КлЕТочНАя ИММуНологИя

– 29 –

27. Saito S., Sasaki Y., Sakai M. CD4+CD25high regulatory T cells in human pregnancy // J. Reprod. Immunol. – 2005. – Vol. 65. – P. 111–120.

28. Steinman R. M. The dendritic cell system and its role in immuno-genicity // Annu. Rev. Immunol. – 1991. – Vol. 9. – P. 271–296.

29. Tafuri A., Alfering J., Moller P. et al. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy // Science. – 1995. – Vol. 270. – P. 630–633.

30. Talayev V. Yu., Matveichev A. V., Lomunova M. A. et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T-cell stimulating ability of dendritic cells in vitro // Clin. Exp.

Immunol. – 2010. – Vol. 162, N 1. – P. 91–99.31. Tarrade A., Kuen R. L., Malassin@e A. et al. Characterization of

human villous and extravillous trophoblasts isolated from first trimester placenta // Lab. Invest. – 2001. – Vol. 81. – P. 1199-1211.

32. Zenclussen A. C., Gerlof K., Zenclussen M. L. et al. Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model // Am. J. Pathol. – 2005. – Vol. 166. – P. 811–822.

Поступила 27.07.11

© КОллеКтИв АвтОРОв, 2012

УдК 612.017.1.014.083

М. Э. Цатуров, В. Ю. Талаев, А. В. Матвеичев, М. В. Плеханова, И. Е. Заиченко, о. Н. Бабайкина, М. А. ломунова

эффеКтЫ пОследОвАтельнОгО И КОнКУРентнОгО взАИМОдействИя ОбЫчнЫх МОнОцИтАРнЫх дендРИтнЫх КлетОК И дендРИтнЫх КлетОК, ОбРАбОтАннЫх ИндУКтОРАМИ тОлеРОгеннОстИ, с АллОгеннЫМИ лИМфОцИтАМИ

ФБУН Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора (603950, Нижний Новгород, ул. грузинская, д. 44)Работа поддержана РффИ, проект 10-04-00304

Показано, что инкубирование созревающих дендритных клеток (ДК) новорожденных детей с интер-лейкином (ИЛ)-10 или с дексаметазоном (ДеКС) приводит к частичному сохранению экспрессии CD14 и существенному снижению экспрессии молекул костимуляции. Модулированные ДеКС и ИЛ-10 ДК детей и взрослых утрачивают способность стимулировать пролиферацию и продукцию интерферона (ИФН)-γ аллогенными лимфоцитами, причем лимфоциты после контакта с такими клетками снижают свою способность отвечать на повторную стимуляцию теми же аллоантигенами. В то же время модули-рованные ДК детей не подавляют пролиферацию и цитокинопродукцию лимфоцитов при конкурентном взаимодействии с обычными ДК, тогда как модулированные ДеКС ДК взрослых в аналогичных услови-ях угнетают продукцию ИФН-γ.

К л ю ч е в ы е с л о в а : дендритные клетки, толерогенность, глюкокортикоиды, Т-лимфоциты

Tsaturov M E., Talaev V.Yu., Matveichev A.V., Zaichenko I.E., Babaikina O.N., Lomunova M.A. EffECTS of CoGNITIvE AND ComPETITIvE INTERACTIoNS of NATIvE moNoCyTE-DERIvED DENDRITIC CELLS AND DENDRITIC CELLS TREATED By ToLERoGENIC INDUCERS wITH ALLoGENoUS LymPHoCyTES

It has been shown that incubation of the maturing dendritic cells from the newborn infants with interleukin-10 or dexamethasone ensured partial preservation of CD14 expression and resulted in a significant decrease of the expression of co-stimulation molecules. Dendritic cells from the children and adult subjects lost the ability to stimulate proliferation and production of interferon-gamma in allogenous lymphocytes. The lymphocytes that had been in contact with such cells in their turn showed the impaired ability to respond to the repeated stimulation by the same allo-antigens. At the same time, the modulated dendritic cells of the children failed to suppress proliferation and cytokine production by lymphocytes under conditions of competitive interaction with their native counterparts whereas dexamethasone-modulated dendritic cells from adult subjects inhibited production of interferon-gamma in analogous conditions.

K e y w o r d s : dendritic cells, tolerogenicity, glucocorticoids, T-lymphocytes

Талаев владимир Юрьевич – д-р мед. наук, зав. лаб.

Одним из самых важных звеньев в механизме им-мунного ответа и регуляции гомеостаза иммунной системы являются дендритные клетки (ДК). Тер-мином ДК объединяются несколько субпопуляций клеток иммунной системы с различными, а порой и кардинально противоположными свойствами. Наи-более общей функцией ДК является презентация

антигена Т-лимфоцитам. Выполняя эту функцию, ти-пичная зрелая ДК вовлекает антигенспецифические Т-лимфоциты и, в частности, наивные Т-лимфоциты в реакции иммунного ответа. В то же время ДК с опре-деленными так называемыми толерогенными свой-ствами могут выполнять роль негативных регулято-ров иммунного ответа и участвовать в формировании иммунологической толерантности, в первую очередь толерантности к тканям собственного организма. Та-кое важное явление, как сохранение полуаллогенного

ИММуНологИя № 1, 2012

– 30 –

плода при нормально протекающей беременности у млекопитающих, также не обходится без вмешатель-ства ДК со специфическими свойствами. И наконец, заслуживают внимания механизмы выработки толе-рантности к определенным антигенам при их искус-ственном введении в организм, а также толерогенный эффект некоторых препаратов со способностью моду-лировать свойства ДК.

Существует несколько типов ДК, различие ко-торых обусловлено тканевой локализацией, проис-хождением и условиями, в которых проходили диф-ференцировка и созревание ДК. В данной статье мы будем рассматривать ДК миелоидного ряда, диффе-ренцировавшиеся из моноцитов. Как уже отмечалось выше, типичные миелоидные ДК играют ключевую роль в активации лимфоцитов. Это свойство ДК свя-зано со способностью захватывать, процессировать и презентировать антигены в составе молекул главно-го комплекса гистосовместимости (ГКГ) II класса, а также перекрестно презентировать их в составе ГКГ I класса. Взаимодействие между костимуляторными молекулами CD80 и CD86 с молекулой CD28, экспрес-сируемой на мембране Т-лимфоцитов, является обя-зательным условием для оптимальной активации по-следних [8]. В незрелом состоянии ДК экспрессируют молекулы CD80 и CD86 на низком уровне. Активация ДК паттернами микробного происхождения, такими, как, например, липополисахарид (ЛПС), посредством tool-подобных рецепторов (TLR) приводит к проме-жуточному созреванию ДК, что проявляется суще-ственным повышением экспрессии молекул костиму-ляции. Терминальное созревание ДК происходит при непосредственном контакте ДК с Т-лимфоцитами. Взаимодействие осуществляется через связывание CD40 и CD154 (CD40L). Созревание, индуцирован-ное этими двумя механизмами, подразумевает вовле-чение в эти процессы фактора транскрипции NF-κВ и р38 МАР-киназного пути [3, 10].

Помимо созревания типичных ДК со стимулиру-ющими свойствами, путь развития части ДК может приводить к выработке у них толерогенных свойств. В результате такие ДК приобретают способность вы-зывать анергию и даже апоптоз контактирующих с ними Т-лимфоцитов, а также стимулировать созре-вание и активность регуляторных Т-клеток (Т-рег) – супрессоров иммунного ответа. Не совсем ясны механизмы, посредством которых презентация анти-гена ДК ведет к прямо противоположным эффектам на Т-лимфоциты. При этом не исключается зависи-мость этих процессов от стадии созревания ДК [4, 7, 9]. Ранее высказывались предположения о том, что индукция толерантности есть результат дефектного пути активации Т-лимфоцитов незрелыми ДК с низ-кой костимулирующей функцией, контакт с которыми приводит к выработке анергии у Т-лимфоцитов [2]. По-видимому, данный механизм имеет значение для толерантности, индуцированной незрелыми ДК в тка-нях, в которых отсутствует инфекция и не развилось воспаление. Более поздние исследования, однако, на-водят на мысль о том, что индукция толерантности яв-ляется активным процессом, требующим, по данным разных авторов, продукции ДК таких специфических молекул, как интерлейкин (ИЛ)-10, индоламин-2,3-диоксигеназа, В7-Н1, ILT3, индуцибельный костиму-

ляторный лиганд (ICOSL), PD-L1, и др. [8, 12, 14]. Та-кие молекулы могут продуцироваться при созревании ДК по альтернативному пути, приводящему к образо-ванию так называемых полузрелых ДК. Эти процес-сы могут быть индуцированы локальной продукцией ИЛ-10, трансформирующего фактора роста β (ТФРβ), введением в культуру моноцитов глюкокортикоидов или других индуцирующих толерогенность соедине-ний. Значительный вклад в появление толерогенных свойств у ДК вносят Т-рег. Эти механизмы не взаи-моисключаемы, поскольку ИЛ-10 и ТФРβ продуциру-ются, в частности Т-рег [5, 9, 22].

В данной работе исследовали формирование толе-рогенных свойств у ДК новорожденных детей и взрос-лых под действием ИЛ-10 и синтетического глюко-кортикоида дексаметазона (ДЕКС). Глюкокортикоиды – гормоны коры надпочечников с широким спектром биологической активности, включая противовоспали-тельное и иммуносупрессорное действие [2, 4]. Соз-данные на их основе медицинские препараты широко используются при различных отклонениях в работе иммунной системы, приводящих к неконтролируемой активации иммунокомпетентных клеток, особенно при аутоиммунных заболеваниях, аллергиях и реакциях от-торжения аллотрансплантанта. Первоначально внима-ние исследователей было сфокусировано на эффекте глюкокортикоидов по отношению к Т-лимфоцитам, что объясняло их терапевтические свойства, но результаты более поздних исследований показали иннгибирующее воздействие также и на ДК. В частности, глюкокорти-коиды изменяют ход созревания ДК при ответе на ли-ганды TLR и на CD40L. При этом они снижают экс-прессию молекул CD80 и CD86, подавляют продукцию ИЛ-12 и стимулируют продукцию ИЛ-10 [13, 20, 21]. Синтетический аналог глюкокортикоидов ДЕКС оказы-вает действие на ЛПС-индуцированное созревание ДК. Особенно мощный эффект наблюдается при совмест-ном использовании ДЕКС и 1α-дигидроксида витамина D3. Моноцитарные ДК, дифференцировка которых про-ходила в присутствии ДЕКС и 1α-дигидроксивитамина D3, после активации ЛПС имеют низкие стимулирую-щие свойства по отношению к аллогенным лимфоци-там, схожие со свойствами незрелых ДК, однако в от-личие от последних они активно продуцируют ИЛ-10 и синтезируют мРНК молекул ILT4 [15, 18].

Материалы и методы. ДК получали из моноцитов пу-повинной крови здоровых доношенных новорожденных и венозной крови здоровых взрослых лиц. Из проб стериль-ной гепаринизированной крови выделяли мононуклеарные клетки над слоем Hystopaque-1077 («Sigma», США), клетки отмывали средой DME («Sigma», США) и готовили суспен-зию клеток концентрацией 5 ∙ 106 клеток/мл на среде DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Биолот», Санкт-Петербург). Клетки засевали в 24-луночные планше-ты («Costar», США) и инкубировали 3 ч при 37oC и 5% СО2. Затем неадгезировавшиеся клетки осторожно смывали с по-верхности пластика тремя порциями среды DME, в лунки с моноцитами вносили среду DME с 10% ЭТС, L-глутамином, β-меркаптоэтанолом и пируватом натрия. Для индукции со-зревания ДК в лунки добавляли рекомбинантные ГМ-КСФ (100 нг/мл; «Biosource», США) и ИЛ-4 (20 нг/мл; «Sigma», США). В отдельные лунки с указанными выше стимулято-рами вносили натриевую соль фосфата ДЕКС (0,4 мкг/мл; KRKA, «Словения») или рекомбинантный человеческий ИЛ-10 (20 и 100 нг/мл; «Biosource», США). Моноциты, росшие без всех цитокинов и ДЕКС, использовали в качестве контро-

КлЕТочНАя ИММуНологИя

– 31 –

ля. На 3-и сутки культивирования к созревающим ДК повтор-но добавляли ИЛ-4 и ГМ-КСФ и клетки культивировали еще 3 сут, в результате чего получали незрелые ДК.

Для постановки двухстадийной смешанной лимфоцитар-ной реакции (СЛР) незрелые ДК разделяли на две части: одна часть клеток (обычные ДК и ДК, которые культивировали в присутствии ДЕКС или ИЛ-10) в дальнейшем использова-ли для первого этапа стимуляции аллогенных лимфоцитов, другую (только обычные ДК) – для второго этапа. К ДК для первого этапа добавляли стимуляторы терминального созре-вания: ЛПС Salmonella typhi (1 мкг/мл; отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Москва) и/или рекомбинантный фактор некроза опухоли α (ФНОα) (10 нг/мл; «Sigma», США). В культуры ДК для второго этапа вновь добавляли ИЛ-4 и ГМ-КСФ. ДК для первого этапа инкуби-ровали с ФНОα и/или ЛПС 1 сут, затем собирали, дважды отмывали и добавляли к аллогенным лимфоцитам взрослых здоровых лиц. Для этого лимфоциты венозной крови засе-вали в лунки 24-луночных планшетов в среде DME с 10% ЭТС и L-глутамином в концентрации 1,5 ∙ 106 клеток/мл и в часть лунок добавляли ДК в концентрации 6 ∙ 104 клеток/мл. Культивировали в течение 4 сут, затем клетки собирали, осаждали центрифугированием и пересевали в свежей среде в 96-луночные планшеты (содержимое 1 лунки 24-луночного планшета в 3 лунки 96-луночного) с добавлением новой пор-ции ДК, предназначенных для второго этапа стимуляции. Для второго этапа использовали ДК, которые культивирова-ли в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 10 сут плюс 1 сут в присутствии ЛПС и ФНОα.

По истечении 3 сут пробы среды из культур клеток со-бирали для определения содержания в ней интерферона (ИФН-γ) и для оценки пролиферации в лунки добавляли по 0,5 мк Кюри меченного тритием метилтимидина («Изотоп», Санкт-Петербург) на 24 ч. После культивирования планшеты замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на стекловолокнистые фильтры («Titertek», США) и анали-

зировали с помощью β-сцинцилляционного счетчика СБС-2. Результаты выражали в импульсах в 1 мин (имп/мин). Про-дукцию ИФН оценивали с помощью иммуноферментных тест-систем ИФА-ИФН-γ («Вектор-Бест», Новосибирск).

Наряду с описанным выше двухэтапным вариантом СЛР в работе также изучали вариант реакции, в которой к лим-фоцитам одновременно добавляли как обычные ДК, так и ДК, модулированные ДЕКС или ИЛ-10. Для сравнения ис-пользовали варианты культур лимфоцитов без добавления ДК, а также с добавлением только обычных или только мо-дулированных ДК. Все варианты ДК были получены инку-бированием моноцитов с ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 6 сут с модуляторами или без них, а затем стимуляцией ЛПС или ФНОα в течение 1 сут. При постановке СЛР концентрация лимфоцитов составляла 1,5 ∙ 106 клеток/мл. Каждый из типов ДК вносили к лимфоцитам в концентрации 6 ∙ 104 клеток/мл. Все варианты культур засевали в триплетах в 96-луночные планшеты. Пробы для определения содержания ИФН-γ от-бирали через 3 сут после засева и в лунки вносили меченный тритием метилтимидин на следующие 24 ч.

Для исследования экспрессии мембранных маркеров ис-пользовали обычные и модулированные ДК, росшие 7 сут с ИЛ-4 и ГМ-КСФ, а затем – 2 сут с ЛПС и ФНОα. Клетки окрашивали моноклональными антителами к HLA-DR, CD14 («Иммуносорбент», Москва), CD80, CD86 («Beckman Coulter Corp.», Франция) и CD83 («BD Biosciences Immunocytometry Systems», США), меченными ФИТЦ или фикоэритрином. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитоф-люориметре FacsCalibur («BD Biosciences Immunocytometry Systems», США) в режиме двухцветной цитометрии. Резуль-таты обрабатывали с помощью программного обеспечения CellQuest и WinMDI 2.8.

Р е з у л ь т а т ы . В данной работе ДК получали из моноцитов венозной крови взрослых лиц и пуповин-ной крови новорожденных детей культивированием с ИЛ-4 и ГМ-КСФ, а затем с ЛПС и ФНОα. Далее та-

кие клетки обозначены, как обыч-ные ДК. В отдельные варианты культур в соответствии с задачами экспериментов, помимо стимули-рующих цитокинов и активаторов созревания, добавляли вещества с модулирующей активностью: ИЛ-10 (далее эти клетки обозна-чены как ДК-ИЛ-10) или синтети-ческий аналог глюкокортикоидов ДЕКС (клетки обозначены как ДК-ДЕКС).

Культивирование моноцитов при различных условиях приводило к приобретению характерных мор-фологических признаков, варьи-рующих в зависимости от исполь-зованных модуляторов (рис. 1, а). Практически во всех культурах размер клеток увеличивался в 1,5–2 раза, заметно возрастало количество гранул в цитоплазме. В культурах обычных ДК наблюдали кластер-ные скопления клеток, имеющих от-четливую дендритную морфологию (pиc. 1, б). По краям плазмалеммы клеток появлялись короткие тонкие отростки, видимые в микроскоп с модуляционным фазовым контра-стом. Культуры ДК-ДЕКС суще-ственно отличались от описанных

Рис. 1. Микрофотографии культур ДК, полученных из моноцитов культивированием в течение 7 сут в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ и активацией ФНОα ЛПС в течение 2 сут.а – моноциты, культивировавшиеся без стимуляторов созревания; б – обычные ДК; в – ДК-ДЕКС; г – ДК-ИЛ-10. Ув. 200, модуляционный фазовый контраст.

ИММуНологИя № 1, 2012

– 32 –

выше – абсолютно не наблюдали кластеров, при этом клетки крайне прочно адгезировались на пластике, имея, как правило, звездчатую или реже веретеновидную фор-му (рис. 1, в). Применение ИЛ-10 в качестве модулятора на этапе созревания ДК приводило к появлению боль-шого количества веретеновидных клеток, прочно сце-пленных с пластиком планшет (рис. 1, г).

В результате анализа фенотипа полученных клеток с использованием лазерной проточной цитофлюори-метрии установили, что на мембране обычных ДК де-тей и взрослых увеличивалась плотность экспрессии молекул антигенпрезентации и костимуляции (данные не приведены) и возрастал процент клеток, несущих молекулы CD80, CD83 и CD86 (рис. 2). Экспрессия моноцитарного маркера – молекулы CD14, напротив, резко снижалась и, как правило, проявлялась не более чем на 4% клеток. Существенных различий фенотипа ДК детей и взрослых не отметили, за исключением несколько меньшего уровня экспрессии CD86 на ДК новорожденных (см. рис. 2).

Культивирование созревающих ДК с ДЕКС или ИЛ-10 существенно изменяло фенотип клеток. Так, культуры ДК-ДЕКС новорожденных характеризова-лись повышенным содержанием CD14+-клеток (61,7 ± 7%). Уровень клеток, позитивных по данному маркеру в культурах ДК-ИЛ-10 при использовании ИЛ-10 в кон-центрации 100 нг/мл, также оказался повышенным, но был в 2 раза ниже, чем в ДК-ДЕКС. Культуры ДК-ИЛ-10 новорожденных не отличались от обычных ДК по содержанию СD86-позитивных клеток. Влияние ДЕКС на экспрессию этой костимулирующей молекулы, как и ожидалось, оказалось супрессорным, и доля CD86+ ДК-ДЕКС не превышала 45,3%. Экспрессия CD83 модулированными ДК новорожденных подчинялась иным закономерностям, и наибольший супрессивный эффект на экспрессию этой молекулы продемонстри-ровал ИЛ-10. При воздействии ИЛ-10 на стадии со-зревания ДК происходило резкое падение экспрессии CD83 до нескольких процентов, тогда как в культурах ДК-ДЕКС доля СD83+-клеток была достоверно сниже-на, но оставалась на уровне 15,6% (см. рис. 2).

Таким образом, инкубирование созревающих ДК с ИЛ-10 и ДЕКС замедляло созревание ДК, что про-являлось в сохранении CD14, и приводило к форми-рованию так называемого толерогенного фенотипа, характеризующегося низким уровнем экспрессии мо-лекул костимуляции.

С целью изучения функциональных особенностей обычных и модулированных ДК новорожденных и взрослых применяли СЛР с аллогенными лимфоци-тами. Культивирование лимфоцитов с ДК проводили в течение 4 сут. Обычные ДК продемонстрировали мощную стимулирующую активность по отношению к аллогенным лимфоцитам, что проявлялось в зна-чительном увеличении пролиферации и продукции ИФН-γ (рис. 3). ДК-ДЕКС были практически лишены митогенной активности, а также способности к индук-ции ИФН-γ, ДК-ИЛ-10 не обладали митогенной актив-ностью, но сохраняли способность стимулировать про-дукцию ИФН-γ. Такие особенности были характерны для модулированных ДК как взрослых, так и детей.

При совместном культивирование аллогенных лимфоцитов со смесью модулированных и обычных ДК выявили различия в свойствах ДК взрослых и де-тей. Показано, что при конкурентном взаимодействии модулированных и обычных ДК новорожденных де-тей не наблюдается подавления пролиферации и про-дукции ИФН-γ лимфоцитами, тогда как ДК-ДЕКС взрослых при конкуренции с обычными ДК подавляли продукцию ИФН-γ при использовании ФНОα в каче-стве активатора ДК (см. рис. 3). Подавления пролифе-ративного ответа в культурах, в которых конкурентно взаимодействовали модулированные и обычные ДК, как взрослых, так и детей, не выявили.

Для определения толерогенной функции мы при-менили оригинальную методику, позволяющую оце-нить степень влияния потенциально толерогенных модулированных ДК на способность лимфоцитов отвечать на повторную активацию тем же набором антигенов. Для этого проводили двухэтапную СЛР, в которой аллогенные лимфоциты венозной крови взрослых доноров последовательно стимулировали различными ДК. На первом этапе лимфоциты сокуль-тивировали с модулированными ДК или обычными

Рис. 2. Количество (в %) обычных ДК детей и взрослых (верхняя диаграмма), несущих мембранные молекулы CD14, CD80, CD83, CD86 и HLA-DR, и нижняя диаграмма – фенотип модулированных ДК новорожденных детей.Звездочка – статистически значимые отличия ДК новорожденных от ДК взрослых.

КлЕТочНАя ИММуНологИя

– 33 –

ДК, на втором во все эти культуры добавляли только обычные ДК, сингенные клеткам, которые использо-вали на первом этапе. Все ДК культивировали в иден-тичных условиях и соответственно презентировали одинаковый набор антигенов.

По нашему предположению, лимфоциты в ответ на стимуляцию аллоантигенами обычных ДК размно-жаются на первом этапе СЛР и при повторной стиму-ляции теми же антигенами на втором этапе реакции дают мощный ответ. В то же время после контакта с аллоантигенами модулированных ДК, обладающих то-

лерогенными свойствами, лимфоциты полу-чают от этих клеток супрессорные сигналы и снижают свою способность отвечать на те же антигены при повторной стимуляции.

На рис. 4 представлены пролиферация и продукция ИФН-γ лимфоцитами на втором этапе СЛР после добавления обычных сти-мулирующих ДК. Совместное культивиро-вание модулированных ДК с аллогенными лимфоцитами на первом этапе накладывает отпечаток на функциональные свойства лим-фоцитов. В результате лимфоциты, росшие на первом этапе с ДК-ДЕКС или с ДК, об-работанными высокой концентрацией ИЛ-10, отвечали на повторную стимуляцию зна-чительно слабее, чем лимфоциты, росшие с обычными ДК. Пролиферативный ответ в таких культурах был в 1,5 раза ниже, чем в культурах с обычными ДК. Неожиданные результаты получены при исследовании дей-ствия ДК новорожденных детей, модулиро-ванных низкой дозой ИЛ-10. Такие ДК не снижали, а достоверно усиливали пролифе-ративный ответ лимфоцитов на втором этапе СЛР. Аналогичные ДК взрослых не оказыва-ли действия на способность лимфоцитов к пролиферации.

Контакт лимфоцитов с ДК-ДЕКС суще-ственно снижал их возможность к продукции ИФН-γ в ответ на обычные ДК: концентра-ция этого цитокина в культурах лимфоцитов, инкубированных на первом этапе СЛР с ДК-ДЕКС, была в 2 раза ниже, чем в культурах, росших с обычными ДК (см. рис. 3). Разли-чий между модулированными ДК взрослых и новорожденных в плане стимуляции про-дукции ИФН-γ в двухэтапной СЛР не выяви-ли (данные не приведены).

Во всех описанных выше экспериментах, направленных на сравнение толерогенных свойств ДК детей и взрослых, в качестве от-вечающих клеток мы использовали только лимфоциты взрослых лиц. В отдельном экс-перименте с двухэтапной СЛР исследовали действие модулированных и обычных ДК де-тей на аллогенные лимфоциты новорожден-ных. Показано, что модулированные ДЕКС и ИЛ-10 ДК новорожденных при контакте с Т-лимфоцитами новорожденных демонстри-руют ярко выраженные толерогенные свой-ства (рис. 5).

О б с у ж д е н и е . Показано, что ДК но-ворожденных детей обладают рядом осо-бенностей, отличающих их от ДК взрослых.

Несмотря на то что модулированные ДК детей имеют толерогенный фенотип, они не подавляют пролифе-рацию и цитокинпродукцию лимфоцитов при конку-рентном взаимодействии с обычными ДК, тогда как модулированные ДК взрослых в аналогичных услови-ях угнетают продукцию ИФН-γ лимфоцитами. При по-следовательном влиянии модулированных и обычных ДК на лимфоциты установлено, что модулированные ДК как детей, так и взрослых снижают способность лимфоцитов пролиферировать и продуцировать ИФН.

Рис. 3. Пролиферативный ответ и продукция (в пг/мл) ИФН-γ в 4-суточной СЛР.ДК получали культивированием в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ с ДЕКС, ИЛ-10 или без них, а затем активировали ФНОα или ЛПС. Полученные варианты ДК вносили в СЛР по отдельности или в смеси.Пролиферация представлена в индексах подавления (за единицу приняты значения СЛР с обычными ДК, активированными ЛПС). Здесь и на рис. 5: звездочка – статисти-чески достоверное отличие от ДК (р < 0,05).

ИММуНологИя № 1, 2012

– 34 –

Выявленные особенности ДК детей могут иметь непосредственное отношение к специфическим для периода новорожденности процессам формирования периферического отдела иммунной системы. В орга-низме ребенка после рождения наблюдается сдвиг в механизме увеличения количества Т-клеток. Принци-пиальное изменение источника нарастания пула лим-фоцитов происходит в результате уменьшения вкла-да внутритимусной пролиферации и значительного усиления пролиферации посттимических Т-клеток на периферии [16, 17]. Учитывая тот факт, что процессы посттимической пролиферации Т-лимфоцитов нахо-дятся под гомеостатическим контролем с непосред-ственным участием антигенпрезентирующих клеток, полагаем, что роль ДК является определяющей. По-скольку полученные нами модулированные ДК ново-

рожденных обладают менее выраженными супрес-сорными свойствами, можно предположить, что эта особенность отражается в реакциях гомеостатическо-го контроля. Вероятно, у новорожденных детей имеет место так сказать лояльный контроль размножения Т-лимфоцитов на периферии иммунной системы со стороны ДК.

лИТераТУра1. Талаев В. Ю., Бабайкина О. К, Ломунова М. А. и др. Функ-

циональные свойства моноцитарных дендритных клеток но-ворожденных в краткосрочных культурах // Иммунология. – 2008. – Т. 29, № 3. – С. 141–147.

2. Ahmadpoor P., Ghasemmahdi L., Makhdoomi К., Ghafari A. Ef-fect of active vitamin D on expression of co-stimulatory mol-ecules and HLA-DR in renal transplant recipients // Exp. Clin. Transplant. – 2009. – Vol. 2. – P. 99–103.

3. Caielli S., Conforti-Andreoni C., Di Pietro C. et al. On/off TLR signaling decides proinflammatory or tolerogenic dendritic cell maturation upon CD1d-mediated interaction with invariant NKT cells // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185, N 12. – P. 7317–7329.

4. Cools N., Ponsaerts P., Van Tendeloo V., Berneman Z. Balancing between immunity and tolerance: an interplay between dendritic cells, regulatory T cells and effector T cells // J. Leukoc. Biol. – Vol. 82. – P. 567–573.

5. De Smedt Т., Van Mechelen M., De Becker G. et al. Effect of interleukin-10 on dendritic cell maturation and function // Eur. J. Immunol. – 1997. – Vol. 5. – P. 1229–1235.

6. Fujimoto Y., Tedder T. F. CD83: a regulatory molecule of the im-mune system with great potential for therapeutic application // J. Med. Dent. Sci. – 2006. – Vol. 53, N 2. – P. 85–93.

7. Gregori S. Dendritic cells in networks of immunological toler-ance // Tissue Antigens. – 2011. – Vol. 77, N 2. – P. 89–99.

Рис. 4. Результат двухэтапной СЛР.К лимфоцитам на первом этапе добавляли указанные под гисто-граммой варианты ДК, на втором – обычные ДК; контроль – лим-фоциты без ДК.Верхняя диаграмма – пролиферация (в имп/мин); нижняя – продукция ИФНγ, представленная в индексах подавления (за единицу приняты значения культур, к которым на обоих этапах добавляли обычные ДК). Звездочка – достоверные отличия от культур, к которым на обоих эта-пах добавляли обычные ДК; стрелка – различия ДК детей и взрослых (р < 0,05).

Рис. 5. Ответ аллогенных лимфоцитов новорожденного на обычные и модулированные ДК новорожденного в двухэтапной СЛР. Обозна-чения аналогичны рис. 4.а – пролиферативный ответ (в имп/мин); б – продукция (в пг/мл) ИФН-γ.

рЕгуляЦИя ИММуНИТЕТА

– 35 –

8. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L. et al. Antigen presen-tation and T cell stimulation by dendritic cells // Annu. Rev. Im-munol. – 2002. – Vol. 20. – P. 621–667.

9. Hu J., Wan Y. Tolerogenic dendritic cells and their potential ap-plications // Immunology. – 2011. – Vol. 10. – P. 1365–2567.

10. Karakhanova S., Meisel S., Ring S. et al. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets // Eur. J. Immunol. – 2010. – Vol. 40, N 1. – P. 254–266.

11. Mackall С. V., Bare L. A., Granger S. O., Sharrow J. A. Thymic-independent T cell regeneration occurs via antigen-driven expan-sion of peripheral T cells resulting in a repertoire that is limited in diversity and prone to skewing // J. Immunol. – Vol. 156. – P. 4609–4616.

12. Manavalan J. S., Rossi P. C., Vlad G. et al. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells // Transplant. Immunol. – 2003. – Vol. 11. – P. 245–258.

13. Matyszak M.K., Citterio S., Rescigno M., Ricciardi-Castagnoli P. Differential effects of corticosteroids during different stages of dendritic cell maturation // Eur. J. Immunol. – 2000. – Vol. 4. – P. 1233–1242.

14. Orabona C., Grohmann U. Indoleamine 2,3-dioxygenase and regulatory function: tryptophan starvation and beyond // Meth. Mol. Biol. – 2011. – Vol. 677. – P. 269–280.

15. Pedersen A. E., Schmidt E. G., Gad M. et al. Dexamethasone/1alpha-25-dihydroxyvitamin D3-treated dendritic cells suppress colitis

in the SCID T-cell transfer model // Immunology. – 2009. – Vol. 127, N 3. – P. 354–364.

16. Schdnland S. O., Zimmer J. K., Lopez-Benitez С. М. et al. Ho-meostatic control of T-cell generation in neonates // Blood. – 2003. – Vol. 102, N 4. – P. 1428–1434.

17. Sprent J., Lo D., Gao E. K., Ron Y. T cell selection in the thymus // Immunol. Rev. – 1988. – Vol. 101. – P. 173–190.

18. Steinman R. M., Hawiger D., Nussenzweig M. C. Tolerogenic dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 21. – P. 685–711.

19. Taylor A., Verhagen J., Blaser K. et al. Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-b: the role of T regulatory cells // Immunology. – 2006. – Vol. 117. – P. 433–442.

20. Van den Heuvel M. M., van Beek N. M., Broug-Holub E. et al. Glucocorticoids modulate the development of dendritic cells from blood precursors // Clin. Exp. Immunol. – 1999. – Vol. 3. – P. 577–583.

21. Xia C. Q., Peng R., Beato F., Clare-Salzler M. J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity // Scand J. Immunol. – 2005. – Vol. 1. – P. 45–54.

22. Zen M., Canova M., Campana C. et al. The kaleidoscope of glu-corticoid effects on immune system // Autoimmun. Rev. – 2011. – Vol. 4. – P. 234–240.

Поступила 27.06.11

РегУЛяЦИя ИММУНИТеТа

© с. ю. сМОленцев, 2012

УдК 615.276.4.03:619

С. Ю. Смоленцев

пРИМененИе лечебнО-пРОфИлАКтИчесКОгО ИММУнОглОбУлИнА для пОвЫШенИя вРОжденнОгО И АдАптИвнОгО ИММУнИтетА сельсКОхОзяйственнЫх жИвОтнЫх

Кафедра генетики, селекции и воспроизводства животных гОУ ВПО Марийский государственный университет (424000, г. Йошкар-Ола, пл. Ленина, д. 1)

Результаты исследований показали, что наиболее значительное повышение показателей специфиче-ской и неспецифической резистентности организма отмечалось при применении препарата “Лечебно-профилактический иммуноглобулин”. Рекомендуется его применение для повышения иммунитета и профилактики иммунодефицитных состояний животных.

К л ю ч е в ы е с л о в а : иммунитет, повышение, показатель, лечебно-профилактический иммуноглобулин

Smolentsev S.Yu. THE APPLICATIoN of THERAPEUTIC-AND- PRoPHyLACTIC ImmUNoGLoBULIN foR THE ImPRovEmENT of CoNGENITAL AND ADAPTIvE ImmUNITy IN AGRICULTURAL ANImALS

The results of relevant investigations give evidence that the application of the “therapeutic-and-prophylactic immunoglobulin” preparation considerably improves the parameters characterizing specific and non-specific resistance of the organism. This preparation can be recommended for the promotion of immunity and prevention of the development of immunodeficiency in agricultural animals.

K e y w o r d s : immunity, promotion, characteristics, therapeutic-and-prophylactic immunoglobulin

Состояние иммунной системы, как и любого другого органа, характеризуется комплексом мор-фологических, функциональных и клинических по-

казателей, присущих иммунной системе в норме и они определяют иммунный статус [1, 3]. Изменение какого-либо одного или нескольких показателей свидетельствует о нарушении иммунного статуса, т. е. отклонении его от нормы, и трактуется как имму-нодефицит [2].смоленцев сергей Юрьевич – ст. препод., e-mail: aft@marsu.ru