате третьей стадииразделения активной фракции 1 с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на той жеколонке в «пологом» градиенте концентрации ацетонитрила (0-15% за 5 мин, 15-25%за 30 мин) (фиг.1В).

Пример 2. Определение молекулярной массы РТ1Индивидуальность очищенного вещества подтверждают масс-спектрометрическим

анализом. Используют десорбционный метод «мягкой» ионизации - времяпролетнойматрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ). Масс-спектрыполучают на МАЛДИ масс-спектрометре Ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik,Германия) с времяпролетным масс-анализатором, идентификацию положительнозаряженных ионов проводят в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используютα-циано-4-гидроксикоричную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном ацетонитриле,содержащем 0,1%-ную ТФУ. Для калибровки прибора используют стандартную смесьпептидов и белков с диапазоном молекулярных масс 700-66000 Да (Sigma, США).Измеренная моноизотопная молекулярная масса природного РТ1 составляет 3833,5Да.

Пример 3. Установление аминокислотной последовательности РТ1Первичную структуру (аминокислотную последовательность) РТ1 устанавливают с

помощью комбинации методов N-концевого секвенирования по Эдману, селективногопротеолиза и масс-спектрометрии. Вначале проводят реакцию восстановлениядисульфидных связей и алкилирования тиольных групп. Для этого 1 нмольвыделенного пептида растворяют в 40 мкл смеси: 0,5 М Трис-HCl (рН 8,5), 6 Мгуанидингидрохлорид, 2 мМ ЭДТА. Добавляют 200-кратный избытокдитиотреитола (5 М раствор в ацетонитриле). Образец инкубируют при 40°С втечение 4 ч, после чего добавляют 3-кратный избыток (по отношению кдитиотреитолу) 4-винилпиридина (50%-ный раствор в изопропаноле). Модификациюпроводят при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. Алкилированныйпептид выделяют с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Jupiter C5 (2×150мм, 300 Å, 5 мкм; Phenomenex, США). Масса алкилированного восстановленногопептида составляет 4682,0 Да, что соответствует восьми присоединенным молекулам 4-

Ñòð.: 7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

винилпиридина (молекулярная масса 105,1 Да). Таким образом, РТ1 содержит восемьостатков цистеина, образующих четыре внутримолекулярные дисульфидные связи.Аминокислотную последовательность S-пиридилэтилированного РТ1 установливаютпо методу Эдмана на автоматическом секвенаторе Precise Model 492 (AppliedBiosystems, США) в соответствии с методикой фирмы-изготовителя. В результатеполучают полную аминокислотную последовательность РТ1:

H2N-Glyl-Tyr2-Cys3-Ala4-Glu5-Lys6-Gly7-Ile8-Arg9-Cys10-Asp11-Asp12-Ile13-His14-Cys15-Cys16-Thr17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Lys22-Cys23-Asn24-Ala25-Ser26-Gly27-Tyr28-Asn29-Cys30-Val31-Cys32-Arg33-Lys34-Lys35-COOH

Расчетная моноизотопная молекулярная масса пептида составляет 3833,6 Да,отличается от измеренной на 0,1 Да. Таким образом, РТ1 не содержит каких-либомодификаций, за исключением четырех дисульфидных связей.

Пример 4. Получение рекомбинантного РТ1Аминокислотную последовательность РТ1 преобразуют в соответствующую ей

нуклеотидную с учетом частот использования кодонов у Escherichia coli. Синтезируютолигонуклеотидные фрагменты, перекрывающие полную последовательность генаРТ1, при этом «концевые» из них содержат сайты рестрикции для клонирования вплазмиду pET-32b (Novagen, США; см. таблицу 1, фиг.2).

Синтез полноразмерной последовательности РТ1 осуществляют с помощью методалигирования-полимеразной цепной реакции (ПЦР). В смесь 1 вносятолигонуклеотиды F1 и F2 (по 2 мкМ), 1 мМ АТФ и 10 ед.полинуклеотидкиназы (Promega, США) в буферном растворе длялигирования (Promega, США). Смесь 2 содержит олигонуклеотиды F, R1, R2 (по 2мкМ) и 1 мМ АТФ в буферном растворе для лигирования. Для проведения реакциифосфорилирования смесь 1 инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин, затемдля инактивации фермента прогревают при 70°С в течение 20 мин. Объединяют по 5мкл смесей 1 и 2, инкубируют 15 мин при 96°С, медленно остужают до комнатнойтемпературы, после чего добавляют 0,5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (Promega, США) иинкубируют 18 ч при 16°С. Затем проводят ПЦР, используя в качестве матрицыразбавленную в 100 раз лигазную смесь с праймерами F и R. ПЦР проводят на ПЦР-

Ñòð.: 8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

амплификаторе РТС-200 (MJ Research, США). Реакционная смесь (200 мкл) содержит:буферный раствор для ПЦР (ИБХ РАН), смесь четырех дезоксинуклеотидов (0,2 мМкаждого) (Promega, США), праймерные олигонуклеотиды (20 пмоль каждого), ~1 нгматричной ДНК и 2,5 ед. Taq-полимеразы (ИБХ РАН). Условия ПЦР: денатурация(96°С) - 20 сек; отжиг (50°С) - 20 сек; элонгация (72°С) - 30 сек, 25 циклов.

Рестрикцию ПЦР-продукта и плазмиды рЕТ-32b проводят в буфере MultiCore,оптимальном для работы ферментов BamHI и KpnI (Promega, США). Длярасщепления 1 мкг ДНК используют 4 ед. каждой рестриктазы. Стандартнаяреакционная смесь (20 мкл) содержит 2 мкл 10-кратного буфера для рестрикции и по 2мкл стокового раствора каждого фермента. Реакцию проводят в течение 2 ч при 37°С.В качестве контроля проводят рестрикцию плазмиды каждым из ферментов поотдельности, результат оценивают по изменению подвижности вектора приэлектрофорезе в агарозном геле. Очистку рестрицированных фрагментов ДНК ивектора проводят с помощью электрофореза в агарозном геле с последующимвыделением ДНК из геля с использованием набора реактивов Wizard SV Gel and PCRClean-Up System (Promega, США) в соответствии с методикой фирмы-производителя.

После обработки рестриктазами KpnI и BamHI синтетический ген РТ1 иэкспрессирующий вектор рЕТ-32b лигируют друг с другом. Реакционная смесь (15мкл) содержит: 1,5 мкл 10-кратного буфера для лигирования, 10 мМ АТФ, 10 нгплазмиды, расщепленной по сайтам BamHI и KpnI, 10 нг ПЦР-продукта,расщепленного по тем же сайтам рестрикции, и 1 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Лигазнуюсмесь инкубируют в течение 18 ч при температуре 16°С на водяной бане. В результатеполучают плазмиду, кодирующую химеру белка тиоредоксина с РТ1 под контролемТ7 промотера (фиг.2).

Полученной смесью трансформируют клетки Е.coli штамма XL1 Blue с помощьюэлектропоратора Cellject (Eurogentec, Бельгия). Для проведения трансформации 45 мклразмороженной на льду суспензии компетентных клеток помещают в кювету дляэлектропорации и добавляют 1 мкл лигазной смеси. Параметры электроимпульсавыставляют согласно рекомендациям фирмы-производителя электропоратора. Послеимпульса к клеткам сразу же добавляют 700 мкл охлажденной на льду среды LB,суспензию инкубируют 5 мин на льду, а затем 1 ч при 37°С. Весь объем суспензиипереносят на чашку Петри с твердой средой LB с добавлением ампициллина (70мкг/мл) в качестве селективного фактора. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 ч.Колонии Е.coli XL1 Blue, полученные на селективной среде после проведениятрансформации, рассеивают штрихами на новой чашке Петри с твердой средой LB иампициллином (70 мкг/мл). Чашки инкубируют 18 ч при 37°С. Проводят ПЦР соспецифичными к интересующей последовательности олигонуклеотиднымипраймерами F и R, в качестве матрицы используют тотальную нуклеиновую кислотуиз полученной клеточной массы. Клеточный материал (~1 мкл) ресуспендируют вреакционной смеси (20 мкл), проводят ПЦР. Отобранные трансформанты используютдля получения ночной жидкой культуры. Небольшое количество клеточногоматериала переносят в 5 мл жидкой среды LB с добавлением ампициллина (70 мкг/мл),суспензию инкубируют 18 ч при 37°С. Процедуру препаративного выделенияплазмидной ДНК проводят с использованием набора реактивов Wizard Plus SVMinipreps DNA Purification System (Promega, США) в соответствии с методикой фирмы-производителя.

Правильность сборки и дотирования проверяют секвенированием по методуСэнгера на приборе Model 373 DNA Sequencer (Applied Biosystems, США) с

Ñòð.: 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

использованием реактивов ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready reactionkit, ДНК-полимеразы AmpliTaq DNA polymerase, FS (Perkin Elmer, США) и праймерарЕТ-HindSeq (5'-CTTCCTTTCGGGCTTTG-3′) в соответствии с рекомендациямиуказанных производителей.

Наработку химерного белка проводят с помощью контролируемой экспрессиисоответствующего гена в клетках Е. coli штамма BL21(DE3). Ночную культуру клеток,трансформированных экспрессионным вектором рЕТ-320, содержащим вставку генаРТ1, разбавляют в 200 раз жидкой питательной средой LB с антибиотикомампициллином (100 мкг/мл). Клетки инкубируют при 37°С и перемешивании (200об/мин) до достижения оптической плотности OD6 2 0=0,6, после чего к культуредобавляют индуктор (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид, ИПТГ; 0,2 мМ) иинкубируют при комнатной температуре в течение 18 ч.

Клетки осаждают центрифугированием (10 мин, 4500 об/мин) и ресуспендируют в 25мл стартового буфера для аффинной хроматографии (см. ниже) с добавлением 1%Тритона Х-100. Разрушение клеточных структур проводят с использованиемультразвукового дезинтегратора СРХ 750 (Cole-Parmer Instruments, США) припостепенном увеличении амплитуды от 25 до 35% с шагом в 2%. Выделениегибридного белка проводят с помощью аффинной хроматографии. Клеточный лизатнаносят в стартовом буфере (50 мМ Трис-HCl, рН 8, 300 мМ NaCl) на колонкуобъемом 3 мл со смолой TALON Superflow Metal Affinity Resin (Clontech, США) соскоростью потока 1 мл/мин. Для исключения возможности неспецифической сорбцииколонку промывают 50 мМ Трис-HCl, рН 8, содержащим 500 мМ NaCl, 5%-ныйглицерин (v/v), 1%-ный Тритон Х-100 (v/v), 5 мМ имидазол. Для элюции целевого белкаиспользуют буфер, содержащий 50 мМ Трис-HCl, рН 8, 300 мМ NaCl, 150 мМимидазол. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению элюата при 280 нм.Контроль за выделением и очисткой гибридного белка ведут с помощьюэлектрофореза аликвот получаемых фракций в полиакриламидном геле (фиг.3А).

Полученный слитный белок подвергают обессоливанию на колонке Jupiter C5(4,6×150 мм, 300 Å, 5 мкм; Phenomenex, США). Элюцию осуществляют ступенчатымизменением концентрации ацетонитрила (0-70%) в 0,1%-ной ТФУ со скоростьюпотока 1 мл/мин. Белок высушивают на вакуумном концентраторе, растворяют в 50мМ Трис-HCl, рН 8, конечная концентрация белка составляет ~1 мг/мл. К растворубелка добавляют раствор каталитической субъединицы энтерокиназы человека (ИБХРАН) из расчета 1 ед. на 1 мг белка, гидролиз проводят при комнатной температуре втечение 18 ч. Разделение продуктов гидролиза гибридного белка проводят наколонке Jupiter С4 (250×10 мм, 300 Å, 10 мкм; Phenomenex, США) в линейном градиентеконцентрации ацетонитрила (0-40% за 60 мин, 40-80% за 20 мин) в 0,1%-ной ТФУ прискорости потока 2 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощениюэлюата при 210 и 280 нм (фиг.3Б). В результате получают выход рекомбинантногоРТ1 3 мг с 1 л бактериальной культуры. Идентичность рекомбинантного иприродного пептидов доказывают при помощи масс-спектрометрии, N-концевогосеквенирования, сравнения хроматографических подвижностей, а такжебиологических свойств.

Пример 5. Электрофизиологические исследования проводимости Р2Х3 рецепторов вкультуре нейронов из ганглиев дорсальных корешков спинного мозга крыс

Нейроны для экспериментов выделяют из ганглиев дорсальных корешков спинногомозга (заднекорешковых ганглиев) 9-12 дневных крыс линии Wistar. Крысам быстроотрезают голову, затем вскрывают спинномозговой канал. По бокам

Ñòð.: 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

спинномозгового канала в межреберном пространстве находятся ганглии, которыеаккуратно вынимают с помощью пинцета и переносят в чашку Петри, наполненнуювнеклеточным раствором (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl, 20мМ HEPES, рН 7,4) комнатной температуры. После получения достаточногоколичества ганглиев их переносят в заранее подготовленный раствор ферментов (1 мгтрипсина и 2 мг коллагеназы в 2 мл внеклеточного раствора), нагретый до 35°С.Ганглии в ферментном растворе инкубируют в течение 10 мин. Затем ганглиитщательно промывают чистым (без ферментов) внеклеточным раствором в другойчашке Петри. Из промытых ганглиев выделяют одиночные клетки с помощью тонкихигл. Чашка с одиночными клетками переносится в электрофизиологическуюустановку. Эксперименты начинают после того, как все клетки осядут на дно чашкичерез ~30 мин после выделения.

Электрофизиологическое тестирование проводится с использованием классическогометода "patch clamp" в конфигурации отведения напряжения от целой клетки ("wholecell") с применением подхода быстрого приложения вещества (агониста), котороесвязывается с Р2Х3 рецепторами и вызывает открытие ионного канала.Электрофизиологическая установка состоит из трех частей: микроскопа, системыприложения веществ на клетку («прыгающий столик»; Pharma Robot, Украина) исистемы регистрации токов, протекающих через каналы в плазматической мембранеклетки. Прыгающий столик является важнейшим элементом системы приложениявеществ на клетку. Выделенные нейроны в чашке Петри располагают подмикроскопом с фазовым контрастом на установке. Для эксперимента выбираютклетки диаметром 8-12 мкм. К выбранной клетке подводят стеклянную пипетку-электрод, заполненный внутриклеточным раствором (120 мМ CsF, 10 мМ Трис-HCl,рН 7,2), в результате формируется плотный контакт между пипеткой и клеточноймембраной с сопротивлением порядка ГОм. Затем клетку на пипетке поднимают содна чашки и помещают в аппликационную трубку. Растворы, используемые вэксперименте, находятся в камерах прыгающего столика. В опыте используютсячетыре типа растворов: раствор №1 - базовый внеклеточный раствор, в которомхранятся полученные клетки, раствор №2 - базовый раствор с добавлением агониста внеобходимой концентрации, раствор №3 - базовый раствор с РТ1 в необходимойконцентрации, раствор №4 - базовый раствор с агонистом и РТ1 в необходимыхконцентрациях. Аппликационную трубку, в которой находится пипетка с исследуемойклеткой, опускают в камеру с раствором агониста. Камеру выбирают, поворачиваястолик. После опускания аппликационной трубки в камеру открывается клапан, и поддействием гидростатического давления в аппликационную трубку всасываетсяраствор из камеры прыгающего столика. Во время всасывания раствора ваппликационную трубку (приложения раствора) регистрируют ионный ток,проходящий через мембрану клетки. Сразу после этого (менее чем за 2 сек)аппликационная трубка перемещается в камеру с базовым внеклеточным раствором.Раствор из камеры затягивается в аппликационную трубку и омывает клетку. Такимобразом осуществляется «отмывка» клетки от агониста. Процедуру отмывки проводятне менее 15 раз на протяжении 3 мин. Через 3 мин после приложения агонистапроцедуру повторяют по той же схеме. Три последовательных приложения агониста,которые приводят к регистрации трех идентичных ионных токов, считаютстатистически достоверным контролем. После получения контрольных токов к клеткеприкладывают исследуемое вещество (РТ1) в разных концентрациях. Далее повторяютпроцедуру прикладывания агониста вместе с РТ1, при которых также регистрируются

Ñòð.: 11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

токи. После прикладывания агониста вместе с РТ1 отмывку клетки от агониста такжепроводят на фоне РТ1. Последовательное приложение агониста с РТ1 прекращают,когда амплитуда Р2Х3-опосредованого тока остается неизменной. Отношениеамплитуды контрольного тока к установившейся амплитуде тока на фонеопределенной концентрации РТ1 является показателем эффективности действияданной концентрации РТ1 и наносится в виде точки на график зависимости доза-эффект.

Добавление агониста во внеклеточный раствор, который омывает нейрон(приложение агониста), вызывает электрохимический ответ - открытие вплазматической мембране нейрона каналов, через которые протекает ионный ток.Ток регистрируется при комнатной температуре с помощью усилителя модели 2400 (А-М Systems, США). Электроды для электрофизиологических исследований изготовляютиз боросиликатного стекла на специальной установке Р-97 Flamming/Brown (SutterInstrument, США), их сопротивление составляет 3-5 МОм. Токи регистрируют приподдерживаемом потенциале -60 мВ, который близок к естественной величинепотенциала покоя нервных клеток. В качестве агонистов, которые вызывают Р2Х-опосредованые токи, используют аденозинтрифосфат (АТФ) и цитидинтрифосфат(ЦТФ). Ток с быстрой фазой нарастания (до 12 мсек) и быстрой фазой спада (до 500мсек) соответствует току, опосредованному Р2Х3 рецепторами. Р2Х3 рецептор имееттри основных конформационных состояния: закрытое, открытое, нечувствительное(десенситизированное). В отсутствие агониста во внеклеточном растворе рецепторнаходится в закрытом состоянии. Приложение агониста вызывает переход рецептораиз закрытого состояния в открытое (активация). Далее рецептор переходит изоткрытого состояния в нечувствительное к агонисту состояние (десенситизация).Удаление агониста из внеклеточного раствора приводит к переходу комплекса изнечувствительного состояния в закрытое состояние (выход из десенситизации). Времяактивации комплекса при использовании обоих агонистов составляет от 2 до 4 мсек.Время десенситизации комплекса при использовании обоих агонистов составляет 20-100 мсек. Время выхода комплекса из десенситизации сильно зависит от агониста исоставляет ~30 мин для АТФ и ~2 мин для ЦТФ. Действие РТ1 на каждое из состоянийанализируют, подбирая соответствующий протокол. При использовании ЦТФ вкачестве агониста действуют согласно протоколу, в котором ЦТФ прикладывают разв три минуты в насыщающей концентрации (100 мкМ).

Эффект РТ1 зависит от состояния, в котором находится рецептор. Связывание РТ1с рецептором в закрытом состоянии выражается в увеличении амплитуды тока посравнению с контрольной (фиг.4А). Связывание РТ1 с комплексом внечувствительном состоянии приводит к значительному уменьшению амплитудытока (фиг.4Б). Оба эффекта полностью обратимы. Уменьшение амплитуды токаисчезает с увеличением периода между приложениями агониста (фиг.5). Этосвидетельствует о том, что РТ1 замедляет выход рецептора из десенситизации.Экспериментальные данные анализируют по уравнению Хилла. Концентрация РТ1,при которой наблюдается уменьшение амплитуды тока в два раза по сравнению сконтрольным значением, (IC5 0) составляет 12±2 нМ, коэффициент Хилла (nH) длязависимости величины эффекта РТ1 от концентрации составляет 1,1±0,2 (фиг.6).

Пример 6. Влияние РТ1 на проводимость Р2Х3 рецепторов человека в условияхэкспрессии их генов в клетках НЕК 293

Ген Р2Х3 человека (исходная плазмида pReceiver-BO2a-P2X3, GeneCopoeia, США)клонируют в вектор pIRES2-EGFP (Clonteth, США) по сайтам рестрикции ЕсоRI и ApaI.

Ñòð.: 12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

Рестрикцию плазмид pReceiver-BO2a-P2X3 и pIRES2-EGFP проводят в буфере MultiCore.Для расщепления 1 мкг ДНК используют по 2 ед. рестриктаз EcoRI и ApaI (Promega,США). Стандартная реакционная смесь (20 мкл) содержит 2 мкл 10-кратного буферадля рестрикции и по 1 мкл стокового раствора каждого фермента. Реакцию проводят втечение 1 ч при 37°С. В качестве контроля проводят рестрикцию плазмид каждым изферментов по отдельности.

После обработки рестриктазами ген Р2Х3 и вектор pIRES2-EGFP очищают илигируют друг с другом. Реакционная смесь (15 мкл) содержит: 1,5 мкл 10-кратногобуфера для лигирования, 10 мМ АТФ, 10 нг расщепленной по сайтам EcoRI и ApaIплазмиды, 10 нг расщепленного по тем же сайтам рестрикции фрагмента ДНК,кодирующего Р2Х3, и 1 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Лигазную смесь инкубируют втечение 18 ч при температуре 16°С на водяной бане. Отбор клонов и выделениецелевой плазмиды проводят аналогично процедуре, описанной в примере 4, используяв качестве селективного антибиотика канамицин (30 мкг/мл). Правильностьлигирования проверяют секвенированием по методу Сэнгера на приборе Model 373DNA Sequencer аналогично процедуре, описанной в примере 4, с использованиемпраймеров CF1 (5'-AGGCGTGTACGGTGGGA-3'), P2X3-F2 (5'-CTGGCCGCTGCGTGAACTAC-3'), P2X3-F3 (5′-CGTTTCTGAGAAAAGCAGCG-3′).

Полученную плазмиду pIRES2-EGFP-hP2X3 используют для трансфекции клетокНЕК 293. Для этого клетки инкубируют в среде DMEM (GIBCO Invitrogen, США),содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5% CO2. Задень до проведения трансфекции клетки переносят в 24-луночный планшет иинкубируют в течение 18 ч до достижения конфлюентности клеток около 60%.Трансфекцию проводят с использованием липофектамина (Invitrogene, США). Дляэтого подготавливают два раствора: первый - 0,5 мкг плазмиды растворяют в 25 мклсреды DMEM без сыворотки; второй - 2 мкл липофектамина растворяют в 25 мклсреды DMEM без сыворотки. Осторожно добавляют раствор липофектамина враствор ДНК, перемешивают, инкубируют 30 мин при комнатной температуре,добавляют 150 мкл среды DMEM без сыворотки. Меняют среду в лунках с клетками насвежую DMEM без добавления сыворотки, вносят по каплям 200 мкл разбавленногокомплекса ДНК-липофектамин, осторожно перемешивают, покачивая планшет,инкубируют в течение 2 ч при 37°С в атмосфере 5% CO2. Затем меняют среду на DMEM

с добавлением сыворотки, клетки инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2, втечение 1-2 дней, после чего используют для проведения электрофизиологическихэкспериментов. В результате получают, что наблюдаемые эффекты при действии РТ1на рекомбинантные Р2Х3 рецепторы человека в клетках НЕК 293 сходны с эффектамиРТ1 на Р2Х3 рецепторы нейронов заднекорешковых ганглиев крыс, однако выраженыслабее (фиг.7).

Пример 7. Селективность действия РТ1В мембранах нейронов ганглиев дорсальных корешков спинного мозга кроме Р2Х3

рецепторов присутствуют также Р2Х2 и Р2Х2/3 рецепторы [Burgard E.C. et al. P2Xreceptor-mediated ionic currents in dorsal root ganglion neurons // J. Neurophysiol., 1999, V.82, P. 1590-1598]. Для проверки влияния РТ1 на Р2Х2 и Р2Х2/3 рецепторы используютпротокол, описанный в примере 5, со следующими отличиями. Так как время выходаиз десенситизации Р2Х3 рецепторов очень велико по сравнению с Р2Х2 и Р2Х2/3рецепторов, агонист прикладывают с периодом в 1 мин. В таком случае всенаблюдаемые (кроме первого) ответы опосредованы только Р2Х2 и Р2Х2/3рецепторами. Все известные в настоящее время агонисты любого из указанных

Ñòð.: 13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

рецепторов не являются селективными только к одному типу, однакочувствительность разных типов рецепторов к различным агонистам значительноотличается. В то время как чувствительность Р2Х2/3 рецептора к АТФ и к α,β-метилен-АТФ приблизительно одинакова (Kd ~30 мкМ), минимальная концентрация α,β-метилен-АТФ, необходимая для активации Р2Х2 рецепторов, составляет не менее 100мкМ. Мембраны клеток могут содержать Р2Х2 и Р2Х2/3 рецепторы в разныхсоотношениях. Эквивалентность ионных токов, наблюдаемых в ответ на поочередноеприложение АТФ и α,β-метилен-АТФ, свидетельствует о значительном преобладанииР2Х2/3 рецепторов в мембране клетки. Прикладывая РТ1 к такой клетке, изучаютдействие РТ1 на Р2Х2/3 рецепторы. В клетках, которые генерируют ионные токиразной амплитуды, большей в ответ на приложение АТФ и очень малой в ответ наприложение α,β-метилен-АТФ, мембрана содержит в основном Р2Х2 рецепторы. Натаких клетках изучают влияние РТ1 на Р2Х2 рецепторы. В результате получают, чтоРТ1 не влияет на ионные токи, опосредованные Р2Х2/3 и Р2Х2 рецепторами.

Кроме P2X рецепторов мембраны нейронов заднекорешковых ганглиев содержаттакже, например, TRPV1 рецепторы. Показано, что TRPV1 рецепторы принимаютучастие в болевой чувствительности [Caterina M.J. et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway // Nature, 1997, Vol.389, P. 816-824]. Влияние РТ1на TRPV1 рецепторы изучают с помощью протокола, описанного выше, в котором вкачестве агониста используют капсаицин в концентрации 500 нМ; внутриклеточныйраствор содержит: 130 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 20 мМ ВАРТА, 4 мМ АТФ, рН 7,2;внеклеточный раствор содержит: 130 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 2 мМ ВаCl2, 2 мМ MgCl2 20мМ HEPES, рН 7,4. В результате получают, что РТ1 не влияет на ионные токи,опосредованные активацией TRPV1 рецепторов.

Передача сигналов в нервной системе происходит при участии потенциал-зависимых ионных каналов различной селективности. Для изучения влияния РТ1 напотенциал-зависимые ионные каналы используют следующий протокол. Длянатриевых и калиевых каналов для получения ионных токов с амплитудой, близкой кмаксимальной, изменяют поддерживаемый потенциал на мембране от -60 мВ до +20мВ, для кальциевых - от -90 мВ до 0 мВ. Измеряют вызванный ионный ток в базовомрастворе, а затем в базовом растворе с добавлением РТ1 исследуемой концентрации,сравнивают регистрированные токи. В результате получают, что РТ1 не влияет наионные токи, опосредованные потенциал-зависимыми ионными каналами нейроновзаднекорешковых ганглиев.

Формула изобретенияПептид РТ1, модулирующий активность пуринергических рецепторов Р2Х3,

имеющий следующую аминокислотную последовательность: Gly1-Tyr2-Cys3-Ala4-Glu5-Lys6-Gly7-Ile8-Arg9-Cys10-Asp11-Asp12-Ile13-His14-Cys15-Cys16-Thr17-Gly18-Leu19-Lys20-Cys21-Lys22-Cys23-Asn24-Ala25-Ser26-Gly27-Tyr28-Asn29-Cys30-Val31-Cys32-Arg33-Lys34-Lys35.

Ñòð.: 14

CL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 422 459 C1

Ñòð.: 15

DR

RU 2 422 459 C1

Ñòð.: 16

RU 2 422 459 C1

Ñòð.: 17

RU 2 422 459 C1

Ñòð.: 18