KNOCK OUT

Knock-in en knock-out - Revolutie in muizengenetica

http://genome.wellcome.ac.uk/doc_WTD021038.html

1 of 8Knockout mice contain an artificially introduced mutation in their cells, abolishing the activity of a preselected gene.2 of 8The gene targeting process is carried out in mouse embryonic stem cells (ES cells). These cells are derived from a very early (usually male) mouse embryo and can therefore differentiate into all types of cell when introduced into another embryo.3 of 8A mutant version of the target gene is introduced into the ES cells.4 of 8Recombination between the related sequences of DNA swaps the mutated version of the target gene into the mouse genome.

5 of 8The ES cells need a host embryo in which to develop, and this is isolated from a mouse with different coloured fur. The use of mice with different coat colours for the ES cells and the host embryo allows the mutant gene to be followed.6 of 8The ES cells with one mutant gene are transferred into the host embryo.7 of 8The resulting mouse is a chimera, as has developed from a mixture of cells from brown and black mice. If the ES cells with the mutant gene contribute to the germline, the next generation of mice have one nonfunctional copy of the gene.8 of 8Inbreeding produces knockout mice where both copies of the gene are mutated.

http://www.watisgenomics.nl/genomics/genomics/i000717.html

Muizen vormen een heel belangrijk model voor de mens in o.a./ het kankeronderzoek. Waar muismodellen van werkelijk onschatbare waarde zijn, is in het onderzoek met behulp van 'knock-outs', en 'knock-ins'; muizen waarin een bepaald gen helemaal 'uit' of juist 'aan' staat.

Stamcel

Neem de knock-out muis. Dat deze mogelijk werd, was te danken aan de techniek om een deel van een bepaald gen uit het chromosoom te verwijderen. En dat was weer mogelijk door de ontwikkeling van embryonale stamcellijnen die eindeloos in het laboratorium kunnen worden gekweekt, en waaruit weer een muis kan ontstaan.

Simpel gezegd gaat het erom heel specifiek mutaties aan te brengen in bepaalde individuele genen van een embryonale stamcellijn waaruit dan weer een muis ontstaat met die specifieke mutatie in alle lichaamscellen.

En dan maar kijken wat er gebeurt. Door één voor één genen uit te schakelen hoop je te ontdekken wat hun functie is.

Verrassing

Bij deze knock-out muizen leverde dat verrassingen op. Verwijdering van genen waarvan men dacht dat ze belangrijk waren, bleek lang niet altijd een groot effect te hebben.

Deze knock-out studies hebben doen beseffen hoe weinig er eigenlijk bekend is over de functie van genen, maar ook dat studies in gekweekte cellen daar in veel gevallen geen goed zicht op geven.

Door het maken van knock-outs van tumoronderdrukkende genen is het wel mogelijk hun rol bij het ontstaan van kanker in detail te bestuderen.

Intussen zijn er methoden ontwikkeld om genen alleen in bepaalde celtypes in de muis aan en uit te schakelen en daarmee heel specifieke vormen van kanker op te wekken.

Knock-out-muis verklapt genfunctie

Kernwoordendna, eiwit, gen, genetische manipulatie, genetische modificatie, groene biotechnologie, knockout,proefdier, rode biotechnologie, transgeen, witte biotechnologie, recombinant

http://www.kennislink.nl/publicaties/knock-out-muis-verklapt-genfunctie

SAMENVATTINGGenen zijn de dragers van de erfelijke eigenschappen. Van de mens is inmiddels vrijwel de gehele genetische code in het DNA opgehelderd, maar van de meeste genen is nog volstrekt onbekend wat ze doen.

Door een enkel gen te veranderen of uit te schakelen, kunnen we daar achter komen.

Genen bevatten de recepten voor eiwitten, die in en buiten de cel het eigenlijke werk doen: eiwitten zorgen dat chemische reacties verlopen en dat bindweefsel en bot stevig zijn, ze transporteren stoffen, communiceren tussen cellen en ga zo maar door. Samen bepalen de genen zo de eigenschappen en daarmee het functioneren van een individu.

Alle cellen van een organisme beschikken over hetzelfde pakket genetische informatie, maar elke cel gebruikt alleen de informatie die hij nodig heeft.

Hemoglobine komt bijvoorbeeld alleen voor in rode bloedcellen.

Alle cellen in het menselijk lichaam beschikken over het hemoglobine-gen, maar alleen de rode bloedcellen schakelen dit gen aan.

Van het grootste deel van de genen weten we niet wat ze doen. Om achter de functie van een gen te komen, kunnen we het – met of zonder aangebrachte wijzigingen – inbrengen bij een dier en kijken wat het effect daarvan is. Dit heet transgenese . Een proefdier bij uitstek hiervoor is de muis.

Genen injecteren

Zwart + beige = bont. In zeer jonge muizenembryo’s brengen we cellen met een uitgeschakeld gen in, om zo de functie van dat gen te

achterhalen. De embryo’s waren afkomstig van zwarte muizen, de ingebrachte cellen van beige muizen. De procedure leidt tot muizen die

beide cellen dragen. Zij hebben een bonte vacht: hoe lichter de vacht, hoe groter het aandeel van de cellen met het uitgeschakelde gen.

Om genen toe te voegen aan muizen, injecteren we het DNA in de celkern van een bevruchte eicel. Dat gebeurt onder een microscoop, met een holle, glazen micronaald. De cel bouwt het geïnjecteerde DNA zelf in het eigen genoom in. Vervolgens plaatsen we de geïnjecteerde eicellen terug in de eileiders van een draagmoedermuis. Na zo’n drie weken zal het nestje dat geboren wordt, pups bevatten die het extra gen (of transgen) doorgeven aan hun nageslacht.

Een nieuw gen inbouwen is op zichzelf niet voldoende. We moeten ervoor zorgen dat het gen in de muis tot uitdrukking komt. Daarvoor moet het transgen beschikken over een promoter: een stukje DNA dat zich vóór het gen bevindt, en dat bepaalt of, wanneer en in welke mate het gen ‘aan’ staat. Daarbij kan een promotor worden gebruikt die het transgen in alle weefsels tot expressie laat komen, of alleen in bepaalde celtypen en ontwikkelingsstadia, of zelfs op commando.

Deze techniek is ook geschikt voor onderzoek naar de promotor van een bestaand gen. Als we willen weten waar en wanneer een bepaald gen tot uitdrukking komt, moeten we achterhalen wanneer de promotor van dat gen actief is. Daartoe koppelen we aan die promotor een gen dat een groen fluorescerend eiwit aanmaakt (het gen is afkomstig van een lichtgevende kwallensoort). Precies op de plaatsen en tijden dat het oorspronkelijke gen tot uitdrukking komt, gaan de cellen nu het groenfluorescerende eiwit produceren.

Erfelijke ziekten worden veroorzaakt door veranderde of uitgeschakelde genen. Voor onderzoek aan een aangeboren afwijking wordt dit genetische defect nagebootst in muizen Daartoe isoleren we het betreffende muizengen en halen er een stukje uit, zodat het niet meer werkt. Het heet nu een knock-out-gen. Vervolgens brengen we het veranderde gen in embryonale stamcellen van muizen in. Dit zijn cellen uit heel jonge embryo’s, die nog het vermogen bezitten uit te groeien tot een volledige muis.

Sommige van de behandelde stamcellen wisselen zelf het ingebrachte knock-out-gen uit met een van de twee eigen kopie 챘 n van het gen in de celkern. Dit geldt slechts voor een klein gedeelte van de stamcellen, zodat het nodig is om die cellen te selecteren waarin het knock-out-gen is ingebouwd in het genoom. Dat doen we door het knock-out-gen tevoren te koppelen aan een gen dat de cel resistent maakt tegen een bepaald antibioticum. Vervolgens stellen we de cellen bloot aan dit antibioticum, met als gevolg dat alleen de cellen die het knock-out-gen hebben opgenomen, overleven.

Chimere muisDe cellen met het knock-out-gen injecteren we vervolgens in een zeer jong muizenembryo dat nog slechts een klompje cellen is. Het klompje bestaat na die injectie uit twee soorten cellen: normale cellen en cellen met het knock-out-gen. Plaatsen we het prille embryo terug in de draagmoedermuis, dan ontwikkelt het zich tot een chimere muis: een muis die gedeeltelijk bestaat uit cellen met het knock-out-gen en gedeeltelijk uit normale cellen. Door onderling kruisen van deze muizen kunnen we nakomelingen krijgen waarin beide genen knock-out-genen zijn. Vertonen deze muizen andere eigenschappen dan normale muizen, dan moet dit te wijten zijn aan het knock-out-gen, dat op deze manier zijn functie verklapt. Dit onderzoek leert ons veel over erfelijke ziekten en bijvoorbeeld kanker.

Het werken met genetisch gemodificeerde dieren is aan strenge wetgeving gebonden. In Nederland moeten de dierexperimenten-commissie, de Commissie Genetische Modificatie en de commissie Biotechnologie toestemming verlenen voordat het experiment mag plaatsvinden.

Meer weten over biotechnologie?Dit is Biotechnologie

Muizen gaan niet snel knock-out http://www.kennislink.nl/web/show?id=114881

Muizen knock-outs leveren vaak niet direct resultaat. ‘Ik heb me wel eens afgevraagd waarom muizen DNA hebben.’

Het maken van een knock-out muis kost bloed zweet en tranen. Maar het gebeurt geregeld dat een dier geboren wordt en niets lijkt te mankeren, terwijl een cruciaal geacht gen ontbreekt. ‘Dat is eerder regel dan uitzondering’, zegt NKI-onderzoeker dr. Paul Krimpenfort. ‘Daar hebben we hier in het laboratorium veel voorbeelden van. Bijvoorbeeld knockouts van genen uit de pim-familie, die betrokken zijn bij leukemie in de muis. Knockouts daarvan komen volkomen normaal ter wereld - op het eerste gezicht.’

‘In een cynische bui heb ik me wel eens hardop afgevraagd, waarom muizen DNA hebben, als je het zonder gevolgen toch allemaal kunt uitschakelen’, zegt dr. Huub Schellekens, directeur van de Centrale Proefdierfacilteit van de Universiteit Utrecht. ‘Dat is natuurlijk overdreven - sommige knock-outs sterven al als embryo - maar het algemene beeld is toch dat ze vaak minder dramatische afwijkingen laten zien dan men vooraf verwacht.’

De muis logenstraft de gedachte dat de functie van een gen eenvoudig te achterhalen is door het gen uit te schakelen en het effect op het fenotype te onderzoeken. Daar zijn verschillende verklaringen voor, weet Krimpenfort. ‘Bij de pim-genen is sprake van een genfamilie, die de functie van het ontbrekende gen kan overnemen.’ Zogenaamde redundantie – overlappende genfunctie - versluiert het effect van de knock-out. Een mogelijkheid is dan om verschillende knock-outs met elkaar te kruisen. Maar dat is geen garantie voor succes. ‘Van een andere genfamilie hebben we een drievoudige knock-out gemaakt, maar daar was aan het fenotype nog steeds niets te zien.’

Sommige knock-outs leveren wel duidelijke resultaten. Muizenembryo’s waarin het noggin-gen is uitgeschakeld, ontwikkelen geen gewrichten (links) en sterven voor de geboorte. Rechts een normaal muizenembryo. Foto: University of California, Berkeley

BloedcellenEen andere verklaring voor het ontbreken van duidelijk fenotype is volgens Krimpenfort dat de dieren niet onder de juiste omstandigheden worden gehouden. Het fenotype ontstaat immers in interactie tussen genotype en milieu, en aanpassingen daarin leiden soms wel tot resultaat. Als sommige pim knockout muizen worden blootgesteld aan infecties dan zijn er wel duidelijke effecten te zien. ‘Dat zijn ingewikkelde analyses, maar door naar verschillende stappen in de immuunrespons te kijken hebben we voor pim een beter beeld gekregen; het is betrokken bij de acute respons op allerlei stimuli.’

Schellekens: ‘De analyse wordt ook steeds belangrijker: het histologisch en cytologisch onderzoek, om effecten van knock-outs te zien.’ ‘Inderdaad’, beaamt Krimpenfort, ‘Grotere aantallen muizen, en beter kijken.’ In binnen en buitenland werken labs steeds harder aan gedetailleerde fenotypering van veelgebruikte muizenlijnen (zie kader). Dat reikt tot in schijnbaar triviale details als aantallen bloedcellen, hormoonspiegels en hartfrequentie. Pas als die gegevens bekend zijn kan worden onderzocht of de knock-out wellicht subtiel verschilt van ongemodificeerde muizen.

Schellekens: ‘Wat ik binnen mijn instituut vooral zie is dat onderzoekers hun knock-outlijn gaan kruisen met andere muizenstammen. Een muis is veel meer dan het resultaat van een uitgeknockt gen. De genetische achtergrond is ook van invloed.’

Uit de literatuur zijn verschillende knock-outs bekend, die in het ene muizenras resulteerde in sterfte voor de geboorte, terwijl in de andere stam de dieren tot drie weken na de geboorte overleefden. Hetzelfde geldt voor de aantallen gezwellen die een dier ontwikkelt; in de ene stam nauwelijks, in de andere veel. Vaak komen onderzoekers zo interessante genen op het spoor die betrokken zijn bij het onderzochte ziekteproces.

Ondanks het feit dat knock-outs vaak geen dramatische effecten te zien geven, staat de rol van dit modeldier in genetisch onderzoek volgens Krimpenfort en Schellekens niet ter discussie. ‘Het heeft wel degelijk zin, het is hooguit complexer dan we dachten. Dat je in eerste instantie niets ziet, betekent niet dat verder onderzoek geen informatie oplevert’, zegt Krimpenfort. ‘Voor functional genomics blijft het de belangrijkste weg’, vindt Schellekens. ‘The proof of the pudding zit toch in de knock-out.’

----------------------------------------------------------------------------

Mouse phenome projectIn een tijd waarin alle aandacht op DNA en de genotypering van organismen is gericht, komt een grootschalig fenotyperingsproject wat vreemd over. Toch is het internationale Mouse phenome project, geboren in 1999, wellicht harder nodig dan weer een complete genoomkaart. Want hoewel de genenkaarten van verschillende muizenstammen inmiddels in detail bekend zijn, is er weinig systematische kennis over de anatomische, fysiologische en gedragsparameters. Per stam wordt de variatie en sekseverschillen vastgesteld in standaardkenmerken als gewicht en groeisnelheid, maar ook bloed pH, cholesterol, gehoor, galsteenontwikkeling, hartslagfrequentie, orgaangewicht, etc.

Dergelijke kennis is onontbeerlijk om een knock-out mee te vergelijken. Als een onderzoeker een afwijkend gewicht en gedrag vermoedt is zonder kennis van de normale variatie in gewicht en gedrag van de gebruikte laboratoriumstam - zeg maar de basislijn - niet mogelijk om te bepalen of de 'afwijking' significant verschilt van de normale variatie. Daarom zijn uitspraken over subtiele afwijkingen bij een knock-out de uitkomst van een statistische analyse.

----------------------------------------------------------------------------

Literatuur:Pearson, H (2002). Surviving a knockout blow. Nature 415: 8-9.

Zie ook:Mouse Genome Informatics (Jackson Laboratory, Engels)Muizen knock-outs in de versnelling (Kennislink artikel)Functionele Genoomanalyse: Van Gen naar Biologische Functie (Kennislink correpondenten artikel)Knock-out-muis verklapt genfunctie (Kennislink artikel)Biotechnologie en ethiek (kennislink artikel)

http://www.kennislink.nl/publicaties/ muizenknock-outs-in-de-versnelling

Stroomstootjes bij embryo’s kunnen tijd en dieren besparen bij het maken van knock-outmuizen. En wat bij de zebravis kan, gebeurt ook bij muizen: knock-outs door chemicaliën.

Honderdvijftig muizen. Zoveel mag een onderzoeker gebruiken om een gen in een muis uit te schakelen, de bekende knock-out. Met overheidsvergunning kunnen dan drie verschillende lijnen worden gemaakt van dezelfde knock-out, met vijftig dieren per lijn. ‘Dat is gebaseerd op ervaringskennis van de commissie’, zegt mr. drs. Henk Lommers, secretaris van de Commissie Biotechnologie bij Dieren (CBD), die de toetsing van de vergunningaanvragen voor genetische modificatie van dieren uitvoert.

‘Om een knock-out te maken zijn eiceldonoren nodig, dekmannetjes en draagmoeders. Er ontstaan vervolgens chimere muizen en ook niet-gemodificeerde dieren. Als je dat allemaal optelt kom je ongeveer uit op vijftig dieren per lijn, maar het exacte aantal verschilt per muizenstam en onderzoeksgroep. Het is daarom ook moeilijk precies aan te geven hoeveel van de vijftig dieren in elke fase van het experiment worden gebruikt.’

Geen wonderHet maken van gemodificeerde dieren is inmiddels een standaardprocedure – in 2000 werden 37.530 muizen gebruikt om nieuwe gemodificeerde lijnen te maken, en werden met 89.422 gemodificeerde muizen experimenten verricht.

Toch is het nog steeds geen routinekwestie, die een beginnend onderzoeker even uitvoert. Bij knockouts gaan er in het meest gunstige geval drie muizengeneraties en negen maanden overheen, voordat onderzocht kan worden wat het effect van het uitgeschakelde gen is. Vaak duurt het langer; geen wonder dus dat ontwerpen, maken en onderzoeken van één enkele knockoutmuis een hele promotie in beslag kan nemen.

Die tijd gaat deels zitten in het uitschakelen van het gewenste gen in embryonale stamcellen, en voor een ander belangrijk deel in het opkweken van een complete muis uit die stamcellen. Dat laatste gebeurt door de stamcellen in een muizenembryo te injecteren en het embryo in een draagmoeder te plaatsen. Met wat geluk ontstaat zo een mannelijk dier dat deels wel en deels niet gemodificeerd is: een chimeer. Omdat de stamcellen en het embryo afkomstig zijn van muizenstammen met verschillende vachtkleuren, heeft het chimere dier een bonte vacht (zie illustratie).

Vervolgens wordt er met de chimere muizen een aantal generaties verder gefokt totdat een dier ontstaat dat helemaal afstamt van de gemodificeerde stamcellen en waarbij beide kopieën van het gen zijn uitgeschakeld. Het is dus niet vreemd dat onderzoekers kijken naar snellere wegen om hetzelfde doel te bereiken.

StroomstootDe onderzoeksgroep van Rudolf Jaenish beschrijft in Nature Biotechnology (mei 2002) een snellere methode. De eerste aanpassing die Jaenish toepaste is tetraploïde embryocomplementatie, waardoor direct muizen onstaan die volledig afstammen van de gemodificeerde stamcellen. Bij deze al langer bestaande methode worden de stamcellen niet in gewone muizenembryo’s (2n) geïnjecteerd, maar in exemplaren met een dubbel chromosoomaantal (4n). Tetraploïde embryo’s ontstaan door gewone embryo’s met een stroomstoot te behandelen.

Het resultaat is een blastocyst die uitsluitend bijdraagt aan de vorming van de placenta, terwijl het embryo zich ontwikkelt uit de geïnjecteerde stamcellen. Er worden dus geen chimere dieren geboren, maar dieren die in iedere cel gemodificeerd zijn. De tweede aanpassing is sexeselectie op de gemodificeerde stamcellen. Normaal gesproken worden altijd mannelijke (XY) stamcellijnen gemodificeerd, omdat met mannelijke muizen sneller fokresultaten kunnen worden behaald. Maar er moeten wel twee generaties doorgefokt worden voordat de onderzoeker de knock-outdieren kan bestuderen.

© Frank Bierkenz

Geen gemeengoedJaenish beschrijft dat tijdens het kweken circa twee procent van de stamcellen hun Y-chromosoom verliezen. En deze XO-stamcellen ontwikkelen zich na injectie tot vrouwtjesmuizen. Het is dus mogelijk om uit dezelfde gemodificeerde stamcellen zowel vrouwtjes als mannetjes te maken. Er is vervolgens slechts één kruising nodig om de gewenste knock-outmuizen te krijgen.

‘Het is een zeer elegante methode, Jeanish loopt voorop’, zegt prof. dr. Anton Berns, directeur van het Nederlands Kankerinstituut (NKI) en pionier op het gebied van genetische modificatie van proefdieren. ‘Maar wij gebruiken deze methode nog niet. Het is vooral handig als je snel wilt zien wat het effect van een knockout is. Voor ons onderzoek is dat niet zo van belang, omdat we vaak op lange termijn onderzoek verrichten met knock-outs – een klein beetje tijdwinst maakt dan weinig verschil.’

Volgens Berns is Jeanish’ methode nog geen gemeengoed. Succes van Jaenish’ aanpak hangt namelijk af van de kwaliteit van de gebruikte embryonale stamcellen. Bij veel gebruikte stamcellijnen is het moeilijk om via tetraploïde embryo’s gemodificeerde muizen te maken. Waarschijnlijk heeft dat met imprintig te maken; de expressie van cruciale genen verandert na langdurige kweek van de stamcellen.

Berns: ‘Je moet dan veel tijd gaan steken in onderzoek aan de kwaliteit van de gebruikte stamcellen, en daar kom je eigenlijk alleen achter als je ze daadwerkelijk in een embryo injecteert.’ Het is daarom volgens Berns de vraag of Jaenish’ methode proefdieren kan besparen. Er ontstaan immers minder dieren tijdens het fokken van de knockoutmuizen. Maar als het gebruik van tetraploïde embryo’s inefficiënt is, zijn er juist meer eiceldonoren en draagmoeders nodig, dan in de reguliere experimenten. ’Misschien als alles perfect zou werken, bespaart het proefdieren. Maar daar gaat wel een heel testtraject aan vooraf.

Voorlopig is het een zeer bruikbare methode, maar voor een specifiek segment van het onderzoek.’ Met dezelfde blik kijkt ook de Commissie Biotechnologie bij Dieren ernaar. De ontwikkelingen in het laboratorium zijn maatgevend voor de aantallen dieren die de commissie toewijst. De CBD zal niet op basis van recente methodologische verfijning direct eisen dat iedere onderzoeker die techniek toepast. Lommers: ‘Uiteraard volgen wij deze ontwikkelingen. Pas als het standard use is in de laboratoria, en blijkt dat het een besparing van proefdieren oplevert, zullen de commissieleden het naar verwachting als voorwaarde gaan stellen.’Bronnen:Eggan, K. et al (2002) Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nature Biotechnology 20:455-459.Zo doende, 2000. Nature 417 (2002): 785-786.

Snellere manier om genen in muizen te blokkeren

http://www.nrc.nl/W2/Lab/GM/190200.html

Verfijnd knippen

Nederlandse onderzoekers maken jaarlijks zo'n 70.000 transgene muizen. De meeste gemanipuleerde muizen zijn knockout-muizen. Dit zijn muizen waarbij de onderzoekers genen hebben uitgeschakeld om zo te kunnen bestuderen wat deze genen doen.

Door Marianne Heselmans

19 FEBRUARI 2000.

Helaas is de standaardmethode om genen bij muizen uit te schakelen nogal omslachtig. Onderzoekers moeten eerst het te bestuderen gen defect maken in embryonale stamcellen van bijvoorbeeld een witte muis. De veranderde stamcellen worden ge 챦 njecteerd in een embryo van bijvoorbeeld een zwarte muis. De daaruit voortkomende zwartbonte muis moet eerst opgroeien. Een deel van de (onderling gekruiste) nakomelingen hiervan zijn pas de gezochte knockout-muizen.

Britse onderzoekers hebben nu een snellere manier gevonden om genen in muizen te blokkeren (Nature Cell Biology, febr). In een muizenembryo spoten ze dubbelstrengs-RNA, afgeleid van het uit te schakelen gen. Normaal wordt DNA vertaald in een enkele streng RNA. In het laboratorium is daar eenvoudig dubbelstrengs-RNA van te maken. Maar dubbelstrengs-RNA is voor dierlijke celleneen vreemd product. De cel start een specifieke (oorspronkelijk tegen virus-RNA) gerichte afweerreactie waarbij het eiwitproduct van het RNA (maar ook van het overeenkomstige DNA) wordt geblokkeerd.

De onderzoekers brachten dubbelstrengs-RNA in, afkomstig van het mos-gen, dat is betrokken bij de vroegste ontwikkeling. Het dubbelstreng mos-RNA zorgde er voor dat de aanmaak van de mos-eiwitten (ook die van het in muizengenoom aanwezige mos-gen) werden geblokkeerd. Daardoor konden de onderzoekers de rol van het mos-gen tijdens de vroege embryonale ontwikkeling bepalen: het is betrokken bij de vorming van de blastocyst-holte.

Al een jaar of twee blokkeren onderzoekers met dubbelstrengs-RNA genen in de worm Caenorhabditis elegans en in het fruitvliegje. Daar blijkt het een handige, snel werkende methode omdat deze dieren hiertegen geen afweerreactie kennen. Volgens Ton Berns, wetenschappelijk directeur van het Nederlands Kankerinstituut NKI (30.000 transgene muizen per jaar), geeft het resultaat van de Engelse onderzoekers hoop op ook een toepassing bij muizen. Maar tegelijkertijd is het niet meer dan een eerste stap. In latere stadia van de ontwikkeling zullen de muizen immers onmiddellijk een brede afweerreactie ontwikkelen. ,,Maar misschien is daar wat aan te doen'', oppert hij. ,,Misschien kunnen de genen die bij deze afweer betrokken zijn uitgeschakeld worden. Dan kun je ook in latere stadia genen uitschakelen met dubbelstrengs-RNA.''

De standaardprocedure om genen uit te schakelen is niet alleen omslachtig, hij is ook beperkt omdat de onderzoeker niet kan kiezen wanneer hij in de ontwikkeling een gen uitschakelt. Zo is de rol van bepaalde genen bij kanker via de `gewone' knockout-muizen niet te achterhalen, omdat veel bij kanker betrokken genen ook een rol spelen bij embryonale groei. Is zo'n gen defect, dan is de muis dood voordat hij kanker kan ontwikkelen. Ook het Nederlands Kankerinstituut werkt daarom aan verbeterde methoden om genen uit te schakelen. Bij onderzoek naar een borstkankergen maken de NKI-onderzoekers dit gen niet meteen defect, maar veranderen het zodanig dat het later in de ontwikkeling defect kan worden gemaakt. Daartoe zetten ze op verschillende plaatsen in het borstkankergen specifieke stukjes virus-DNA, die worden herkend door een `knip-enzym' afkomstig van dat virus. Het borstkankergen met stukjes virus-DNA functioneert normaal. Pas als het knip-enzym erbij komt wordt het gen defect gemaakt. Om deze nieuwe knockoutmuis te verkrijgen maken de onderzoekers een muizenstam met virus-DNA-fragmentjes in het borstkankergen en een muizenstam die in zijn borstklierweefsel het knip-enzym aanmaakt. Berns: ``Als je deze muizen met elkaar kruist, krijg je een muis waarbij specifiek in het borstklierweefsel het borstkankergen niet meer functioneert, omdat precies daar een stuk virus-DNA wordt uitgeknipt. Zo kunnen we bestuderen hoe dit gen bijdraagt aan tumorvorming.''

Het NKI werkt al een aantal jaren met deze knipmethode, en naar tevredenheid. Sinds kort worden een aantal, mogelijk bij kanker betrokken genen tegelijk voorzien van virus-DNA-fragmenten die allemaal worden herkend door het knip-enzym. Aan het knip-enzym hebben de onderzoekers een eiwit geplakt dat wordt herkend door een hormoon, waardoor het virus-enzym pas in de muis gaat knippen wanneer het in aanraking komt met het hormoon. Wanneer de onderzoekers het hormoon bij een muis inspuiten wordt het knip-enzym actief, en wordt het te bestuderen gen beschadigd. Het hormoon hoeft hiervoor maar enkele dagen te worden toegediend. ``Je kunt zo een serie genen tegelijk uitschakelen'', schetst Berns. ``En in principe kun je het systeem uitbreiden door gebruik te maken van eiwitfragmenten die verschillende hormonen herkennen en genen op verschillende tijdstippen uitschakelen. Zo hopen we de tumorvorming zoals die bij mensen verloopt na te kunnen bootsen in muizen, om uiteindelijk nieuwe therapie 챘 n te testen.''

Muis ruimt op/ Grote stukken DNA overbodig

http://noorderlicht.vpro.nl/artikelen/19547674/

Links

Lees ook: "Grofvuil genen - grote populaties, praktisch DNA", Noorderlicht nieuws, 21 nov 2003 Lees ook: "Muizige mens - onderzoek vindt het knaagdier in de mens", Noorderlicht nieuws, 13 aug 2003 Lees ook: 'Van muis en mens - DNA labmuis in kaart', Noorderlicht nieuws, 5 december 2002 Lees ook: "Junk throws up precious secret", BBC news online, 12 mei 2004

Muizen blijken grote delen van hun DNA te kunnen missen. Dat roept opnieuw vragen op over de rol van het zogenaamde 'junk-DNA' dat maar liefst 97 procent uitmaakt van ons erfelijk materiaal.

De Amerikaanse onderzoekers Marcelo A. Nobrega en Yiwen Zhu verwijderden twee grote stukken DNA uit het genoom van een muis. Maar in plaats van een dramatische misgeboorte, kwam er een nest vrolijk piepende muisjes ter wereld waar niets bijzonders mee aan de hand lijkt. Ze waren uiterlijk niet van onbehandelde soortgenootjes te onderscheiden en ook wat betreft voortplanting, leeftijd en grootte was er geen verschil te ontdekken. Dat zet grote vraagtekens bij de functie van het verwijderde DNA.

Het maken van 'knock-out' muizen is een standaard onderzoekstechniek in de genetica. Als de functie van een gen onbekend is, kunnen onderzoekers daar aanwijzingen over krijgen door een muis te maken waarbij het bewuste gen is uitgeschakeld ('knock-out'). Vaak loopt er door die ingreep iets mis in de embryonale ontwikkeling of later bij de stofwisseling of de voortplanting.

In dit geval hebben de onderzoekers gekozen voor de uitschakeling van twee 'genetische woestijnen'; grote delen van anderhalf miljoen respectievelijk achthonderdduizend baseparen ('genetische letters') die geen genen bevatten. Een gen is een 'actief' deel van het DNA dat de code bevat voor een bepaald eiwit. Het is een raadsel waarom slechts 3 procent van het DNA een dergelijke functie heeft en het is ook de vraag wat de functie kan zijn van de rest van het genoom.

Aanvankelijk werd die rest oneerbiedig aangeduid als 'junk-DNA', maar al snel ontstond het vermoeden dat er meer achter schuil ging dan alleen afval. Hele stukken onbegrepen DNA bleken namelijk in vrijwel identieke vorm bij heel verschillende diersoorten voor te komen. Vergelijkend genetisch onderzoek van muis, rat en mens heeft maar liefst 480 gemeenschappelijke fragmenten junk-DNA opgeleverd.

Dus, was het idee, moeten die fragmenten een essenti 챘 le, zij het onbegrepen, rol vervullen voor het organisme. Anders zou de evolutie er in de loop van 75 miljoen jaar wel een aantal veranderingen in hebben aangebracht.

Men dacht dat junk-DNA belangrijk was voor de ontwikkeling van het embryo. David Hausler van de universiteit van California (Santa Cruz) zei het alvolgt: "Het feit dat de geconserveerde fragmenten zich rond de belangrijkste ontwikkelingsgenen bevinden, doet vermoeden dat ze een rol spelen in de regulering van het proces van ontwikkeling en differentiatie."

Daarmee wordt het raadsel van het junk-DNA alleen maar groter. Want waarom behoudt de evolutie iets zo zorgvuldig dat naar ons beste weten geen enkele functie heeft?

Het raadsel wordt nog vergroot door recent menselijk genetisch onderzoek. Daaruit bleek dat er grote individuele verschillen bestaan in het DNA. Het gaat om stukken van het genoom waarin grote delen herhaald voorkomen. Het aantal herhalingen kan persoon verschillen zonder dat dat merkbare gevolgen heeft.

De wetenschap zit nu dus met een paradox. Enerzijds zou het junk-DNA onmisbare functies vervullen bij de embryonale ontwikkeling, maar anderzijds blijven grootschalige veranderingen zonder effect. De onderzoekers kunnen dat resultaat alleen verklaren door te veronderstellen dat de (onbekende) functies in het verwijderde DNA kennelijk in meervoud aanwezig zijn. Zo belangrijk zouden ze dan zijn.

Jos Wassink

Marcelo A. Nobrega, Yiwen Zhu, Ingrid Plazer-Frick, Veena Afzal & Edward M. Rubin: "Megabase deletions of gene deserts result in viable mice", Nature, Vol. 431, 21 okt 2004, p. 988 - 992

http://repositories.cdlib.org/cgi/viewcontent.cgi?article=3767&context=lbnl

Jonathan Sabat, B. Lakshmi, Jennifer Troge, Joan Alexander et. al: "Large-Scale Copy Number Polymorphism in the Human Genome", Science, Vol. 305, 23 jul 2004, p. 525 - 528

http://hum-molgen.org/NewsGen/08-2004/000001.html

Oct 9, '07

Knock-outmuizen na jaren beloond

Nobelprijs voor technologie uit de jaren tachtig/Door Wim Kayser /9 okt 2007 .

De Nobelprijs voor geneeskunde en fysiologie is toegekend aan drie wetenschappers die een baanbrekende technologie hebben ontwikkeld om doelgericht genen in muizen uit te schakelen.

http://nl.wikipedia.org/wiki/Oliver_Smithies Oliver Smithies

Deze zogeheten knock-out-technologie, ontwikkeld eind jaren tachtig, maakt het mogelijk om muizen te gebruiken als proefdiermodellen voor allerlei menselijke ziekten. Hiermee zijn bijvoorbeeld kanker en diabetes tot in detail onderzocht. Ook heeft de vinding geleid tot grote nieuwe inzichten in de ontwikkelingsbiologie.

achtergrond - Muizen krijgen tumoren zoals mensen die hebben achtergrond - Snellere manier om genen in muizen te blokkeren

De laureaten zijn de Amerikaans-Italiaanse onderzoeker Mario Capecchi (70), de Amerikaan Oliver Smithies (82) en de Brit Martin Evans (66). Capecchi en Smithies werkten beiden aan een techniek waarmee een gen op een chromosoom kan worden vervangen. Evans ontwikkelde een techniek om embryonale stamcellen uit een muizenembryo te winnen.

De combinatie van deze twee onderzoekslijnen leverde in 1986 een krachtige technologie waarmee onderzoekers specifiek elk willekeurig gen van muizen konden veranderen.

De eerste publicaties over zulke zogeheten knock-out-muizen verschenen in 1989 in de wetenschappelijke bladen. Sindsdien heeft dit onderzoek een grote vlucht genomen. Tegenwoordig zijn er zelfs bedrijven waar onderzoekers op bestelling een ‘Alzheimer-muis’ kunnen kopen.

Ton Berns, wetenschappelijk directeur van het Nederlands Kankerinstituut, die knock-outmuizen eind jaren tachtig als eerst in Nederland introduceerde, vindt de keuze van het Nobelcomité „volkomen terecht”.

„Het is een revolutionaire technologie met een enorme impact op het biologisch onderzoek. Ik herinner me nog goed de eerste proeven van Capecchi, daarvan was ik diep onder de indruk.”

De technologie wordt nog altijd veel gebruikt in het onderzoek, vertelt Berns.

„De techniek is niet wezenlijk veranderd, al zijn er natuurlijk wel verbeteringen aangebracht die hem veel efficiënter maken. We kunnen nu ook de genen van specifieke cellen beïnvloeden of heel specifieke wijzigingen in een gen aanbrengen.”

Capecchi, Smithies en Evans delen ieder voor eenderde in de 1,09 miljoen euro.

De drie ontvingen in 2001 al de Lasker Award voor hun wetenschappelijke prestatie. Deze Amerikaanse prijs wordt vaak gezien als een goede voorspeller van toekomstige Nobelprijswinnaars.

Sir Martin J. Evans (66) is de voormalige directeur van the School of Biosciences en professor Mammalian Genetics aan de Britse Cardiff University. In 1969 promoveerde hij aan de afdeling Anatomy and Embryology van het University College in Londen. Hij ontwikkelde proefdiermodellen voor menselijke ziektes. De Brit pleit ervoor om ook menselijke embryo’s te gebruiken voor stamcelonderzoek. Hij meent dat de morele angst voor stamcelonderzoek moet verdwijnen. Wetenschappers zijn volgens hem zeer goed in staat te bepalen waar de ethische grenzen liggen.

Oliver Smithies (82) behaalde in 1951 zijn doctorsgraad Biochemistry aan de Oxford University. Hij is inmiddels Amerikaans staatsburger en Excellence Professor of Pathology and Laboratory Medicine aan de University of North Carolina. Hij gebruikt proefdiermodellen om onderzoek te doen naar erfelijke ziektes zoals cystis fibrosis en de bloedziekte thalassemia.

Hij zei het ‘tamelijk plezierig’ te vinden om op dit niveau te worden erkend na meer dan twintig jaar onderzoek. Hij hoopt dat door de Nobelprijs het makkelijker zal zijn ander onderzoek te financieren.

Mario R. Capecchi (70) is onderzoeker aan het Howard Hughes Medical Institute en Distinguished Professor of Human Genetics and Biology aan de University of Utah. Zijn onderzoek wierp een licht op aangeboren misvormingen.

Het was een fantastische verrassing, zei Capecchi, toen hij hoorde van de Nobelprijs. Hij lag nog te slapen toen hij om drie uur ‘s nachts het telefoontje kreeg van het Nobelcomité. De winst is bijzonder voor de van oorsprong Italiaanse wetenschapper. Toen hij na de Tweede Wereldoorlog naar de VS emigreerde, sprak hij nog geen woord Engels.

Zebravis als concurrent van de labmuishttp://home.hetnet.nl/~martine_segers/biotechnologie/zebravis.html

Medische labs kunnen een deel van hun muizenkooien inruilen voor aquaria, als het aan zebravisonderzoekers ligt. Met een nieuwe Utrechtse techniek is het uitschakelen van menselijke ziektegenen in de zebravis een fluitje van een cent. door Martine Segers, gepubliceerd in Bionieuws, 20 juli 2002

De zebravis is de fruitvlieg onder de gewervelde dieren. De kleine flitsende visjes overleven prima in een simpele aquariumbak. In het Hubrecht Laboratorium in Utrecht zwemmen er tienduizenden rond in zulke kleine bakken. De vrouwtjes produceren honderden eitjes tegelijk en de mannetjes

bevruchten die uitwendig. Dat levert goed te bestuderen doorzichtige embryo's op, waarin je na vijf dagen zelfs een hartje ziet kloppen en bloed door de vaten ziet stromen.

Zebravisembryo van zestien uur oudfoto's: Hubrechtlab, Utrecht

De zebravis heeft last van veel dezelfde soort ziektes als mensen, zoals kanker, geboortedefecten, spierziektes en infectieziektes. Kankerweefsels bij mensen en vissen lijken bijvoorbeeld visueel sterk op elkaar. Al komt borstkanker natuurlijk alleen maar voor bij zoogdieren.

Een mens is weliswaar geen vis, maar wel een variatie op hetzelfde thema’, meent prof.dr. Ronald Plasterk van het Hubrecht Laboratorium in Utrecht. Een zebravis heeft ogen, een hart, een lever, een maag, huid, een zenuwstelsel en een wervelkolom, net als wij mensen. Het is ook het eerste dier in de evolutie dat een immuunsysteem heeft.

De vis heeft veel dezelfde overeenkomsten met de mens als de muis. ‘De zebravis is in het laboratorium echter minstens tien keer zo goedkoop en makkelijk te houden als de muis’, stelt Plasterk. De overheid stimuleert bovendien om experimenten met zo laag mogelijke dieren te doen. ‘Ik vind het zelf ook minder vervelend om een vis dood te maken dan een muis. Doordat vissen uitwendige embryo's hebben, hoef je ook minder volwassen dieren te doden.’

1200 euroOndanks die praktische en ethische voordelen, moet de echte opmars van de zebravis in de medische genetica nog beginnen. Tot nu toe is de zebravis eigenlijk vooral populair bij embryogenese-onderzoekers. Voor veel medische genetici was de genetische trukendoos voor zebravissen nog te armzalig.

Maar dat verandert. In rap tempo wordt in Engeland momenteel het genoom van de uit India en Burma afkomstige vis ontrafeld. En die informatie is volledig openbaar. Veel zebravisgenen zijn al op internet te vinden. Medische biologen komen ze al zeer regelmatig in databases tegen tijdens hun zoektocht naar homologen van allerlei ziektegenen.

Bovendien heeft drs. Erno Wienholds uit Plasterks onderzoeksgroep een relatief eenvoudige methode ontwikkeld om een specifiek gen uit te schakelen in een zebravis. Dat is een handig hulpmiddel in de zoektocht naar de functie van een gen en hun rol in ziektes. Begin juli publiceerde Science zijn artikel waarin hij beschrijft hoe hij een gen uitschakelde waardoor het immuunsysteem van de vis plat komt te liggen.

Het maken van knock-out zebravissen is met de nieuwe techniek flink goedkoper dan het maken van een knock-out muis. Uiteindelijk moet je voor 1200 euro een gen in vis kunnen uitschakelen, schat Wienholds.

‘Je hoeft eigenlijk alleen de sequentie te kennen van het gen dat je wilt uitschakelen’, vertelt Plasterk. ‘Weten waar het ligt op het genoom is niet nodig.’ Wienholds schakelt genen namelijk uit door gericht te zoeken naar random mutaties die hij met een mutagene chemische stof opwekt in een groot aantal zebravissen (zie kader).

Volgens de definitie zijn de vissen zelfs niet genetisch gemodificeerd en dat scheelt een hoop papierwerk. ‘Daarom hebben we bijvoorbeeld geen zorgen over veiligheidsaspecten van recombinant DNA-onderzoek; we hoeven geen goedkeuring van de Cogem te krijgen’, aldus Plasterk.

En zo wordt de zebravis nu wel een geduchte concurrent van de labmuis, denkt Plasterk. ‘Ik verwacht dat onze knock-out techniek een grote zuigende werking zal hebben richting het zebraonderzoeksveld.’ Tot voor kort piekerde bijvoorbeeld immunoloog en spinozaprijswinnaar prof.dr. Hans Clevers er niet over om aan de zebravis te gaan werken. ‘En nu gaan we waarschijnlijk samen met hem het APC-gen in zebravis uitschakelen om de rol van dit gen bij het ontstaan van darmkanker verder te ontrafelen.’

‘Een knock-out vis maken kan je bovendien op basis van je lopende budget doen’, vult dr.ir. Freek van Eeden aan, die op het Hubrechtlab de embryogenese van de zebravis bestudeert. ‘Terwijl je voor het maken van een nieuwe knock-out muis een serieuze projectaanvraag moet doen.’

Van Eeden speculeert ook dat het nu mogelijk wordt om een aantal goed geconserveerde genen waar niets van bekend is onder de loep te nemen. ‘Bij een muis zou het veel te duur zijn om er daar een paar van uit te schakelen, maar als het

bij zebravissen echt goedkoop wordt kun je dat wel eens proberen.’

MissiewerkOp de Universiteit Leiden verricht zebravisonderzoeker prof.dr. Herman Spaink missiewerk voor de zebravis. Na een enthousiaste lezing voor zo'n dertig onderzoekers voor het Leids Universitair Medisch Centrum vertelt hij dat de mens en de zebravis op moleculair niveau zo vreselijk veel op elkaar lijken dat het verschil soms amper te zien is.

Spaink denkt dat er veel onnodige experimenten met muizen plaatsvinden. Volgens hem is een groot deel van het muizenonderzoek ook in zebravissen mogelijk, misschien wel 90 procent. 'Van homologen van menselijke ziektegenen kan je eerst in de zebravis goed uitzoeken in welke pathways ze een rol spelen en met welke eiwitten het genproduct een interactie aangaat. Weet je dat allemaal, dan kan je heel gericht onderzoek doen in de muis.'

'De zebravis zal de muis nooit volledig vervangen', vervolgt Spaink. 'Medicijnen wil je echt wel eerst op muizen testen. Maar er worden nu duizenden medicijnen getest op muizen die niet blijken te werken.' Een groot deel daarvan had je ook eerst op zebravissen kunnen testen. En nog makkelijker ook. Zo gebruikt het Duitse bedrijf Artemis-pharmaceuticals microtiterplaten vol met zebravisembryo's om uit te zoeken welke fysiologische effecten mogelijke nieuwe medische stoffen hebben in gewervelde dieren. Ook de toxische effecten van een mogelijk nieuw medicijn komen zo snel boven water.

Toch betwijfelt Spaink of de muizenwereld zich spoedig laat overtuigen van de ethische en financiële voordelen van de zebravis.

De nieuwe knock-out technologie is in de zebraviswereld in ieder geval niet onopgemerkt gebleven. Plasterk heeft het gevoel dat de geschiedenis zich herhaalt. ‘Bij C. Elegans, het diertje waar genetisch alles mee kon, konden onderzoekers ironisch genoeg lange tijd niet een specifiek gen uitschakelen. Technisch bleek dat voor ons een kleine stap.' Toch had zijn groep er een enorme impact mee op het hele onderzoeksveld dat vooral bevolkt werd door klassieke genetici.

'Wij waren de DNA-wizards die trucs bedachten waar andere mee konden werken. Dat heeft ons veel bezoek opgeleverd. En dat gebeurt nu weer', vervolgt Plasterk. 'Eigenlijk is de knock-out zebravis het werk van slechts één derdejaars aio, een goede weliswaar. Maar de aanvoerders van het zebraveld komen ons nu met de hoed in de hand om hulp vragen.’

'Biologen onderschatten kracht van robotiseren'

‘Onze techniek is eigenlijk heel simpel’, stelt drs. Erno Wienholds. Met de mutagene stof ENU wekt hij volstrekt willekeurige mutaties op in het genoom van de zebravis en dan gaat hij slim zoeken naar de vissen waar toevallig het gewenste gen is uitgeschakeld. De kracht van de Utrechtse techniek is dat hij dat niet bij een paar vissen deed, maar bij meer dan 2500.

Voor die zoektocht gebruikt Wienholds het vissen-DNA dat hij uit sperma van de vissen haalt of isoleert uit een klein stukje afgeknipte vin. Hij vult vervolgens de putjes op microtiterplaten met het complete DNA van elk van de 2500 vissen. En dan mag de robot aan de slag. Via de PCR-techniek probeert die het gezochte gen te vermenigvuldigen. Een andere machine kan deze genen vervolgens sequencen, waarna met de computer makkelijk te bepalen is welke vissen een gemuteerd gen hebben dat niet meer naar behoren functioneert.

'Elke onderzoeker kan mutagene stoffen toedienen aan zebravissen en het sequencen is ook simpel', vertelt Wienholds. 'Er is een apparaat dat dat voor je doet en waarvoor allerlei kitjes te koop zijn met de juiste componenten.' Om het goedkoop te houden moet je elke proef wel in kleine volumes uitvoeren. ‘Wij denken dat onze techniek de standaard techniek wordt die iedereen in het veld gaat gebruiken.’

Biologen onderschatten nog steeds hoeveel er te winnen is met het paralelliseren, minituriariseren, robotiseren en het geautomatiseerd verwerken van gegevens, meent Plasterk. ‘Biologen zijn erg gewend om een proef te doen met twee buisjes, het experiment en de controle. Terwijl wij een proef doen met vijfduizend buisjes.’ ‘En maar één daarvan is positief’, vult Wienholds aan.

De Utrechtse techniek verschilt 180 graden met die bij de muis, waar het gen in een stamcel gericht wordt uitgeschakeld via homologe recombinatie. Daarna stoppen onderzoekers die cel in een embryo tussen de andere cellen in de hoop dat er in de volgende generatie muizen bij minstens één muis het gen in alle cellen is uitgeschakeld.

Nu er een bank met gemuteerde vissen aanwezig is, kost het maar een maand om de gewenste knock-out vis te vinden. Een deel van die tijd is nodig om een goede PCR-primers voor je gen te vinden. Inteeltkruisingen leveren vervolgens in zes maanden homozygote knock-out vissen. ‘We hebben inmiddels uit stukjes vin van zevenduizend vissen genoeg DNA in de diepvries zitten om te zoeken naar 200 verschillende knock-outs’, zegt Wienholds. 

© Martine Segers

Dec 16, '07

Gen-verlieskapotte genen ?uitgeschakelde genen ?14. 12 2007

De ontwikkeling van nieuwe genen leidt tot aanpassingen die helpen soorten te overleven....

Gen -verlies( door sommigen creationisten als "degeneratie" beschouwd )kan ook een selectief voordeel betekenen .

Een groep van wetenschappers aan de Universiteit van Californië«, Santa Cruz olv professor David Haussler heeft dit (minder bestudeerd ) idee onderzocht :De studie bevat onder meer de eerste systematische analyse waarbij lang geleden verworven actieve en gevestigde genen , verloren zijn gegaan in de miljoenen jaren van evolutie die uitmonden in de menselijke soort

"Het idee dat gen- verlies kan bijdragen tot aanpassing is een fijn idee , maar niet goed bestudeerd,"zei Zhu"We vonden drie voorbeelden van dit soort verlies in de wetenschappelijke literatuur : dit soort verliezen kunnen allemaal medische implicaties hebben ."Het opsporen van dergelijke "verloren "genen gebeurde met het speciaal software programma "TransMap" , dat werd ontwikkelddoor co-auteur Diekhans

Het programma vergeleek de genomen van muis en mens en zocht naar genen die voldoende belangrijke mutaties hadden ondergaan om nonfunctioneel te worden , ergens sinds de 75 miljoen jaar geleden splitsing muis / mens.

"Deze studie is de eerste in haar soort die op zoek ging naar recent verloren genen en waarbij geen (bijna) kopieën ervan , elders in het genoom aanwezig zijn ,(1) " zei Haussler. "Dit zijn waarschijnlijk de belangrijkste verloren geraakte genen .

" (Werkzame en functionele ) genen kunnen op diverse manieren worden geelimineerd De studie concentreerde zich vooral op mutationele verliezen die het" open reading frame " (ORF) verstoren

Dat zijn :

ofwel punt- mutaties, waarbij invoegingen (insertie ) of vervanging (substitutie )van een DNA-base de gecodeerde instructies vastgelegd in het DNA , verstoren ....ofwel veranderingen die optreden wanneer een groot deel van een gen helemaal is geschrapt ( deleted ) of verplaatst (translocatie )naar een nieuwe plek (locus/ ) in het genoom.

"We gebruikten het honden genoom als de out-groep om de valse valse positieven eruit te filteren ," zei Sanborn ," omdat de hond al eerder afsplitste van de gemeenschappelijke muis/ mens voorouder ." (1)

"Als er een gen is dat nog steeds voorkomt in zowel hond als muis, maar niet in de mens, dan was het waarschijnlijk aanwezig in de gemeenschappelijke voorouder en is het vervolgens verloren gegaan in het menselijk geslacht."

Met behulp van dit proces, werden 26 verliezen van oude -genen vastgesteld, met inbegrip van 16 die nog niet eerder bekend waren .

De in deze studie gevonden gen -verlies kandidaten vertegenwoordigen niet de komplete lijst van genexpressie -verliezen van ( reeds lang bewaarde en doorgegeven ) conservatieve genen in het menselijk geslacht, en wél omdat de analyse voornamelijk is ontworpen voor het opsporen van valse negatieven, meer dan valse positieven.

Vervolgens werden de geïdentificeerde homologe genen (in het volledige genoom van de mens, chimpansee, rhesus aap, muis, rat, hond en opossum ) gebruikt om een een schatting uit te voeren over de tijdsduur waarbinnen zulk ( specifiek ) gen functioneel bleef vooraleer het definitief "verloren"ging .

Dit maatk een verfijnde benadering mogelijk van het tijdstip van gen -verlies en diende ook als een instrumentaal werkmodel bij het beantwoorden van de vraag : of het gen in kwestie al erg lang meeging (en dus waarschijnlijk functioneel was ) , of slechts het verlies van een redundante gen kopie aantoont .

Ze vonden 6 genen die verloren gingen ____alleen al in het menselijk genoom.

Een vroeger onbekend verlies, ___ het gen voor acyltransferase-3 (ACYL3), ____kreeg hun bijzondere aandacht

"Dit is een oud eiwit dat overal voorkomt in de gehele stamboom van het leven," zei Zhu.

" Meerdere exemplaren ( multipele copieen ) van het ACYL3 gen zijn aanwezig in vliegen- en worm -genomen. In de zoogdieren clade is er slechts een exemplaar links, en is ergens in de primaten stamlijn dat exemplaar verloren gegaan."

"In onze analyse hebben we vastgesteld dat dit bepaalde gen in mens en chimp een (zelfde )

onzin (nonsense ) mutatie bevat, maar het lijkt nog steeds te functioneren in de rhesus-makaak ," zei Sanborn .

Verder vonden de wetenschappers dat deze chimp/mens nonsens mutatie niet aanwezig is in de oerangoetan, zodat het gen waarschijnlijk nog functioneel is in die soort.

"in de evolutionaire stamboom van de mensapen , zat dat (nog)functionele gen ( vermoedelijk ) tussen de split chimp /orangutan (en de split chimp/mens ), in het genoom van de gorilla," voorspelde Sanborn.

Weten dat het gen nog steeds actief is in de gorilla zou het tijdstip van het verlies goed kunnen benaderen .

Sanborn heeft in het laboratorium de volgorde van de overeenkomstige sequentieele regio in een DNA-monster van een gorilla , ontcijferd . In de gorilla DNA-sequentie bleek het gen intact, zonder de (nonsense) mutatie, zodat het verlies waarschijnlijk moet plaatsgevonden hebben na de soortvorming van de gorilla en de chimpansee.

"Acyltransferase-3 was niet de enige verloren -gen waarvan geen verwante functionele homologen in het menselijk genoom , zijn gevonden . Een van de hoogtepunt van ons onderzoek was dat we een lijstje hebben kunnen opstellen van deze 'orphan -gene verliezen," zei Zhu.

"Sommigen onder hen zijn meer dan 300 miljoen jaar, functioneel gebleven , en ze zijn de laatste exemplaren ( van die stamlijnen ) die nog in het menselijk genoom overblijven . Het zijn de in het menselijke genoom aanwezige afstammelingen ( kopieën van kopieen ) van functionele muis-genen , nog in het menselijk genoom aanwezig ,lijkt het , zij het non-functioneel /uitgeschakeld of kapot "

"Deze verweesde- genen(1) ___orphan genes ____ kunnen interessante kandidaten worden voor de experimentele biologen " zei Zhu. "Het zou bijvoorbeeld interessant zijn om uit te vinden wat het biologische effect van dit soort genen -verlies was . Zodra hun functie(s) goed is (zijn) bestudeerd , bij die soorten die ze nog steeds als actieve exemplaren bezitten , kunnen we misschien speculeren over de effecten op de menselijke evolutie."

http://www.sciencedaily.com/releases/2007/12/071214094129.htmLosses Of Long-established Genes Contribute To Human EvolutionHaussler ,Jingchun Zhu, Zack Sanborn ,Craig Lowe, Mark Diekhans, Tom PringleHun bevindingen verschenen in het nummer van (14 december )PLoS Computational Biology.Hun bevindingen verschijnen in het nummer van 14 december PLoS Computational Biology.(1)Dit soort éénmaal (= niet gedupliceerde) in het genoom aanwezige genen , noemt men verweesde( orphan ) genen(2)knaagdieren staan volgens de fylogenetische consensus( zowel genetisch als in tijd ) dichter bij de primaten dan de roofdieren ...

Nov 11, '07

Ultraconserved DNAhttp://pharmacy.ucsf.edu/news/2007/10/23/2/http://www.ucsf.edu/sciencecafe/2007/ahituv.htmlhttp://intl.emboj.org/nature/journal/v449/n7158/full/449010b.htmlhttp://www.nature.com/nature/journal/v449/n7158/full/449010b.htmlhttp://www.cbse.ucsc.edu/news/2004/12/16/ultraconserved_breakthrus/index.shtmlhttp://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/304/5675/1321http://www.cbse.ucsc.edu/news/2004/12/16/ultraconserved_breakthrus/index.shtml

Blogshttp://genomicron.blogspot.com/2007/09/ultraconserved-non-coding-regions-must.html*********************************************************************

Creationistshttp://www.scienceagainstevolution.org/v11i12f.htmhttp://afdave.wordpress.com/2007/09/13/ultraconserved-dna-another-failed-prediction-of-evolution/(en natuurlijk ook Peter Borger )

Oct 12, '08

ultra conserved non-coding sequensesWetenschappers van de Stanford University (1) vragen zich af waarom grote stukken niet-coderend DNA van muizen en mensen zoveel op elkaar lijken.Als je redeneert vanuit de evolutietheorie zou je kunnen verwachten dat deze sequenties niet bewaard blijven ( in de beide afzonderlijke phylogenetische stamlijnen vertrekkend vanuit hun gemeenschappelijke voorouder ) .Deze stukken DNA zouden vanwege natuurlijke selectie op z'n minst gemuteerd moeten zijn.

Toch schijnen ze bij alle zoogdieren hetzelfde te zijn.( deze " ultra conserved non-coding sequenses " behoren tot de gemeenschappelijke voorouder van alle zoogdieren )Knock-out proefmuizen, waarbij selectie van die bepaalde stukken ultra -conserved DNA experimenteel verwijderd werden uit hun opstart-genoom , kunnen een "normaal " leven leiden. (althans onder de gepamperde laboratiorium-omstandigheden )Waarom zou natuurlijke selectie die delen zo goed bewaren als ze geen nut hebben voor de overleving van de soort ?Ze hebben dat dus duidelijk wel ... ze coderen dus niet voor de meeste reeds goed bekende en bestudeerde eiwitten , je mag ( bijvoorbeeld ) veronderstellen dat ze wel regulariserend optreden en coderende genen aan of uitzetten dmv ( andersoortige ?) nog niet in detail ontdekte scheikundige machientjes ? Niemand weet het fijne ervan tot nu toe .

Volgens een onderzoeker is evolutie "erg leuk... je beantwoordt 챕챕 n vraag en je krijgt er vijf anderen voor terug." Dat is dus de normale gang van zaken in elke tak van eerlijke wetenschap ....(2)

Hij vond het ook "erg verrassend" dat die verwijderde delen geen effect hadden op de muizen en vond het niet logisch. Hij wil graag weten wat die 'ultra geconserveerde elementen' doen.http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081001181306.htm

(1)McLean, C., and Bejerano, G. Dispensability of mammalian DNA. Genome Res., (in press) DOI: 10.1101/gr.080184.108http://genome.cshlp.org/cgi/content/abstract/gr.080184.108v1

Adapted from materials provided by Stanford University Medical Center.

(2) Maar creationisten zien dat natuurlijk als een mankement (Speciaal in dit verband mag de creationist Peter Borger en zijn oppponent Thomasso Agricola zeker niet ontbreken ... die hebben het namelijk ook al herhaaldelijk over die knock- out muizen gehad )Creationisten beweren zelfs dat dergelijke lopende onderzoeken en nieuwe puzzels , de evolutietheorieen definitief onderuit halen( falsifieren ) ( wat ze zelf zo overtuigend en demonstratief onderuit halen , zijn natuurlijk hun eigen gefabriceerde misvattingen , desinformatie en "stromannen van de wetenschap en de evolutietheorie )Ze beweren dat deze nieuwe puzzels ( zoals altijd ) beter sporen met de bijbelse sprookjes en verhalen , die zelf inhoudelijk als feitelijke gebeurtenissen al veelvuldig wetenschappelijk onderuit zijn gehaald en waarvoor ze geen ander gronden aanvoeren dan "geloof " , laat staan wetenschappelijk onderzoek doen naar hun basale(uittestbare ) claims ( in verband met zondvloed >ouderdom aarde >up datings van fossielmateriaal , ontdekkingen, nieuwe inzichten ... etc...etc ) ....

(aangepast (en aangevuld ) naar = comment # 56 van Roel / 11-10-2008 21:04volkskrantblog.nl/bericht/223547

....(.Creationisten ) gooien evolutiebiologie, kosmologie en geologie op één hoop en noemen dat het "evolutiemodel".( ze zien dat model ook graag als een " onveranderlijk "( meestal verouderd )allegaartje van oude wetenschap met nog slechts historische waarde )

Volgens hen verwijzen alle natuurwetenschapelijke theorieën naar elkaar en is het wetenschappelijke bouwwerk één grote cirkelredenering.Evolutiebiologie, kosmologie en geologie zijn echter verschillende disciplines die onafhankelijk zijn van elkaar en toch tot resultaten komen die consistent zijn met elkaar. Gezamenlijk is dat een sterk maar bewegelijk en plastisch bouwwerk( voortdurend goedt onderhouden door het te repareren wanneer nodig ) .

Creationisme heeft nog niet eens het begin van zo'n bouwwerk.Geen steen, geen heipaal, geen losse plank.Het is bovendien uitermate star net zoals alle doctrines van het grote gelijk en de absolute waarheidWaarschijnlijk is het daarom dat creationisten geen "riskant " wetenschappelijk onderzoek doen, waarbij de uitkomsten niet vooraf vast staan . Ze weten dat ze aan echte wetenschap toch niet kunnen tippen. Dus schrijven ze maar blogs en boeken, komen bij de Minister van Onderwijs op de thee, bewerken de politiek en de publieke opinie, etc. etc.

Politieke spelletjes en propaganda, bah.En dan hebben al dan niet gediplomeerde creationistische "wetenchappers " het gore lef om te beweren dat het wetenschappers (door hem steevast "darwinisten" genoemd) zijn die dat doen.