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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
USO DA TÉCNICA DE PHAGE DISPLAY NA IDENTIFICAÇÃO DE
EPITOPOS DA LHF-II, UMA METALOPROTEINASE DO VENENO DA
SERPENTE LACHESIS MUTA MUTA.
Paula Castanheira
Orientador: Prof. Dr. Carlos Delfin Chávez Olórtegui
Minas Gerais -Belo Horizonte
2005
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Paula Castanheira
Uso da técnica de Phage Display na identificação de epitopos da LHF-II, uma
metaloproteinase do veneno da serpente Lachesis muta muta, utilizando a técnica de
Phage Display
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Farmacologia Bioquímica e Molecular do
departamento de Fisiologia e Farmacologia do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Farmacologia Bioquímica e Molecular
Orientador: Prof. Dr. Carlos Delfin Chávez Olórtegui
Universidade Federal de Minas Gerais
Belo Horizonte
2005
Trabalho realizado no Laboratório de Imunoquímica de Toxinas Naturais e Parasitas do
Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais e no Institut de Biotecnologie et Pharmacologie da Faculté de Farmacie
de Montpellier-France, com o auxílio das seguintes instituições:
CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior.
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.
FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais.
INSERM – Institute National de la Sante et de la Recherche Médicale, França.
AGRADECIMENTOS
ÍNDICE
RESUMO..................................................................................................................viii
ABSTRACT................................................................................................................ix
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................x
LISTA DE TABELAS...............................................................................................xii
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................xiii
1 – INTRODUÇÃO....................................................................................................1
1.1 – O Ofidismo no Brasil.................................................................................................................1
1.2 – Breve caracterização das serpentes Brasileiras de importância médica....................................2
1.3 – Epidemiologia...........................................................................................................................4
1.4 – Classificação taxonômica e características gerais da serpente L. muta muta...........................6
1.5 – Características Bioquímicas do veneno de L. muta muta.........................................................7
1.6 – SVMP ( Snake Venom Metalloproteinases) e sua relação com a hemorragia.........................9
1.7 – As metaloproteinases do veneno de L. muta muta.................................................... ...11
1.8 – Phage Display........................................................................................................................15
1.9 – Síntese de peptídeos em membrana de celulose. Método de Spot-Synthesis.........................17
2 – OBJETIVOS......................................................................................................19
2.1 – Objetivos gerais......................................................................................................................19
2.2 – Objetivos específicos..............................................................................................................19
3 – MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................20
3.1 – Animais e venenos..................................................................................................................20
3.2 – LHF-II e anti-venenos.............................................................................................................20
3.3 – Seleção de epitopos por Phage Display..................................................................................20
3.4 – Individualização dos fagos......................................................................................................20
3.5– ELISA para identificar clones positivos (Screening)..............................................................21
3.6 –Sequenciamento de DNA dos clones positivos........................................................................22
3.7 – Identificação dos peptídeos selecionados................................................................................24
3.8 – Análise de Homologia.............................................................................................................24
3.9 – Síntese de peptídeos em membrana de celulose......................................................................24
3.10–Imunoensaios com peptídeos ligados à membrana..................................................................24
3.11 – Regeneração da membrana....................................................................................................25
3.12 – Identificação de resíduos importantes através de Alanine Scanning.....................................25
3.13 – Síntese química manual do peptídeo em fase sólida (Estratégia Fmoc)...............................26
3.14 – ELISA para verificação do reconhecimento do peptídeo bruto selecionado por
anticorpos anti LHF II................................. ................................................................28
3.15 – Purificação do peptídeo selecionado.....................................................................................28
3.16 – Dot Blot para identificação dos picos reativos......................................................................29
4 – RESULTADOS...................................................................................................................30
4.1 – Caracterização de anticorpos monoclonais e policlonais anti LHF-II....................................30
4.2 – Reatividade dos fagos obtidos na bioseleção..........................................................................31
4.3 – Seleção de clones positivos através da técnica de ELISA......................................................33
4.4 – Sequenciamento do cDNA dos clones selecionados............................................................. 37
4.5– Imunoensaios com as membranas para localização de epitopos conformacionais reconhecidos
por anticorpos monoclonais e policlonais neutralizantes anti LHF-II.............................................39
4.6 – Identificação de epitopos .......................................................................................................39
4.7 – Identificação de resíduos importantes através de Alanine Scanning......................................40
4.8 – Síntese Química......................................................................................................................43
4.9– Reconhecimentodo peptídeo bruto sintetizados pelo mAb B2D4...........................................43
4.10 – Purificação do peptídeo sintético..........................................................................................44
4.11 – Dot Blot para identificação dos picos reativos.....................................................................45
5 – DISCUSSÃO.......................................................................................................48
6 – CONCLUSÕES..................................................................................................52
7 – PERSPECTIVAS...............................................................................................53
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 54
RESUMO
Hemorragia local ou sistêmica é o principal sintoma resultante do envenenamento por
venenos das serpentes de Bothrops e de Lachesis. LHF-II é uma proteína de cadeia única de 22.5,
kDa purificada do veneno de Lachesis muta muta que possui ampla especificidade proteolítica
baixa atividade hemorrágica. Foi demonstrado, previamente, que anticorpos policlonais e
monoclonais anti-LHF-II apresentam reatividade cruzada e neutraliza os efeitos hemorrágicos dos
venenos de algumas espécies de Bothrops e de Lachesis. Estes resultados sugerem que LHF-II é
um antígeno muito eficiente, tendo potencial para ser usado na preparação de anticorpos eficientes
na imunoterapia passiva ou até na vacinação humana.
Duas abordagens diferentes, a técnica phage display e a spot peptide synthesis em
membranas da celulose, foram usadas selecionar e identificar seqüências reconhecidas por
anticorpos específicos anti LHF-II. Dezessete peptídeos foram selecionados pelo anticorpo
monoclonal B2D4, mas somente 13 confirmaram sua reatividade no ensaio de spot , Enquanto que,
de 15 peptídeos selecionados pelo anticorpo policlonal anti LHF-II, somente 2 o confirmaram sua
reatividade. Nenhumas das seqüências de aminoácidos dos peptídeos selecionados apresentaram
homologia com seqüência primária de LHF-II ou com qualquer toxina. De acordo com o ensaio de
ala scan dos três peptídeos mais reativos selecionados por mAb B2D4, apenas um peptídeo
confirmou sua reatividade (N C T L E G T R F R C S ) . O ensaio de ala scan também identificou
os resíduos de aminoácidos deste peptídeo que podem influenciar na sua reatividade com o mAb
B2D4. Este peptídeo foi então sintetizado em forma solúvel, utilizando a estratégia F-moc,
purificado em HPLC e testado para verificação de sua reatividade frente o mAb B2D4. O ensaio de
dot blot demonstrou que este peptídeo é capaz de reconhecer bem anticorpos específicos. Os
resultados obtidos neste estudo indicam que as técnicas de phage display e spot synthesis podem
ser utilizadas como estratégias precisas na identificação de mimotopos funcionais e descontínuos.
viii
ABSTRACT
Local or evasive hemorrhage is a major complication resulting from envenomation by
Bothrops and Lachesis snake venoms. Mutalysin-II is a 22.5 kDa single chain protein, purified
from the Lachesis muta muta venom with broad substrate specificity and hemorrhagic effects. We
have shown previously that polyclonal antibodies and a monoclonal antibody against Mutalysin –II
show cross-reactivity and neutralize the hemorrhagic effects of some Bothrops and Lachesis whole
venoms. These results suggest that LHF-II is a very efficient antigen, which might have potential
for the preparation of efficient anti-venom anti-sera for passive immunotherapy or even for human
vaccination.
Two different approaches, the phage display technique and the Spot peptide synthesis on
cellulose membranes, were used to select and identify sequences recognized by specific antibodies
against LHF-II. Seventeen peptides were selected by monoclonal antibody B2D4, but only 13
confimed their reactivity in the spot assay, while from 15 peptides selected by polyclonal antibody
against LHF-II only 2 confirmed it´s reactivity. None of the peptides aminoacid sequences selected
presented homology with LHF-II sequence nor any toxin. Analysis from an ala scan assay, from
the three most reactive peptides selected by mAb B2D4, confirmed only one peptide
(N C T L E G T R F R C S ) as reactive and identified the key residues of this peptide that can
influence binding affinity. This peptide was, then, synthesized in soluble form using the F-moc
synthesis technique, purified using HPLC and tested for it´s reactivity with mAb B2D4. A dot blot
assay showed that the peptide is able to recognize well the specific antibodies. The results obtained
in the present study indicates that the Phage display and Spot synthesis methods should be used as
techniques to the precise identification of functional and discontinuous mimotopos.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Distribuição de acidentes ofídicos segundo o gênero da espécie peçonhenta
Figura 2 – Letalidade dos acidentes ofídicos por região fisiográfica.
Figura 3 - Serpente Lachesis muta muta.
Figura 4 - Etapas do Biopanning.
Figura 5 - ELISA indireta para testar a reatividade dos anticorpos policlonais anti veneno total
de L.muta muta e LHF-II.
Figura 6 – ELISA indireta para testar a reatividade do mAb B2D4.
Figura 7 - ELISA sanduíche para testar a reatividade dos fagos frente aos três ciclos de seleção.
Figura 8 – ELISA sanduíche para testar a reatividade dos fagos frente aos três ciclos de seleção.
Figura 9 – Testes de ELISA sanduíche para individualizar os clones positivos
Figura 10 – ELISA sanduíche para testar reatividade cruzada dos clones selecionados na ELISA
para screening
Figura 11 – Testes de ELISA sanduíche para individualizar os clones positivos
Figura 12 – Testes de ELISA sanduíche para re-testar os clones positivos
Figura 13 – Elisa sanduíche para testar a reação cruzada dos clones reativos selecionados na
ELISA para screening.
Figura 14 – Seqüências dos peptídeos selecionados pelo mAb B2D4
Figura 15 – Seqüências dos peptídeos selecionados pela IgG policlonal anti LHF-II.
Figura 16 – Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana contento o grupo de
peptídeos selecionados por Phage Display.
Figura 17 – Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana contento o grupo de
peptídeos selecionados por Phage Display.
Figura 18 – Seqüência de aminoácidos dos 13 peptídeos imobilizados na membrana que reagem
com mAb B2D4.
x
Figura 19 – Seqüência de aminoácidos dos peptídeos mais reativos selecionados pelo método de
Spot.
Figura 20 – Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana de alanine scanning de 3
peptídeos.
Figura 21 – Análise mostrando a densidade da reação de cada spot do peptídeo 12
(N C T L E G T R F R C S ) em porcentagem, e de seus análogos de alanina.
Figura 22 – Perfil de eluição do peptídeo sintético bruto em coluna de fase reversa C18 em
sistema de HPLC.
Figura 23 – Reconhecimento do peptídeo sintetizado pelo mAb B2D4 anti LHF-II.
Figura 24 – Análise da reatividade dos picos presentes no perfil cromatográfico de purificação
em HPLC do peptídeo bruto.
Figura 25 – Perfil de eluição do pico C12 em coluna de fase reversa C18 em sistema de HPLC.
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Letalidade dos acidentes ofídicos por gênero de serpente, Brasil 1990-1993.
Tabela 2 - Neutralização da atividade hemorrágica de LHF-II, em venenos de Bothrops e
Lachesis pelo mAb anti-LHF-II
Tabela 3 - Porcentagem de inibição e a posição de cada aminoácido considerado importante na
afinidade do peptídeo pelo anticorpo.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
BCIP – Bromo – 4 – Chloro – 3 - Indolyl Phosphate Mono Toluidinium Salt.
CBS – Citrate buffered saline.
C° - Graus centígrados.
Da – Daltons.
DIPC – Diisopropilcabodiimida.
DCM- Diclometano
DMF – Dimetil formamida.
ELISA – Enzime linked Immunosorbent Assay.
Fmoc – Fluorenilmetiloxicarbonila.
HOBt – Hidroxibenzotriazole.
HPLC – Cromatografia liquida de alta precisão.
IgG – Imunoglobulina G.
kDa – Kilodaltons.
M – Molar.
mAb – Anticorpo monoclonal
MBS – Maleimido benzoyl-N-hidroxysuccinamida.
mg – Miligrama.
mL – Mililitro.
mM – Milimolar.
MTT – (3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide).
OPD – Ortofenilenodiamino.
PBS – Tampão salina fosfato.
pH – Potencial hidrogêniônico
SPPS – Síntese de peptídeos em fase sólida.
TBS – Salina 0,8%, KCI 0,002M, Tris 0,05M.
TFA – Ácido trifluoracético.
T-TBS – TBS, contendo Tween-20.
g – Microgramas.
l – Microlitros.
xiii
1
1- INTRODUÇÃO
1.1- O OFIDISMO NO BRASIL
No que se diz respeito aos acidentes por animais peçonhentos, o ofidismo é o
principal deles, tendo enorme importância médica em virtude da freqüência e da gravidade
com que ocorrem esses acidentes. Globalmente, mordidas por serpentes venenosas afetam
por volta de 2.5 milhões de pessoas anualmente, causando mais que 100.000 mortes. O
ofidismo está também presente em todas as regiões e estados brasileiros e é considerado um
importante problema se saúde, quando não se administra a soroterapia no tempo certo e de
forma adequada. (FUNASA, 1996)
No Brasil, a fauna ofídica engloba cerca de 69 espécies venenosas de interesse
médico existentes, sendo que 32 pertencem ao gênero Bothrops, representado pelas
jararacas, 6 ao gênero Crotalus (cascavéis), 2 ao gênero Lachesis (surucucus) e 29 ao
gênero Micrurus (corais), sendo que a maior incidência de acidentes é atribuída ao gênero
Bothrops , seguida pelos gêneros Crotalus , Lachesis e Micrurus , (Jorge & Ribeiro, 1990),
(figura 1) resultando em um alto índice de acidentes ofídicos, que ocorrem principalmente
na área rural e na periferia dos grandes centros (20.000 casos/ano).
Figura 1
Distribuição de acidentes ofídicos segundo o
gênero da espécie peçonhenta, Brasil, 1990 - 1993
Bothops
Crotalus
Lachesis
Micrurus
90,5% 7,70%
1,40% 0,40%
É importante no entanto, que essas serpentes sejam identificadas e reconhecidas
pois alem de ser uma medida auxiliar na indicação mais precisa do antiveneno a ser
administrado, viabiliza o reconhecimento das espécies de importância médica em âmbito
2
regional (FUNASA,1992).Um primeiro passo para tal reconhecimento, é saber diferenciar
uma serpente peçonhenta de uma serpente não peçonhenta. Para tal identificação são
usados critérios como, a presença ou não de dentes moveis bem desenvolvidos inoculadores
de veneno, localizados na região anterior do maxilar superior, a presença de fosseta loreal,
um órgão sensorial termo receptor localizada entre a narina e o olho, que vista em posição
frontal este animal pode apresentar de 2 a 4 orifícios na região anterior da cabeça,
justificando o nome popular “cobra de quatro ventas” (IOESP; 1993). As serpentes não
peçonhentas geralmente tem hábitos diurnos, vivem em todos os ambientes, tem coloração
viva e brilhante e escamas lisas.
As serpentes do gênero Micrurus, são peçonhentas mas apresentam exceções aos
critérios citados acima, por não possuírem fosseta loreal e confundem pela presença de
dentes inoculadores pouco desenvolvidos e fixos na região anterior da boca (Campbell et
al.,1989).
1.2- Breve caracterização das serpentes Brasileiras de importância médica
Gênero Bothrops
Compreendem cerca de 30 espécies, distribuídas em todo território nacional. São
conhecidas como: jararaca e jararaca do rabo branco (Bothrops jararaca), ouricana,
jararacuçu(bothrops jararacuçu), urutu e urutu-cruzeira (Bothrops alternatus), jararaca
pintada (Bothrops neuwiedi), coatira (Bothrops cotiara), caiçaca (Bothrops moojenii) entre
outros (Ribeiro et al., 1990).
Apresentam cabeça triangular, fosseta loreal, cauda lisa e presa inoculadora de
veneno. São encontradas com mais freqüência no Paraná, tem hábitos geralmente noturnos
e crepusculares, podem apresentar comportamento agressivo quando ameaçados, desferindo
botes sem produzir ruídos.
Seu veneno tem ação proteolítica, coagulante e hemorrágica e as manifestações
clinicas mais freqüentes de um acidente botrópico são caracterizadas pela dor, edema
equimoses e sangramento no local da picada. Enfartamentos ganglionar e bolhas podem
aparecer na evolução acompanhados ou não de necrose.(Warrell et al., 1992)
3
Gênero Crotalus
Serpentes do gênero Crotalus, distribui-se irregularmente pelo país. São conhecidas
como Cascavel, maracamboia e Boicininga (Crotalus durissus).
Apresentam cabeça triangular, fosseta loreal, cauda com chocalho (guizo) e presa
inoculadora de veneno. São menos agressivas que as jararacas e encontram-se geralmente
em locais secos.
São três as ações principais do veneno crotálico: neurotóxica, miotóxica e
coagulante (Azevedo-Marques et al., 1987). Quanto as manifestações clinicas, o acidente
crotálico possui um quadro local pouco expressivo sem dor ou edema. Há parestesia local
ou regional acompanhada de eritema no local da picada. O quadro neuroparalítico é de
aparecimento precoce. Pode ocorrer também mialgia, generalizada, podendo haver
evolução para insuficiência renal aguda, maior causa de óbito neste grupo (Azevedo-
Marques et al., 1985).
Gênero Lachesis
São encontradas principalmente em áreas florestais como Amazônia, Mata atlântica,
e alguns enclaves de matas úmidas do Nordeste. Já foram identificadas, 4 subespécies de
Lachesis muta, como: L. m muta, L. m. rhombeata, L. m. melanocephala e L. m. stenophrys
(Campbell et al., 1989). Apesar da ampla distribuição, os venenos das várias subespécies
são similares em termos de atividades farmacológicas e padrões eletroforéticos (Otero et
al., 1998). No Brasil, o gênero Lachesis muta, conhecido popularmente como surucucu,
pico de jaca, surucutinga e malha de fogo, são encontradas duas sub-espécies: L. m. muta e
L. m. rhombeata.
Apresentam grande porte, cabeça triangular, fosseta loreal, cauda com escamas
arrepiadas e presa inoculadora de veneno (Santos et al.,1995).
O veneno das espécies deste gênero apresenta atividade proteolítica, hemorrágica e
coagulante as quais serão discutidas com mais detalhes ao longo da dissertação (Bolanos et
al.,1982)
4
Gênero Micrurus
Desprovidas de fosseta loreal, com cabeça arredondada e presa inoculadora de
veneno. A característica fundamental no reconhecimento deste grupo é o padrão de
coloração com combinações diversas de anéis vermelhos, pretos e brancos.
Seus nomes populares são Coral verdadeira (micrurus), coral, Boicorá. São
encontradas em tocas e possuem hábitos subterrâneos
Seus acidentes são raros, porém, pelo risco de insuficiência respiratória aguda
devem ser considerados como graves. Os componentes tóxicos do veneno são denominados
neurotoxinas (NTXs) (Coelho et al.,1992).
1.3- Epidemiologia
A coordenação Nacional de controle de zoonoses e Animais peçonhentos, define um
perfil epidemiológico de em média 20.000 casos por ano no Brasil, sendo os acidentes
ofídicos o segundo maior responsável pelos acidentes humanos por animais peçonhentos
(SINITOX,1999).
Foram notificados à FUNASA, no período de janeiro de 1990 a dezembro de 1993,
81.611 acidentes, indicando que o coeficiente de incidência para o Brasil foi de
aproximadamente 13,5 acidentes a cada 100.000 habitantes. A maioria das notificações
procedeu das regiões Sudeste e Sul, as mais populosas do país. Entretanto a letalidade dos
acidentes ofídicos não se mostrou uniforme nas regiões fisiográficas; como se observa na
figura 2, o maior índice foi registrado no Nordeste, apesar desta região apresentar baixo
índice de incidência no país (FUNASA ,1996).
5
Dos 81.611 casos notificados, houve registro de 359 óbitos, indicando que a
letalidade geral no Brasil foi de 0,45%. O maior índice foi observado nos acidentes por
Crotalus , seguido por Lachesis. (Tabela 1)
Tabela 1
Letalidade dos acidentes ofídicos por gênero de serpente
Brasil, 1990-1993
GÊNERO NO CASOS N
O ÓBITOS LETALIDADE (%)
BOTHROPS 59.619 185 0,31
CROTALUS 5.072 95 1,87
LACHESIS 939 9 0,95
MICRURUS 281 1 0,36
NÃO INFORMADO 13.339 69 0,52
TOTAL 79.250 359 0,45
A ocorrência do acidente ofídico está diretamente relacionada a fatores climáticos e
aumento da atividade humana nos trabalhos de campo. Com isso, nas regiões é observado
um aumento na incidência de acidentes no período de setembro a maio, variando de acordo
com a região.
6
Em 52,3% das notificações a faixa etária acometida situou entre 15 a 49 anos, que
corresponde ao grupo de idade onde se encontra a força de trabalho. Cerca de 70% dos
pacientes são do sexo masculino, justificando-se pelo fato de homem desempenhar com
mais freqüência atividades de trabalho fora da moradia, onde os acidentes ofídicos
habitualmente ocorrem (FUNASA, 1991). Dos 359 óbitos notificados, em 314 foi
informado o tempo decorrido entre a picada e o atendimento. Destes em 124 (39,49%), o
medicamento foi ministrado nas primeiras seis horas após a mordida, enquanto que em 190
(60,51%) depois de seis horas da ocorrência do acidente. Esses dados demonstram a
importância da precocidade do atendimento.
1.4- Classificação taxonômica e características gerais da serpente L. muta
muta
As serpentes L. muta muta (figura 3) são répteis pertencentes ao filo Chordata à
ordem Squamata, subordem Serpentes (ophidia), e a família Viperidae, e na subfamília
Crotalinae. Podem ser encontradas em florestas tropicais úmidas da América Central e do
Sul, em tocas de pedra ou em galerias de animais silvestres (Jorge et al., 1997)
A serpente Lachesis muta muta, também conhecida popularmente como surucucu é
considerada a maior serpente peçonhenta das Américas, podendo atingir mais de 4.5 metros
de comprimento. Possuem hábito noturno, se alimentando principalmente de pequenos
mamíferos, e comportamento agressivo, podendo deferir botes com distancia equivalente a
4/5 do seu corpo. Ao contrário das serpentes do gênero Crotalus, a fêmea de L.muta muta é
ovípara e seus ovos possuem um período de incubação de 76 a 79 dias.
Figura 3- Lachesis muta muta
7
1.5- Características bioquímicas do veneno de Lachesis muta muta
Os venenos das serpentes contêm componentes que servem para imobilizar a presa,
mas que também facilitam a digestão. Mais de 90% do peso seco do veneno são
polipeptídeos, os quais incluem enzimas, toxinas e pequenos peptídeos.
Os outros compostos incluem carboidratos (glicoproteínas), lipídeos
(primariamente fosfolipídios), aminas biogênicas (particularmente abundante nos venenos
de Viperídeos e Crotalídeos), nucleotídeos e aminoácidos (Bjarnason et al., 1994).
Os constituintes inorgânicos dos venenos incluem: Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P,
Co, e Zn. O papel biológico de cada metal não está claro, entretanto, é provável que alguns
deles, como o Ca, Mg e Mn, sejam importantes para a estabilização de certas proteínas do
veneno, enquanto outras, em particular, Zn, Cu, Fe e Co, possam ser participantes nos
mecanismos catalíticos de certos componentes enzimáticos do veneno, como de
metaloproteinases (Bjarnason et al., 1994).
Os efeitos fisiopatológicos provocados pelos venenos de serpentes são atribuídos a
essa complexa mistura bioquímica de enzimas e proteínas tóxicas envolvidas em atividades
biológicas distintas que, quando associadas podem levar à morte (Stephano et al., 2005).
Estudos in vitro realizados com o veneno da serpente L. muta muta, demonstram a
ação proteolítica do mesmo. O veneno possui patogênese complexa decorrente da
atividade de proteases, hialuronidases e fosfolipases, assim como da liberação de
mediadores de resposta inflamatória, da ação de hemorraginas sobre o endotélio vascular e
de pré-coagulantes . A ação proteolítica tem como principais sintomas lesões locais como
edema, bolhas e necrose (Sanchez et al.,1991).
Foi descrita também,a ação coagulante do veneno, que foi obtida pela caracterização
parcial de uma fração de veneno com atividade tipo trombina, que converte fibrinogênio em
fibrina. Essas ações produzem distúrbios na coagulação, caracterizados pelo consumo de
seus fatores, pela geração de produtos de degradação da fibrina em fibrinogênio, podendo
ocasionar incoagulabilidade sanguínea. Esse quadro pode levar a alteração da função
plaquetária, bem como plaquetopenia (Sanchez et al.,1987).
A ação neurotóxica é descrita como uma ação do tipo vagal, tendo como sintomas o
surgimento de náuseas, cólica abdominal, hipotensão, hipersalivação, sudorese, distúrbios
8
respiratórios, repetidas ocorrências de vômito, diarréia e sintomas de choque ocorridos em
períodos de tempo que variam de 15 a 90 minutos após o acidente. Porém ainda não foi
caracterizada a fração específica responsável por esta atividade.
As manifestações locais de um acidente laquético são bastante semelhantes as do
acidente botrópico predominando a dor e edema (Colombini et al.,2001). Podem surgir
vesículas de conteúdo seroso ou soro hemorrágico nas primeiras horas do acidente e na
maioria dos casos ocorrem manifestações hemorrágicas no local da mordida (Estevao-Costa
et al.,2000).
As manifestações sistêmicas são caracterizadas pela hipotensão, tonturas,
escurecimento da visão, bradicardia, cólicas abdominais e diarréia (síndrome vagal) (Silva
– Haad, 1980, 1981).
Trabalhos experimentais (Sánchez et al.,1987) demonstraram que a intensa
atividade hemorrágica característica do veneno de L. muta muta, tem propriedades muito
semelhantes a atividade hemorrágica do veneno das serpentes do gênero Bothrops,
decorrentes da ação das hemorraginas que provocam lesões na membrana basal dos
capilares, associadas a plaquetopenia e alterações na coagulação. A hemorragia é
geralmente aparente alguns minutos após a mordida, e é algumas vezes seguida pela
necrose da área onde ocorreu a mordida. O grau de atividade hemorrágica observado nos
humanos acidentados por serpentes do gênero Bothrops e Lachesis está relacionada com a
gravidade do acidente e a restauração da coagulabilidade sanguínea tem sido proposta como
um bom indicador da neutralização da atividade biológica do veneno ( Ho et al., 1968,
Sano Martins et al., 1994).
Um constante desafio, no entanto, é a melhora no tratamento de envenenamentos
causados por serpentes e, com esse objetivo, estão sendo pesquisados atualmente
componentes sintéticos e naturais capazes de neutralizar toxinas importantes do veneno.
9
1.6- SVMP ( Snake Venom Metalloproteinases) e sua relação com a
hemorragia
Serpentes da família Viperidae, com algumas exceções, induzem envenenamentos
caracterizados por hemorragia, além de inúmeras manifestações fisiopatológicas que
incluem necrose local, bolhas e edemas, e efeitos sistêmicos como a coagulopatia,
nefrotoxicidade, alterações hemodinâmicas e em alguns casos neurotoxicidade e
cardiotoxicidade ( Warrell, 1995,1996). Hemorragia induzida pelo veneno pode ocorrer
localmente, no local da mordida, causando isquemia local e lenta regeneração tecidual
(Gutiérrez et al., 1995) e também sistêmicamente, afetando múltiplos órgãos e causando
sérias complicações como choque cardiovascular, hemorragia pulmonar e no sistema
nervoso central ( Warrell, 1996; Cardoso et al., 1993; Otero et al., 2002). Esses sintomas
ocorrem porque venenos de serpentes são ricas fontes de substancias enzimáticas potentes
(como nucleotidases, fosfolipases A2, serino proteases e metaloproteinases) e não
enzimáticas (como lectinas tipo C e disintegrinas) , farmacologicamente ativas.
Venenos de Viperídeos e Crotalídeos possuem componentes que podem afetar a
hemostasia através de mudanças na coagulação sanguínea a na função plaquetária. A
maioria destes componentes tem propriedades coagulantes (ex: conversão do fibrinogênio
em fibrina, ativação da protrombina ou fator X) causando consumo dos fatores de
coagulação e levando a completa incoagulabilidade sanguínea.
Toxinas hemorrágicas presentes em venenos de serpentes são metaloproteinases
zinco dependentes que pertencem à família das metzincinas, juntamente com as astacinas,
serralisinas, metaloproteinases de matriz (MMP) e Adams ( enzimas que contém domínios
tipo-disintegrina e metaloproteinase mas se diferem das SVMPs por não apresentarem
atividade proteolítica).
As SVMPs compreendem quatro grupos, classificados de acordo com a constituição
de seus domínios. O grupo P-I é constituído por enzimas que possuem somente o domínio
metaloproteinase. O grupo P-II incluem enzimas que apresentam o domínio
metaloproteinase seguido pelo domínio tipo-disintegrina. O grupo P-III é caracterizado por
enzimas contendo os domínios metaloproteinase, tipo-disintegrina e um domínio rico em
10
cisteínas (cys-rich). Já o grupo P-IV compreende enzimas com duas sub-unidades. Uma
constituída pelos três domínios do grupo P-III e o outro é uma proteína lectina tipo C,
ligada através de pontes dissulfeto à primeira sub-unidade (Bjarnason and Fox 1994; Hite et
al.,1994). Nem todas as SVMPs induzem hemorragia. Em termos gerais as
metaloproteinases do grupo P-III são toxinas hemorrágicas mais potentes do que outros
grupos, especialmente o grupo P-I, onde enzimas não hemorrágicas tem sido caracterizadas
(Gutiérrez et al., 2005). Os domínios adicionais tipo disintegrina e as regiões ricas em
cisteínas podem ter um papel importante no direcionamento da enzima para seu(s) alvo(s).
As plaquetas são o maior alvo das SVMPs no rompimento da hemostasia. Pela inibição da
interação de plaquetas com colágeno e/ou fator de von Willebrand usando vários
mecanismos, como por exemplo, o direcionamento dos próprios ligantes ou seus receptores
de plaquetas, pode-se dizer que as SVMPs contribuem para a hemorragia sistêmica
(Kamiguti 2005).
As SVMPs são estocadas na glândula de veneno na forma de zimogênios inativos e
são ativados por um mecanismo de cysteine swich-like. Essas enzimas possuem um papel
crítico na função tóxica/patológica do veneno pois permite que as toxinas sejam
rapidamente disseminadas no local onde ocorreu o envenenamento e que elas localizem
seus tecidos-alvo ( Swenson et al., 2005).
O efeito hemorrágico das SVMPs é dependente da atividade proteolítica dessas
enzimas, já que a quelação do zinco pelo EDTA, ο- phenantrolina ou hidroxamatos
peptidomiméticos sintéticos inibem completamente esse efeito ( Bjarnason e Fox,1994;
Escalante et al., 2000). A especificidade proteolítica de muitas SVMPs tem sido avaliada
também através do uso de substratos como a cadeia B da insulina e um padrão
relativamente similar tem sido descrito entre as SVMPs mostrando grande variabilidade
em suas potências hemorrágicas (Bjarnason e Fox,1994).
O mecanismo de ação das SVMPs hemorrágicas tem sido estudado de várias formas
e existe um consenso de que a hidrólise dos componentes da membrana basal em
microvasos é uma etapa chave para esse processo (Ohsaka, 1979, Gutiérrez et al., 2000).
Quando componentes isolados da membrana basal, como fibrolectina, colágeno tipo IV e
laminina, foram incubados com SVMPs hemorrágicas, uma degradação tempo e
concentração dependente foi observada (Gutiérrez et al., 2005). Esse fenômeno tem sido
11
avaliado pela detecção de mudança no padrão protéico em SDS-PAGE (Civello et al.,
1983; Bjarnason et al., 1988; Baramova et al., 1989; Yamakawa et al., 1995).
Uma correlação foi observada entre a atividade de proteinases em componentes da
membrana basal e atividade hemorrágica das SVMPs , enquanto não houve correlação
quando um substrato proteolítico comum (dimetilcaseína) foi utilizado (Bjarnason et al.,
1988). Esse fato corrobora com a idéia de que a hidrólise dos componentes da membrana
basal é uma fator central na patogênese da hemorragia induzida por SVMPs.
Ensaios de microscopia intravital mostraram que quando a SVMP LHF-II , isolada
do veneno de L.muta muta, foi aplicada em músculo cremaster de camundongo, lesões
microhemorrágicas foram observadas ao longo dos capilares, logo após a aplicação da
toxina. Alguns segundos depois, o tamanho desses microhematomas não variou mas novas
lesões hemorrágicas apareceram em outros locais da microvasculatura (Rucavado et al.,
1999). Observações similares foram descritas com o veneno total de B.jararaca (Battelino
et al., 2003) e com as SVMPs purificadas do veneno de B.asper, BaP1 e BaH4 (Lomonte et
al., 1994; Rucavado et al., 1995; Franceschi et al., 2000).
1.7- As metaloproteinases do veneno de L. muta muta
Envenenamento por Lachesis e Bothrops podem resultar em aspectos clínicos
semelhantes caracterizados principalmente pela hemorragia, o qual é considerado o efeito
mais dramático e pronunciado deste envenenamento e as metaloproteinases são apontadas
como o principal fator causativo (Rucavado et al., 1995).
As metaloproteinases zinco dependentes estão presentes em altas concentrações nos
venenos de serpentes da família Viperidae (Bjarnason et al, 1994) e são, como já descrito
anteriormente, responsáveis pelas conspícuas hemorragias associadas aos acidentes com
serpentes da família Viperidae (Ramos et al., 2004).
Estes fatores apresentam ação em diversos componentes do sistema hemostático e
fibrinolítico. O mecanismo de hemorragia induzida pelas metaloproteinases do veneno de
L. m. muta não parecem depender da degradação disseminada de componentes da matriz
extracelular, mas provavelmente da hidrólise de sítios altamente específicos e ainda
indefinidos na lâmina basal dos capilares, que é responsável pela sua integridade (Ohsaka et
12
al., 1976; Bjarnason 1994). A clivagem de proteínas da membrana basal com conseqüente
enfraquecimento da estrutura dos capilares constitui o principal mecanismo pelo qual estas
enzimas provocam hemorragia (Rucavado et al., 2000).
Várias toxinas presentes no veneno de L. m. muta com atividade hemorrágica já
foram isoladas e caracterizadas. (Sanchez et al.,1995) Entre elas, estão a Lachesis
Hemorrhagic Factor I (LHF-I, também chamada de mutalisina I) e Lachesis Hemorrhagic
Factor II ( LHF-II, ou mutalisina II). Como as outras SVMPs, as mutalisinas degradam
proteolicamente não só o fibrinogênio como também outros componentes da matriz
extracelular como as lamininas, fibrolectinas, colágeno tipo IV ou gelatina (Sanchez, 1998;
Rucavado et at., 1999). Evidências conclusivas de que as duas metaloproteinases presentes
no veneno de L. m. muta são distintas, provém de dados imunológicos, da determinação
completa da seqüência de aminoácidos de LHF-II (Sanchez et al., 1991) e de suas
especificidades proteolíticas.
LHF-I é uma glicoproteína, que possui cerca de 100 KDa, pI 4.7, e duas sub-
unidades, e que perde sua atividade quando tratada com mercaptoetanol, mostrando a
importância da sua conformação através das suas pontes dissulfeto. Essa metaloproteinase,
representante do grupo P-IV, contém 0.7g atom de zinco e 1.2 g atom de cálcio por mol de
proteína. Sua natureza de metaloproteinase foi confirmada, de acordo com Sanchez et
al.,1995 ; pelo fato de que sua atividade hemorrágica não foi inibida por inibidores de
serino proteases como PMSF, TLCK e outros e foi inibida na presença de 2mM de EDTA.
A LHF-I é responsável por uma atividade hemorrágica elevada enquanto a LHF-II , possui
atividade hemorrágica consideravelmente menor quando comparada a atividade da LHF-I,
além de possuir também as atividades proteolítica (menor que a de LHF-II) e coagulante
(Sanchez et al.,1987).
LHF-II é caracterizada como uma zinco metaloproteinase de cadeia única, contendo
200 resíduos de aminoácidos com um peso molecular de 22,3 kDa, e um ponto isoelétrico
de 6.6 , não apresentando glicosilações . Contém 1g atom de zinco e 2g atom de cálcio por
mol de proteína. Essa metaloproteinase processa uma atividade proteolítica frente a vários
substratos como caseína, dimetilcaseína, fibrinogênio e fibrina. A atividade proteolítica da
LHF-II com dimetilcaseína como substrato é completamente inibida pela α2-
macroglobulina humana (Souza et al., 2001). A natureza de metaloproteinase do fator foi
13
indicada pela sua ativação com Ca++ e inibição de por Zn2+, cisteína e quelante de metal
como EDTA e EGTA (Sanchez et al.,1991).
Estudos realizados com o objetivo de testar a atividade proteolítica de LHF-I e
LHF-II frente a diferentes substratos como cadeia B da insulina, caseína e como peptídeo
fluorogênico Abz-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Arg-EDDnp mostram que não há correlação
suas atividades proteolíticas e hemorrágicas. A atividade específica para hidrólise do
peptídeo Abz-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu Gly-Arg-EDDnp por LHF-II foi 7059 vezes maior que
por LHF-I, enquanto que a LHF-II apresenta uma atividade hemorrágica 27 vezes menor
que LHF-I. Esse fato indica que assim como a insulina, o peptídeo fluorogênico não é um
substrato específico para a LHF-I, sugerindo que esta pode apresentar especificidade por
algumas proteínas presentes na membrana basal de capilares e outros componentes da
matriz extracelular (Sanchez et al., 1995).
O Papel da LHF-II na patogênese da lesão tecidual induzida pelo veneno está
associada com a formação de edema e degradação de componentes da matriz extracelular,
por ativação direta ou indireta de metaloproteinases da matriz endógena. Foi demonstrado
também o seu papel na degradação da parede de vasos sanguíneos (Rucavado et al.,1999)
Um anticorpo monoclonal anti LHF-II produzido em camundongos imunizados com
veneno total de L.muta muta foi testado para comparar a sua reatividade cruzada com os
venenos do gênero Bothrops. Esse anticorpo monoclonal anti LHF-II, chamado de B2D4,
foi capaz de neutralizar a atividade hemorrágica de LHF-II e do veneno total de L.muta
muta, bem como de várias espécies do gênero Bothrops, no entanto, não tem reatividade
alguma com o veneno de Micrurus ou Crotalus, que não são hemorrágicos (Estevão-Costa
et al.,1997 ). (Tabela 2)
14
Tabela 2- Neutralização da atividade hemorrágica de LHF-II, em venenos de Bothrops
e Lachesis pelo mAb anti-LHF-II
Veneno
MHD
(g)
Capacidade neutralizante
(%)*
B. alternatus 6.55 100.00
B. atrox 6.42 44.00
B. itapetiningae 6.65 93.00
B. jararaca 6.22 7.00
B. neuwiedii 3.63 9.00
L. muta muta 4.55 84.00
Mutalysin-II 89.68 100.00
*Anticorpo monoclonal anti LHF- II (50g/MHD in 100 l) foi incubado com veneno
bruto ou LHF--II por 30 min a 37 oC. Atividade hemorrágica foi medida pelo método de
of Kondo et al. (1960).
Foi produzido também, anticorpos policlonais anti LHF-II, em coelhos. Estes
também foram capazes de neutralizar a atividade hemorrágica tanto do veneno das espécies
de Lachesis e Bothrops quanto da LHF-II (Souza et al., 2001).
Esses resultados demonstram que a LHF-II para ser considerada um antígeno
eficiente e poderá ter grande potencial para a preparação de antivenenos direcionados para
a imunoterapia passiva e até mesmo para a vacinação veterinária ou humana. Entretanto, a
imunização de animais com estes antígenos (sumamente tóxicos) é obviamente um
problema para ser solucionado.
Portanto, neste trabalho, utilizamos as técnicas de Phage Display e Spot método
para selecionar regiões antigênicas responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes
citados anteriormente.
15
1.8- Phage Display
Phage display consiste de uma técnica de seleção in vitro, na qual um gene
capaz de expressar um peptídeo ou uma proteína é geneticamente acoplada a genes de
proteínas capsidiais de um bacteriófago, resultando na manifestação ou expressão dessa
proteína acoplada, com proteínas presentes na superfície do fago. A ligação entre o DNA
do fago e o gene do peptídeo a ser expresso permite a manifestação de um vasto numero de
variantes deste peptídeo.
Por um processo chamado de Biopanning é feito um tipo de seleção in vitro do fago.
Essa seleção é feita pela incubação de um pool de fagos com um alvo de interesse que foi
imobilizado em uma placa. Após a incubação, a ligação entre o fago e o alvo é rompida,
fazendo com que o fago selecionado fique pronto para ser amplificado via infecção com
E.coli. Após três ciclos de infecção e amplificação, pode-se dizer que os fagos estão bem
selecionados e altamente específicos, a partir daí serão analisadas as seqüências de
peptídeos que se mostraram positivas (que se ligaram ao alvo), para analise da seqüência de
DNA do bacteriófago (Smith.,1985). ( Figura 4)
O bacteriófago utilizado nesta técnica é caracterizado como um bacteriófago
filamentos chamado M13. Essa classe, além de não matarem seu hospedeiro durante a
infecção para a sua reprodução usam o pilli da E.coli como receptor para tal infecção.
A partícula do bacteriófago tem em média 6,5 nm de diâmetro e 930 nm de largura.
A massa da partícula é de aproximadamente 16,3 MD, os quais 87% são atribuídos a parte
protéica. Seu genoma é constituído por uma fita única e covalentemente fechada de DNA,
contendo algo em torno de 6400 nucleotídeos revestidos por um cilindro protéico flexível.
Geralmente, os peptídeos que são expressos na superfície dos fagos são acoplados a
proteína pIII e pVIII. A proteína pIII possui 406 AA, e existem apenas 5 copias dela na
superfície do fago. A seqüência do peptídeo é normalmente inserida entre a seqüência para
o pIIISP e o começo do primeiro domínio N1. Essa proteína tem a vantagem de selecionar
ligantes com alta afinidade.
A proteína pVIII, possui 50 AA e existem 2700 copias desta na superfície do fago.
A seqüência do peptídeo é normalmente inserida entre a seqüência do pVIIISP e a parte
16
N-terminal de pVIII. Essa proteína tem a característica de expressar na sua superfície
somente peptídeos acoplados com menos de 8 AA.
O peptídeo a ser expresso pode tanto ser acoplado a todas as copias de pIII ou pVIII
, quanto a somente uma fração delas (Barbas et al.,1991).
Considerando finalmente que as bibliotecas de bacteriófagos expressando peptídeos
acoplados permitem uma rápida seleção dos peptídeos capazes de se ligaram a um alvo,
pode-se concluir que tal técnica tem uma importância biológica que se baseia na
identificação de novos antagonistas e agonistas; através de alvos de interesse imobilizados.
Uma vantagem desta estratégia é a seleção de mimotopos, significando ser possível
mimetizar um epitopo descontínuo (Geysen et al., 1986).
A identificação de epitopos reconhecidos por anticorpos monoclonais ou
policlonais, a seleção de anticorpos associados a doenças para serem usados no diagnóstico
e vacinação, e a utilização de imunógenos com seqüências previamente selecionadas são
consideradas algumas das aplicações desta metodologia.
Figura 4- Etapas do Biopanning
17
1.9- Síntese de peptídeos em membrana de celulose. Método de Spot-
Synthesis.
Foi realizada a síntese paralela de peptídeos sobre membrana de celulose, pela
vantagem desta permitir a síntese rápida de um grande número de peptídeos (816 por
síntese ou ciclo), em pontos delimitados por volume de deposição de cada aminoácidos. Os
aminoácidos são depositados em volume mínimo (0,6 l) com auxílio de um
micropipetador automático, permitindo obter aproximadamente 50 nanomoles de peptídeo
por ponto. A síntese múltipla foi realizada em sintetizador (Abimed Spot Synthesis–
ASP222, Langenfeld, Alemanha e o plano de distribuição dos aminoácidos, bem como a
determinação dos protocolos dos diversos peptídeos foram definidos em programa de
computação Multipeps (Molina et al., 1996).
Os grupos hidroxilas livres sobre a membrana de celulose servem de ponto de
ancoragem para a síntese do peptídeo. Estes grupos são acoplados através de ligação estável
com 8 a 10 unidades de polietileno glicol, com o objetivo de afastar o peptídeo do suporte e
conferir melhor estabilidade na ligação do peptídeo à membrana. A síntese do peptídeo
inicia-se sempre pelo C-terminal do último aminoácido da seqüência estabelecida.
Adiante, será feita uma breve descrição do processo básico pelo qual o peptídeo é
sintetizado. Para que seja efetuada a síntese, a amina de um aminoácido é ligada à carboxila
do outro. No entanto, só é formado um produto único se uma só amina e uma só carboxila
estiverem disponíveis para reação. Por esse motivo é necessário bloquear alguns
grupamentos e ativar ouros para evitar reações indesejadas. A amina do primeiro
aminoácido do peptídeo desejado é bloqueada com um grupamento Fmoc, formado um
Fmoc aminoácido. A desproteção do grupo ligado ao Fmoc,é feita pela adição de piperidina
(20% em DMF), e as funções aminas são recuperadas e podem ser visualizadas pela
coloração azul com bromofenol A carboxila do aminoácido a ser ligado é ativado por
DIPC/HOBT e a amina livre (sem o grupamento Fmoc) do aminoácido já ancorado ataca a
carboxila ativada, levando à formação de uma ligação peptídica.
Desta forma são realizados vários ciclos para a síntese completa de um peptídeo,
sendo que os ativadores utilizados propiciam um rendimento de ligação variando de 74-
87% por ciclo. A deposição de aminoácidos sempre começa com arginina, por ser este o
mais instável, e, cada aminoácido é depositado por duas vezes em cada ciclo. As reações de
18
ligação são seguidas por mudança de coloração dos Spots, passando da cor azul ao verde-
amarelado. As funções NH2 livres ou que não reagiram, são acetiladas (anidrido acético
10% em DMF) para evitar a formação de peptídeos errados ou outras ligações indesejáveis.
O grupo protetor Fmoc do próximo aminoácido é novamente eliminado em meio básico
pela piperidina e verificado a ligação pela coloração com bromofenol. Efetua-se lavagens
da membrana com metanol, e após secagem ao ar fresco, esta membrana é posicionada no
sintetizador para outro ciclo. O acompanhamento se faz necessário durante todo o processo
para verificar se a síntese está sendo efetuada corretamente. Cada etapa constitui um ciclo
da síntese, realizado em média 1 h e 15 min, e será repetido quantas vezes necessário para
se obter o peptídeo total alongado. Pelo método de Spot, o tamanho do peptídeo sintetizado
é limitado a 15-20 aminoácido (Laune et al., 2002), pois há duvidas quanto a qualidade de
ligação de peptídeos muito alongados ou grandes. Ao final da síntese, os grupos laterais dos
aminoácidos são desprotegidos pela adição de ácido trifluoracético-TFA associado a
diclorometano e trietilsilano, e assim os peptídeos encontram-se fixados de maneira
covalente sobre a membrana.
A membrana com os diversos peptídeos pode ser analisada por imunoensaios de
colorimetria indireta. A capacidade dos peptídeos sintéticos se ligarem com anticorpos é
avaliada por ensaios imunológicos e estes podem ser reproduzidos em torno de 30-40 vezes
utilizando-se a mesma membrana, para anticorpos policlonais e até 70 vezes para anticorpos
monoclonais. Esta metodologia vem sendo empregada em diversos estudos de identificação
de determinantes antigênicos nas estruturas protéicas, e predileções de estruturas funcionais
nestas moléculas.
19
2- Objetivos
2.1- Objetivo Geral
Identificar e caracterizar epitopos da LHF II, presente no veneno da serpente L.
muta muta.
2.2- Objetivos Específicos
1- Confirmação da atividade de anticorpos monoclonais e policlonais contra LHF-
II, previamente caracterizados,para serem usados como ligantes na seleção de peptídeos
presentes nas bibliotecas de fagos.
2- Mapeamento de epitopos da LHF-II (Método de Phage Display e Spot).
3- Caracterização e seqüênciamento dos peptídeos selecionados por anticorpos anti
LHF-II.
4- Síntese química, purificação e caracterização de peptídeos selecionados por
Phage display e Spot Método.
5- Imunização de animais com peptídeos sintéticos ou com peptídeos expressos em
fagos.
20
3- Materiais e Métodos
3.1- Animais e Venenos
Os venenos foram obtidos de espécies da serpente L.muta muta que habitam regiões
perto de Manaus (Amazonas, Brasil) .
Camundongos adultos da raça Balb/c pesando entre 18-22 g foram utilizados. Estes
foram mantidos no Centro de Bioterismo do ICB-UFMG e receberam água e alimentação
em condições controladas.
3.2- LHF-II e anti-venenos
A metaloproteinase LHF-II, gentilmente cedida pelo Dr. Eládio Flores Shanchez do
Laboratório de Bioquímica de proteínas da Fundação Ezequiel Dias , foi purificada do
veneno total por gel de filtração em coluna Sephadex G-100 e G-50 e por cromatografia por
troca iônica em CM-Sepharose como descrito por Sanchez et al,1991.
Anticorpos policlonais de coelho anti LHF-II foram previamente produzidos por
Souza et al., 2001 e também cedidos pelo Laboratório de Bioquímica de proteínas da
Fundação Ezequiel Dias. Anticorpos monoclonais de camundongo anti LHF-II foram
produzidos de acordo com Estevão-Costa et al., 2000. A caracterização dos anticorpos foi
feita através de ensaios de ELISA indireta.
3.3- Seleção de epitopos por Phage Display
Bibliotecas de fagos filamentosos expressando peptídeos de 12-mer (XCX8CX), 15-
mer (X15), 17-mer (XCX15) e 30-mer (X30) com seqüências randômicas acopladas à porção
N-terminal da proteína PVIII do capsídeo protéico foi submetida a três ciclos de bio-
seleção ou “Biopanning”.
21
Para a realização do primeiro panning, IgGs (anticorpos policlonais ou
monoclonais) foram sensibilizadas na concentração de 50g/ml e 5g/ml, diluídos em
coating buffer (NaHCO3 100mM pH 8,6) respectivamente em placas de petri de
poliestireno (10x1.5 cm, Falcon 1029) por 2 horas com agitação a 37o C . Após a
sensibilização foram bloqueadas com TBS-T 0.05%-BSA 3% e então 5x1012
fagos de 4
bibliotecas de 12,15,17 e 30 AA , obtidas por J. Scott (Simon Fraser University, Burnaby
BC, Canadá), diluídos em TBS 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5, Tween 0,05% foram
adicionados a cada placa de petri e incubados a 4oC por 12 horas com rotação. Os fagos
foram então eluídos por com uma solução ácida ( 0,1N HCl, pH2.2 – Glicina 0.1M, BSA 1
mg/ml), neutralizados com Tris-HCl 2M pH 9.0 e amplificados pela adição de uma cultura
de Escherichia coli em crescimento exponencial (Do=1.8 a 550nm). O eluato final (obtido
após o terceiro panning) foi titulado para a obtenção de colônias bem separadas para que
colônias individuais pudessem ser testadas quanto a sua reatividade frente às IgGs anti
LHF-II por ELISA (Screening) e então seqüenciadas. A título de comparação foi feita um
ELISA testando o eluato final dos fagos dos Pannings 1,2 e3.
3.4- Individualização dos Phagos
Os phagos selecionados pelo terceiro panning foram colocados em cultura com
bactérias E. coli e posteriormente plaqueados em diluições seriadas para que as colônias
cresçam separadamente. Cada colônia é então cultivada em 200 µl meio LB com
tetraciclina, em wells individuais de placas de cultura de 96 well. Após o crescimento
individual de todas as colônias, estas são submetidas à testes de ELISA para verificar suas
reatividades frente aos anticorpos anti LHF-II.
3.5- ELISA para identificar clones positivos (Screening)
A especificidade dos fagos selecionados foi avaliada extensivamente com
anticorpos imobilizados através do uso da técnica Phage-ELISA.
Microplacas, tipo maxisorp (Nunc) de 96 wells, foram sensibilizadas durante a noite
a 4oC com uma solução de 100l de coating buffer (tampão Bicarbonato de sódio 0.02M,
22
pH 9.6) contendo 1µg/ml de IgG policlonal e monoclonal anti LHF-II, bloqueadas com
caseína 2% em Tampão fosfato 0,05 M + 0,015M NaCl, pH 7.4 por 1 hora a 37oC e então
adicionados a cada well 50 l de sobrenadante (de cultura de E.coli K91 infectadas por
clones individuais de fagos (previamente cultivados em meio LB com tetraciclina, em
placas de cultura de 96 well) mais 50 l de tampão de incubação (PBS, 0,25% de caseína,
0,05% tween 20), que são incubados por 1 hora a 37oC. Para a visualização da ligação dos
fagos, foi adicionado imunoglobulinas anti fago M13 conjugados com a enzima peroxidase
(Sigma). A atividade enzimática foi revelada usando-se a solução ortofenilenodiamino
(OPD) como substrato (0,33 mg/ml em tampão citrato pH 5,2, na presença de 0,04% de
água oxigenada). Os clones individuais que foram considerados positivos são aqueles que
apresentavam Do > 1.0 a 450 nm. Estes então foram seqüenciados e tiveram sua seqüência
de nucleotídeos analisadas.
Também foram sensibilizadas placas com IgGs monoclonais e policlonais anti
FVIII e TstFG50 (irrelevante) respectivamente a 1 µg/ml e testadas em paralelo com os
mesmos clones de fagos que nas outras placas, em caráter de controle negativo.
A TstFG50 (Tityus serrulatus fração G50) é considerada a fração mais tóxica do
veneno do escorpião Tityus serrulatus.
Os ensaios foram conduzidos como descrito por chávez-olórtegui e col, 1991. As
leituras da absorbância foram feitas a 450 nm em leitor de ELISA TITERTEK multiscan.
3.6- Seqüênciamento de DNA dos clones positivos
Extração de DNA para seqüênciamento
Para extrair o DNA dos fagos que foram selecionados no screening, usou-se o
protocolo de extração QIAprep Spin M13 purification procedure protocol, da QIAGEN.
Este é designado especialmente para preparação de fita única de DNA de M13 usando
colunas em microcentrífuga.
Dosagem de DNA
Para realizar a reação de PCR de seqüênciamento, foi feita a dosagem de DNA no
aparelho GeneQuant da Pharmacia. O programa usado para dosagem de DNA de fita única
23
faz as leituras das absorbâncias a 260 nm e 280 nm, avaliando a razão dessas leituras e a
pureza do DNA fornecendo sua dosagem diretamente.
Seqüênciamento Automático Capilar
Para sequênciamento dos clones identificados foram adicionados em um tubo de
microcentrífuga:
DNA molde ( fita única de DNA dos clones selecionados) 100 ng
Primer complementar reverso (5’TCGGCAAGCTCTTTTAGG 3’) 3,2 pmol
Tampão de seqüênciamento 2.5x (Perkim Elmer) 4,0 µl
Mix contendo nucleotídeos terminadores fluorescentes,Taq 4,0µl
DNA polimerase mutante e pirofosfatase inorgânica
Termoestável do kit ABI Prism Sequencing (Perkim Elmer)
Água deionizada estéril qsp.20µl
Os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão da PCR foram realizados no
termociclador PTC-100 (MJ Research).O programa utilizado está descrito a seguir:
1- 96oC por 30 segundos
2- 50oC por 15 segundos
3- 60oC por 4 minutos.
4- A partir do primeiro passo, o ciclo foi repetido 25 vezes
Após a reação de seqüênciamento, as amostras foram precipitadas pela adição de
80µl de isopropanol 75% ao conteúdo dos tubos de microcentrífuga, devidamente
preparados e ressuspendidos em 20µl de Template Supression Reagent (TSR), estando
pronto para seqüênciamento no aparelho ABI Prism- 310 Genetic Analyser (Perkim Elmer).
24
3.7- Identificação dos peptídeos selecionados
Para identificação dos peptídeos selecionados, primeiramente foi obtida a seqüência
de nucleotídeos que codifica esses peptídeos através da analise das seqüências de DNA.
Após a identificação do nucleotídeos, foi usada a opção DNA protein select translate
3’5’ frame 1, do programa proteomics tools disponível em http://www.expasy.ch para
identificar os peptídeos.
3.8- Análise de homologia
As seqüências dos nucleotídeos referentes aos clones seqüenciados, foram
analisadas quanto a similaridade com outras seqüências já registradas em banco de dados
através do programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST- ALTSCHU, 1990)
disponível em http//:www.ncbi.nlm.nih.gov.
3.9- Síntese de peptídeos em membrana de celulose
Todos os peptídeos selecionados por Phage Display e identificados como reativos
nos ensaios de ELISA, foram sintetizados em membrana de celulose pelo método de spot
(Frank ., 1992), para serem re-testados quanto à sua reatividade frente aos anticorpos anti
LHF-II.
3.10- Imunoensaios com peptídeos ligados á membrana
Ambas as membranas contendo os peptídeos sintéticos descritas no tópico anterior
após incubadas, separadamente, com solução de bloqueio (GENOSIS, SU-07-250A) em
TBS, contendo Tween-20 a 0,05% (T-TBS) e sacarose a 0.5%, a temperatura ambiente
foram incubadas com os soros testes distintos ( anticorpos monoclonais de camundongos
ou policlonais de coelhos anti LHF-II ) em ensaios distintos , por 90 min à 37oC. Após os
soros, os conjugados (anticorpos anti mouse ou rabbit conjugados com fosfatase alcalina)
25
são adicionados e mantidos sob agitação por 90 minutos. Após o conjugado foi adicionando
o substrato para fosfatase (MTT-BCIP, Sigma) por 30 minutos. A reação é visualizada pela
presença de um precipitado azul sobre os peptídeos mais reativos (Frank., 2002). A
intensidade da cor foi calculada com base no ponto mais escuro, usando uma escala
arbitrária de 0-100 e com base na análise densitométrica da reação utilizando o sistema de
análise Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD).
3.11- Regeneração da membrana
Ao final dos ensaios imunológicos as membrana foram escaneadas e em seguida
submetidas a um tratamento de regeneração, para sua posterior reutilização. As membranas
foram seqüencialmente tratadas com dimetilformamida (DMF), reagente A (uréia 8M, 1%
de SDS, 0.1% de 2-mercaptoetanol), reagente B (etanol/água/ácido acético na proporções
50:40:10 vol/vol/vol), e metanol para remover os complexos moleculares precipitadas
sobre os peptídeos (três lavagens de 10 min cada). Este procedimento de regeneração
permite o uso das membranas 30-40 vezes utilizando-se a mesma membrana, para
anticorpos policlonais e até 70 vezes para anticorpos monoclonais (Frank., 2002).
3.12- Identificação de resíduos importantes através de Alanine Scanning
Após análise densitométrica da reação de spot, foram selecionados os peptídeos
mais reativos para serem sintetizados novamente em membrana de nitrocelulose,como
descrito anteriormente; utilizando-se ,no entanto, a técnica de substituição de aminoácidos
Alanine scanning (Clackson et al., 1995).
Para avaliar a importância de todos os resíduos de aminoácidos envolvidos na
ligação com anticorpos específicos, os peptídeos selecionados foram sintetizados através do
método Ala Scan, onde cada resíduo de aminoácido é substituído por resíduos de alanina,
um por um, sendo que, para avaliação da importância de um resíduo de alanina já presente
na seqüência primaria do peptídeo, é utilizado um resíduo de glicina para sua substituição
( De Lano., 2002 ; Thorn et al., 2001)
26
A densidade da reação de cada spot é então avaliada através do sistema Scion
Image. Os resíduos importantes são identificados com base na diminuição da capacidade do
peptídeo de se ligar ao anticorpo específico em relação a seqüência peptídica sem
modificação.
3.13- Síntese química manual do peptídeo em fase sólida (Estratégia
Fmoc)
Após a seleção e avaliação das seqüências peptídicas pelo método de Spot e
Alanine Scanning, o peptídeo mais reativo foi identificado e sintetizado utilizando-se
um protocolo de síntese química que utiliza aminoácidos com o grupamento amina
protegido por um grupamento Fmoc e a cadeia lateral protegida por outros grupamentos.
Para a técnica de SPPS foi utilizado a estratégia (Fmoc)/tert-butyl (tBu) (Carpino,
1972) com os grupos protetores de cadeia lateral mais comuns: tert.-butyl éter (tBu) para
serina, treonina e Tirosina; tert.-butyl ester (OtBu) para glutamanto e aspartato;
benzyloxycarbonyl (Boc) para lisina e triptofano; trityl (Trt) para glutamina, asparagina,
histidina e cisteína; 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) para arginina.
O protocolo foi realizado de acordo com Merryfield (1969) com as seguintes
modificações:
Foram utilizados 55mg de resina (Amide Rink) e esta foi colocada no tubo de
síntese coberta com 10ml de DMF e deixada em repouso por 30 minutos. Em seguida o
grupamento Fmoc foi retirado usando uma solução de piperidina 20% em DMF por 5
minutos. Este procedimento foi repetido três vezes para expor o grupamento amino
presente na resina. O desbloqueio foi confirmado pelo teste de Kaiser.
Após o desbloqueio, a resina foi lavada três vezes com DMF e ficou pronta para
receber o primeiro aminoácido da seqüência (sempre começando do C-terminal do
peptídeo).
O aminoácido foi adicionado em uma quantidade equivalente a quatro vezes em
excesso em relação à resina. O aminoácido se liga pelo seu grupamento carboxila ao
grupamento amino da resina, formando uma ligação peptídica. Juntamente com o
27
aminoácido foi adicionado 21.6mg de HOBt e 25µL de DIPC. Estes dois reagentes
favorecem a ativação da função COOH do aminoácido, o que facilita a ligação
peptídica. Foi colocado DMF suficiente para cobrir toda a resina e o tubo ficou sob
agitação por 3 horas.
Após o tempo de acoplamento, todo o liquido do tubo de síntese foi retirado com
auxilio de uma bomba a vácuo. A resina foi lavada com DMF por três vezes e o
acoplamento foi confirmado pelo teste de Kaiser. Novamente se fez necessário o
desbloqueio do grupo N-terminal para o acoplamento do próximo aminoácido.
O processo de elongação do peptídeo continuou até que o último aminoácido foi
acoplado. Após o término do ultimo ciclo, o último aminoácido foi desprotegido, com a
retirada do grupamento Fmoc, e a resina com o peptídeo foi lavada quatro vezes por
cinco minutos com DCM.
O peptídeo foi desligado da resina com o uso de uma solução de clivagem
contendo 2,5% de trietilsilano + 2,5% de etanoditiol + 2,5% de água em um volume
final de 5mL de TFA. O tubo de reação ficou agitando com esta solução durante 3
horas.
Passado às três horas, a solução peptídica foi retirada do tubo de síntese com o
auxilio de uma bomba a vácuo. Foi adicionado éter à -10°C à solução peptídica, em
seguida, a solução resultante foi armazenada overnight 4oC a fim de precipitar o
peptídeo.
A solução contendo o peptídeo foi centrifugada a 3000 rpm por 30 minutos e o
sobrenadante foi desprezado. O pellet peptídico foi ressuspendido em água Milli-Q e
liofilizado.
28
3.14– ELISA para verificação do reconhecimento do peptídeo
bruto selecionado por anticorpos anti LHF II.
Microplacas de ELISA,marca Falcon (Becton Dickinson Labware Oxnard,
Canada) com 96 poços, foram sensibilizadas overnight 4°C com uma diluição
inicial de 5g do peptídeo em PBS, pH 7.4. A placa foi lavada com solução de
lavagem (0,05% Tween-salina) e bloqueada com solução de caseína 2% em PBS
0,05 M + 0,015M NaCl, pH 7.4.
O primeiro anticorpo usado foi o mAb B2D4 anti-LHF II, diluído 1:100 em
tampão de incubação (PBS 0,25% de caseína 0,05% tween 20). Para a
visualização da ligação dos anticorpos, foi adicionado anticorpo anti -IgG de
camundongo conjugado à enzima peroxidase (Sigma) 1:10000.
A atividade enzimática foi revelada usando-se a solução ortofenilenodiamino (OPD)
como substrato (0,33 mg/ml em tampão citrato pH 5,2, na presença de 0,04% de água
oxigenada) e a reação foi interrompida pela adição de 20 l de acido sulfúrico
diluído 1:20.
A absorbância foi verificada em um leitor de ELISA (SpetraMax,
Molecular Devices) no comprimento de onda de 492nm .
3.15- Purificação do peptídeo selecionado
O peptídeo foi purificado em HPLC (High performance Liquid Chromatografy)
de fase reversa utilizando uma coluna Shimadzu-C18 (diâmetro 0,6cm, volume 4,2mL
e 15cm de comprimento) acoplada a sistema de HPLC (Äkta Explorer, Amersham
Pharmacia Biotech). O sistema de solventes utilizados foi: solução A, TFA 0,1% em
água; e solução B, 0,1% de TFA em acetonitrila. Cada peptídeo foi eluído em um
gradiente linear que variou entre 0 e 50% de solvente B em 90 minutos em um fluxo de
1mL/min. O pico que apresentou reatividade frente ao mAb B2D4, no ensaio de Dot
Blot, foi refracionado em um gradiente que variou de 20 a 30% de acetonitrila em 90
minutos ( 10-20 minutos até 10% de acetonitrila na solução A e de 20-90 minutos até
29
25% de acetonitrila em solução A). Os picos obtidos na purificação foram submetidos
à espectrometria de massas para análise do produtos sintetizados.
3.16- Dot Blot para identificação dos picos reativos
Objetivando a análise dos picos presentes no perfil cromatográfico de fase reversa
quanto à reatividade frente ao mAb B2D4 anti LHF-II, foi realizado o ensaio de Dot Blot
(Magi et al., 2005)
Foram incubados em uma membrana de nitrocelulose dentro de um aparato próprio
de Dot Blot (96 wells, formato 8x12), 50 µl por well do eluato de cada tubo de purificação,
correspondentes aos picos , overnigth à 37°C. Foi adicionado, então, à membrana uma
solução de Bloqueio ( PBS-T 0,3%) por 1h à temperatura ambiente sob agitação. A
membrana foi lavada com solução de lavagem (PBS-T 0,05%) 3 vezes por 5 minutos e
então incubada por 1h à temperatura ambiente com mAb B2D4 anti LHF II diluído 1:500
em solução de lavagem. Após mais três lavagens foi adicionado o anticorpo anti-IgG de
camundongo conjugado à enzima peroxidase (Sigma) na diluição de 1:10.000 por
1h também em tampão de lavagem. O ensaio foi revelado usando uma solução de
10mg de 3,3’-Diaminobenzidine em 10ml de solução de lavagem e 5 mg 4-chloro-1-
naphthol em 8,32 ml de solução de lavagem e 1,66 ml de metanol na presença de
8,3l de H2O2 . Após 15 minutos de incubação a reação foi interrompida pela
adição água destilada. A reação é visualizada pela presença de um precipitado marrom
sobre os wells mais reativos.
30
30
4- Resultados
4.1- Caracterização de anticorpos monoclonais e policlonais anti LHF-II.
Anticorpos policlonais anti LHF-II foram produzidos em coelhos e monoclonais em
camundongos BALb/c de acordo com as metodologias descritas por Chávez-Olortegui et al.,
1997 e Estevão-Costa et al., 2000, respectivamente. Ambos anticorpos foram testados,
previamente, quanto a sua capacidade de neutralizar a atividade hemorrágica do veneno total de L
muta muta (Chávez-Olortegui et al., 1997 e Estevão-Costa et al., 2000) e caracterizados em
ensaios de ELISA indireta .
A figura 5 mostra que os anticorpos policlonais anti LHF-II produzidos em coelho foram
capazes de reconhecer não só a metaloproteinase purificada quanto o veneno total de L. muta
muta. A reatividade do mAb B2D4 anti LHF-II frente ao veneno total de L.muta muta e a
metaloproteinase purificada é mostrada na figura 6. Após confirmação da capacidade
neutralizante os anticorpos foram utilizados como ligantes nas placas de seleção de fagos.
Figura 5- ELISA indireta para testar a reatividade dos anticorpos policlonais anti
veneno total de L.muta muta e LHF-II. A placa de ELISA foi sensibilizada com 0.5g/well de
veneno total e LHF-II e incubada com 2g/well de IgG policlonal anti LHF-II e IgG normal de
coelho como controle negativo.
31
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1:1
00
1:2
00
1:4
00
1:8
00
1:1
600
1:3
200
1:6
400
1:1
2800Diluições
Ab
s 4
92
nm
mAb B2D4
soro pré imune
soro anti V.T L.m.m
Figura 6- ELISA indireta para testar a reatividade do mAb B2D4. A placa de ELISA
foi sensibilizada com 1g/well de LHF-II e incubada com uma diluição inicial de 1:100 do mAb
B2D4, do soro anti veneno total e do soro pré imune de camundongo como controle negativo
4.2- Reatividade de fagos obtidos na bioseleção
Através da realização do teste de ELISA indireta, foi possibilitada a visualização, em
análise qualitativa, do aumento de afinidade do fago por seu ligante durante três ciclos de seleção
consecutivos, sendo que para que houvesse esta seleção a concentração do ligante sensibilizado
na placa de panning, no terceiro ciclo, é decrescida.
Nos gráficos abaixo estão representados, respectivamente, os resultados das ELISAs
realizadas para testar o panning cujo alvo de seleção foi a IgG policlonal anti LHF-II (fig 7) e o
panning usando IgG monoclonal (B2D4) anti LHF-II como alvo (fig 8).
32
0
0,8
1,6
2,4
3,2
4
Fagos
Silvestres
P1 P2 P3
Pannings
Ab
s 4
50 n
m
Fig 7– ELISA sanduíche para testar a reatividade dos fagos frente aos três ciclos de seleção.
A placa de ELISA foi sensibilizada com 10g/ml de IgG policlonal anti LHF-II e incubada com
1010
fagos que foram eluídos dos pannings 1,2 e 3 e fagos silvestres como controle negativo.
0
0,8
1,6
2,4
Fagos
Silvestres
P1 P2 P3
Pannings
Ab
s 4
50 n
m
Fig 8 – ELISA sanduíche para testar a reatividade dos fagos frente aos três ciclos de
seleção. A placa de ELISA foi sensibilizada com 5g/ml de mAb B2D4 e incubada com 1010
fagos que foram eluídos dos pannings 1,2 e 3 e fagos silvestres como controle negativo.
33
Como podemos observar nas figuras 7 e 8, a reatividade dos fagos, selecionados no
panning 3 (P3) é maior que com os fagos de P2 e ambos fagos maiores que P1, sugerindo que a
cada ciclo de seleção aumenta a reatividade dos fagos frente aos anticorpos anti LHF- II ligados
nas placas de ELISA.
4.3- Seleção de clones positivos através da técnica de ELISA
Com a finalidade de identificar os fagos positivos previamente individualizados , descritos
anteriormente, foi utilizado o teste de ELISA sanduíche. As placas de ELISA foram
sensibilizadas com anticorpos anti LHF-II (mono e policlonais). Como controles negativos foram
usados sobrenadantes de bactérias não infectadas e também placas de ELISA sensibilizadas com
outros anticorpos (irrelevantes).
Os clones positivos foram aqueles com absorbância (450 nm) igual ou superior a 1.0.
Como mostrado na figura 9, foram selecionados 51 clones (barras vermelhas) de 188 clones
testados. A Figura 10 mostra a reatividade cruzada destes 51 clones frente a anticorpos
policlonais (irrelevante) reativos com toxinas do veneno de Tityus serrulatus (TstFG50). Os
clones cuja reatividade com absorbância (450 nm) igual o superior a 0.3 nm. foram considerados
não específicos e descartados. Após esta seleção 33 clones foram específicos para anticorpos anti
LHF- II e finalmente selecionados para posterior identificação do peptídeo (epitopo) expresso.
34
A1 A2A3
A4
A5B1 B2 B3 C1 C2 C3 C5 C7 D2
D4
E1
E2
E6
E7
F1
F2 G1G2 G4
G5
G7 G11
H1
H2
H3H5 H6
H10
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
A1 A4 B1C1
C7
D4
E1 E7 F1G1
G4
G7
H1
H10
Clones
Ab
s 4
50n
m
Fig 9 - Testes de ELISA sanduíche para individualisar os clones positivos. Placas de
ELISA foram sensibilizadas com 1 g/ml de IgG de coelho policlonal anti-LHF-II e incubada
com 50 µl do sobrenadante de cultura de K91 contendo fagos previamente selecionados pelo
panning. Como controle negativo foram utilizados 50µl do sobrenadante de cultura de K91 não
infectada (barras em verde) e 50µl do sobrenadante de cultura de K91 infectada por fagos
silvestres (barras em amarelo) .
E5
D10
A5
A9 A10 A12 B11
C3 C8
D12
E2
E1 F10
F11
F12
G5H8
H10
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
A10D10 E1
F10H10
Clones
Ab
s 4
50
nm
35
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51
Clones
Ab
s 4
50 n
m
Fig 10- ELISA sanduíche para testar reatividade cruzada dos clones selecionados na ELISA
para screening. Placas de ELISA foram sensibilizadas com uma solução de 100 l/poço
contendo 1 g/ml de IgG de coelho policlonal anti TstFG50 e incubada com o sobrenadante dos
fagos reativos.
Outro screening foi realizado com o mesmo protocolo do screening anterior, com o
objetivo de individualizar os clones positivos selecionados pelo mAb B2D4 anti LHF-II .Os
clones positivos neste screening são aqueles com Do igual ou acima de 1.0 a 450 nm (barras
vermelhas), como mostrado na fig 11. Pelo fato de que nenhum clone apresentou reação cruzada
com a IgG monoclonal anti FVIII (irrelevante) como mostra a figura 13, selecionou-se então
apenas os clones com Do igual ou acima de 1.0 a 450nm como mostrado na fig 11, para serem
re-testados frente ao mAb B2D4 (fig 9) já que nosso objetivo era selecionar somente os clones
com alta afinidade pelo anticorpo.
Desta maneira, foram selecionados apenas os mais reativos (Do igual ou acima de 2.0 a
450nm) totalizando 40 clones selecionados para posterior identificação do peptídeo (epitopo)
expresso na superfície do fago.
CLONES REATIVOS
CLONES COM REAÇÃO
CRUZADA
36
FIG 11- Testes de ELISA sanduíche para individualisar os clones positivos. Placas de ELISA foram
sensibilizadas com 1 g/ml de mAb B2D4 anti-LHF-II e incubada com 50 µl do sobrenadante de cultura
de K91 contendo fagos previamente selecionados pelo panning. Como controle negativo foram utilizados
50µl do sobrenadante de cultura de K91 não infectada (barras em verde) e 50µl do sobrenadante de cultura
de K91 infectada por fagos silvestres (barras em amarelo) .
FIG 12 - Testes de ELISA sanduíche para re-testar os clones positivos. Placas de ELISA foram
sensibilizadas com 1 g/ml de mAb B2D4 anti LHF-II e incubada com 50 µl do sobrenadante de cultura
de K91 contendo fagos previamente selecionados pelo panning. Como controle negativo foi utilizado 50µl
do sobrenadante de cultura de K91 não infectada (barras em verde) e 50µl do sobrenadante de cultura de
K91 infectada por fagos silvestres (barras em amarelo) .
A1
A6
A7
A8
A11A12
B1
B2
B3 B5
B8
B9
B12
C4 C6
C7
C10
C12
D2D6
D5
D12
E1E3
E4
E5
E9
F2
F5
F8
F9G1
G4G6
G7
G9
H1
H4H8
H10
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
A1 A3 A5 A7 A9A11 B1 B3 B5 B7 B9
B11 C1
C3
C5
C7
C9
C11 D
1D3
D5
D7
D9
D11 E1 E3 E5 E7 E9
E11 F1 F3 F5 F7 F9F11 G
1G
3G
5G
7G
9G
11 H1
H3
H5
H7
H9
H11
Clones
Ab
s 4
92
nm
37
Fig 13- ELISA sanduíche para testar a reação cruzada dos clones reativos selecionados na
ELISA para screening. A placa foi sensibilizada com 1g/ml de mAb anti-Factor VIII
(irrelevante) e incubada com o sobrenadante dos fagos já considerados reativos.
4.4- Seqüênciamento do cDNA dos clones selecionados
O DNA dos clones positivos foram seqüenciados e tiveram sua seqüência de nucleotídeos
analisadas como descrito em material e métodos. Estas seqüências foram submetidas à tradução
no programa proteomics tools disponível em http://www.expasy.ch para a identificação da
estrutura primária ( número e seqüência de aminoácidos) dos peptídeos expressa na proteína do
fago. Nesta análise, foi obtido 33 seqüências diferentes. Foi observado que vários peptídeos
exibem a mesma estrutura mas nenhuma seqüência destes peptídeos apresentou similaridade com
outras seqüências já registradas em banco de dados, de acordo com a análise feita no programa
BLAST (dados não mostrados). A Fig. 14 mostra as seqüências dos peptídeos obtidos através da
seleção com mAb B2D4. E a Fig. 15 mostra as seqüências dos peptídeos obtidos através da
seleção com anticorpos policlonais anti-LHF-II
0
0,05
0,1
0,15
0,2
A1
A3
A5
A7
A9
A11 B
1B3
B5
B7
B9
B11 C
1C3
C5
C7
C9
C11 D
1D3
D5
D7
D9
D11 E
1E3
E5
E7
E9
E11 F1 F3 F5 F7 F9
F11 G1
G3
G5
G7
G9
G11 H
1H3
H5
H7
H9
H11Clones
Ab
s 4
50n
m
38
Figura 14 -Seqüências dos peptídeos selecionados pelo mAb B2D4
1- S C Q L E G S R L R S P
2- Q C K L E G S R L R C V
3- Q C A L E G A R I R C S
4- Q C T M D Q G R L R C R
5- G C I T E Q G R S R C I
6- S C K L E G S R L R C P
7- T C A T D Q G R L R C T
8- H C F H D Q G R V R C A
9- T C E M T Q G R L R C V
10- A C R S D Q G R A R C T
11- N C T L E G T R F R C S
12- R C K P D Q G R L R C G
13- S C M K D P S S P R C L
14- H C T M D Q G R L R C R
15- S C M L D Q G R S R C R
16- T C R Q T L T P A V C H
17- Q C Q E D Q G R R R C S
Observamos nesta figura que todos os peptídeos apresentas 12 aminóacidos
Figura 15 -Seqüências dos peptídeos selecionados pela IgG policlonal anti LHF-II
1- W H M E P S T L A C P Q L G P
2- H C L W N E Y Q G M C D
3- T C M W S E S L G S C A
4- C H E E W P P R C R A I Q E V
5- H C Y W D A V S A R C V
6- T C L W N D D L G W C M
7- Q T M D G T E L C I G C M R Q R M
8- H C A W S E S L S S C L
9- N C F W S S E V E Q C V
10- H C Y W D A V T A R C V
11- T C L W D E W T G S C L
12- H C T W D D S Q G V C M
13- K T S E F S E Y R T M V M R H
14- H C S W S D T L G T C L
15- H C E W S D S L G G C I
39
4.5- Imunoensaios com os peptídeos ligados às membranas para confirmação
das reatividade dos epitopos reconhecidos por anticorpos monoclonais e
policlonais neutralizantes anti LHF-II
Soros de coelhos e liquido ascitico de camundongo contendo anticorpos policlonais e
monoclonais respectivamente anti LHF-II foram então utilizados nas membrana de celulose
contendo os peptídeos sintéticos. A ligação dos anticorpos com os peptídeos foi detectada pela
adição de um segundo anticorpo (IgG anti coelho e anti mouse fosfatase, SIGMA), nas condições
descritas previamente em material e métodos.
4.6- Identificação de epitopos
Soro de coelho contendo IgGs policlonais anti LHF-II, diluído 1:200, reconheceu dois
peptídeos na membrana contento os peptídeos selecionados por Phage Display. (Fig 16). O
peptídeo 20 contém 12 resíduos de aminoácidos (H C L W N E Y Q G M C D ) e o peptídeo 32
contém 15 resíduos de aminoácidos (K T S E F S E Y R T M V M R H ) e ambos foram
selecionados pelo panning realizado com a IgG policlonal de coelho anti- LHF-II. A fig 17
mostra o padrão da ligação dada pelo anticorpo monoclonal anti LHF-II (B2D4), diluído 1:500,
frente à membrana de celulose contendo o grupo de peptídeos selecionados por Phage Display.
Treze peptídeos com seqüências aminoácidos comuns de foram reconhecidas pelo anticorpo
monoclonal. (Fig 18). Estes peptídeos foram selecionados pelo panning realizado com IgG
monoclonal anti- LHF-II (B2D4) .
Figura 16- Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana contento o grupo de
peptídeos selecionados por Phage Display, com o soro de coelho policlonal anti LHF-II. O soro foi
usado na diluição 1:200, as condições da reação foram feitas segundo o protocolo descrito em
material e métodos.
32
20
40
Figura 17- Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana contento o
grupo de peptídeos selecionados por Phage Display, com ascite de camundongo anti
LHF-II . O liquido ascítico foi usado na diluição 1:500.
Figura 18- Seqüência de aminoácidos dos 13 peptídeos imobilizados na
membrana que reagem com mAb B2D4.
4.7- Identificação de resíduos importantes através de Alanine Scanning
Os três peptídeos mais reativos, avaliados pelo programa Scion Image (dados não
mostrados), selecionados pelo método de Spot (Fig 19) foram novamente sintetizados em
membrana de nitrocelulose pela forma de substituição Ala Scan, para que a importância de todos
os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação com anticorpos específicos seja avaliada.
2- S C Q L E G S R L R C P
3- Q C K L E G S R L R C V
4- Q C A L E G A R I R C S
5- Q C T M D Q G R L R C R
6- G C I T E Q G R S R C I
7- S C K L E G S R L R C P
8- T C A T D Q G R L R C T
9- H C F H D Q G R V R C A
10-T C E M T Q G R L R C V
12-N C T L E G T R F R C S
15-H C T M D Q G R L R C R
16-S C M L D Q G R S R C R
18-Q C Q E D Q G R R R C S
4 5 6 7 8 9 10
2 3
15 16 18 12
41
4 – Q C A L E G A R I R C S
1 2 - N C T L E G T R F R C S
1 8 - Q C Q E D Q G R R R C S
Figura 19- Seqüência de aminoácidos dos peptídeos mais reativos selecionados pelo
método de Spot.
Tendo em vista que os três peptídeos mais reativos identificados pelo método de Spot
foram selecionados pelo bio-panning que tinha como alvo mAb B2D4, a membrana de Ala Scan
foi testada somente frente ao anticorpo monoclonal anti LHF-II na diluição 1 :500. Este anticorpo
reconheceu somente a seqüência de aminoácidos de um único peptídeo e várias substituições dos
aminoácidos deste mesmo peptídeo pela alanina (fig 20) determinando assim, quais são os
aminoácidos deste peptídeo que são importantes e influenciam na afinidade do peptídeo pelo
anticorpo monoclonal.
Figura 20- Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana de alanine
scanning de 3 peptídeos . Os números 4,12 e 18 correspondem às respectivas seqüências de
aminoácidos dos 3 peptídeos correspondentes sem modificações. O mAb B2D4 foi usado na
diluição 1:500.
Substituição dos aminoácidos do peptídeo 4 por alanina
Substituição dos aminoácidos do peptídeo 12 por alanina
Substituição dos aminoácidos do peptídeo 18 por alanina
4 12
18
42
A densidade da reação de cada spot do peptídeo 12 foi avaliada através do sistema Scion
Image. Baseando-se na diminuição da capacidade do peptídeo de se ligar ao anticorpo específico
em relação a seqüência peptídica sem modificação os aminoácidos considerados importantes são
a treonina, leucina, ácido glutâmico,glicina, arginina e fenilalanina (Figura 21). A porcentagem
de inibição e a posição de cada um desses aminoácidos está mostrado na tabela 3 e pode-se
concluir que as argininas presentes na seqüência de aminoácidos do peptídeo assim como a
fenilalanina são essenciais na ligação do peptídeo com o mAb B2D4.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% R
ea
tiv
ida
de
NC
TLE
GT
RF
RC
S
AC
TLE
GT
RF
RC
S
NA
TLE
GT
RF
RC
S
NC
ALE
GT
RF
RC
S
NC
TA
EG
TR
FR
CS
NC
TLA
GT
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S
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TLE
AT
RF
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S
NC
TLE
GA
RF
RC
S
NC
TLE
GT
AF
RC
S
NC
TLE
GT
RA
RC
S
NC
TLE
GT
RF
AC
S
NC
TLE
GT
RF
RA
S
NC
TLE
GT
RF
RC
A
Peptídeos
]
Figura 21- Análise mostrando a densidade da reação de cada spot do peptídeo 12
(N C T L E G T R F R C S ) em porcentagem, e de seus análogos de alanina.
43
Tabela 3- Porcentagem de inibição e a posição de cada aminoácido considerado
importante na afinidade do peptídeo pelo anticorpo.
AMINOÁCIDOS % DE INIBIÇÃO
THR3 63,6
LEU4 68,8
GLU5 55,8
GLY6 72,3
ARG8 90,9
PHE9 93,5
ARG10 97,4
Uma vez identificado o peptídeo mais reativo e a importância de cada aminoácido
presente em sua seqüência, a próxima etapa foi realizar a síntese química deste na forma solúvel
para sua utilização como imunógeno em ensaios de neutralização da atividade hemorrágica
causadas por acidentes ofídicos.
4.8- Síntese química
O peptídeo (N C T L E G T R F R C S ) foi sintetizado na forma solúvel como descrito em
material e métodos.
4.9- Reconhecimento do peptídeo bruto sintetizados pelo mAb B2D4
Após sua síntese, o peptídeo (N C T L E G T R F R C S ) foi avaliado quanto à sua
afinidade pelo mAb B2D4 anti LHF-II através de uma ensaio de ELISA indireta (Fig 23). Como
controle negativo foi utilizado um peptídeo irrelevante com diferente seqüência de aminoácidos.
44
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
5ug 2,5ug 1,25ug 0,625ug
Concentração por well
Ab
s 4
92n
m
peptideo bruto
peptideo
irrelevante
Figura 23-Reconhecimento do peptídeo sintetizado pelo mAb B2D4 anti LHF-II .A
placa foi sensibilizada com 5, 2.5, 1.25 e 0.625 g/well dos peptídeos. O conjugado
anticamundongo HRP foi usado na diluição 1:10000.
4.10- Purificação do peptídeo sintético
A amostra (o peptídeo bruto) foi solubilizada e submetida à cromatografia líquida
de alta pressão (HPLC- shimadzu) acoplada à coluna C18. Por sua vez, a coluna foi lavada com
solução A (TFA 0.1% em água) por 10 minutos. Os componentes presentes foram eluídos,
utilizando um gradiente que variou entre 0 e 50% de acetonitrila em 90 minutos (Fig 22). O perfil
de fracionamento apresentou inúmeros picos e todos foram analisados em ensaio de dot blot para
verificar se algum destes picos teria afinidade pelo mAb B2D4 anti LHF-II.
45
peptideo Paula 2 240105:1_UV3_214nm peptideo Paula 2 240105:1_Conc peptideo Paula 2 240105:1_Fractions peptideo Paula 2 240105:1_Logbook
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
%B
0
200
400
600
800
mAU
35.0 40.0 45.0 50.0 ml
C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 D15 D14 D13 D12 D11 D10 D9 D8 D7 D6 D5
34.76
35.34
35.52
36.55
36.84
37.24
37.87
38.30
40.17
40.35
40.78
42.00
43.29
43.85
44.47
45.45
46.98
Figura 22- Perfil de eluição do peptídeo sintético bruto em coluna de fase reversa C18 em
sistema de HPLC.
4.11 Dot Blot para identificação dos picos reativos
O anticorpo monoclonal B2D4 anti LHF-II utilizado para análise dos picos presentes no
perfil cromatográfico de fase reversa quanto à suas atividades biológicas reconheceu somente o
pico C12 como reativo. A figura 24 mostra um ensaio de Dot Blot onde o well correspondente ao
pico C12 apresenta um precipitado marrom, assim como os wells correspondentes aos controles
positivos contendo veneno total de L.muta muta (5µg) e peptídeo bruto (5µg), cada; O well
correspondente ao controle negativo (5µg de peptídeo irrelevante) não apresentou nenhuma
reatividade
46
Figura 24- Análise da reatividade dos picos presentes no perfil cromatográfico de
purificação em HPLC do peptídeo bruto , frente ao mAb B2D4 anti LHF-II na diluição de
1:500.
O pico C12, eluído em 28,2%, foi então submetido à uma recromatografia, utilizando um
gradiente que variou de 20 a 30% em 90 minutos. O perfil desta eluição está representado na
figura 25.
Figura 25- Perfil de eluição do pico C12 em coluna de fase reversa C18 em sistema de
HPLC
C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 D15 D14 D15
D12
v.t. L.m.m pept.bruto pept. irrelev
47
Após a realização da recromatografia, o maior pico foi submetido ao seqüênciamento, no
espectrômetro de massas, para que pudesse ser verificada a seqüência de aminoácidos
correspondente a esse pico.
Por ser um subproduto de síntese o resultado do sequênciamento foi considerado
inconclusivo devido à prováveis ramificações de cadeia, porém em um novo ensaio de Dot Blot o
maior pico da recromatografia manteve sua afinidade frente ao mAbB2D4 (dados não
mostrados).
47
5- Discussão
Um número considerável de serpentes da família Viperidae possuem toxinas que
aumentam a permeabilidade vascular ou causam danos ao endotélio vascular. Essas toxinas
são conhecidas como hemorraginas e muitas delas são zinco-metaloproteinases (Markland
et al., 1998). Um importante grupo de pesquisadores da Fundação Ezequiel Dias (FUNED)
de Belo Horizonte, dirigidos inicialmente pelo professor Carlos Ribeiro Diniz e Eládio
Flores Sánchez, vem trabalhando desde 1985 na purificação, caracterização estrutural e
funcional de enzimas do veneno de Lachesis muta muta. O genero Lachesis foi inicialmente
estudado para a caracterização de enzimas fibrinolíticas, mas as enzimas identificadas
foram também consideradas hemorrágicas ( Sanchez et al., 1991,1995,2003). Assim, entre
as metaloproteinases isoladas desse veneno temos a LHF-I (corresponde ao fator
hemorrágico LHF-I ou Lachesis Hemorrhagic factor I) que é uma glicoproteína de 100
kDa, com alta atividade hemorrágica ( Sanchez et al., 1987). A LHF II (corresponde ao
fator LHF-II), constituído por cadeia polipeptídica simples não glicosilada e massa
molecular de 22.5 kDa. A LHF-II apresenta elevado efeito proteolítico e apenas traços de
atividade hemorrágica ( Sanchez et al., 1991). A seqüência completa de aminoácidos da
LHF-II já foi determinada (200 resíduos), e a enzima apresenta alto grau de homologia com
metaloproteinases não hemorrágicas de venenos de serpentes, como por exemplo a
fibrolase (Ahmed et al., 1990; Loayza et al., 1994), isolada do veneno de Agkistrodon
controtrix contortrix e a Lachesis stenophrys fibronogenase (LSF), uma enzima
fibrinolítica de 24kDa pertencente à classe P-I das proteinases e isolada do veneno de
Lachesis stenophrys ( Leonardi et al., 1999). Recentemente foram isoladas e caracterizadas
duas isoformas da LHF-II denominadas mut IIa e mut IIb. As duas proteínas são
proteinases monoméricas não glicosiladas com massas moleculares similares de 23 kDa.
Ambas isoformas apresentaram alta similaridade em todas as propriedades enzimáticas
usando fibrinogênio, fibrina e dimetilcaseína como substratos (Sanchez et al.,2003). A
caracterização da especificidade destas enzimas já foi bem definida usando substratos
sintéticos e substratos de natureza protéica com a cadeia oxidada da insulina, fibrinogênio
humano e fibrina ( Sanchez et al.., 1995). A ação destas metaloenzimas sobre vários
componentes dos sistemas hemostático e fibrinolítico, assim como a inibição pela 2-
48
macroglobulina humana foram igualmente elucidadas.(Estevão- Costa et al., 2000; Souza et
al., 2001). As alterações patológicas induzidas pela LHF-II foram investigadas utilizando
técnicas de microscopia intravital (Rucavado et al., 1999).
LHF-II não é citotóxica a células endoteliais em cultura, como foi observado nas
metaloproteinases de B. asper BaH1(Lomonte et al., 1994; Borkow et al., 1995) e
BaP1(Rucavado et al., 1995). Nestes casos, a viabilidade celular não foi afetada mas o
desprendimento de células endoteliais de seus substratos foi observado. Assim, a atividade
hemorrágica dessas metaloproteinases não depende diretamente da citotoxicidade em
células endoteliais, mas sim na degradação proteolítica de componentes da membrana basal
( Moreira et al., 1994). Em relação à atividade hemorrágica de LHF-II pode-se considerar
portanto, que essa enzima possui apenas um pequeno papel na hemorragia local
característica de envenenamento por L.muta muta.
A pesar da LHF-II ter um efeito hemorrágico consideravelmente menor que a LHF
I, estudos relacionados com a caracterização imunológica demonstram que anticorpos
policlonais e monoclonais anti-LHF-II, não somente neutralizam a LHF-II como também
reconhecem e neutralizam a LHF I, além do veneno total de L.muta muta e de outras
espécies Bothrópicas com atividade hemorrágica ( Estevão- Costa et al., 2000).
A partir destes dados, consideramos que seria importante um estudo imunológico
mais detalhado da LHF-II, tendo como enfoque principal a identificação das regiões
imunogênicas desta enzima; para isso utilizamos a técnica de phage Display. Pelo fato de
que a maioria dos anticorpos reconhecem epitopos descontínuos (que não correspondem a
seqüência primária da proteína), foram isolados somente peptídeos que mimetizam
funcionalmente esses epitopos e essa seleção foi feita através do uso de bibliotecas
randômicas de fagos filamentosos que apresentam peptídeos em sua superfície. Tais
bibliotecas são ferramentas poderosas para a seleção de peptídeos que podem mimetizar
epitopos lineares, conformacionais e até de natureza não protéica. Utilizando a técnica de
phage display identificamos, então 32 peptídeos derivados da biblioteca de 12 resíduos de
aminoácidos (que incluem 2 cisteínas fixas, entre a seqüência formando pontes de sulfeto,
XCX8CX) ou da biblioteca de 15 resíduos de aminoácidos (X15). Sendo 17 destes 32
peptídeos, selecionados por anticorpos monoclonais anti LHF-II, denominado B2D4, e 15
selecionados por anticorpos policlonais de coelho anti LHF-II. Todas as seqüências de
49
aminoácidos dos 32 peptídeos selecionados foram submetidas ao programa de análise de
homologia Blast, onde nenhuma homologia ou similaridade com a seqüência primária de
aminoácidos de LHF-II ou outras toxinas foi encontrada. De acordo com Geysen et al.,
1986 epitopos selecionados não, necessariamente, se parecem com seus ligantes naturais,
mas preferencialmente mimetizam suas propriedades de ligação, por isso são denominados
mimotopos. Nossos resultados sugerem então, que os peptídeos selecionados por phage
display mimetizam epitopos descontínuos (conformacionais) reconhecidos pelo mAb B2D4
e por anticorpos policlonais anti LHF-II. Para confirmar a reatividade destes peptídeos
frente aos anticorpos específicos (monoclonais e policlonais) foram preparadas membranas
de celulose contento estas seqüências (construídos pelo método de Spot, Frank, et al.,
1992). A síntese múltipla de peptídeos em membrana representa uma alternativa e um
ensaio complementar para o mapeamento de epitopos ( Hohne et al., 1993; Ferrieres et al.,
1998; Liu et al., 1999) e tem sido freqüentemente utilizada para complementar a técnica de
phage display. Apenas 15 peptídeos, dos 32 sintetizados na membrana, confirmaram sua
atividade imunogênica. Treze dos 15 peptídeos confirmaram sua reatividade frente ao mAb
B2D4, não sendo reconhecidos pelo anticorpos policlonais anti LHF-II e 2 dos peptídeos
confirmaram sua reatividade frente anticorpos policlonais e não foram reconhecidos pelo
mAb B2D4. Os 13 peptídeos que foram reconhecidos pelo mAb B2D4 são peptídeos com
caráter considerado mais fortemente positivo (devido às cargas existentes nas argininas),
básico e também polar, possuindo todos um motivo consenso RXR (sendo X qualquer
aminoácido) e apenas 5 dos 13 peptídeos apresentam também um motivo consenso LEG.
Além disso , todos esses peptídeos são derivados da biblioteca de 12 resíduos de
aminoácidos (XCX8CX) sugerindo que a conformação obtida através da ponte dissulfeto é
essencial para o reconhecimento dos peptídeos pelo mAb B2D4. Os 2 peptídeos que foram
reconhecidos por anticorpos policlonais não possuem motivo consenso. Um deles
(H C L W N E Y Q G M C D ) é derivado também da biblioteca XCX8CX possuindo
então uma ponte dissulfeto e o outro (K T S E F S E Y R T M V M R H ) é derivado da
biblioteca X15, sendo portanto linear.
Após análise dos ensaios de Spot pelo programa Scion Image (dados não
mostrados), apenas os 3 peptídeos mais reativos foram novamente sintetizados em
membrana, utilizando-se desta vez as vantagens do método alanine scanning, no qual
50
peptídeos são sintetizados mudando cada aminoácido por alanina. Este método é
extensivamente utilizado para identificar os aminoácidos dos peptídeos que são essenciais
para a interação com anticorpos específicos. Neste ensaio, somente um peptídeo (
N C T L E G T R F R C S ) e alguns dos seus análogos de alanina foram reconhecidos pelo
mAb B2D4. Também através de análise feita pelo programa Scion Image foram
identificados os aminoácidos essenciais para que esse peptídeo reconhecido tenha afinidade
pelo anticorpo, são eles: Thr3, Leu4, Glu5, Gly6, Arg8, Phe9 e Arg10. Um fato interessante
é que os aminoácidos -as argininas- que mais afetam a interação do peptídeo com o
anticorpo, em análise quantitativa, são parte do motivo consenso RXR. Justificando
portanto a presença deste motivo em todos os peptídeos que interagem com mAb B2D4. A
glicina é um resíduo de aminoácido que também interfere bastante na afinidade do peptídeo
pelo anticorpo, mesmo sendo o aminoácido mais simples, possuindo somente um átomo de
hidrogênio em sua cadeia lateral. Este fato pode ser devido ao papel da glicina na
conformação estrutural do peptídeo, pois do ponto de vista estérico, a glicina pode
favorecer algum tipo de dobra, permitindo que o peptídeo tenha maior flexibilidade. Um
outro fato interessante é que a substituição de ambas as cisteínas pela alanina não afetou
significamente a reatividade do peptídeo frente ao mAb B2D4 sugerindo que a formação da
ponte dissulfeto, tornando o peptídeo conformacional, não é importante para a sua
reatividade.
Após a confirmação da afinidade deste peptídeo pelo mAb B2D4, e posterior
identificação dos aminoácidos deste peptídeo essenciais para esta afinidade, o próximo
passo foi sua síntese em forma solúvel. A síntese de peptídeos solúveis em fase sólida é
uma técnica poderosa de extensão da análise bioquímica. Uma das principais vantagens
deste método em fase sólida é que o produto desejado em cada etapa está preso a matriz
que podem ser rapidamente filtrados ou lavados, não sendo assim, necessário purificar
intermediários (Stryer 5°edição). Após sua síntese química, o peptídeo foi testado em um
ensaio de ELISA para verificar se há afinidade entre ele e o mAb B2D4. Afinidade
confirmada, o peptídeo foi então submetido a purificação em HPLC. Todos os picos
correspondentes ao perfil de purificação do peptídeo em HPLC foram então testados
separadamente, através do ensaio de Dot Blot, para a identificação do pico que possui
reatividade frente ao mAb B2D4. O pico C12 identificado como reativo foi
51
recromatografado e novamente submetido a um ensaio de dot blot. O maior pico da
recromatografia manteve sua afinidade pelo mAb B2D4, ,e o peptídeo existente neste pico
foi então submetido ao seqüênciamento de seus aminoácidos para verificação de sua real
estrutura primária. O seqüênciamento realizado no espectrômetro de massas não obteve por
enquanto, resultados conclusivos.
Considera-se portando, que a utilização da técnica de Phage Display em conjunto
com a técnica de Spot Synthesis, é uma ferramenta importante para identificar regiões
imunogênicas (mapeamento de epitopos) de proteínas com interesse biotecnológico sendo
também é bastante viável por ser eficiente e rápida no que diz respeito a mapeamento de
epitopos contínuos e descontínuos .
52
6- Conclusões
- A técnica de Phage Display foi realizada com sucesso, tendo em vista que os três ciclos
de Biopanning foram suficientes para selecionar fagos expressando peptídeos que
possuem alta afinidade pelo anticorpo anti LHF-II
- O uso da técnica ELISA para selecionar os clones positivos foi eficiente, já que um
grande número de fagos com alta reatividade frente a IgG policlonal anti LHF-II e ao
monoclonal B2D4 foram selecionados através desta técnica.
- A técnica de Spot Synthesis se mostrou rápida e eficiente para a confirmação das
atividades antigênicas dos peptídeos selecionados por Phage Display.
- Os epitopos selecionados por Phage Display e confirmados por Spot Synthesis não
correspondem a seqüência primaria de LHF-II sugerindo que os epitopos localizados
sejam descontínuos.
- A estratégia Fmoc de síntese química foi eficiente na construção do peptídeo
identificado como mimotopo da LHF-II
- O peptídeo selecionado e sintetizado foi apresentou reatividade com o anticorpo
monoclonal B2D4 .
53
7- Perspectivas
- Caracterização do peptídeo solúvel já sintetizado (N C T L E G T R F R C S ).
- Realização de ensaios de imunização com o peptídeo já sintetizado para produção de
anticorpos anti-peptídeo.
- Caracterização dos anticorpos anti-peptídeo
- Realização de ensaios de neutralização da atividade hemorrágica dos venenos de
Lachesis e Bothrops utilizando anticorpos anti-peptídeo.
- Síntese química de outros peptídeos selecionados por phage display e posterior
caracterização destes.
38
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