xylose isomerase ec 5.3.1.5
DESCRIPTION
Xylose Isomerase EC 5.3.1.5. Oleh: Hairunnisa – 20512007 Florence A. Husada – 20512057 . Mata Kuliah KI-6161 Enzimologi November 2012. Agenda Presentasi. Pendahuluan. 1. Struktur & Mekanisme Reaksi. 2. Kinetika Enzim. 3. Isolasi & Pemurnian Enzim. 4. Aplikasi di Industri. 5. 6. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Xylose IsomeraseEC 5.3.1.5
Oleh:Hairunnisa – 20512007
Florence A. Husada – 20512057
Mata Kuliah KI-6161 EnzimologiNovember 2012
Agenda Presentasi
Aplikasi di Industri
Struktur & Mekanisme Reaksi
Isolasi & Pemurnian Enzim
Pendahuluan1
2
5
3
4
Kinetika Enzim
Modifikasi Genetika6
Xylose IsomeraseEC 5.3.1.5
• EC 5 : Class IsomeraseEC 5.3 : Subclass Intramolecular OxidoreductasesEC 5.3.1 : Subsubclass Interconverting Aldoses & Ketoses
EC 5.3.1.5 : Xylose Isomerase
• Katalisis reaksi reversibel dalam isomerisasi – D-xylosa menjadi D-xylulosa.– D-glukosa menjadi D-fruktosa (beberapa enzim).
• Memiliki nama lain: D-xylose isomerase; D-xylose ketoisomerase; D-xylose ketol-isomerase; D-Glucose Isomerase
• Nama sistematik: D-xylose aldose-ketose-isomerase
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
• http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&view=INTENZ (11 November 2012 pukul 7.25 WIB) • http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#0105 (11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
Sejarah Xylose Isomerase• Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang
diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa.1. 1957 – starting point; ditemukannya enzim pada
Pseudomonas hydrophila dengan kemampuan mengisomerisasi glukosa oleh Marshall & Kooi.
2. Ditemukan aktivitas xylose isomerase pada Escherichia intermedia . [Diketahui kemudian sebagai phosphoglucose isomerase (EC 5.3.1.9)].
3. Takasaki & Tanabe mengisolasi glucose isomerase (GI) (EC 5.3.1.18) dari Bacillus megaterium AI a yang terikat pada NAD dan spesifik terhadap glukosa.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sejarah Xylose Isomerase• Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang
diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa.4. Aktivitas GI yang sama diisolasi dari
Paracolobacterium aerogenoides yang dapat mengkatalisis isomerisasi pada glukosa dan mannosa menjadi fruktosa.
• Dari sekian banyak yang ditemukan, Xylose Isomerase (EC 5.3.1.5) yang sangat cocok untuk dikomersialkan.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sejarah Xylose Isomerase• 1967 – Clinton Corn Processing Co., USA, pertama
kali membuat isomerisasi glukosa enzimatik skala industri.
• 1980 – Kebutuhan high-fructose corn syrup (HFCS) dalam industri makanan meningkat, akhirnya seluruh perusahaan pengolah pati beralih menggunakan teknologi enzim.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber Xylose Isomerase: Prokariot
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber Xylose Isomerase: Prokariot
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sifat Xylose Isomerase • Spesifisitas Substrat• Mampu mengubah D-ribose, L-arabinose, L-rhamnose, D-
allose, dan 2-deoxyglucose, seperti substrat yang biasanya digunakan, yaitu D-glucose dan D-xylose (afinitas tertinggi).
• Rasio konversi (D-glucose → D-fructose) = 26 – 59% (dari berbagai organisme).
• Nilai KM untuk D-glucose = 0.086 – 0.920 M • Nilai KM untuk D-xylose = 0.005 – 0.093 M
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sifat Xylose Isomerase • Kofaktor dan Inhibitor• Kofaktor: Mg2+, Co2+, Mn2+, atau gabungan dari
ketiganya.• Mg2+ dan Co2+ bertindak sebagai aktivator, Co2+
sebagai penstabil konformasi enzim.• Inhibitor Logam: Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, Ca2+,dan Ni2+
• Inhibitor Nonlogam: xylitol, arabitol, sorbitol, mannitol, lyxose, dan Tris.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sifat Xylose Isomerase • Suhu dan pH Optimum• Range suhu optimum = 60 – 80°C (akan meningkat jika
ada ion Co2+).• Range pH optimum = 7,0 – 9,0.
• Studi Active-Site• Melalui X-ray crystallography diketahui histidin dan
gugus karboksilat ditemukan pada sisi aktif.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Kelebihan Xylose Isomerase• Heat-stable • Tidak membutuhkan kofaktor yang mahal, seperti NAD+
atau ATP. • Meskipun afinitas enzim untuk glukosa 160x lebih kecil
dibandingkan xylosa, tetapi enzim ini masih sangat menguntungkan secara komersial dibandingkan dengan isomerisasi secara kimia.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Chemical Conversion
• Membutuhkan suhu dan pH tinggi.
• Reaksi tidak spesifik dan cenderung membentuk produk samping yang tidak diinginkan.
• Sulit memperoleh [fruktosa] > 40%.
• Rasa fruktosa tidak enak dan kurang manis.
Enzimatic Conversion
• Dapat bekerja pada pH dan suhu lingkungan.
• Reaksi spesifik.• Tidak menghasilkan
produk samping.• Rasa fruktosa lebih
manis.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi
3. Kinetika Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim
5. Aplikasi di Industri
6. Modifikasi Genetika
VS
Struktur Xylose Isomerase• Berat Molekul bervariasi,
antara 52,000 to 191,000 Da. • Subunit struktur = trimer,
tetramer, dimer, atau subunit yang identik (terikat secara non-kovalen).
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Mekanisme Reaksi
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996
Kinetika Xylose Isomerase• Dilakukan pengamatan
terhadap pembentukan D-fruktosa sebagai fungsi waktu inkubasi dengan konsentrasi D-glukosa awal.
• Data mengindikasi afinitas D-glukosa terhadap enzim lebih rendah daripada D-xylosa.
• D-glukosa (KM=0,5 M pada pH 8,0 dan 40°C).
• D-xylosa (KM=3x10-3 M pada pH 7,5 dan 30°C).
• Suhu optimum ditentukan pada konsentrasi D-glukosa 0,2 M = 42 – 43°C.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber: Marshall, R. O. and Kooi, R. E., 1957
Isolasi Xylose Isomerase dari Streptomyces
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber: Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010)
Produksi dan Ekstraksi EnzimMedia produksi yang
digunakan: Xylosa (0,75%), Peptone (1,00%), Yeast Extract
(0,5%), dan MgSO4.7H2O (0.1%). pH dijaga agar tetap di
atas 7,0.
Setelah media steril, kultur diinokulasi, inkubasi 24 jam. Setelah diproduksi 2,00 mL pindahkan ke 100 mL lalu
inkubasi lagi. Begitu seterusnya hingga volume 1000 mL.
Sel dipanen dan dicuci dengan akuades, disuspensikan
kemudian dipecah selnya menggunakan homogenizer.
Debris dipisah agar enzim dapat dimurnikan.
Sampel tanah dari ladang jagung dikumpulkan
Diinokulasi pada medium agar berisi salt starch solid dan liquid setelah serial dilution. Kemudian, dilakukan Gram Staining, uji oxidase, uji hidrolisis pati, gelatin, dan kasein, & uji H2S.
Pemurnian Xylose Isomerase
• Pemurnian dapat dilakukan menggunakan metode– Heat treatment,– Precipitation menggunakan garam amonium
sulfat-aseton-Mg2+ atau Mn 2+,– Kromatografi penukar ion,– Gel filtrasi, dan– Kromatografi afinitas.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Aplikasi di Industri• Produksi Bioetanol• Interconversion dari xylosa
menjadi xylulosa menyediakan nutrisi yang dibutuhkan bakteri saprofitik untuk melakukan pembusukan material tanaman dan biokonversi hemiselulosa menjadi bioetanol.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber: http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (11 November 2012 pukul 22.30 WIB)
Aplikasi di Industri• Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS)• HFCS (glucose:fructose = 1:1) 1.3 kali lebih dari sukrosa
dan 1.7 kali lebih manis dari glukosa.• Harga HFCS 10 to 20% lebih rendah dari pemanis
sukrosa dan tidak akan mengalami penggumpalan seperti sukrosa.
• Baik digunakan untuk penderita diabetes karena direabsobsi secara perlahan oleh perut dan tidak berpengaruh pada kadar glukosa dalam darah.
• Biasa digunakan pada beverage, baking, canning, dan confectionery industries.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Aplikasi di Industri• Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS)
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996
Modifikasi Genetik untuk Meningkatkan Produksi Enzim
• Dicapai dengan melakukan strain improvement melalui mutagenesis atau teknologi DNA rekombinan.
• Hasil dari beberapa modifikasi genetik:– Peningkatan jumlah enzim sebesar 60% melalui mutagenesis
Streptomyces wedmorensis dengan ethyleneimine dan N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine.
– UV irradiation terhadap Streptomyces olivochromogenes menghasilkan strain mutan dengan peningkatan aktivitas 70%.
– Mutan yang dimutagenesis dengan ethyl methanesulfonate menghasilkan1,500 U/mL enzim ketika ditumbuhkan pada media berisi glukosa saja, sementara parent memproduksi 10 U/mL dengan kondisi yang sama.
1. Pendahuluan
2. Struktur & Mekanisme
Reaksi3. Kinetika
Enzim
4. Isolasi & Pemurnian
Enzim5. Aplikasi di
Industri6. Modifikasi
Genetika
Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996
Daftar Pustaka • Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., (1996), Molecular
and Industrial Aspects of Glucose Isomerase, Microbiolology and Molecular Biology Review, 60(2):280, p. 280 – 300.
• Marshall, R. O. and Kooi, R. E., (1957), Enzymatic Conversion of D-Glucose to D-Fructose, Science, Vol. 125, No. 3249 (Apr. 5, 1957), p. 648 – 649.
• Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010), Isolation, Purification & Characterization of Glucose Isomerase Enzyme form Streptomyces species isolated from Parbhani Region, Journal of Enzyme Research, ISSN: 0976–7657 & E-ISSN: 0976–7665, Vol. 1, Issue 1, p. 01 - 10.
• http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#0105 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
• http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=5.3.1.5 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
• http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&view=INTENZ (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB)
• http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (diakses pada 11 November 2012 pukul 22.30 WIB)
Thank You..