viroseq v2_8_italian_ifu[1]

CELERA

ViroSeqHIV-1 Genotyping System v2.0Destinato alluso con ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici) e ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8

Istruzioni per luso

0197 4J94-26

CDx

5001503 Rev. A

Celera 1401 Harbor Bay Parkway August 21, 2008 12:55 pm, 5001503_cover_it.fm Alameda, CA 94502 *+H3764J94260W* USA

DRAFT

ABBOTT Max-Planck-Ring 2 65205 Wiesbaden Germany + 49-6122-580

DRAFTAugust 21, 2008 12:55 pm, 5001503_cover_it.fm

IndiceIntroduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Indicazioni per luso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Sintesi e spiegazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Principi della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Ordinazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Legenda dei simboli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Preparazione e trattamento del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2Reagenti del Pack 1 (confezione 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Avvertenze e Precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Requisiti per la conservazione ed il trattamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Prelievo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Allestimento dellarea di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Impedire la degradazione dellRNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Flusso di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Dimensione dellanalisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Controlli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Protocollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Controllo Qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Limitazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Analisi di sequenziamento su ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100/3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15Introduzione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Protocollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0

i

Analisi di ViroSeq HIV -1 Genotyping System Software v2.8. . . . . . . .24Introduzione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Requisiti del computer per eseguire il ViroSeq Software v2.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Installazione, disinstallazione e utilizzo del software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Esempi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Modifica dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Tabelle delle mutazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Messaggi di errore del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Software ViroSeq e risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Caratteristiche di rendimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48Rendimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Manutenzione e calibrazione di ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici ABI PRISM 3100/3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 Manutenzione dei 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici 3100/3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Schiera di capillari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 Siringhe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Blocchi polimerici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Campionatore automatico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Unit piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Manutenzione del computer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Calibrazione spaziale e spettrale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66Riferimenti citati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

ii

ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0

Sezione 1: IntroduzioneIn questa sezione:Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Indicazioni per luso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sintesi e spiegazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Principi della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ordinazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Legenda dei simboli. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 1 1 1

ViroSeq HIV-1 Genotyping System individua le mutazioni nelle regioni RT e proteasi del gene pol e fornisce un rapporto che indica levidenza genetica di resistenza virale. Si tratta di un sistema completo che fornisce reagenti per lisolamento dellRNA virale dal plasma, RT-PCR e sequenziamento.19,20 Lintero gene proteasi e due terzi del gene RT vengono amplificati per generare un amplicone di 1,8 kb. Lamplicone viene utilizzato come stampo di sequenziamento per sette primer che producono una sequenza di consenso di circa 1,3 kb. Il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software assembla, elabora e identifica le mutazioni presenti in questa sequenza di 1,3 kb. Il software confronta la sequenza di consenso con un riferimento noto, HXB-2, per determinare le mutazioni presenti nel campione. Infine il software ViroSeq utilizza un algoritmo proprietario per analizzare le mutazioni e generare un rapporto di resistenza farmacologica.

Uso previstoViroSeq HIV-1 Genotyping System stato progettato per la rilevazione delle mutazioni genomiche HIV che fanno sorgere resistenza a determinati tipi di farmaci antiretrovirali e come ausilio nel monitoraggio e trattamento dellinfezione da HIV. Nello specifico, il ViroSeq HIV-1 Genotyping System pu essere utilizzato per: rilevare la resistenza virale dellHIV-1 sottotipo B nei campioni di plasma raccolti in EDTA con una carica virale compresa tra 2.000 e 750.000 copie/mL genotipizzare lintero gene della proteasi HIV-1 dai codoni 1-99 e i due terzi del gene della trascrittasi inversa (RT) dai codoni 1-335 lutente (operatore o tecnico) deve essere adeguatamente addestrato linterpretazione e lapplicazione dei risultati devono essere effettuate da un medico qualificato.

Principi della proceduraPer ottenere risultati accurati fondamentale che loperatore sia addestrato nellesecuzione dellanalisi ViroSeq HIV-1 Genotyping. Il ViroSeq HIV-1 Genotyping System si basa su sei procedure principali: Preparazione del campione Trascrittasi inversa (RT) Reazione a catena della polimerasi (PCR) Sequenziamento ciclico Rilevamento automatico della sequenza Analisi del software

Al fine di utilizzare ViroSeq HIV-1 Genotyping System:

Ordinazioni4J94-26 ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 Destinato alluso con ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (analizzatori genetici) e ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 Istruzioni per luso

Il kit non deve essere utilizzato come analisi di screening per lHIV o come test diagnostico per confermare la presenza di HIV.

Indicazioni per lusoComprende le seguenti popolazioni: soggetti infetti da HIV-1 in fallimento terapeutico (con aumento della carica virale) prima del cambio di terapia soggetti infetti da HIV-1 allo stadio iniziale, non ancora sottoposti a terapia farmacologica

Legenda dei simboliCDx= Numero di catalogo Celera = Rischio biologico

Sintesi e spiegazioneIl virus dellimmunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) lagente eziologico responsabile della pandemia della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS).1,2 Il trattamento delle infezioni da HIV-1 con potenti farmaci antiretrovirali pu inibire la replicazione del virus HIV-1.3,4 Tuttavia, leradicazione del virus HIV-1 appare problematica perch le infezioni latenti innescano un meccanismo di persistenza e riattivazione del virus che pu durare tutta la vita.5,6 Spesso il fallimento della terapia dovuto alla scarsa aderenza agli schemi terapeutici e/o alla comparsa di ceppi virali resistenti ai farmaci.7 Questi ceppi mutanti di HIV-1 possono essere resistenti a uno o pi farmaci di ciascuna delle sei classi di farmaci antiretrovirali: inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa, inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa, inibitori della proteasi, inibitori della fusione, inibitori d'ingresso e inibitori dello strand transfer dell'integrasi dell'HIV.8,9,10 Inoltre, la resistenza a un dato farmaco pu produrre una resistenza crociata nei confronti di altri farmaci della stessa classe.7,11 Tuttavia, il fallimento terapeutico non sempre produce resistenza a tutti i farmaci di uno stesso schema.12 Determinare la migliore terapia di salvataggio per i pazienti con fallimento a pi schemi terapeutici costituisce quindi una sfida ardua. Un fattore chiave nellindividuazione di nuove strategie di trattamento la conoscenza del genotipo di resistenza virale indicato dalle mutazioni presenti nello sciame virale nel plasma del paziente.13 Studi retrospettivi e prospettici di intervento terapeutico hanno fornito evidenze che supportano lutilit clinica dei test di resistenza.14-16 Tali studi indicano che la presenza di resistenza al farmaco un fattore di rischio indipendente per il fallimento terapeutico. Attualmente il test di resistenza raccomandato per pazienti con infezione da HIV al momento di entrare in cura, indipendentemente dal fatto che la terapia venga iniziata immediatamente o meno. consigliabile ripetere il test all'inizio della terapia antiretrovirale. Il test di resistenza farmacologica dell'HIV deve essere eseguito in caso di modifica dei regimi antiretrovirali in seguito a fallimento virologico. Il test di resistenza raccomandato anche alle donne in gravidanza prima dell'inizio della terapia antiretrovirale e alle donne che intraprendono una gravidanza nel corso della terapia.17,18

ABI= 48 48

=

Numero di catalogo Applied Biosystems

=

Limiti di temperatura

=

Contiene 48 analisi

=

Consultare le istruzioni per luso

=

Pericolo di scossa elettrica/incendio

=

Rappresentante autorizzato nella Comunit Europea

=

Nocivo

=

Dispositivo medico per la diagnostica In Vitro

=

Tossico

=

Produttore

=

Pericolo laser

=

Rischio di infezione

=

Fotosensibile

ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

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Sezione 2: Preparazione e trattamento del campioneIn questa sezione:Reagenti del Pack 1 (confezione 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Avvertenze e Precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Requisiti per la conservazione ed il trattamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Prelievo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Allestimento dellarea di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Impedire la degradazione dellRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Flusso di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Dimensione dellanalisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Controlli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Protocollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Controllo Qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Limitazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module HIV RT Mix (mix RT HIV), provetta OrbixWeb Daemon). IMPORTANTE! necessario avviare OrbixWeb Daemon per poter eseguire il software di raccolta dati. 6.

2.

7.


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Uso del software di raccolta datiPer 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1) e 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0) Selezionare View > Preferences (visualizza > preferenze). Nella finestra Setting Preferences (imposta preferenze), fare clic sulla scheda Data Analysis and Extraction (analisi ed estrazione dati) ed effettuare le seguenti selezioni: Selezionare Enable AutoAnalysis (attiva autoanalisi) cancellare Extract to Sequence Collector (estrai a raccoglitore sequenze) selezionare By run (per analisi) per i file dei campioni di gruppo specificare il formato per Sample File Name Format (formato del nome file campioni): Sample Name (nome campione) Well Position (posizione del pozzetto) (nessuno) Fare clic su OK. Selezionare la scheda Plate View (visualizzazione piastra), quindi fare clic su New (nuovo) o selezionare Tools > Plate Editor (strumenti > editore piastra) Nella finestra di dialogo Plate Editor (editor piastra) che si apre: inserire il nome della piastra Specificare lapplicazione (Sequencing) (sequenziamento) specificare il tipo di piastra (96-Well) (a 96 pozzetti) IMPORTANTE! Utilizzare solo caratteri alfanumerici o i simboli indicati sotto. Non inserire spazi. -_(){}#.+ Fare clic su Finish (fine). Si apre il foglio di calcolo Plate Editor (editor piastra).

Uso delleditor della piastra1. Nella colonna Sample Name (nome del campione), inserire i nomi dei campioni. IMPORTANTE! Accertarsi di utilizzare la convenzione di denominazione dei campioni indicata sotto. Perch il ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.8 Software possa assemblare correttamente i progetti dei campioni, il nome del campione deve rispettare la seguente convenzione di denominazione. Il nome del campione pu contenere un massimo di 32 caratteri. I nomi dei campioni possono contenere solo caratteri alfanumerici e i seguenti simboli: -_(){}#.+. NON INSERIRE SPAZI. Il nome del campione deve essere identico per le sequenze di tutti i sette primer di un campione. Il nome del campione e lidentificativo del primer devono essere separati da due caratteri di sottolineatura (due underscore). Lidentificazione del primer contiene il nome del primer e altre informazioni distintive della sequenza specifica. Ad esempio: Paziente196__A Paziente196__B Paziente196__C 2. Selezionare le seguenti impostazioni per ogni campione nel foglio di calcolo.3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati, v.1.0.1) Dye Set (Set di coloranti) Mobility File (File di mobilit) Comments (Commenti) BioLIMS Project (Progetto BioLIMS) Project Name (Nome del progetto) Run Module 1 (Modulo di analisi 1) Analysis Mode 1 (Modalit di analisi 1) Analysis Module 1 (Modulo di analisi 1) E E 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati, v.1.1) 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0) E

Per 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1)

1.

Selezionare View > Preferences (visualizza > preferenze). Nella finestra Setting Preferences (imposta preferenze), fare clic sulla scheda Data Analysis (analisi dati) ed effettuare le seguenti selezioni: selezionare AutoAnalysis On (autoanalisi attivata) cancellare Enable BioLIMS (attiva BioLIMS) specificare il formato per Sample File Name Prefix Format (formato del prefisso del nome file campioni): Sample Name (nome campione) Well Position (posizione del pozzetto) (nessuno)

2.

3. 4.

Fare clic su OK. Selezionare la scheda Plate View (visualizzazione piastra), quindi fare clic su New (nuovo) o selezionare Tools > Plate Editor (strumenti > editore piastra). Nella finestra di dialogo Plate Editor (editor piastra) che si apre: inserire il nome della piastra specificare lapplicazione (Sequencing) (sequenziamento) specificare il tipo di piastra (96-Well) (a 96 pozzetti) IMPORTANTE! Utilizzare solo caratteri alfanumerici o i simboli indicati sotto. Non inserire spazi. -_(){}#.+

DT3100POP6{BD}v DT3100POP6{BD}v DT3100POP6{BD}v 2.mob 2.mob 2.mob

inserire eventuali commenti



3100-Project1

5.

3100-Project1

3100Avant-Project1

StdSeq50_POP6Def aultModule



BC-3100SR_SeqOff FtOff.saz

6.

Fare clic su Finish (fine). Si apre il foglio di calcolo Plate Editor (editor piastra).

BC-3100POP6SR_ SeqOffFtOff.saz

BC-3100APOP6SR_ Seq OffFtOff.saz

Nota. Per facilitare linserimento del testo, selezionare limpostazione appropriata per il primo campione, quindi fare clic sullintestazione della colonna per selezionare lintera colonna. Quindi, dal menu Edit (modifica), utilizzare il comando Fill Down (ricopia in basso) o premere Ctrl + D. 3. Verificare che il record della piastra sia corretto, quindi fare clic su OK per tornare al menu principale.

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Preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100 Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100)Nota. Per le istruzioni sulla preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant), consultare la sezione seguente. 1. Se i campioni sono congelati, portarli a temperatura ambiente. IMPORTANTE! Questa operazione deve essere eseguita immediatamente prima del caricamento dei campioni. 2. Risospendere i campioni aggiungendo 20 L di formammide Hi-Di a ogni pozzetto; utilizzare una nuova aliquota di formammide Hi-Di per ogni esperimento.

3. 4.

Agitare al vortex per 10-15 secondi. Centrifugare la piastra per 30-40 secondi a 2.000 g per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. Nota. Non necessario denaturare a caldo i campioni. IMPORTANTE! I campioni lasciati sul 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant) per pi di 14 analisi (1 analisi = circa 2,5 ore) possono andare incontro a degradazione del segnale. Se la piastra contiene non pi di 7 colonne di campioni (compresi i controlli), preparare e installare lunit piastra come descritto nel paragrafo Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra. OPPURE Se la piastra contiene pi di 7 colonne di campioni, continuare con la fase 6 descritta sotto.

5.

6. Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). Nota. I campioni risospesi in formammide Hi-Di sono stabili a temperatura ambiente per un massimo di 35 ore. Non lasciare questi campioni a temperatura ambiente per un periodo di tempo maggiore. 3. 4. Agitare al vortex per 10-15 secondi. Centrifugare la piastra per 30-40 secondi a 2.000 g per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. Nota. Non necessario denaturare a caldo i campioni. Preparare e installare lunit piastra.

Trasferire le restanti colonne di campioni dalla piastra 1 a una nuova MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (piastra di reazione ottica da 96 pozzetti MicroAmp) (piastra 2). Nota. Eventuali piastre supplementari possono essere acquistate da Applied Biosystems. Vedere il paragrafo Materiali richiesti a pagina 5. Trasferire 10 L di controllo positivo (50% del volume della preparazione di sequenziamento) dalla piastra 1 alla piastra 2. Ripetere questa fase per ognuno dei 7 pozzetti che contengono il controllo positivo. Preparare e installare la piastra 1 sullunit piastra come descritto nel paragrafo Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra. Sigillare la piastra 2 con nastro adesivo in alluminio e conservare al buio a temperature comprese tra 15 C e 25 C. Analizzare i campioni entro una settimana. Nota. Caricare la piastra 2 dopo il completamento della piastra 1. Eseguire le fasi 10-13 descritte sotto. IMPORTANTE! Questa operazione deve essere eseguita immediatamente prima del caricamento dei campioni.

7.

8. 9.

10. Portare la piastra 2 a temperatura ambiente.

5.

11. Agitare al vortex per 10-15 secondi. 12. Centrifugare la piastra per 30-40 secondi a 2.000 g per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. Nota. Non necessario denaturare a caldo i campioni. 13. Preparare e installare la piastra 2 sullunit piastra come descritto nel paragrafo Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra.

Preparazione di reazioni di sequenziamento purificate per lanalisi con il 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100-Avant)1. Se i campioni sono congelati, portarli a temperatura ambiente. IMPORTANTE! Questa operazione deve essere eseguita immediatamente prima del caricamento dei campioni. 2. Risospendere i campioni aggiungendo 20 L di formammide Hi-Di a ogni pozzetto; utilizzare una nuova aliquota di formammide Hi-Di per ogni esperimento.

Contiene formammide. R 61 Pu danneggiare i bambini non ancora nati. R 36/38 Irritante per gli occhi e la pelle. S 53 Evitare lesposizione procurarsi speciali istruzioni prima delluso. S 24/25 Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. S 35 Non disfarsi del prodotto e del recipiente se non con le dovute precauzioni. S 36/37/39 Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S 45 In caso di incidente o malessere, consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli letichetta). Nota. I campioni risospesi in formammide Hi-Di sono stabili a temperatura ambiente per un massimo di 35 ore. Non lasciare questi campioni a temperatura ambiente per un periodo di tempo maggiore.


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Caricamento dei campioni e collegamento di una piastra al record della piastra1. Fissare un setto a 96 pozzetti alla piastra e far scattare questultima nel fermapiastra e nella base dellanalizzatore. Posizionare la piastra con le reazioni di sequenziamento sullo strumento. Posizionare il pozzetto A1 nellangolo in alto a destra. Fare clic sulla scheda Plate View (visualizzazione piastra). Verificare che lindicatore di posizione della piastra sia giallo. Nella tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) selezionare il Plate Record (record delle piastre) della piastra che si desidera caricare. Selezionare lindicatore di posizione della piastra relativo alla piastra che si desidera collegare al record appena selezionato. Lindicatore di posizione della piastra diventa verde. Il record della piastra si sposta dalla tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) alla tabella Linked Plate Records (record delle piastre collegate). Nota. Questa operazione richiede un tempo variabile, a seconda del numero di campioni. Fare clic sulla scheda Run View (visualizzazione analisi) per visualizzare le analisi programmate. Selezionare ciascuna analisi per verificare che siano evidenziati i pozzetti corretti. IMPORTANTE! Se il pozzetto non evidenziato, non verr analizzato. 7. Per aggiungere informazioni a un record della piastra collegato: a. Scollegare il record della piastra per riportarlo nella tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa). b. Fare doppio clic sul nome del record della piastra per aprirlo. c. Aggiornare il record della piastra e far clic su OK. d. Ricollegare il record alla relativa piastra. Verificare che la piastra sia stata collegata.

Avvio dellanalisi1. IMPORTANTE! Evitare di interrompere le analisi. Fare clic sul pulsante verde Run Instrument (avvia lo strumento) per iniziare lanalisi. IMPORTANTE! Non eseguire simultaneamente lanalisi dei dati e lavvio di altri software durante lanalisi di sequenziamento. I dati di sequenziamento devono essere trasferiti a un altro computer per lanalisi se la workstation del computer utilizzata per la raccolta dei dati. 2. Il software controlla automaticamente lo spazio disponibile nel database e sul disco D.Se il database o il disco D sono... Pieni Allora...

2.

3.

4.

5.

Se il disco D pieno, archiviare i file dei campioni su un CD-RW o cancellare il campione originale dal disco. Quindi fare clic su Run Instrument (avvia lo strumento). Se il database pieno, utilizzare lutilit CleanUp DB (pulitura DB) per pulire il database. Quindi fare clic su Run Instrument (avvia lo strumento). Lanalisi inizia.

Non pieno

6.

3.

Una volta completate le fasi di preparazione, verificare quanto segue: Starting Electrophoresis (avvio elettroforesi) visualizzato nellangolo in basso a sinistra dello schermo EP (EF) On (in corso) Oven Temp (temperatura forno) 50,0 C Nota. Se manca corrente elettrica, si formata una bolla nel blocco del polimero ed necessario: a. cancellare lanalisi. b. eliminare la bolla dal blocco del polimero. c. riavviare lanalisi. Per monitorare landamento dellanalisi, selezionare View > Instrument Status Monitor (visualizza > monitor stato strumento).

4.

8.

Scollegamento da un record della piastra1. Nella tabella Linked Plate Records (record delle piastre collegate) alla pagina Plate View (visualizzazione pagina), selezionare il record della piastra che si desidera scollegare. Fare clic su Unlink (scollega). Se il record della piastra ...Completo

Non usare i dati in fase di raccolta se viene a mancare la corrente elettrica durante unanalisi.

Visualizzazione dei dati grezziIMPORTANTE! Uscire sempre dalle finestre Array View (visualizzazione schiera) e Capillary View (visualizzazione capillari). Durante unanalisi, non lasciare aperte queste pagine troppo a lungo. Questo potrebbe causare problemi di aggiornamento dello schermo non recuperabili. Lasciare aperta la finestra Status View (visualizzazione stato).

2.

Allora il record della piastra...Passa alla tabella Processed Plate Records (record delle piastre analizzate) e lindicatore di posizione della piastra ritorna giallo. Torna alla tabella Pending Plate Records (record delle piastre in attesa) e lindicatore di posizione della piastra ritorna giallo.

Visualizzazione di dati non elaborati da unanalisi completata1. Nel software Data Collection (raccolta dati), selezionare la scheda Array View (visualizzazione schiera). Selezionare Instrument > Data Acquisition > Display Run Data (strumento > acquisizione dati > visualizza dati analisi). Nellelenco a discesa, selezionare lanalisi che si desidera visualizzare e fare clic su OK. Nota. possibile visualizzare qualsiasi analisi completata presente nel database dello strumento. Recuperare i dati pu richiedere alcuni istanti, soprattutto se il database quasi pieno. Utilizzare le funzioni di scorrimento nella pagina Array View (visualizzazione schiera) per visualizzare i dati.

Non completo

2.

3.

4.

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5.

In alternativa, per visualizzare i dati di un elettroferogramma relativo a diversi capillari contemporaneamente, selezionare la scheda Capillary View (visualizzazione capillari) per visualizzare la pagina Capillary View (visualizzazione capillari).

Creazione delle Basecaller Settings (impostazioni Basecaller)Le Basecaller Settings (impostazioni Basecaller) sono funzioni del programma Basecaller che consentono di definire il numero di basi da analizzare a partire dai file di dati. Durante lidentificazione delle basi il Basecaller considera sia le Basecaller Settings (impostazioni Basecaller) sia qualsiasi valore Stop Point (punto di arresto) nella finestra Sample Manager (gestione dei campioni) e si arresta in corrispondenza di uno dei criteri di endpoint o del valore Stop Point (punto di arresto), a seconda di quale si presenti per primo. 1. Nel programma per lanalisi di sequenziamento, selezionare Edit > Preferences > Basecaller Settings (modifica > preferenze > impostazioni Basecaller). Nella finestra Preferences (preferenze), fare clic su Create a set (crea un set). Selezionare la casella di controllo Set the endpoint (imposta endpoint) e inserire 580 nella casella di testo. Salvare il set come impostazione predefinita denominata HIV580.

Visualizzazione dei dati analizzatiAl termine dellanalisi, i file dei campioni analizzati vengono estratti in una cartella delle analisi, insieme a un registro dellanalisi, in un percorso specificato nelle preferenze o seguendo il percorso predefinito: D:\AppliedBio\3100\DataExtractor o D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor Se sono stati ri-estratti, i dati si trovano nel percorso specificato nelle preferenze o nel seguente percorso predefinito: D:\AppliedBio\3100\DataExtractor\Extracted Runs o D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor\Extracted Runs

2.

3.

Uso dellABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 e analisi dei datiABI PRISM Sequencing Analysis SoftwareLABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 viene installato sul disco rigido della workstation. Questo software viene utilizzato per: controllare le sequenze codificate mediante identificazione delle basi rianalizzare i dati

4.

Impostazione del parametro Basecaller1. Selezionare Edit > Preferences > Sample Manager Defaults (modifica > preferenze > impostazioni predefinite gestione campioni). Selezionare il Basecaller desiderato dallelenco a discesa Basecaller: Per il 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1), selezionare: 3100SR Per il 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1), selezionare: 3100POP6SR Per il 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0), selezionare: 3100APOP6SR Nota. A questo punto il 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (analizzatore genetico 3100 o 3100-Avant) pronto per iniziare lanalisi di sequenziamento.

2.

Modulo di analisi strumentale per analizzatori genetici da utilizzare con il ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0Per il 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1), usare: BC-3100SR_SeqOffFtOff.saz o Per il 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1), usare: BC-3100POP6SR_SeqOffFtOff.saz o Per il 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0), usare: BC-3100APOP6SR_SeqOffFtOff.saz

Uso della finestra Sample Manager (gestione dei campioni)La finestra Sample Manager (gestione dei campioni) consente di elencare i file dei campioni da elaborare con il software per lanalisi di sequenziamento e di selezionare i valori dei vari parametri di analisi. 1. Per aprire la finestra, selezionare Window > Show Sample Manager (finestra > mostra gestione dei campioni). Per chiudere la finestra, selezionare Window > Hide Sample Manager (finestra > nascondi gestione dei campioni).

Parametri di elaborazioneUn parametro di elaborazione una parola, frase o casella di controllo che comunica al software per lanalisi di sequenziamento le operazioni da svolgere in determinate fasi dellelaborazione dei file.

2.


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Uso del software per lanalisi di sequenziamento1. Quando lanalisi completa, avviare il software per lanalisi di sequenziamento. Aggiungere tutti i file della/e cartella/e Run (analisi) a Sample Manager (gestione dei campioni). Selezionare le seguenti impostazioni per ogni campione:

3.

Aggiungere i file da inserire in Sample Manager (gestione dei campioni) allelenco Sample Files (file dei campioni) nella parte inferiore della finestra di dialogo.Per aggiungere... Allora... Selezionare il file e fare clic su Add (aggiungi) o fare doppio clic sul nome del file. Fare clic su Add All (aggiungi tutti). Aggiungerli singolarmente o fare clic su Add All (aggiungi tutti) e usare il pulsante Remove (elimina) per eliminare i file che non devono essere aggiunti allelenco

2.

Un solo file allelenco

3.

Tutti i file allelenco Per 3100 Data Collection Software v.1.0.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.0.1): Basecaller-3100SR Per 3100 Data Collection Software v.1.1 (software di raccolta dati 3100 v.1.1): Basecaller-3100POP6SR Per il 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software di raccolta dati 3100-Avant v.1.0): Basecaller-3100APOP6SR Definito dallo strumento Solo alcuni dei file allelenco

Basecaller

4.

Spacing (spaziature) Basecaller Setting (impostazione Basecaller) Peak 1 Location (posizione del picco 1) Start Point (punto di avvio) Stop Point (punto di arresto) DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) Factura settings (impostazioni Factura)

Quando tutti i file desiderati sono stati inseriti nellelenco in basso, fare clic su Finish (fine) per chiudere la finestra di dialogo e aggiungere i file a Sample Manager (gestione dei campioni).

HIV580

Impostato dal software

possibile eliminare un file dei campioni dalla finestra Sample Manager (gestione dei campioni) in qualsiasi momento, tranne durante lelaborazione di quel file da parte del programma. anche possibile modificare lordine in cui i file dei campioni vengono visualizzati nella finestra Sample Manager (gestione dei campioni).

Eliminazione di un fileImpostato dal software

1.Impostato dal software

Fare clic sul nome del file nella colonna Sample File Name (nome del file dei campioni). Viene evidenziata lintera riga. Premere il tasto Delete (Canc) o fare clic su Remove (elimina) nella parte superiore della finestra oppure selezionare Manager > Remove Files (gestione > elimina file). Il software per lanalisi di sequenziamento elimina quel file dallelenco.

DT3100POP6{BD}v2

2.

Questa funzione non viene utilizzata con lanalisi ViroSeq

4. 5. 6. 7.

Selezionare la casella di controllo A (analizza) per ogni campione. Cancellare le colonne P (stampa) e F (Factura). Fare clic su Start (avvio). Dopo lanalisi, controllare la colonna A per verificare se ogni campione contrassegnato da una casella verde. IMPORTANTE! Se uno dei campioni contrassegnato da una casella rossa, verificare le impostazioni e rianalizzare i dati.

Eliminazione di pi file1. Eliminare tutti i file. a. Selezionare Edit > Select All (modifica > seleziona tutto). b. Fare clic su Remove (elimina) o premere il tasto Delete (Canc). Eliminare pi file adiacenti. a. Fare clic sul Sample File Name (nome del file dei campioni) del primo file del gruppo. b. Tenendo premuto il tasto Shift (Maiusc) fare clic sul Sample File Name (nome del file dei campioni) dellultimo file del gruppo. c. Fare clic su Remove (elimina) o premere il tasto Delete (Canc). Eliminare pi file non adiacenti. a. Tenendo premuto il tasto Control, fare clic sul Sample File Name (nome del file dei campioni) di ogni file da eliminare. b. Fare clic su Remove (elimina) o premere il tasto Delete (Canc).

2.

Aggiunta di file di campioni1. Fare clic su Add files (aggiungi file) nella finestra Sample Manager (gestione dei campioni) o selezionare Manager > Add Files (gestione > aggiungi file). La parte superiore della finestra di dialogo che si apre simile a una comune finestra di dialogo delle directory, ma visualizza solo i nomi delle cartelle e dei file dei campioni. Nella casella di riepilogo in alto, individuare e aprire la cartella contenente i file da aggiungere a Sample Manager (gestione dei campioni).

3.

Riorganizzazione dei file1. Fare clic sul nome del file nella colonna Sample File Name (nome del file dei campioni). Viene evidenziata lintera riga. Tenendo premuto il tasto Alt, trascinare il Sample File Name (nome del file dei campioni) nella nuova posizione nella colonna.

2.

2.

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Stampa di dati relativi a unanalisi1. Per modificare temporaneamente lorientamento della pagina, il tipo di carta, pannelli/pagina ecc., selezionare File > Print Setup (file > imposta stampante) per aprire unapposita finestra di dialogo Print Setup (imposta stampante). Modificare le impostazioni, se necessario. Quindi fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo. Aprire il file da stampare. Selezionare File > Print (file > stampa) per aprire la finestra di dialogo Printing Options (opzioni di stampa). Se si desidera lasciare un margine sinistro pi ampio per consentire la perforatura a tre fori, selezionare Allow for 3-hole punch (consenti perforatura a 3 fori). Fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo Printing Options (opzioni di stampa) e aprire la finestra di dialogo standard Printer (stampante) relativa alla propria stampante. Effettuare le modifiche necessarie nella finestra di dialogo Printer (stampante) poi fare clic su Print (stampa) per avviare la stampa.

Operazioni preliminari allutilizzo del ViroSeq HIV-1 Genotyping System SoftwareChecklist per i dati dellanalisi di sequenziamento del DNAPrima di analizzare i dati dellanalisi di sequenziamento del DNA con il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software, controllare i file nel modo seguente:Articolo Controllo / Azione

2.

3. 4.

5.

6.

Controllare/correggere gli Esaminare un sottoinsieme di campioni per verificare che gli Start Points (punti di avvio) Start Points (punti di avvio) siano stati posizionati correttamente. Posizionare gli Start Points (punti di avvio) dopo il blob iniziale di terminatore colorante. o Determinare lo Start Point (punto davvio) medio per un sottoinsieme di campioni e inserire questo valore sia in Start Point (punto davvio) sia in Peak 1 Location (posizione del picco 1) del primo campione, quindi Fill Down (ricopia in basso) per tutti i campioni. Controllare/correggere gli Stop Points (punti darresto) Nomi dei campioni Verificare che gli Stop Points (punti darresto) per un sottoinsieme di campioni siano in corrispondenza delle basi 580. In caso contrario, selezionare limpostazione HIV580. Verificare che i nomi dei file dei campioni siano corretti. Utilizzare lo stesso nome per tutti i campioni di uno stesso progetto. I nomi dei file dei campioni: non possono contenere pi di 59 caratteri devono includere tutte le informazioni necessarie a identificare un campione devono contenere due segni di sottolineatura (underscore) consecutivi che separino il nome del campione dal primer di sequenza. Il software ViroSeq richiede i due underscore per poter assemblare e creare progetti. IMPORTANTE! Linformazione a sinistra dei due underscore deve essere identica per tutte le sei o sette sequenze di un campione. Linformazione a destra dei due underscore riferita alla singola sequenza e deve includere la lettera relativa al primer. File DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) appropriato per lanalisi. Controllare i numeri dellintensit del segnale per ogni base. Se il valore totale dellintensit del segnale di A, C, G e T inferiore a 400, verificare i dati non elaborati e quelli analizzati ed eliminare i dati rumorosi.

7.

File DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) Sufficiente intensit del segnale

IMPORTANTE! Perch sia possibile procedere con lanalisi del software ViroSeq, sei dei sette segmenti devono essere sequenziati con successo. Uno dei segmenti mancanti pu essere A o D.


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Sezione 4: Analisi di ViroSeq HIV -1 Genotyping System Software v2.8In questa sezione:Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Materiali richiesti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Requisiti del computer per eseguire il ViroSeq Software v2.8 . . . . . . . . . . . . . Installazione, disinstallazione e utilizzo del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Esempi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Modifica dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tabelle delle mutazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Messaggi di errore del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Software ViroSeq e risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 24 24 25 32 35 37 40 46 47

Termine File dei campioni Sequenza Ritaglio VM XML

Definizione Un file contenente i dati della sequenza campione, generati nellABI PRISM DNA Sequencing Analysis Software. Una stringa di basi di nucleotidi. Marcatura dei dati da non utilizzare nellestrazione della sequenza di consenso. Virtual Machine. Linterprete Java di Windows che consente al computer di comprendere il linguaggio Java. Extensible Markup Language. Formato di testo flessibile utilizzato nello scambio di dati su Web e altrove.

Segmento di sequenza I dati di sequenza risultanti da un primer.

Materiali richiestiDescrizione ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 4J94-22

Requisiti del computer per eseguire il ViroSeq Software v2.8Per eseguire il software ViroSeq offline su un computer singolo, necessario che vengano soddisfatti i seguenti requisiti minimi. Il software non pu essere installato su Windows NT. Java Runtime Environment (JRE) Microsoft Windows 2000 - JRE versione 1.4.2_10, o Microsoft Windows XP - JRE versione 1.4.2_10. Nota. JRE incluso nel CD di installazione del software ViroSeq e viene installato automaticamente con il software ViroSeq. Configurazione 1Requisiti del sistema operativo:

IntroduzioneIl software ViroSeq analizza i file relativi alle sei o sette sequenze dei primer corrispondenti a un singolo campione di plasma per generare un progetto. Un progetto un gruppo di file dei campioni contenente tutte le informazioni di sequenziamento necessarie per produrre un genotipo. Il formato del progetto supporta la revisione e modifica manuale dei dati dellelettroferogramma per generare una sequenza di consenso finale per i geni della HIV-1 proteasi e della trascrittasi inversa (RT). IMPORTANTE! Per informazioni su anomalie e limiti noti nel ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8, consultare le Release Notes (Note sulla versione) allegate al ViroSeq Software v2.8 CD (CD del software ViroSeq v.2.8).

Configurazione 2Requisiti del sistema operativo: Microsoft Windows XP, Service Pack 2

Configurazione 3Requisiti del sistema operativo: Microsoft Windows XP, Service Pack 2

Terminologia utilizzata in questa sezioneTermine ASCII Identificazione delle basi Cursore di modifica Elettroferogramma Definizione American Standard Code for Information Interchange. Un formato di testo semplice, riconoscibile da molte piattaforme e computer. Identit del nucleotide assegnata a un picco di segnale in un elettroferogramma. Elemento grafico che evidenzia un singolo nucleotide nella sequenza di consenso e che rappresenta il punto focale di unoperazione di modifica. I segnali di fluorescenza dei coloranti di sequenziamento analizzati e calcolati dal software di analisi e raccolta fornito con la strumentazione di sequenziamento. Un file di testo formattato ASCII contenente linformazione del nome del file e una sequenza. International Union of Biochemists (Unione internazionale dei biochimici) Linguaggio di programmazione ideato per generare applicazioni che possano essere eseguite su diversi sistemi operativi senza modifiche. Elemento grafico che visualizza le POI (posizioni dinteresse) e fornisce un mezzo per spostarsi sui dati corrispondenti. Position of interest (posizione dinteresse). Posizione di un nucleotide che garantisce il controllo da parte dellutente. Corrispondenza di una sequenza a un primer noto. Lentit software che comprende dati, cronologia delle modifiche, posizioni di taglio, sequenze assemblate ecc., associati allanalisi dei segmenti di sequenza di un singolo campione di HIV-1. Il file primario creato e utilizzato dal software ViroSeq. Contiene tutti i dati necessari per produrre unanalisi del genotipo. La sequenza fissa rispetto alla quale vengono eseguiti tutti i confronti. La sequenza di riferimento del ViroSeq basata su HXB-2 (GenBank K03455).

Microsoft Windows 2000, Service Pack 4

Piattaforma del computer Intel Pentium IV, (Single Core) 2,0 GHz o superiore 1 GB di RAM o superiore Disco rigido, 40 GB o superiore Tastiera, mouse Monitor con risoluzione schermo di 1280 x 1024

Piattaforma del computer Intel Pentium M (Single Core) 1,86 GHz o superiore 512 MB di RAM o superiore Disco rigido, 40 GB o superiore Tastiera, mouse Monitor con risoluzione schermo di 1280 x 1024

Piattaforma del computer Intel Core 2 Duo (Dual Core) 2,4 GHz o superiore 2 GB o superiore Disco rigido, 40 GB o superiore Tastiera, mouse Monitor con risoluzione schermo di 1440 x 900

Sequenza di consenso Una sequenza sviluppata a partire da varie altre sequenze allineate.

FASTA IUB Java Barra di navigazione POI Identificazione con primer Progetto

File del progetto Sequenza di riferimento

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Installazione, disinstallazione e utilizzo del softwarePrima di installare o disinstallare il ViroSeq software v2.8, necessario accedere al sistema Windows utilizzando un account con privilegi di amministratore. Evitare qualsiasi tentativo di installare o disinstallare il software ViroSeq utilizzando un account utente standard o utente limitato.

Avvio del softwareIl software pu essere avviato in tre modi: 1. Facendo doppio clic sullicona ViroSeq v2.8 sul desktop. AVVERTENZA: non aprire pi di unistanza dellapplicazione ViroSeq software v2.8 contemporaneamente. 2. Avviando il software ViroSeq dal menu Start. a. Fare clic sul menu Start. b. Selezionare Programs > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8 (programmi > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8). Avviando il software da C:\ViroSeq v2.8. a. Fare clic sulla directory C:\ViroSeq v2.8. b. Fare doppio clic sullicona ViroSeq.

Installazione del software su un computer Windows 2000 o XPSono necessari i privilegi di amministratore perch linstallazione avvenga in modo corretto. 1. 2. 3. Chiudere tutte le applicazioni sul desktop. Inserire il CD del ViroSeq software v2.8 nellunit CD.

3.

Accesso al softwareIl programma di installazione dovrebbe avviarsi automaticamente. In caso contrario, procedere come segue: a. Fare doppio clic su My Computer (risorse del computer) sul desktop. b. Con il tasto destro del mouse, selezionare lunit che contiene il CD. c. Selezionare Explore (esplora). d. In Windows Explorer (esplora risorse), aprire la cartella del software ViroSeq. Fare doppio clic su Setup.exe. Accettare le condizioni del License Agreement (contratto di licenza). Seguire le istruzioni della schermata del programma di installazione. Nota. Il software viene installato nella directory C:. possibile selezionare una directory diversa. Licona ViroSeq v2.8 viene installata automaticamente sul desktop. Per ragioni di sicurezza, il software richiede a ciascun utente di eseguire la procedura di accesso. Allavvio del software viene visualizzata la finestra di dialogo User Login (login utente). Inserire un nome utente e una password validi, quindi fare clic su OK. Il nome utente, la data e lora del sistema vengono registrati nella finestra History (cronologia). Consultare i Messaggi di errore del software. Quando si accede al software per la prima volta, il nome utente predefinito Admin e la password hiv1.

4. 5.

Modifica della password dellamministratore1. Digitare il nome della localit dellutente nella casella Installation Site (sito di installazione). Nota. Sono ammessi abbreviazioni e identificativi numerici. Nel campo Default Password (password predefinita), digitare hiv1. Digitare la propria password nella casella New Password (nuova password) e nella casella Re-Enter Password (reinserire la password). Nota. La password riconosce le maiuscole/minuscole e deve essere composta da un minimo di sei a un massimo di 14 caratteri. Fare clic su OK.

Disinstallazione del software da un computer Windows 2000 o XPIl software pu essere facilmente eliminato dal computer usando il programma Uninstall (disinstalla). Il programma di disinstallazione rimuover tutti i file di programma e licona sul desktop, ma non rimuover dal sistema eventuali file modificati dallutente. 1. Dal menu Start di Windows, selezionare Start > Programs > ViroSeq v2.8 > Uninstall (start > programmi > ViroSeq v2.8 > disinstalla). Viene visualizzata la finestra di dialogo InstallShield Wizard (guida allinstallazione). Fare clic su Remove (elimina). Fare clic su Next (successivo). Viene visualizzata una finestra di conferma. Fare clic su Yes (s) per rimuovere lapplicazione.

2. 3.

4.

2.

Aggiunta di nuovi utentiLesecuzione dellanalisi ViroSeq consentita solo a personale addestrato. Nella finestra Navigation (navigazione), selezionare Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Nota. Perch venga visualizzata la finestra Navigation (navigazione) necessario che un progetto ViroSeq sia aperto. Digitare il nome del nuovo utente da aggiungere nella casella User Name (nome utente) della scheda User Information (informazioni utente). Nella casella Employee ID (ID del dipendente), digitare il nome o numero identificativo del dipendente. Digitare una password nella casella New Password (nuova password) e nella casella Re-Enter Password (reinserire la password).

3. 4. 5. 6. 7.

1.

2. Il processo di disinstallazione viene completato automaticamente, quindi viene visualizzata la finestra di dialogo Maintenance Complete (manutenzione completata).

3.

4.


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5.

Fare clic su Add User (aggiungi utente). Il nuovo utente viene inserito nella scheda Registered Users (utenti registrati). possibile aggiungere tutti gli utenti desiderati e infine fare clic su OK.

Verificare che le mutazioni della resistenza farmacologica corrispondano alle informazioni contenute nella tabella seguente: QA10 RTM41L A62V T69ins V118I M184V T215Y

ProteasiL10I L24I M46I F53L I54V A71V V82A

6.

Resistenza Mutazioni

Eliminazione di un utente1. Nella finestra Navigation (navigazione), selezionare Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Si apre la finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore). Nella scheda Registered Users (utenti registrati), selezionare il nome che si desidera eliminare. Viene attivato il pulsante Remove (elimina). Fare clic su Remove (elimina) per cancellare lutente selezionato, quindi fare clic su OK.

Descrizione del progettoFasi principali di un progettoFile di dati per il sequenziamento del DNA Controllare che:

2.

3.

la qualit della sequenza sia corretta i limiti siano definiti i nomi dei campioni siano corretti il file DyeSet/Primer (primer/set di coloranti) sia appropriato Trovare e selezionare i file di sequenziamento Assemblare il progetto

Modifica delle password utenteLamministratore pu modificare le password utente nella finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) dopo aver selezionato Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Gli utenti non amministratori possono modificare le password utente nella finestra di dialogo User Access (accesso dellutente) dopo aver selezionato Edit > Change Passwords (modifica > cambia password). Quando viene visualizzata la finestra di dialogo User Access (accesso dellutente), compilare i campi Current Password (password corrente), New Password (nuova password) e Re-Enter Password (reinserire la password) e fare clic su OK. Ai nomi utente e alle password si applicano le regole seguenti: i nomi utente devono essere unici, ma non sono alle maiuscole nel nome utente e nella password sono ammessi gli spazi le password sono case sensitive i campi delle password non possono essere lasciati vuoti le password possono contenere un minimo di sei e un massimo di 14 caratteri quando vengono visualizzate sullo schermo, le password sono codificate come asterischi le password possono essere composte da lettere, numeri e caratteri speciali (stampabili) la password predefinita hiv1 non pu essere usata quando si aggiunge un nuovo utente.

Creazione di un nuovo progetto

Revisione dei dati del progetto

Verificare che:

il numero dei file di sequenziamento assemblati sia sufficiente i nomi dei campioni siano corretti i file di sequenziamento siano allineati nellordine e nellorientamento corretti Inserire le informazioni specifiche relative a paziente, laboratorio e campione Distinguere picchi e rumore Tagliare le estremit dei segmenti Verificare e riconciliare le identificazioni di basi miste e le basi discordanti Confrontare con la sequenza di riferimento Stamparlo o salvarlo in formato XML Salvare il file FASTA

Modifica dei dati

Preparazione del rapporto sulla resistenza

Creazione di un nuovo progetto1. Avviare il software ViroSeq e fare clic su New (nuovo) nella finestra Project Status (stato del progetto). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (apri). Se il software ViroSeq gi aperto, selezionare File > New Project (file > nuovo progetto). Spostarsi sulla cartella contenente i file del software per lanalisi di sequenziamento e aprirla. Selezionare un file di dati di sequenza e fare clic su Open (apri). Il software assembla ed allinea i file relativi alle sequenze dei primer di un campione per generare una sequenza di consenso e crea un progetto. Mentre il software assembla il progetto, si apre la finestra Progress (avanzamento). Nota. Il software crea progetti separati per ogni nome di campione univoco attribuito ai dati nel software per lanalisi di sequenziamento. Esiste un limite al numero di progetti che possono essere assemblati contemporaneamente. Un limite ragionevole 14 progetti. Al termine delloperazione, la finestra Progress (avanzamento) si chiude e si aprono le finestre Navigation (navigazione) e View*Edit (visualizza*modifica), che visualizzano uno dei progetti assemblati.

Verifica dellinstallazione del softwareVerificare che il ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 sia stato installato correttamente analizzando i file dei campioni dimostrativi QA10 (.ab1) nella directory C:\ViroSeq v2.8. 2. 1. Fare clic su New (nuovo) nella finestra Project Status (stato del progetto). Si apre la finestra di dialogo Open (apri). 3. 2. 3. Spostarsi alla cartella C:\ViroSeq v2.8 > Projects > Demo > QA10. Selezionare un file di dati di sequenza e fare clic su Open (apri). Il software raggruppa ed allinea i dati per generare una sequenza di consenso utilizzando i file .ab1 trovati nella cartella QA10. Si aprono le finestre Navigation (navigazione) e View*Edit (visualizza*modifica), che visualizzano il progetto completo assemblato per QA10. Selezionare File > Generate Resistance Report (file > genera rapporto sulla resistenza) per visualizzare lanteprima delle mutazioni della resistenza farmacologica elencate a pagina 1 dellAntiretroviral Drug Resistance report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali).

4.

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I progetti assemblati esistenti vengono visualizzati dal software ViroSeq nella finestra Project Status (stato del progetto). Per visualizzare la finestra Project Status (stato del progetto), spostarsi nella finestra Navigation (navigazione) e selezionare File > Open Project (file > apri progetto). La colonna Status (stato) indica se il software ha trovato o meno tutti i segmenti inseriti.Se lo stato ... OK Allora... Tutti i segmenti previsti sono stati trovati e il progetto stato assemblato correttamente. Il software ViroSeq ha riscontrato problemi di assemblaggio. Le possibili cause comprendono: impossibilit di identificare uno o pi segmenti assemblaggio di un numero di segmenti inferiore a 6 Nota. Evitare di procedere se nel progetto sono stati assemblati meno di sei segmenti. Uno dei segmenti mancanti pu essere A o D.

Finestra Navigation (navigazione)Dopo aver assemblato un progetto, il software ViroSeq presenta graficamente la sequenza di consenso nella finestra Navigation (navigazione). La finestra Navigation (navigazione) composta da due parti: barra di navigazione sezione di allineamento dei segmenti

?

Barra di navigazioneLa barra di navigazione si trova nella parte superiore della finestra Navigation (navigazione). Fornisce una panoramica del numero e dei percorsi delle posizioni di interesse (POI). Queste vengono rappresentate come linee verticali su una barra grigia.

Apertura di un progetto esistente1. Nella finestra Project Status (stato del progetto), selezionare il progetto desiderato. Se il progetto desiderato non visualizzato nella finestra Project Status (stato del progetto): a. Fare clic su Find (trova) per aprire la finestra di dialogo Open (apri). b. Spostarsi sulla cartella in cui archiviato il progetto. c. Selezionare il progetto desiderato. Fare clic su Open (apri). Si aprono le finestre Navigation (navigazione) e View*Edit (visualizza*modifica), relative al progetto.

I numeri sulla scala orizzontale rappresentano le posizioni dei codoni per ciascun gene. Le POI sono codificate con colori diversi, come indicato nella tabella seguente. Codifica colore per le posizioni di interesse (POI)Colore Significato

2.

IMPORTANTE! Non consentito aprire e modificare lo stesso file di progetto in pi di unistanza del software ViroSeq. Modificare contemporaneamente gli stessi segmenti di dati in istanze multiple del software ViroSeq pu avere conseguenze impreviste sul funzionamento software.

Grigio = colore dello sfondo Nessuna differenza rispetto al riferimento Rosso Nero Verde Blu Giallo Bianco POI selezionate Discordanze tra segmenti Differenze note o sconosciute tra sequenza di riferimento e sequenza di consenso Posizione multibase Mostra le aree coperte da un solo segmento durante lassemblaggio Identificazione delle basi confermata dallutente Nota. Prima necessario salvare il progetto.

Sezione di allineamento dei segmentiLa sezione di allineamento dei segmenti viene visualizzata nella parte inferiore della finestra Navigation (navigazione). Questa parte mostra graficamente in che modo i segmenti di sequenza si sovrappongono.

Letichetta su ogni segmento composta dal nome del progetto e dal primer utilizzato. I segmenti sono rivolti nella direzione di polimerizzazione. Verificare che le sequenze siano posizionate come previsto. Direzione in avanti - primer A, D, B, C Direzione indietro - primer F, G, H

In rari casi, il segmento D pu essere allineato al percorso sbagliato. Dopo aver assemblato il progetto, controllare la posizione del segmento D. Questo dovrebbe coprire completamente il gene della protesasi e linizio del gene della RT. Se il segmento D non posizionato come specificato, riassemblare il progetto senza segmento D.


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Finestra View*Edit (visualizza*modifica)La finestra View*Edit (visualizza*modifica) visualizza la sequenza di consenso generata dal software e contiene gli strumenti di navigazione e modifica.

Parti della finestra View*Edit (visualizza*modifica) e relativa descrizioneArticolo 1 Nome Pulsante spostamento a sinistra Pulsante spostamento indietro Pulsante Trim (taglia) Descrizione Si sposta sulla POI allestrema sinistra.

2

Si sposta sulla POI a sinistra della POI attiva.

3

Taglia e ricongiunge le estremit selezionate di un segmento nellelettroferogramma. Ripristina lattribuzione della base originale della POI corrente. Modifica la POI attiva. I pulsanti rappresentano i codici alfabetici delle basi e delle basi miste. Se la casella selezionata, il sistema si sposta automaticamente alla POI successiva dopo ogni modifica.

4

Pulsante Revert (ripristina)

5

Tavolozza di modifica

6

Casella di controllo Auto jump on edits (spostamento automatico dopo una modifica) Casella di controllo Reverse jump (spostamento indietro)

7

Utilizzato dopo la modifica della posizione corrente, determina uno spostamento sulla successiva POI a sinistra. Questa casella attiva solo quando selezionata la casella di controllo Auto jump on edits (spostamento automatico dopo una modifica).

8

Pulsante Navigation Options Apre la finestra di dialogo Navigation Options (opzioni (opzioni di navigazione) di navigazione). In questa finestra di dialogo possibile selezionare le POI attive. Le POI attive sono quelle su cui il sistema si posiziona mediante i pulsanti di spostamento. Pulsante di spostamento in avanti Pulsante di spostamento a destra Etichetta scheda Determina lo spostamento sulla POI a destra della POI attiva. Determina lo spostamento sulla POI allestrema destra.

9

10

11

Etichetta ogni riga della scheda di sequenza. Inoltre attribuisce il nome del primer e la direzione di polimerizzazione per ogni sequenza. Indica il numero di codoni della sequenza di riferimento. Indica il codice di una lettera per la traduzione in aminoacidi del codice per la sequenza di riferimento. Indica il codice di una lettera per la traduzione in aminoacidi del codice per la sequenza di consenso. Basi della sequenza di riferimento. Basi della sequenza di consenso. POI corrente. Elettroferogramma per un segmento di sequenza. Il software ViroSeq mostra tutti i segmenti di sequenza che si sovrappongono in una posizione. Barra di scorrimento orizzontale per la scheda delle sequenze.

12 13

Numero di codoni Reference Translation (traduzione di riferimento) Consensus Translation (traduzione di consenso) Sequenza di riferimento Sequenza di consenso Casella attorno alla base Picchi delle sequenze

14

15 16 17 18

19

Barra di scorrimento

20

Casella di informazione sulla Spiega perch una posizione stata identificata come posizione POI. Close View Edit (chiudi visualizza modifica) Chiude la finestra View Edit (visualizza modifica).

21

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Tavolozza di modifica

Menu File

Codici IUBCodici IUB A = adenosina C = citidina G = guanosina T = timidina U = uracile K = G o T (Keto) (cheto) M = A o C (aMino) (amino) R = A o G (puRine) (purina) S = G o C (Strong [forte]3 legami H) W = A o T (Weak [debole]2 legami H) Y = C o T (pYrimidine) (pirimidina) B = C, G, o T D = A, G, o T H = A, C, o T V = A, C, o G N = aNy (qualsiasi) base New Project (nuovo progetto) Ctrl+N Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (apri). Facendo clic sul pulsante New (nuovo) possibile selezionare da una cartella e aprire un file relativo allanalisi di sequenziamento; il software assembler in nuovi progetti tutte le sequenze contenute in quella cartella. Open Project (apri progetto) Aminoacidi Alanina Arginina Asparagina Aspartato o acido aspartico Cisteina Glutammina Glutammato o acido glutamico Glicina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina Codice a tre lettere Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Codice a una lettera A R N D C Q E G H I L K M F P Voce di menu S T W Y V Edit Report Information (modifica le informazioni del rapporto) Ctrl+E Apre la finestra di dialogo Edit Report Information (modifica le informazioni del rapporto), dove possibile inserire le informazioni relative a paziente, laboratorio e tecnico per lintestazione del rapporto finale. Toggle Position Cursor (attiva/disattiva cursore di posizione) Export Resistance Report (esporta rapporto sulla resistenza) Quit (esci) Ctrl+X Consente di esportare il rapporto sulla resistenza. Save consensus (salva consenso) [FASTA] Generate Resistance Report (genera rapporto sulla resistenza) Ctrl+F Archivia la sequenza di consenso in un file di testo ASCII con estensione .fasta. Consente di visualizzare e stampare il rapporto sulla resistenza. Save (salva) Ctrl+S Ctrl+O Viene visualizzata la finestra di dialogo Project Status (stato del progetto). Selezionare un progetto dallelenco oppure, facendo clic sul pulsante Find (trova), selezionare e aprire un progetto ViroSeq gi assemblato. Salva il progetto aperto con le eventuali modifiche apportate. Voce di menu

Opzioni del menu FileScelta rapida da tastiera Descrizione

Codici degli aminoacidi

Ctrl+G

Ctrl+Q

Esce dal software ViroSeq.

Menu Edit (modifica)

Opzioni del menu Edit (modifica)Scelta rapida da tastiera Ctrl+T Descrizione

Attiva e disattiva la linea di posizionamento del cursore.


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Opzioni del menu Edit (modifica)Voce di menu Scelta rapida da tastiera Descrizione

Revisione del progetto assemblato

Change Passwords (cambia password)

Quando lutente accede come amministratore, si apre la finestra di dialogo Administrator Access (accesso dellamministratore) dove possibile cambiare le password ed eseguire altre funzioni amministrative. Quando si accede come utenti, si apre la finestra di dialogo User Access (accesso utente) nella quale possibile cambiare la propria password.

Dopo che il software ViroSeq ha assemblato un progetto, necessario rivedere e verificare le identificazioni delle basi in corrispondenza delle POI nella sequenza di consenso. Lutente pu accettare o modificare le identificazioni delle basi nei punti in cui il software rileva differenze tra la sequenza di consenso e la sequenza di riferimento. Per stabilire se lidentificazione delle basi suggerita giustificata, necessario osservare gli elettroferogrammi. Per esempio, i blob di colorante allinizio di una sequenza di ripetizioni della stessa base, possono indurre il software a valutare erroneamente la sequenza e a suggerire una variazione che in realt non esiste.

Login As New User (accesso come nuovo utente)

Apre la finestra User Login (login utente).

POIUna POI una base nella sequenza di consenso per la quale sono valide una o pi delle definizioni seguenti: diversa dal ceppo di riferimento HIV-1 trovata nella tabella interna delle posizioni di resistenza note identificata come base mista in almeno un segmento in quella posizione inserzione relativa alla sequenza di riferimento diversa da un segmento allaltro Nota. Per una posizione di consenso data possono essere validi uno o pi criteri POI.Descrizione

Menu Window (finestra)

Opzioni del menu Window (finestra)Voce di menu Scelta rapida da tastiera

Codici colore delle basiBase Adenina Citosina Guanina Colore Verde Blu Nero Rosso Rosa

History (cronologia)

Apre il registro History (cronologia).

Menu Help (guida)

Opzioni del menu Help (guida)Voce di menu Scelta rapida da tastiera Descrizione

Timina Basi miste

About ViroSeq (informazioni su ViroSeq)

Visualizza informazioni sul prodotto.

Impostazione delle opzioni di navigazioneLa finestra Navigation Options (opzioni di navigazione) si apre con un clic sul pulsante Navigation Options (opzioni di navigazione) nella finestra View*Edit (visualizza*modifica).

Parti di un progetto assemblatoIl progetto assemblato composto da: Elettroferogrammi per segmenti di sequenza. Il software ViroSeq rappresenta le basi come picchi di un colore diverso per ciascuna delle quattro basi. Sequenza di consenso di segmenti di sequenza Con sette primer diversi, i segmenti di sequenza si sovrappongono e coprono ogni sezione del gene bersaglio almeno due volte e in entrambe le direzioni. (Fanno eccezione i codoni della RT allincirca alle posizioni 315-335.) Sequenza di riferimento Il software ViroSeq confronta la sequenza di consenso con una sequenza di riferimento, HXB-2. Traduzioni di consenso e di riferimento Il software ViroSeq mostra la sequenza di aminoacidi nel ceppo virale di riferimento e tutte le possibili traduzioni in aminoacidi della sequenza di consenso. Numero di codoni Il software ViroSeq numera i codoni in base alla sequenza di riferimento.

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Spiegazione delle opzioni di navigazioneOpzione Descrizione Global Settings (impostazioni globali) Additional variants from reference (varianti supplementari rispetto al riferimento) Multibase positions (posizioni multibase) Individua le mutazioni che non sono utilizzate nellalgoritmo del software ViroSeq.

I picchi di miscela devono essere distinti dai picchi di rumore. Tuttavia, quando in una sequenza sono presenti livelli elevati di rumore continuo, i dati reali possono risultare oscurati e pu essere impossibile distinguere dal rumore i picchi pi piccoli.

Sequenza degli eventi di modifica Tagliare le estremit dei segmenti per eliminare i segmenti di sequenza di scarsa qualit. Verificare e ricomporre le identificazioni di basi miste e le basi discordanti. Confrontare le aree con problemi di mobilit con i segmenti di altre sequenze e con la sequenza di riferimento per determinare la corretta posizione dei picchi.

Consente di spostarsi sulle posizioni della sequenza di consenso derivate da segmenti che presentano miscele o pi di un nucleotide in una data posizione. Individua differenze in una posizione di una sequenza di consenso derivate da segmenti di primer forward o reverse che non corrispondono a quella posizione. Individua le basi che sono state modificate manualmente e salvate nel progetto. Individua basi extra che non fanno parte della sequenza di riferimento. Nota. Per informazioni su come il software gestisce le inserzioni, vedere il paragrafo Mutazioni per inserzione.

Modifica di un progetto1. Fare clic su Navigation Options (opzioni di navigazione) per aprire la finestra Navigation Options. Verificare che tutte le caselle di controllo delle opzioni della finestra Navigation Options (opzioni di navigazione) siano selezionate. Selezionare e tagliare le aree con sequenza di scarsa qualit per migliorare lidentificazione delle basi. Sulla barra di Navigation (navigazione) i densi raggruppamenti di barre verticali rappresentano le aree in cui la sequenza di uno o pi primer pu risultare di scarsa qualit. Confermare o modificare le identificazioni delle basi. a. Partire dalla POI allestremit sinistra del gene della proteasi facendo clic sul pulsante per modificare o confermare lidentificazione delle basi. b. Premere la barra spaziatrice per confermare la selezione. c. Passare alla POI successiva premendo per modificare o confermare lidentificazione delle basi. Ripetere fino ad aver modificato o confermato tutte le POI nella sequenza di consenso. Nota. Se le sequenze sovrapposte non corrispondono alla maggior parte delle posizioni, verificare possibili errori di miscelazione o denominazione dei campioni. Nella finestra Navigation Options (opzioni di navigazione), deselezionare tutte le caselle di controllo eccetto Show Resistance positions (mostra posizioni di resistenza) e fare clic su OK. Ripetere la procedura di modifica/conferma partendo dallestremit sinistra e spostandosi verso destra. Nota. possibile utilizzare listruzione di modifica 1 nel riepilogo seguente per identificare le miscele che possono essere state tralasciate dal software.

Mismatches between segments (Discordanze tra segmenti)

Show saved edits (mostra le modifiche salvate) Insertions (inserzioni)

2.

3.

Features from Gene Profile (funzioni profilo del gene) Show Resistance positions (mostra posizioni di resistenza) Trasforma ogni mutazione utilizzata nellalgoritmo di resistenza farmacologica in una POI, indipendentemente dal fatto che la sequenza di consenso sia diversa o meno dalla sequenza di riferimento. Nota. A questo scopo necessario che la casella Only show if variant (mostra solo se variante) sia deselezionata. Selezionando questa casella, oltre alla casella Show Resistance positions (mostra posizioni di resistenza), vengono selezionati solo quei codoni di resistenza farmacologica della sequenza di consenso, per i quali sono state rilevate mutazioni che contribuiscono a determinare la resistenza farmacologica. Questa funzione pu essere utilizzata al momento di creare nuovi progetti. Non consigliabile attivarla per progetti salvati o modificati.

4.

Only show if variant (mostra solo se variante)

5.

Conferma o modifica delle POIPer ogni posizione di interesse (POI) selezionata nelle Navigation Options (opzioni di navigazione) necessario confermare o modificare manualmente la posizione. Il cursore nella finestra View*Edit (visualizza*modifica) una casella che circonda il codice a lettere di una base o di una POI nella sequenza di consenso. possibile confermare o modificare eventuali discordanze tra segmenti sovrapposti o mutazioni che siano state identificate dal software. 6.

Perch utilizzare le istruzioni di modifica

Distinzione tra picchi e rumoreUn picco un segnale elettroforetico con un massimo definibile e fronti chiaramente risolti su entrambi i lati. I picchi rappresentano lintensit del segnale del colorante fluorescente legato a ogni frammento di sequenza del DNA. I picchi vengono letti e analizzati dai programmi di raccolta dati e analisi di sequenziamento.

IMPORTANTE! La coerenza da operatore a operatore nella procedura di identificazione delle basi essenziale. Le istruzioni di modifica delle sequenze forniscono un metodo per raggiungere questa coerenza. Nella maggior parte dei casi, il software ViroSeq identifica con precisione le miscele. Nei casi in cui la decisione deve essere presa dallutente, queste istruzioni vanno utilizzate per individuare le miscele effettive. IMPORTANTE! La qualit dei dati di sequenza influenza laccuratezza dellindividuazione delle basi. Quanto pi basso risulta il rumore di fondo o il rumore, tanto minore il numero di modifiche che sar necessario apportare.

Riepilogo delle istruzioni di modifica per lidentificazione delle miscelePicchi completamente Picchi solo parzialmente risolti risolti

possibile identificare una miscela quando: 1. Due segmenti di sequenza di senso opposto contengono picchi secondari chiaramente al di sopra del rumore locale (circa il doppio del livello di rumore).

Nota. Le spalle dei picchi sono definite come picco solo se anchesse presentano un massimo definibile. Il rumore il segnale di fondo presente in un elettroferogramma. Pu essere causato dallo strumento o dalla qualit della schiera di capillari, del polimero, del campione, della soluzione tampone o della formammide Hi-Di.


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2. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario con un livello di rumore triplo di quello locale. Prendere nota delle mutazioni della resistenza nelle regioni a copertura singola solo listruzione di modifica n. 2 pu essere utilizzata per identificare una mutazione della resistenza. 3. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario e il segmento nella direzione opposta conferma la miscela.

Gerarchia per la modifica del progetto1. Per una prima analisi dei dati, selezionare tutte le funzioni di navigazione. Questo consente di arrestare il programma in tutte le posizioni in cui stata identificata una miscela. Questo si verifica perch almeno una delle sequenze presenta un 30% di miscela. 2. Valutare se il 30% di miscela effettivo (ovvero al di sopra del livello del rumore). 3. Se i criteri del 30% sono soddisfatti, verificare se la sequenza opposta presenta un picco di conferma (Istruzione 3). Se il picco di conferma presente, identificare la miscela. 4. Se il filamento opposto non presenta un picco di conferma, stabilire se il 30% del picco (nel filamento originale) 3 rumore di fondo. Se il criterio 3 rumore di fondo soddisfatto, identificare la miscela (Istruzione 2). Questa regola valida per una miscela in una sola direzione. 5. Dopo aver eseguito unanalisi dei dati, le opzioni di navigazione dovrebbero essere modificate in modo che il programma si arresti solo in corrispondenza delle posizioni di resistenza. Attenzione necessario deselezionare la funzione Only show if variant (mostra solo se variante). 6. Eseguire una seconda analisi di tutti i dati, ricercando le miscele che soddisfano lIstruzione 1 (2 rumore di fondo in entrambe le direzioni). A questo punto, controllare anche le modifiche e le identificazioni automatiche effettuate nelle altre posizioni di resistenza.

EsempiEsempio di dati di sequenza di buona qualitLesempio seguente mostra un rumore di fondo molto basso e picchi secondari.

Esempio di dati di sequenza di scarsa qualitLesempio seguente mostra un rumore di fondo molto elevato, con limpossibilit di identificare con certezza i picchi secondari. possibile che a causa del rumore di fondo le miscele vengano identificate in modo errato. Questo campione dovrebbe essere ripetuto.

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Esempi di applicazione dellIstruzione 1RiuscitaIstruzione 1: Due segmenti di sequenza di senso opposto contengono picchi secondari chiaramente al di sopra del rumore locale (circa il doppio del livello di rumore). Il software ViroSeq identifica automaticamente le miscele al 30% del picco primario (pi grande). In alcune situazioni, si osservano miscele che non vengono identificate dal software perch inferiori al 30%.

Esempi di applicazione dellIstruzione 2RiuscitaIstruzione 2: Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario con un livello di rumore triplo di quello locale. In rari casi una sequenza di miscela viene osservata in una sola direzione. Per identificare questa miscela, il picco di miscela del singolo segmento deve essere ben definito e chiaramente interpretabile. Il software ViroSeq identifica questo tipo di miscela come . . . Mismatch, . . . Mixture (. . . discordanza, . . . miscela).

Per modificare unidentificazione delle basi in questa situazione (seconda posizione del codone 20), seguire lIstruzione 1 per effettuare con precisione e coerenza lidentificazione corretta delle basi. Lidentificazione corretta della base in questo esempio W.

Lesempio sopra mostra una miscela in cui un segmento di sequenza contiene un picco secondario superiore al 30% mentre laltro segmento di sequenza non presenta alcuna miscela (non ha un massimo risolvibile). La miscela presente nella sequenza in alto pari almeno al 30% del picco primario e significativamente superiore al rumore di fondo.

FallitaSotto riportato lesempio di una miscela (prima posizione del codone 32) che non pu essere identificata. Si tratta di una miscela apparente, causata da un blob di colorante allinizio del primer B.

FallitaDi seguito riportato lesempio di un picco di miscela presente in entrambe le direzioni che non ha potuto essere identificato perch di dimensioni identiche a quelle dei picchi di rumore di fondo circostanti. Gli stessi picchi rappresentano condizioni di rumore.


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Esempi di applicazione dellIstruzione 3RiuscitaIstruzione 3: Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari almeno al 30% del picco primario e il segmento nella direzione opposta conferma la miscela. HIV-1 Genotyping System forniscono una I primer di sequenza del copertura doppia per lintera lunghezza del gene della proteasi e fino circa al codone 315 del gene della RT e una copertura singola a partire allincirca dal codone 315 fino al 335. La miscela osservabile in entrambe le direzioni, sia in avanti che indietro, il che rende pi affidabili le identificazioni delle miscele. ViroSeq In molti casi, la miscela maggiore del 30% del picco primario in una direzione e minore del 30% nellaltra. La sequenza inferiore (il segmento nella direzione opposta) viene usata per confermare la presenza della miscela.

Eccezioni alle istruzioniGli esempi seguenti mostrano posizioni anomale in corrispondenza di RT151 e RT215 che non seguono le istruzioni di modifica. Le eventuali miscele presenti in queste posizioni mostrano frequentemente un pattern uguale a quello illustrato sotto. Confrontare questi esempi con il campione. Se i pattern corrispondono, possibile identificare una miscela per queste posizioni.

FallitaSotto riportato lesempio di una miscela apparente (terza posizione del codone 254) causata dallelevato e continuo rumore di fondo. Lidentificazione corretta della base C.

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Modifica dei datiRitaglio con il software ViroSeqLe sequenze allinizio o alla fine di un segmento sono spesso di scarsa qualit. Il software ViroSeq taglia automaticamente queste sequenze e consente, inoltre, il ritaglio manuale. La parte tagliata di una sequenza rimane visibile come parte di un elettroferogramma, ma viene visualizzata sullo schermo su uno sfondo grigio. Il software ViroSeq ignora le differenze tra le sequenze tagliate e la sequenza di riferimento nella determinazione della sequenza di consenso. Tuttavia, possibile utilizzare questa informazione (nellarea con sfondo grigio) quando si effettua lidentificazione delle basi.

Dopo il ritaglio

Ritaglio manuale delle estremit dei segmenti1. Nella finestra View*Edit (visualizza*modifica), selezionare la regione di scarsa qualit facendo doppio clic su questa porzione dellelettroferogramma. La regione compresa tra il punto del doppio clic e lestremit pi vicina viene evidenziata in nero. Fare clic su Trim (taglia). La sequenza selezionata viene tagliata e visualizzata su sfondo grigio. Nota. Il ritaglio esclude luso di dati tagliati solo durante lindividuazione delle basi di consenso. Il software non esclude luso dei dati tagliati durante lassemblaggio dei dati. Se i dati rumorosi causano risultati mediocri di assemblaggio o allineamento, sar dunque necessario tagliarli utilizzando il software Sequence Analysis (software per l'analisi di sequenziamento). Per annullare il taglio di un segmento: a. Selezionare una regione di dati pi piccola e fare doppio clic per evidenziarla in nero. b. Fare clic su Trim (taglia).

2.Sequenza tagliata

Esempio di ritaglioPrima del ritaglio3.

Controllare attentamente le aree con inserzioni. Queste interpretazioni influenzano i risultati dellAntiretroviral Drug Resistance Report (rapporto sulla resistenza ai farmaci antiretrovirali).

Ricerca delle POISono previsti quattro metodi per spostare il cursore di modifica su una nuova posizione: Fare clic sul pulsante di spostamento avanti ( ) o indietro ( ) per spostarsi sulla POI successiva, come specificato nelle Navigation Options (opzioni di navigazione). Utilizzare la barra di scorrimento nella parte inferiore della finestra View*Edit (visualizza*modifica) per spostarsi lungo la sequenza. Il cursore di modifica si trova al centro della finestra. Utilizzare i tasti freccia sinistra o destra sulla tastiera. Fare clic una sola volta sul lato sinistro o destro della sequenza di consenso per spostare la cornice della finestra Edit (modifica). La base selezionata diventa la POI centrale.


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Modifica di unidentificazione delle basiModifica di una mutazione 1. Esecuzione della modifica. a. Fare clic sul pulsante della tavolozza di editing (modifica) corrispondente al tipo di mutazione da modificare oppure inserire la lettera relativa allidentificazione delle basi (codice IUB) per la POI premendo il tasto corrispondente sulla tastiera. b. Premere la barra spaziatrice per confermare la modifica.

Revisione del progetto nella finestra History (cronologia)La finestra History (cronologia) visualizza una registrazione permanente dei segmenti aggiunti, rifiutati e tagliati, nonch delle modifiche alle identificazioni delle basi. Visualizzazione della finestra History (cronologia) 1. Dal menu Window (finestra), selezionare History (cronologia). Si apre la finestra History (cronologia). Far scorrere il registro utilizzando la barra di scorrimento verticale sulla destra dello schermo per visualizzare le attivit.

2.

Nota. Se vengono apportate pi modifiche a una base, salvando ogni volta, la modifica finale sar registrata correttamente nella finestra History (cronologia). 2. Seguire le istruzioni di modifica per le miscele. 1. Due segmenti di sequenza di senso opposto contengono picchi secondari chiaramente al di sopra del rumore locale (circa il doppio del livello di rumore). 2. Un segmento di sequenza contiene un picco secondario pari al 30% del picco primario con un livello di rumore triplo rispetto a

viroseq v2_8_italian_ifu[1]

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