Performa tinggi kromatografi cair (atau tekanan tinggi kromatografi cair, HPLC) adalah kromatografi teknik yang dapat memisahkan campuran senyawa dan digunakan dalam biokimia dan kimia analitik untuk mengidentifikasi, mengukur dan memurnikan masing-masing komponen campuran.

HPLC typically utilizes different types of stationary phases, a pump that moves the mobile phase(s) and analyte through the column, and a detector that provides a characteristic retention time for the analyte. HPLC biasanya menggunakan berbagai jenis fasa diam, sebuah pompa yang bergerak fase mobile (s) dan analit melalui kolom, dan detektor yang menyediakan waktu retensi karakteristik untuk analit. The detector may also provide other characteristic information (ie UV/Vis spectroscopic data for analyte if so equipped). Detektor dapat juga memberikan informasi karakteristik lainnya (yaitu UV / Vis data spektroskopi untuk analit jika demikian dilengkapi). Analyte retention time varies depending on the strength of its interactions with the stationary phase, the ratio/composition of solvent(s) used, and the flow rate of the mobile phase. waktu retensi analit bervariasi tergantung pada kekuatan interaksi dengan fase diam, rasio / komposisi pelarut (s) yang digunakan, dan laju alir fase gerak.

With HPLC, a pump (rather than gravity) provides the higher pressure required to propel the mobile phase and analyte through the densely packed column. Dengan HPLC, pompa (bukan gravitasi) memberikan tekanan yang lebih tinggi diperlukan untuk menggerakkan fase gerak dan analit melalui kolom padat. The increased density arises from smaller particle sizes. Kepadatan meningkat timbul dari ukuran partikel yang lebih kecil. This allows for a better separation on columns of shorter length when compared to ordinary column chromatography. Hal ini memungkinkan untuk pemisahan yang lebih baik pada kolom panjang lebih pendek bila dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa.

Operasi

The sample to be analyzed is introduced in small volume to the stream of mobile phase. sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil untuk aliran fase gerak. The solution movement through the column is slowed by specific chemical or physical interactions with the stationary phase present within the column. Gerakan solusi melalui kolom diperlambat oleh kimia tertentu atau interaksi fisik dengan fase diam yang hadir di dalam kolom. The velocity of the solution moves depends on the nature of the sample and on the compositions of the stationary (column) phase. Kecepatan bergerak solusi tergantung pada sifat sampel dan pada komposisi dari fase (kolom) stasioner. The time at which a specific sample elutes (comes out of the end of the column) is called the retention time; the retention time under particular conditions is considered an identifying characteristic of a the given sample. Waktu di mana suatu elutes sampel tertentu (yang keluar dari ujung kolom) disebut waktu retensi, waktu retensi dalam kondisi tertentu dianggap sebagai mengidentifikasi karakteristik dari suatu sampel yang diberikan. The use of smaller particle size column packing (which creates higher backpressure) increases the linear velocity giving the components less time to diffuse within the column, improving the chromatogram resolution. Penggunaan kolom ukuran partikel kemasan lebih kecil

(yang menciptakan backpressure lebih tinggi) meningkatkan linear kecepatan memberikan komponen lebih sedikit waktu untuk menyebar di dalam kolom, meningkatkan kromatogram resolusi. Common solvents used include any miscible combination of water or various organic liquids (the most common are methanol and acetonitrile ). Umum pelarut digunakan termasuk kombinasi larut dalam air atau cairan berbagai organik (yang paling umum adalah metanol dan asetonitril ). Water may contain buffers or salts to assist in the separation of the sample components, or compounds such as trifluoroacetic acid which acts as an ion pairing agent. Air mungkin mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen sampel, atau senyawa, seperti asam trifluoroacetic yang bertindak sebagai agen pasangan ion.

A further refinement of HPLC is to vary the mobile phase composition during the analysis; gradient elution . Sebuah perbaikan lebih lanjut HPLC adalah memvariasikan komposisi fase gerak selama analisis tersebut; elusi gradien. A normal gradient for reversed phase chromatography might start at 5% methanol and progress linearly to 50% methanol over 25 minutes; the gradient depends on how hydrophobic the sample is. Sebuah gradien normal untuk kromatografi fase terbalik mungkin mulai di% metanol 5 dan kemajuan linear menjadi metanol 50% lebih dari 25 menit; gradien tergantung pada seberapa hidrofobik sampel. The gradient separates the sample mixtures as a function of the affinity. gradien memisahkan campuran sampel sebagai fungsi dari afinitas. This partitioning process is similar to that which occurs during a liquid-liquid extraction but is continuous, not step-wise. Proses partisi ini mirip dengan yang terjadi selama ekstraksi cair-cair tetapi terus menerus, tidak langkah-bijaksana. In this example, using a water/methanol gradient, more hydrophobic components will elute (come off the column) when the mobile phase consists mostly of methanol (giving a relatively hydrophobic mobile phase). Dalam contoh ini, dengan menggunakan air / gradien metanol, komponen hidrofobik lebih akan mengelusi (datang dari kolom) ketika fase gerak terdiri sebagian besar dari metanol (memberikan mobile fase hidrofobik relatif).

The choice of solvents, additives and gradient depend on the nature of the column and sample. Pemilihan pelarut, aditif dan gradien tergantung pada sifat dari kolom dan sampel. Often a series of tests are performed on the sample together with a number of trial runs in order to find the HPLC method which gives the best peak separation. Seringkali serangkaian tes yang dilakukan pada sampel bersama-sama dengan sejumlah uji coba untuk menemukan metode KCKT yang memberikan pemisahan puncak terbaik.

[ edit ] Types [ sunting ] Jenis

[ edit ] Partition chromatography [ sunting ] kromatografi Partisi

A modern self contained HPLC. Sebuah HPLC terkandung modern sendiri. In this picture; an Agilent 1200 connected to a PC Dalam gambar ini, sebuah Agilent 1200 terhubung ke PC

Partition chromatography was the first kind of chromatography that chemists developed. kromatografi partisi adalah jenis pertama dari kromatografi yang dikembangkan kimiawan. The partition coefficient principle has been applied in paper chromatography , thin layer chromatography , gas phase and liquid-liquid applications. The koefisien partisi Prinsip telah diterapkan di kromatografi kertas , kromatografi lapis tipis , fasa gas -cair dan aplikasi cair. The 1952 Nobel Prize in chemistry was earned by Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge for their development of the technique, which was used for their separation of amino acids . Tahun 1952 Hadiah Nobel di bidang kimia telah diperoleh oleh Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge bagi perkembangan mereka dari teknik, yang digunakan untuk pemisahan mereka dari asam amino . Partition chromatography uses a retained solvent, on the surface or within the grains or fibres of an "inert" solid supporting matrix as with paper chromatography ; or takes advantage of some additional coulombic and/or hydrogen donor interaction with the solid support. kromatografi partisi menggunakan pelarut dipertahankan, di permukaan atau di dalam biji-bijian atau serat dari sebuah "inert" solid matrik pendukung seperti kromatografi kertas , atau mengambil keuntungan dari beberapa tambahan muatan dan / atau hidrogen donor interaksi dengan dukungan solid. Molecules equilibrate (partition) between a liquid stationary phase and the eluent. Molekul menyetimbangkan (partisi) antara fase diam cair dan eluen. Known as Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) in HPLC, this method separates analytes based on polar differences. Dikenal sebagai Hidrofilik Interaksi Kromatografi (HILIC) dalam HPLC, metode ini memisahkan analit berdasarkan perbedaan kutub. HILIC most often uses a bonded polar stationary phase and a non-polar, water miscible , mobile phase. HILIC paling sering menggunakan kutub terikat fase diam dan-polar, air yang tidak larut , fase gerak. Partition HPLC has been used historically on unbonded silica or alumina supports. HPLC partisi telah digunakan historis pada silika tak terikat atau mendukung alumina. Each works effectively for separating analytes by relative polar differences, however, HILIC has the advantage of

separating acidic , basic and neutral solutes in a single chromatogram. Masing-masing bekerja secara efektif untuk memisahkan analit oleh perbedaan kutub relatif, bagaimanapun, HILIC memiliki keuntungan dari memisahkan asam , dasar netral zat terlarut dan dalam kromatogram tunggal.

The polar analytes diffuse into a stationary water layer associated with the polar stationary phase and are thus retained. The polar analit berdifusi ke lapisan air yang diam yang terkait dengan fase diam polar dan karena itu ditahan. Retention strengths increase with increased analyte polarity, and the interaction between the polar analyte and the polar stationary phase (relative to the mobile phase) increases the elution time. Retensi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. The interaction strength depends on the functional groups in the analyte molecule which promote partitioning but can also include coulombic (electrostatic) interaction and hydrogen donor capability. Kekuatan interaksi tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit yang mempromosikan partisi tetapi juga dapat mencakup muatan (elektrostatik) interaksi dan donor kemampuan hidrogen. Use of more polar solvents in the mobile phase will decrease the retention time of the analytes, whereas more hydrophobic solvents tend to increase retention times. Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan hidrofobik pelarut lebih cenderung meningkatkan waktu retensi.

[ edit ] Normal-phase chromatography [ sunting ]-tahap kromatografi Normal

For more details on this topic, see aqueous normal-phase chromatography . Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat normal-fase kromatografi air .

Also known as normal-phase HPLC (NP-HPLC), or adsorption chromatography, this method separates analytes based on adsorption to a stationary surface chemistry and by polarity. Juga dikenal sebagai fase normal HPLC (NP-HPLC), atau kromatografi adsorpsi, metode ini memisahkan analit berdasarkan adsorpsi ke kimia permukaan stasioner dan polaritas. It was one of the first kinds of HPLC that chemists developed. Itu adalah salah satu jenis pertama KCKT yang dikembangkan kimiawan. NP-HPLC uses a polar stationary phase and a non-polar, non-aqueous mobile phase, and works effectively for separating analytes readily soluble in non-polar solvents. NP-HPLC menggunakan fasa diam polar dan fase, non-polar mobile non-air, dan bekerja efektif untuk memisahkan analit mudah larut dalam pelarut non-polar. The analyte associates with and is retained by the polar stationary phase. Perusahaan asosiasi analit dengan dan dipertahankan oleh fase diam polar. Adsorption strengths increase with increased analyte polarity, and the interaction between the polar analyte and the polar stationary phase (relative to the mobile phase) increases the elution time. Adsorpsi kekuatan meningkat dengan polaritas analit meningkat, dan interaksi antara analit kutub dan fase diam polar (relatif terhadap fase gerak) meningkatkan waktu elusi. The interaction strength depends not only on the functional groups in the analyte molecule, but also on steric factors. Kekuatan interaksi tidak hanya tergantung pada kelompok-kelompok fungsional dalam molekul analit, tetapi juga pada faktor-faktor sterik. The effect of sterics on interaction strength allows this method to resolve

(separate) structural isomers . Pengaruh sterics pada kekuatan interaksi memungkinkan metode ini untuk menyelesaikan (terpisah) isomer struktural .

The use of more polar solvents in the mobile phase will decrease the retention time of the analytes, whereas more hydrophobic solvents tend to increase retention times. Penggunaan pelarut polar lebih dalam fase gerak akan menurunkan waktu retensi dari analit, sedangkan pelarut lebih hidrofobik cenderung meningkat kali retensi. Very polar solvents in a mixture tend to deactivate the stationary phase by creating a stationary bound water layer on the stationary phase surface. Sangat pelarut polar dalam campuran yang cenderung menonaktifkan fase diam dengan membuat lapisan air yang diam terikat pada permukaan fase diam. This behavior is somewhat peculiar to normal phase because it is most purely an adsorptive mechanism (the interactions are with a hard surface rather than a soft layer on a surface). Perilaku ini agak aneh bagi fasa normal karena sangat murni mekanisme serap (interaksi adalah dengan permukaan yang keras daripada lapisan lembut pada permukaan).

Partition and NP-HPLC fell out of favor in the 1970s with the development of reversed-phase HPLC because of a lack of reproducibility of retention times as water or protic organic solvents changed the hydration state of the silica or alumina chromatographic media. Partisi dan NP-HPLC jatuh dari kasih karunia di tahun 1970-an dengan perkembangan terbalik-fase HPLC karena kurangnya reproduksibilitas kali retensi sebagai air atau pelarut organik protik mengubah keadaan hidrasi silika atau alumina media kromatografi. Recently it has become useful again with the development of HILIC bonded phases which improve reproducibility. Baru-baru ini telah menjadi berguna lagi dengan perkembangan HILIC fase terikat yang meningkatkan reproduktifitas.

[ edit ] Displacement chromatography [ sunting ] Pemindahan kromatografi

The basic principle of displacement chromatography is: A molecule with a high affinity for the chromatography matrix (the displacer) will compete effectively for binding sites, and thus displace all molecules with lesser affinities. [ 1 ] There are distinct differences between displacement and elution chromatography. Prinsip dasar kromatografi perpindahan adalah: molekul dengan tinggi untuk afinitas kromatografi matriks (yang) displacer akan bersaing secara efektif untuk mengikat, situs dan dengan demikian menggantikan semua molekul dengan lebih rendah. kedekatan A [1] Ada perbedaan jelas antara perpindahan dan kromatografi elusi . In elution mode, substances typically emerge from a column in narrow, Gaussian peaks. Dalam mode elusi, zat biasanya muncul dari sebuah kolom dalam sempit, puncak Gaussian. Wide separation of peaks, preferably to baseline, is desired in order to achieve maximum purification. Wide pemisahan puncak, sebaiknya data dasar, yang diinginkan untuk mencapai pemurnian maksimal. The speed at which any component of a mixture travels down the column in elution mode depends on many factors. Kecepatan di mana setiap komponen campuran bergerak ke bawah kolom dalam modus elusi tergantung pada banyak faktor. But for two substances to travel at different speeds, and thereby be resolved, there must be substantial differences in some interaction between the biomolecules and the chromatography matrix. Tapi untuk dua zat untuk bepergian dengan kecepatan yang berbeda, dan dengan demikian dapat diselesaikan, harus ada perbedaan substansial dalam beberapa interaksi antara biomolekul dan

matriks kromatografi. Operating parameters are adjusted to maximize the effect of this difference. parameter operasi disesuaikan untuk memaksimalkan pengaruh dari perbedaan ini. In many cases, baseline separation of the peaks can be achieved only with gradient elution and low column loadings. Dalam banyak kasus, dasar pemisahan puncak dapat dicapai hanya dengan elusi gradien dan beban kolom rendah. Thus, two drawbacks to elution mode chromatography, especially at the preparative scale, are operational complexity, due to gradient solvent pumping, and low throughput, due to low column loadings. Jadi, dua kelemahan untuk kromatografi elusi mode, terutama pada skala preparatif, kompleksitas operasional, karena gradien memompa pelarut, dan throughput yang rendah, karena beban kolom rendah. Displacement chromatography has advantages over elution chromatography in that components are resolved into consecutive zones of pure substances rather than “peaks”. kromatografi Pemindahan memiliki keunggulan dibandingkan kromatografi elusi dalam komponen diselesaikan dalam zona berturut-turut zat murni bukan "puncak". Because the process takes advantage of the nonlinearity of the isotherms, a larger column feed can be separated on a given column with the purified components recovered at significantly higher concentrations. Karena proses mengambil keuntungan dari nonlinier dari isoterm, feed kolom yang lebih besar dapat dipisahkan pada kolom yang diberikan dengan komponen dimurnikan pulih pada konsentrasi yang lebih tinggi secara signifikan.

[ edit ] Reversed-phase chromatography (RPC) [ sunting ]-tahap kromatografi Terbalik (RPC)

A chromatogram of complex mixture (perfume water) obtained by reversed phase HPLC Sebuah kromatogram dari campuran kompleks (air parfum) yang diperoleh HPLC fasa terbalik For more details on this topic, see Reversed-phase chromatography . Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat -fase kromatografi Terbalik .

Reversed phase HPLC (RP-HPLC or RPC) has a non-polar stationary phase and an aqueous, moderately polar mobile phase. HPLC fasa terbalik (RP-HPLC atau RPC) memiliki fase stasioner non-polar dan fase, air bergerak agak polar. One common stationary phase is a silica which has been treated with RMe 2 SiCl, where R is a straight chain alkyl group such as C 18 H 37 or C 8 H 17 . Satu fase stasioner umum adalah silika yang telah diobati dengan RME 2 SiCl, dimana R adalah gugus alkil rantai lurus seperti C 18 H 37 atau C 8 H 17. With these stationary phases, retention time is longer for molecules which are more non-polar, while polar molecules elute more readily. Dengan fasa diam, waktu retensi lebih lama bagi molekul yang lebih non-

polar, sedangkan molekul polar mengelusi lebih mudah. An investigator can increase retention time by adding more water to the mobile phase; thereby making the affinity of the hydrophobic analyte for the hydrophobic stationary phase stronger relative to the now more hydrophilic mobile phase. Seorang penyidik dapat meningkatkan waktu retensi dengan menambahkan lebih banyak air ke fase bergerak; sehingga membuat afinitas dari analit hidrofobik untuk fase diam hidrofobik kuat relatif terhadap fase bergerak sekarang lebih hidrofilik. Similarly, an investigator can decrease retention time by adding more organic solvent to the eluent. Demikian pula, seorang penyelidik dapat menurunkan waktu retensi dengan menambahkan lebih pelarut organik eluen. RPC is so commonly used that it is often incorrectly referred to as "HPLC" without further specification. RPC sangat umum digunakan sehingga sering salah disebut sebagai "HPLC" tanpa spesifikasi lebih lanjut. The pharmaceutical industry regularly employs RPC to qualify drugs before their release. Industri farmasi secara teratur menggunakan RPC untuk memenuhi syarat obat sebelum rilis mereka.

RPC operates on the principle of hydrophobic forces, which originate from the high symmetry in the dipolar water structure and play the most important role in all processes in life science. RPC beroperasi pada prinsip kekuatan hidrofobik, yang berasal dari simetri tinggi dalam struktur air dipole dan memainkan peran paling penting dalam semua proses dalam ilmu kehidupan. RPC allows the measurement of these interactive forces. RPC memungkinkan pengukuran gaya-gaya interaktif. The binding of the analyte to the stationary phase is proportional to the contact surface area around the non-polar segment of the analyte molecule upon association with the ligand in the aqueous eluent. Pengikatan analit ke fase stasioner sebanding dengan luas permukaan kontak sekitar segmen non-polar dari molekul analit pada asosiasi dengan ligan dalam eluen air. This solvophobic effect is dominated by the force of water for "cavity-reduction" around the analyte and the C 18 -chain versus the complex of both. Ini solvophobic efek didominasi oleh kekuatan air untuk "pengurangan rongga-" sekitar analit dan C 18-rantai versus kompleks keduanya. The energy released in this process is proportional to the surface tension of the eluent (water: 7.3 × 10 −6 J /cm², methanol: 2.2 × 10 −6 J/cm²) and to the hydrophobic surface of the analyte and the ligand respectively. Energi yang dilepaskan dalam proses ini adalah sebanding dengan tegangan permukaan dari eluen (air: 7,3 × 10 -6 J / cm ², metanol: 2,2 × 10 -6 J / cm ²) dan permukaan hidrofobik dari analit dan ligan masing-masing . The retention can be decreased by adding a less polar solvent (methanol, acetonitrile ) into the mobile phase to reduce the surface tension of water. Gradient elution uses this effect by automatically reducing the polarity and the surface tension of the aqueous mobile phase during the course of the analysis. retensi ini dapat dikurangi dengan menambahkan sedikit pelarut polar (metanol, asetonitril ) ke dalam fase gerak untuk mengurangi tegangan permukaan air. elusi Gradient menggunakan efek ini dengan secara otomatis mengurangi polaritas dan tegangan permukaan fase gerak air selama kursus analisis.

Structural properties of the analyte molecule play an important role in its retention characteristics. sifat struktur pada molekul analit memainkan peran penting dalam karakteristik retensi. In general, an analyte with a larger hydrophobic surface area (CH, CC, and generally non-polar atomic bonds, such as SS and others) results in a longer retention time because it increases the molecule's non-polar surface area, which is non-interacting with the water structure. Secara umum, sebuah analit dengan luas permukaan yang lebih besar hidrofobik (CH, CC, dan obligasi atom umumnya non-

polar, seperti SS dan lain-lain) hasil dalam waktu retensi lebih lama karena meningkatkan permukaan non-polar molekul's area, yang tidak -berinteraksi dengan struktur air. On the other hand, polar groups, such as -OH, -NH 2 , COO - or -NH 3 + reduce retention as they are well integrated into water. Di sisi lain, kelompok polar, seperti-OH,-NH 2, COO - atau-NH 3 + mengurangi retensi seperti yang terintegrasi dengan baik ke dalam air. Very large molecules, however, can result in an incomplete interaction between the large analyte surface and the ligand's alkyl chains and can have problems entering the pores of the stationary phase. Sangat molekul besar, bagaimanapun, dapat mengakibatkan interaksi yang tidak lengkap antara permukaan analit besar dan rantai alkil ligan dan dapat memiliki masalah pori-pori memasuki fase diam.

Retention time increases with hydrophobic (non-polar) surface area. Retensi waktu meningkat dengan hidrofobik (non-polar) luas permukaan. Branched chain compounds elute more rapidly than their corresponding linear isomers because the overall surface area is decreased. senyawa rantai Branched mengelusi lebih cepat dari isomer yang berhubungan linear karena luas permukaan keseluruhan menurun. Similarly organic compounds with single CC-bonds elute later than those with a C=C or CC-triple bond, as the double or triple bond is shorter than a single CC-bond. Demikian pula senyawa organik dengan satu obligasi CC mengelusi kemudian dibandingkan dengan C = C atau ikatan CC-tiga, sebagai ikatan ganda atau tiga lebih pendek dari ikatan-CC tunggal.

Aside from mobile phase surface tension (organizational strength in eluent structure), other mobile phase modifiers can affect analyte retention. Selain dari fase tegangan permukaan mobile (kekuatan organisasi dalam struktur eluen), lain pengubah fase gerak dapat mempengaruhi retensi analit. For example, the addition of inorganic salts causes a moderate linear increase in the surface tension of aqueous solutions (ca. 1.5 × 10 −7 J/cm² per Mol for NaCl, 2.5 × 10 −7 J/cm² per Mol for (NH 4 ) 2 SO 4 ), and because the entropy of the analyte-solvent interface is controlled by surface tension, the addition of salts tend to increase the retention time. Misalnya, penambahan garam anorganik menyebabkan kenaikan linier moderat dalam tegangan permukaan larutan mengandung air (sekitar 1,5 × 10 -7 J ² cm / per Mol untuk NaCl, 2,5 × 10 -7 J ² cm / per Mol untuk (NH 4 ) 2 SO 4), dan karena entropi dari-pelarut antarmuka analit dikendalikan oleh tegangan permukaan, penambahan garam cenderung meningkatkan waktu retensi. This technique is used for mild separation and recovery of proteins and protection of their biological activity in protein analysis (hydrophobic interaction chromatography, HIC). Teknik ini digunakan untuk pemisahan ringan dan pemulihan protein dan perlindungan dari kegiatan biologis mereka dalam analisis protein (kromatografi interaksi hidrofobik, HIC).

Another important component is the influence of the pH since this can change the hydrophobicity of the analyte. Komponen penting lainnya adalah pengaruh pH karena ini dapat mengubah sifat hidrofobik analit. For this reason most methods use a buffering agent , such as sodium phosphate , to control the pH. Untuk alasan ini metode yang paling menggunakan agen buffering , seperti natrium fosfat , untuk mengendalikan pH. The buffers serve multiple purposes: they control pH, neutralize the charge on any residual exposed silica on the stationary phase and act as ion pairing agents to neutralize charge on the analyte. Ammonium formate is commonly added in mass spectrometry to improve detection of certain analytes by the formation

of ammonium adducts . Buffer melayani beberapa tujuan: mereka kontrol pH, menetralkan muatan pada setiap terpapar silika residual pada fase diam dan bertindak sebagai agen pasangan ion untuk menetralkan muatan analit. formate Amonium biasanya ditambahkan dalam spektrometri massa untuk meningkatkan deteksi analit tertentu dengan pembentukan amonium aduk . A volatile organic acid such as acetic acid , or most commonly formic acid , is often added to the mobile phase if mass spectrometry is used to analyze the column eluent. Trifluoroacetic acid is used infrequently in mass spectrometry applications due to its persistence in the detector and solvent delivery system, but can be effective in improving retention of analytes such as carboxylic acids in applications utilizing other detectors, as it is one of the strongest organic acids. Suatu asam organik yang mudah menguap seperti asam asetat , atau paling sering asam format , sering ditambahkan ke fase mobile jika spektrometri massa digunakan untuk menganalisis kolom eluen. Trifluoroacetic asam yang jarang digunakan dalam aplikasi spektrometri massa karena kegigihan dalam detektor dan sistem pengiriman pelarut, tetapi dapat secara efektif meningkatkan retensi analit seperti asam karboksilat dalam aplikasi menggunakan detektor lainnya, karena merupakan salah satu asam organik kuat. The effects of acids and buffers vary by application but generally improve the chromatography. Pengaruh asam dan buffer berbeda-beda oleh aplikasi namun pada umumnya meningkatkan kromatografi.

Reversed phase columns are quite difficult to damage compared with normal silica columns; however, many reversed phase columns consist of alkyl derivatized silica particles and should never be used with aqueous bases as these will destroy the underlying silica particle. kolom fase Terbalik cukup sulit untuk kerusakan dibandingkan dengan kolom silika normal, namun banyak kolom fase balik terdiri dari alkil partikel silika diderivatisasi dan tidak boleh digunakan dengan air basis karena ini akan menghancurkan partikel silika yang mendasarinya. They can be used with aqueous acid, but the column should not be exposed to the acid for too long, as it can corrode the metal parts of the HPLC equipment. Mereka dapat digunakan dengan air asam, tapi kolom tidak boleh terkena asam terlalu lama, karena dapat menimbulkan korosi bagian logam dari peralatan HPLC. RP-HPLC columns should be flushed with clean solvent after use to remove residual acids or buffers, and stored in an appropriate composition of solvent. RP-HPLC Kolom ini harus dibilas dengan pelarut bersih setelah digunakan untuk membuang asam sisa atau buffer, dan disimpan dalam komposisi yang sesuai pelarut. The metal content of HPLC columns must be kept low if the best possible ability to separate substances is to be retained. Kandungan logam dari kolom HPLC harus disimpan rendah jika kemampuan terbaik untuk zat yang terpisah harus ditahan. A good test for the metal content of a column is to inject a sample which is a mixture of 2,2'- and 4,4'- bipyridine . Sebuah tes yang baik untuk kandungan logam kolom adalah untuk menyuntikkan sampel yang merupakan campuran dari 2,2 '- dan 4,4' - bipiridin . Because the 2,2'-bipy can chelate the metal, the shape of the peak for the 2,2'-bipy will be distorted (tailed) when metal ions are present on the surface of the silica . [ citation needed ] .. Karena 2,2 '-bipy bisa chelate logam, bentuk dari puncak untuk 2,2 '-bipy akan terdistorsi (tailed) ketika logam ion yang hadir pada permukaan silika . [ rujukan? ] ..

[ edit ] Size-exclusion chromatography [ sunting ]-pengecualian kromatografi Ukuran

For more details on this topic, see size-exclusion chromatography . Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat -kromatografi eksklusi ukuran .

Size-exclusion chromatography (SEC), also known as gel permeation chromatography or gel filtration chromatography , separates particles on the basis of size. Ukuran-kromatografi eksklusi (SEC), juga dikenal sebagai permeasi kromatografi gel atau kromatografi filtrasi gel, memisahkan partikel berdasarkan ukuran. It is generally a low resolution chromatography and thus it is often reserved for the final, "polishing" step of a purification. Ini umumnya merupakan kromatografi resolusi rendah sehingga sering dicadangkan untuk, akhir langkah "polishing" dari suatu pemurnian. It is also useful for determining the tertiary structure and quaternary structure of purified proteins. Hal ini juga berguna untuk menentukan struktur tersier dan struktur kuartener protein dimurnikan. SEC is used primarily for the analysis of large molecules such as proteins or polymers. SEC digunakan terutama untuk analisis molekul besar seperti protein atau polimer. SEC works by trapping these smaller molecules in the pores of a particle. SEC bekerja dengan menjebak molekul-molekul yang lebih kecil di pori-pori partikel. The larger molecules simply pass by the pores as they are too large to enter the pores. Molekul-molekul yang lebih besar hanya melewati pori-pori karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori. Larger molecules therefore flow through the column quicker than smaller molecules, that is, the smaller the molecule, the longer the retention time. Oleh karena itu molekul yang lebih besar mengalir melalui kolom lebih cepat dari molekul yang lebih kecil, yaitu semakin kecil molekul, semakin lama waktu retensi.

This technique is widely used for the molecular weight determination of polysaccharides. Teknik ini banyak digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida. SEC is the official technique (suggested by European pharmacopeia) for the molecular weight comparison of different commercially available low-molecular weight heparins . SEC adalah teknik resmi (disarankan oleh Pharmacopeia Eropa) untuk perbandingan berat molekul yang berbeda tersedia secara komersial-molekul berat rendah heparins .

[ edit ] Ion-exchange chromatography [ sunting ] Ion kromatografi pertukaran

For more details on this topic, see Ion-exchange chromatography . Untuk detail lebih lanjut tentang topik ini, lihat -pertukaran Ion kromatografi .

In ion-exchange chromatography, retention is based on the attraction between solute ions and charged sites bound to the stationary phase. Dalam kromatografi pertukaran ion, retensi didasarkan pada daya tarik antara ion terlarut dan situs dibebankan terikat pada fase diam. Ions of the same charge are excluded. Ion dari biaya yang sama tidak termasuk. Types of ion exchangers include: Jenis penukar ion antara lain:

Polystyrene resins – These allow cross linkage which increases the stability of the chain. resin Polistirena - Ini memungkinkan hubungan lintas yang meningkatkan stabilitas dari rantai. Higher cross linkage reduces swerving, which increases the equilibration time and ultimately improves selectivity. linkage Tinggi lintas mengurangi swerving, yang meningkatkan waktu equilibrium dan akhirnya meningkatkan selektivitas.

Cellulose and dextran ion exchangers (gels) – These possess larger pore sizes and low charge densities making them suitable for protein separation. Selulosa dan dekstran penukar ion (gel) - ini memiliki ukuran pori yang lebih besar dan kepadatan biaya rendah membuat mereka cocok untuk pemisahan protein.

Controlled-pore glass or porous silica Terkendali-pori kaca atau silika berpori

In general, ion exchangers favor the binding of ions of higher charge and smaller radius. Secara umum, penukar ion mendukung pengikatan ion biaya yang lebih tinggi dan radius yang lebih kecil.

An increase in counter ion (with respect to the functional groups in resins) concentration reduces the retention time. Peningkatan ion counter (berkenaan dengan kelompok-kelompok fungsional dalam resin) mengurangi konsentrasi waktu retensi. An increase in pH reduces the retention time in cation exchange while a decrease in pH reduces the retention time in anion exchange. Peningkatan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran kation sedangkan penurunan pH mengurangi waktu retensi dalam pertukaran anion.

This form of chromatography is widely used in the following applications: water purification, preconcentration of trace components, ligand-exchange chromatography, ion-exchange chromatography of proteins, high-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, and others. Bentuk kromatografi secara luas digunakan dalam aplikasi berikut: air pemurnian, prakonsentrasi jejak komponen, pertukaran ligan-kromatografi, pertukaran ion kromatografi protein, tinggi pH kromatografi pertukaran anion karbohidrat dan oligosakarida, dan lain-lain.

[ edit ] Bioaffinity chromatography [ sunting ] kromatografi Bioaffinity

This chromatographic process relies on the property of biologically active substances to form stable, specific, and reversible complexes. Proses kromatografi bergantung pada properti dari bahan biologis aktif untuk membentuk kompleks stabil, spesifik, dan reversibel. The formation of these complexes involves the participation of common molecular forces such as the Van der Waals interaction, electrostatic interaction, dipole-dipole interaction, hydrophobic interaction, and the hydrogen bond. Pembentukan kompleks ini melibatkan partisipasi pasukan molekul umum seperti Van der Waals interaksi, interaksi elektrostatik, interaksi dipol-dipol, interaksi hidrofobik, dan ikatan hidrogen. An efficient, biospecific bond is formed by a simultaneous and concerted action of several of these forces in the complementary binding sites. Ikatan, efisien biospecific dibentuk oleh tindakan simultan dan terpadu dari beberapa gaya-gaya dalam situs pengikatan pelengkap.

[ edit ] Aqueous normal-phase chromatography [ sunting ] normal-tahap kromatografi berair

Aqueous normal-phase chromatography (ANP) is a chromatographic technique which encompasses the mobile phase region between reversed-phase chromatography (RP) and organic normal phase chromatography (ONP). Berair kromatografi fase normal (ANP) adalah suatu teknik kromatografi yang meliputi wilayah fase gerak antara kromatografi fase terbalik (RP) dan organik kromatografi fasa normal (ONP). This technique is used to achieve unique selectivity for hydrophilic compounds, showing

normal phase elution using reverse-phase solvents. [ citation needed ] Teknik ini digunakan untuk mencapai selektivitas unik untuk senyawa hidrofil, elusi menunjukkan fase-fase normal yang menggunakan pelarut terbalik. [ rujukan? ]

[ edit ] Isocratic flow and gradient elution [ sunting ] aliran isokratik dan elusi gradien

A separation in which the mobile phase composition remains constant throughout the procedure is termed isocratic (meaning constant composition ). Sebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak tetap konstan selama prosedur ini disebut isokratik (makna komposisi konstan). The word was coined by Csaba Horvath who was one of the pioneers of HPLC. [ citation needed ] , Kata ini diciptakan oleh Csaba Horvath yang merupakan salah satu pelopor HPLC. [ rujukan? ],

The mobile phase composition does not have to remain constant. Komposisi fase gerak tidak harus tetap konstan. A separation in which the mobile phase composition is changed during the separation process is described as a gradient elution . [ 2 ] One example is a gradient starting at 10% methanol and ending at 90% methanol after 20 minutes. Sebuah pemisahan dimana komposisi fase gerak berubah selama proses pemisahan digambarkan sebagai elusi gradien. [2] Salah satu contoh adalah gradien mulai 10% metanol dan berakhir di 90 metanol% setelah 20 menit. The two components of the mobile phase are typically termed "A" and "B"; A is the "weak" solvent which allows the solute to elute only slowly, while B is the "strong" solvent which rapidly elutes the solutes from the column. Dua komponen dari fase gerak biasanya disebut "A" dan "B"; A adalah "lemah" pelarut yang memungkinkan terlarut ke mengelusi hanya perlahan-lahan, sedangkan B adalah "kuat" pelarut yang cepat elutes yang zat terlarut dari kolom . Solvent A is often water, while B is an organic solvent miscible with water, such as acetonitrile, methanol, THF , or isopropanol. Pelarut adalah sering air, sedangkan B adalah larut pelarut organik dengan air, seperti asetonitril, metanol, THF , atau isopropanol.

In isocratic elution, peak width increases with retention time linearly according to the equation for N, the number of theoretical plates. Dalam elusi isokratik, meningkat lebar puncak dengan waktu retensi linear menurut persamaan untuk N, jumlah pelat teoritis. This leads to the disadvantage that late-eluting peaks get very flat and broad. Hal ini menyebabkan kelemahan yang memuncak akhir-eluting menjadi sangat datar dan luas. Their shape and width may keep them from being recognized as peaks. bentuk mereka dan lebar bisa mencegah mereka diakui sebagai puncak.

Gradient elution decreases the retention of the later-eluting components so that they elute faster, giving narrower (and taller) peaks for most components. elusi Gradient menurunkan retensi komponen nanti-eluting sehingga mereka mengelusi cepat, memberikan sempit (dan lebih tinggi) untuk komponen yang paling puncak. This also improves the peak shape for tailed peaks, as the increasing concentration of the organic eluent pushes the tailing part of a peak forward. Hal ini juga meningkatkan bentuk puncak puncak tailed, sebagai peningkatan konsentrasi eluen organik mendorong bagian tailing dari puncak ke depan. This also increases the peak height (the peak looks "sharper"), which is important in trace analysis. Hal ini juga meningkatkan tinggi puncak (puncak tampak "lebih tajam"), yang penting dalam

analisis jejak. The gradient program may include sudden "step" increases in the percentage of the organic component, or different slopes at different times – all according to the desire for optimum separation in minimum time. Program gradien mungkin termasuk tiba-tiba "langkah" peningkatan persentase komponen organik, atau lereng yang berbeda pada waktu yang berbeda - semua sesuai dengan keinginan untuk pemisahan optimal dalam waktu minimum.

In isocratic elution, the selectivity does not change if the column dimensions (length and inner diameter) change – that is, the peaks elute in the same order. Dalam elusi isokratik, selektivitas tidak berubah jika dimensi kolom (panjang dan diameter bagian dalam) perubahan - yaitu, puncak mengelusi dalam urutan yang sama. In gradient elution, the elution order may change as the dimensions or flow rate change. [ citation

needed ] Dalam elusi gradien, urutan elusi dapat berubah sebagai dimensi atau tingkat perubahan aliran. [ rujukan? ]

The driving force in reversed phase chromatography originates in the high order of the water structure. Kekuatan pendorong dalam kromatografi fase terbalik berasal dalam urutan tinggi struktur air. The role of the organic component of the mobile phase is to reduce this high order and thus reduce the retarding strength of the aqueous component. Peran komponen organik dari fase gerak adalah untuk mengurangi urutan tinggi dan dengan demikian mengurangi kekuatan penghambat dari komponen air.

[ edit ] Parameters [ sunting ] Parameter

[ edit ] Internal diameter [ sunting ] diameter Internal

The internal diameter (ID) of an HPLC column is an important parameter that influences the detection sensitivity and separation selectivity in gradient elution. Diameter internal (ID) dari sebuah kolom HPLC merupakan parameter penting yang mempengaruhi sensitivitas deteksi dan selektivitas pemisahan di elusi gradien. It also determines the quantity of analyte that can be loaded onto the column. Hal ini juga menentukan jumlah analit yang dapat dimuat ke kolom. Larger columns are usually seen in industrial applications, such as the purification of a drug product for later use. kolom yang lebih besar biasanya terlihat dalam aplikasi industri, seperti pemurnian produk obat untuk digunakan kemudian. Low-ID columns have improved sensitivity and lower solvent consumption at the expense of loading capacity. Rendah-ID kolom telah meningkatkan kepekaan dan konsumsi pelarut lebih rendah dengan mengorbankan kapasitas beban.

Larger ID columns (over 10 mm) are used to purify usable amounts of material because of their large loading capacity. ID kolom yang lebih besar (lebih dari 10 mm) digunakan untuk memurnikan jumlah yang dapat digunakan bahan karena kapasitas muat besar mereka.

Analytical scale columns (4.6 mm) have been the most common type of columns, though smaller columns are rapidly gaining in popularity. kolom analisis skala (4,6 mm) telah menjadi jenis yang paling umum kolom, meskipun kolom kecil dengan cepat mendapatkan popularitas. They are used in traditional quantitative analysis of samples and often use a UV-Vis

absorbance detector . Mereka digunakan dalam analisis kuantitatif tradisional sampel dan sering menggunakan detektor-Vis absorbansi UV .

Narrow-bore columns (1–2 mm) are used for applications when more sensitivity is desired either with special UV-vis detectors, fluorescence detection or with other detection methods like liquid chromatography-mass spectrometry Sempit menanggung kolom (1-2 mm) digunakan untuk aplikasi ketika sensitivitas lebih diinginkan baik dengan khusus-vis detektor UV, fluoresensi deteksi atau dengan metode pendeteksian lainnya seperti spektrometri massa-kromatografi cair

Capillary columns (under 0.3 mm) are used almost exclusively with alternative detection means such as mass spectrometry . Kolom kapiler (di bawah 0,3 mm) digunakan hampir secara eksklusif dengan deteksi alternatif cara seperti spektrometri massa . They are usually made from fused silica capillaries, rather than the stainless steel tubing that larger columns employ. Mereka biasanya terbuat dari leburan silika kapiler, bukan stainless steel tubing yang mempekerjakan lebih besar kolom.

[ edit ] Particle size [ sunting ] Ukuran butiran

Most traditional HPLC is performed with the stationary phase attached to the outside of small spherical silica particles (very small beads). Kebanyakan HPLC tradisional dilakukan dengan fase diam melekat pada bagian luar bola kecil silika partikel (kecil manik-manik yang sangat). These particles come in a variety of sizes with 5 μ m beads being the most common. Partikel ini datang dalam berbagai ukuran dengan 5 μ m manik-manik yang paling umum. Smaller particles generally provide more surface area and better separations, but the pressure required for optimum linear velocity increases by the inverse of the particle diameter squared. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] partikel yang lebih kecil pada umumnya memberikan luas permukaan lebih banyak dan pemisahan lebih baik, tetapi tekanan yang dibutuhkan untuk optimal meningkatkan kecepatan linier dengan kebalikan dari kuadrat diameter partikel. [3] [4] [5]

This means that changing to particles that are half as big, keeping the size of the column the same, will double the performance, but increase the required pressure by a factor of four. Ini berarti bahwa mengubah untuk partikel yang separuh besar, menjaga ukuran kolom yang sama, akan menggandakan kinerja, tetapi meningkatkan tekanan yang dibutuhkan dengan faktor empat. Larger particles are used in preparative HPLC (column diameters 5 cm up to >30 cm) and for non-HPLC applications such as solid-phase extraction . partikel yang lebih besar digunakan dalam HPLC preparatif (diameter kolom 5 cm sampai dengan> 30 cm) dan untuk aplikasi non-HPLC seperti fase ekstraksi padat .

[ edit ] Pore size [ sunting ] ukuran pori

Many stationary phases are porous to provide greater surface area. fasa diam Banyak berpori untuk memberikan luas permukaan yang lebih besar. Small pores provide greater surface area while larger pore size has better kinetics, especially for larger analytes. Kecil pori-pori menyediakan luas permukaan yang lebih besar sedangkan ukuran pori yang lebih besar memiliki kinetika yang lebih baik, terutama untuk analit yang lebih besar. For example, a protein which is only slightly smaller than a pore might enter the pore but does not easily leave once inside. Sebagai contoh, sebuah

protein yang hanya sedikit lebih kecil daripada pori mungkin memasuki pori-pori tetapi tidak mudah meninggalkan begitu dalam.

[ edit ] Pump pressure [ sunting ] tekanan Pompa

Pumps vary in pressure capacity, but their performance is measured on their ability to yield a consistent and reproducible flow rate . Pressure may reach as high as 40 MPa (6000 lbf/in 2 ), or about 400 atmospheres. Pompa bervariasi dalam kapasitas tekanan, tetapi kinerja mereka diukur pada kemampuan mereka untuk menghasilkan konsisten dan reproducible laju aliran . Tekanan dapat mencapai setinggi 40 MPa (6000 lbf / in 2

), atau sekitar 400 atmosfer. Modern HPLC systems have been improved to work at much higher pressures, and therefore are able to use much smaller particle sizes in the columns (<2 μ m). Modern HPLC sistem telah diperbaiki untuk bekerja di banyak tekanan yang lebih tinggi, dan oleh karena itu dapat menggunakan partikel ukuran yang lebih kecil banyak kolom (<2 μ m). These "Ultra High Performance Liquid Chromatography" systems or RSLC/UHPLCs can work at up to 100 MPa (15,000 lbf/in²), or about 1000 atmospheres. Ini "Ultra Kromatografi Cair Kinerja Tinggi" sistem atau RSLC / UHPLCs dapat bekerja sampai dengan 100 MPa (15.000 lbf / in ²), atau sekitar 1000 atmosfer. The term "UPLC" is a trademark of the Waters Corporation , but is sometimes used to refer to the more general technique. Istilah "UPLC" adalah merek dagang dari Corporation Waters , tetapi kadang-kadang digunakan untuk merujuk pada teknik yang lebih umum.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)Ditulis oleh Jim Clark pada 06-10-2007

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Pelaksanaan HPLC

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai “normalâ€, ini bukan �merupakan bentuk yang biasa dari HPLC.Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

DetektorAda beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.