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OCORR~NCIA E ESTUDÓS ELECTRONO-MICROSCÓPICOS DO VÍRUS DOMOSAICO DO TRIGO, TRANSMITIDO PELO SOLO, NO ESTADO DO

RIO GRANDE DO SUL1

VANDERLEI R. CAETANO,2 E.W. KITAJIMA3 & A.S. COSTA4

1Centro Nacional de Pesquisa do Trigo, EMBRAPA, 99100 - Passo Fundo, RS,2Depto. Biol. Cel., Univ. Brasília, 70.000 - Brasílía, DF e 3 S. Virologia, Inst.

Agronômico, 13100 - Campinas, SP(Aceito para publicação em 22/11/77)

RESUMO

Uma moléstia de trigo caracterizada por sintomas de mosaico ocorre de maneira gene-ralizada nos trigais do Estado do Rio Grande do Sul. Sua disseminação natural se dá atravésdo solo, associada ao fungo Po/ymyxa graminis Led. A hipótese de que esta anomalia seriacausado pelo vírus do mosaico do trigo, transmitido pelo solo, baseada em sintomatologia edisseminação pelo solo, foi corroborada pelas evidências obtidas através de testes de trans-missão mecânica, pelo solo e pelos lavados de raiz, propriedades físicas in vitro do agenteetiológico, bem como dos estudos sobre a morfologia de bastonetes associadas à infecção e aultraestrutura dos tecidos afetados.

(Fítopatologia Brasileira 3:39 - 46.1978)

ABSTRACT

The occurrence and electron microscopy of the soíl-borne wheat mosaic virus at theState of Rio Grande do Sul, Brazil

A disease of wheat, characterized by mosaic symptoms of the leaves, is widespread inthe culture of this cereal throughout the State of Rio Grande do Sul, Brazil. This condition

Estes trabalho foi realizado quando o autor principal se achava no Inst. Pesq. Agropec. Sul, Pelotas,RS, e recebeu auxílios financeiros do FECOTRIGO, FAPESP e CNPq; apresentado durante o X Cong,Soe. Bras. Fitopatologia (Recife, PE; Fevereíro/77).

4 Bolsista do CNPq (Pesquisador-conferencista).

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is transmitted through the soil in the nature, being associated with the presence of the soilfungus Polymyxa graminis.

The hypothesis that this disease is caused by the soil-borne wheat mosaic virus, basedon symptomatology and dissemination associated with the soil, was confirmed by transmis-sion testes (mechanical, soil and root washings), physical properties in vitro of the pathogen,morphology of the rodlike particles found associated with the disease, as well as the ultras-tructure of the affected cells.

INTRODUÇÃO

Embora o trigo seja cultivado há déca-das no Brasil, principalmente nos estados dosul do país, só recentemente algumas virosesforam reconhecidas afetando este cereal: umamarelecimento generalizado, causado pelovírus do nanismo amarelo da cevada (barleyyellow dwarf), já bastante disseminado nosul do país, e causando sérios prejuízos(Caetano, 1972) e a "espiga branca" (Caeta-no et al., 1970), causada por um vírus trans-mitido por cigarrinha (Costa et alo, 1973) epossivelmente pertencente ao grupo do vírusda "hoja blanca" do arroz (Kitajima et aI.,1971). Uma nova anomalia de possível etio-logia viral foi recentemente verificada numlote experimental, no Centro de Pesq. Agrop.Cerrado, no Distrito Federal, caracterizadapor um mosaico estriado e associada a partí-culas do tipo rhabdovírus (Kitajima et ai.,1976).

Uma outra enfermidade, tida como decausa viral, começou a preocupar os triticul-tores a partir de fins da década dos 60, repre-sentada por sintomas de mosaico nas folhas,e cuja disseminação estaria associada ao solo.Observações preliminares indicaram estaresta forma de mosaico bastante disseminadano Estado do Rio Grande do Sul, causandomesmo certos prejuízos (Caetano et ai.,1971; Prestes et al., 1972). Constatou-se,por outro lado, a ocorrência do fungoPolymyxa graminis Led., no sistema radi-cular das plantas afetadas (Caetano et ai.,1971; Pierobom et aI., 1972).

(Fitopatologia Brasileira 3 :39 - 46. 1978)

Esses dados iniciais sugeriram que estaanomalia seria causada pelo vírus do mosaicodo trigo, transmitido pelo solo (soil-bornewheat mosaic virus) descrito inicialmentenos Estados Unidos (McKinney, 1925) e quetambém acha-se descrito na Itália e no Japão(vide Brakke, 1971).

O presente artigo relata os resultadosde uma série de estudos realizados visandoconfirmar esta hipótese.

MATERIAL E MÉTODOS

Fonte de inóculo: esta constituiu-se de plan-tas de campo, ostentando sintomas típicos(Figs. 1 e 2) e do solo, proveniente da mes-ma área aonde a planta fora recolhida.Plantas teste: utilizaram-se como planta indi-cadoras, nos testes de transmissão, as seguin-tes variedades de trigo: 'IAS-51', "I'oropi' e'Lagoa Vermelha'.Testes de transmissão: (a) transmissão me-cânica - o inóculo constituiu-se do suco defolhas com sintomas típicos de mosaico,extraído em presença de tampão fosfato pH8, O,lM (1; 1 p/v), o qual era esfregado nasfolhas das plantas indicadoras, previamentepolvilhadas com carborundo; (b) Transmis-são com lavados de rafz - essencialmenteempregou-se a técnica descrita por Brakke &Rao (1967). Cinqüenta sementes foram pos-tas a germinar numa placa de Petri forradacom papel filtro umedecido. Dois dias após agerminação adicionaram-se 30rnl do lavadode raíz, o qual era mantido na placa duran-te 24hs. a 50C. Após este período, as mudi-

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nhas eram transplantadas em vasos contendosolo esterilizado, fazendo-se a leitura dos sin-tomas periodicamente. Numa outra alternati-va, as variedades indicadoras eram semeadasem vaso com 2/3 de areia e 1/3 solo, ambosesterilizados. Quatro dias após a semeadura,o vaso foi regado com lavado de raíz, man-tendo-se a seguir esses vasos a 50C, duran-te dois dias. Os lavados de raíz, utilizadosnestes ensaios, foram obtidos do sistema ra-dicular das plantas afetadas, enxaguadas emágua destilada por 30 minutos à temperatu-ra ambiente, após uma lavagem prévia emágua corrente; (c) transmissão pelo solo -sementes das plantas indicadoras foram se-meados em solos provenientes dos locais deonde foram recolhidas as plantas com mosai-co, tendo sido os vasos mantidos em condi-ções de casa-de-vegetação(l8-300C) ou na-turais (5-1O°C).Determinação das propriedades [tsicas invitro do patógeno: (a) ponto fmal de dilui-ção - o inóculo original foi diluido a 10-1 ,

10-2 e 10-3, e a seguir inoculado mecanica-mente nas plantas indicadoras; (b) ponto deinativação térmica - numa primeira série,o inóculo foi aquecido por 10 minutos a 30,40, 50, 60 e 700C, e a seguir inoculado.Numa outra série, as temperaturas usadasforam 60, 65 e 700C.

Todos estes testes acimacitados foramconduzidos no IPEAS,Pelotas, RS.Microsco-Ipia electrônica: (a) preparações "leaf dip"-amostras de folhas de plantas com sintomasde mosaico no campo, ou exibindo-os apósserem inoculadas experimentalmente commaterial procedente de plantas afetadas,foram colhidas e acondicionadas em sacosplásticos e levadas à S. Virologia, Jnst. Agro-nômico de Campinas, SP. Preparações rápi-das para exame ao microscópio electrônicoforam feitas pela técnica de "leaf dip", me-talizadas ou contrastadas negativamente,para detecção de eventuais partículas virais;(b) exames histológicos pequenosfragmentos do tecido foliar de plantas afeta-das e sadias, contrôle, foram fixadas em glu-

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taraldeido a 3% em tampão fosfato 0,04M,pH 7,2, pós-fixados com solução a 1% deOS04, em tampão fosfato 0,15M, incluidosem Epon, seccionados e examinados. Os tra-balhos de microscopia electrônica foram fei-tas em um microscópio electrônico ElmiskopJ, da Siemens.

RESULTADOS

Dez a 25% das plantas inoculadas me-canicamente, com suco extraído de plantascom sintomas de mosaico, exibiram os pri-meiros sintomas 20-25 dias após a inocula-ção. Houve uma redução da infecção daordem de 43% quando o suco foi diluido a1:1Oem relação ao inóculo original, e quan-do a diluição foi de 1:100 não se verificoutransmissão. Com sucos aquecidos a 600C,em dois testes, a taxa de transmissão foi de 2a 5%, respectivamente, enquanto a 650Caquela foi nula.

Em inoculações feitas com lavado deraíz os sintomas levaram 25-30 dias para semanifestarem. Em leituras feitas 40 dias apósa.ínoculação, nas experiências realizadas emplacas de Petri, aonde foram germinadas assementes, a eficiência da transmissão verifí-cada foi de 50-80%. Contudo, em inocula-ções com lavados de raíz, em plântulas de-senvolvidas, no vaso, a eficiência foi menor,variando de 30-60%. A taxa de transmissãodo mosaico, quando houve a semeadura emsolo contaminado, por outro lado, foi muitoalta, atingindo mesmo 100%,principalmentequando a planta foi mantida fora da casa-de-vegetação. Dentro desta, porém, a transmis-são foi sensivelmentemenor, nunca ultrapas-sando a 10%.

Quanto aos sintomas, sua manifestaçãosempre se iniciava pelas folhas em fase dedesenvolvimento. Há inicialmente o apareci-mento de algumas poucas estrias cloróticasde 1mm x 3-4mm. Conforme as condiçõesambientais e da variedade do trigo, como nocaso do 'IAS-51', estas estrias se tornam maismaiores e de bordos irregulares.Nas varieda-

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des 'Lagoa Vermelha' e 'Toropi', isto já nãoocorria, nelas surgindo sintomas típicos demosaico (Fig. 2). As plantas inoculadas, emgeral, perfilham intensamente assumindo fre-quentemente a forma de roseta. No caso devariedades mais susceptíveis como a 'IAS-51',se a infecção for precoce, não há granação.Em outras mais tolerantes, como a 'LagoaVermelha' e 'Toropi', as plantas apesar deexibirem sintomas podem se desenvolverquase normalmente (Fig. 1) embora hajadrástica redução na produção de grãos.

Preparações "leaf dip" de plantas detrigo ostentando sintomas típicos da molés-tia, após inoculação experimental ou emcondições de campo, apresentavam consis-tentemente partículas em forma de bastone-tes de ca. 20mm em diâmetro (Fig. 3). O his-tograma da distribuição dos comprimentosdas particulas exibia duas classes modais:uma entre 150 e 20nm, e outra nas proximi-dades de 300nm (a calibração da magnifica-ção foi feita usando-se a réplica de grade dedifração de 2.140 linhas/mm e também me-dindo-se as partículas do vírus do mosaicodo fumo). Tais bastonetes não foramdetectados em preparações similares feitas deplantas sadias.

O exame de secções ultrafmas, detecido foliar de trigo mostrando sintomas tí-picos de mosaico, revelou a frequente ocor-rência de partículas aparentemente rígidas,15-18nm em diâmetro e de comprimentovariável,provavelmente em função do ângulode seccionamento, e espalhadas ao acaso nocitoplasma (Figs. 4-6), e que devem repre-sentar os bastonetes encontrados nas prepa-rações "leaf dip" in situo Elas ocorriam empraticamente todos os tipos de células folia-res, inclusive nos vasos crivados e lenhosos(Fig. 7). Inclusões, de certa densidadeelectrônica, aparentemente constituída deelementos tubulares convolutos, 30-40nmem diâmetro, formando um emaranhado dedimensões variadas, foram frequentementenotadas nas imediações da área citoplasmá-tica contendo os bastonetes (Figs. 4 e 5).

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Ocasionalmente, pequenos cristais, exibindouma periodicidade de 5-7 nm, ocorriam nocitoplasma (Fig. 6). Os cloroplastos geral;mente apareciam normais, mas às vezes apre-sentavam-se com sinais de degenerescência,caracterizada por um estroma menos denso edesorganização do sistema lamelar, além dapresença de numerosos glóbulos electron-densos. O núcleo, por outro lado, exibia oca-sionalmente uma condensação exagerada deseu material cromático (Fig. 5).

Em tecidos de folhas de plantas sadias,essas anomalias não puderam ser constata-das.

DISCUSSÃO

A soma das evidências até agora coligi-das indicam, com relativa margem de segu-rança, que o mosaico verificado afetando deuma maneira generalizada a cultura do trigono Estado do Rio Grande do Sul, seria causa-do pelo vírus do mosaico do trigo, transmi-tido pelo solo (VMT).

A sintomatologia nas plantas infetadas,natural ou artificialmente, a transmissibili-dade do agente causal por métodos mecâni-cos, pelo solo contaminado ou ainda peloslavados de raízes de plantas afetadas, e aspropriedades físicas in vitro determinadas(ponto final de diluição e de inativação tér-mica) são similares àquelas descritas para oVMT nos Estados Unidos, Japão e Itália(Brakke, 1971).

Confirmando as similaridades nas pro-priedades biológicas, os exames ao micros-cópio electrônico de preparações "leaf dip"constataram a presença de partículas em for-ma de bastonetes, 20nm em diâmetro e com2 comprimentos modais: uma entre 150 e200nm e outra a cerca de 300nm, à seme-lhança do que foi descrito para o VMT(Brandes at al., 1964). Ensaios de purifica-ção tem demonstrado que estes bastonetesrepresentam as partículas do VMT (Gumpf,1971; Tsuchizaki etal., 1973). Gumpf(1971)havia verificado que a infetividade do VMT

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Figuras 1 e 2. Sintomas exibidos pelas plantas de trigo, var. 'Toropi', afetadas pelo vírus do mosaico dotrigo (VMT). Figura 1. Aspecto geral da planta infetada à esquerda (à direita, planta sadia).Figura 2. Detalhe dos sintomas foliares; a última folha, à direita, é procedente de uma plantasadia.

estaria associada às partículas longas, mas re-centemente Tsuchizaki et ai. (1975) pude-ram demonstrar que os dois tipos de partí-culas, curtas e longas, seriam necessários parainiciar a infecção, constituindo-se assim oVMT em mais um caso de sistema multicom-ponente (Jaspars, 1974).

As alterações ultraestruturais das cé-lulas de folhas infetadas pelo VMT no Esta-

do do Rio Grande do Sul, são também simi-lares àquelas descritas para a infecção peloVMT nos Estados Unidos e no Japão (peter-son, 1970; Hibino et al., 1974a, b). Foramencontradas inclusões citoplasmáticas for-madas de túbulos convolutos, às quaisHibino e Saito (1976) puderam associar ati-vidade de diaforase. Embora partículas VMTfossem encontradas dispersas no citoplasma,não se verificou sua ocorrência no vacúolo,

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Figura 3. Micrografia electrônica de uma preparação "Ieaf dip" metalizada com crômo, mostrando par-tículas em forma de bastonete, do VMT.

Figuras 4 a 7. Micrografias electrônicas de secções ultrafinas de tecido foliar de trigo infetado pelo VMT.Figura 4. Parte do citoplasma de uma célula do parenquina palisádico, exibindo um grandenúmero de partículas do vírus (V), além da inclusão (i) constituida de material tubular con-voluto. p - cloroplasto; Figura 5. Detalhe de uma zona citoplasmática adjacente ao núcleo(N), contendo grande número de partículas do VMT (V) e a inclusão (i). Nota-se que a croma-tina do núcleo acha-se condensada. Figura 6. Uma inclusão cristalina (c) no cito plasma. Part í-

culas do VMT (V) ocorrem ao seu redor. Figura 7. Detalhe de uma vaso lenhoso, mostrandopartículas do VMT (V) em seu interior. ps - parede secundária.

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ou formando agregados, como descrito porHibino et ai. (1974a, b). Os ocasionais cris-tais citoplasmáticos são idênticos àquelesrelatados por Peterson (1970) e Hibino etai. (1974a). Estes sugeriram que tais cristaisconstituissem material normal das células fo-liares de trigo, porquanto eles constataramsua presença em tecido sadio. Contudo, nopresente caso, foram eles notados apenas emtecidos infetados.° fungo Polymyxa graminis, identifi-cado como vector do VMT (Rao & Brakke,1969), acha-se presente nos solos aondeocorria o mosaico do trigo no Estado do RioGrande do Sul (Caetano etal., 1971 ;Pierobonet ai., 1972). Não há, contudo, até agora,

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dados experimentais defínitivos sobre o en-volvimento de P. graminis como vector, em-bora as evidências circunstanciais, como atransmissão pelos lavados de raíz, e pelosolo, sejam bastante sugestivos.

Não sendo o VMT transmissível pelasemente (Brakke, 1971) torna-se difícilexplicar sua presença no sul do Brasil, umavez que o trigo não é planta nativa da região,bem como, provavelmente, o VMT_ A intro-dução de planta viva, contaminada, ou desolos contaminados, mesmos dessecados, nosquais McKinney (1937, citado em Brakke,1971) menciona que o patógeno possa sobre-viver, representariam duas das possibilidadespara explanação do evento.

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