us20110318847.pdf

7/27/2019 US20110318847.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/us20110318847pdf 1/21

US

20110318847A1

( 1 9 ) United

S t a t e s

( 1 2 ) Patent

Application

Publication ( 1 0 )

P u b .

N o . : US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7 A 1

SUNDREHAGEN ( 4 3 )

P u b .

D a t e : Dec.

2 9 , 201

( 5 4 ) CVD SSAY ( 3 0 ) F o r e i g n A p p l i c a t i o n P r i o r i t y

D a t a

( 7 5 ) I n v e n t o r ; Erling SUNDREHAGEN’ slo Dec. 2 0 , 2002 (GB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0229747.1

(NO) P u b l i c a t i o n C l a s si ? c a t i o n

( 7 3 )

A s s i g n e e : A x i s - S h i e l d ASA, 0 5 1 0 ( N O )

( 5 1 )

I n t - C l

G 0 1 N 3 / 8 2 ( 2 0 0 6 . 0 1 )

( 2 1 )

A p p l .

N o . :

1 3 / 1 7 0 , 3 8 7

3 8 2 1 , 1 5 / 0 0 ( 2 0 1 1 0 1 )

( 5 2 )

US.

l .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.

436/501; 977/773; 9 77/ 9 20

( 2 2 )

F i l e d : J u n .

2 8 , 2 0 1 1 ( 5 7 ) ABSTRACT

. .

An

assay method

and k i t

f o r t h e

d e t e c t i o n

of o t e n t i a l f o r

Related U ' s ' Apphcatlon Data CVD r p r o p e n s i t y

t o

CVD

n

a human r non-human

animal

( 6 2 )

D i v i s i o n o f

a p p l i c a t i o n N o ,

1 0 / 5 3 9 , 7

7 , ? l e d o n D e c , s u b j e c t , s a i d method

o m p r i s i n g

a s s e ss i n g t h e c o n c e n t r a t i o n

1 9 , 2 0 0 5 , ? l e d

as

a p p l i c a t i o n

N o .

PCT/GB03/05607

on

Dec.

2 2 , 2 0 0 3 .

o f

c a l p r o t e c t i n i n

a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g

s a m p l e t a k e n

f r o m s a i d s u b j e c t .

7/27/2019 US20110318847.pdf


P a t e n t

A p p l i c a t i o n P u b l i c a t i o n D e c . 2 9 , 2011

S h e e t

1

0 f

7 US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7

A 1

[ L 9 1 . 1

Figure

l

7/27/2019 US20110318847.pdf


P a t e n t


S h e e t 2 0 f

7 US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7

A 1

1 +

1.

9 5% u n f i c i e m e e M i a m i ? f o r M1

. . . .

v

1

D i n - H a

Figure 2

7/27/2019 US20110318847.pdf


P a t e n t A p p l i c a t i o n P u b l i c a t i o n D e c . 2 9 , 2 0 1 1

S h e e t 3 0 f

7

US

2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7

A 1

y

Fi g u r e 3

7/27/2019 US20110318847.pdf


P a t e n t


S h e e t

4

0 f

7 US 2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7

A 1

.

5 5 : 3 .

_ § 5 % C u n ? d e n q a I n t e w a i f e r M 1

C B I i BIWI

D i ‘

Figure

:

7/27/2019 US20110318847.pdf


P a t e n t

A p p l i c a t i o n

P u b l i c a t i o n

a l p r o t e c t i ng / L

D e c . 2 9 ,

2 0 1 1

S h e e t 5 0 f 7

US

011/0318847

A 1

. O F J Q Q Q : ~ * : - * - * — ‘ ~ — *

o w i s o v o o o w o v o o

‘ l l l l l

C o n i r o l s

Figure

5

7/27/2019 US20110318847.pdf


P a t e n t A p p l i c a t i o n P u b l i c a t i o n D e c . 2 9 , 2 0 1 1

S h e e t 6 0 f

7

US

2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7

A 1

100

80

60

F ' 5 I I I Iii : I

~ al r

- hs RP

. _ F ~ ' - - '

4O , i f , z

_ j ?

_

a? 1 :

2D i s .

S e n s i t i v i t y

O

I I

I l

I

I I I

l

I I

I

I

l

I

0 28 4D 60 8O _ 1 D D

1 O D ~ S p e c I ? c i t y

Figure

6

7/27/2019 US20110318847.pdf


US

011/0318847

A 1

( J a i p r

hs CRP

D e c .

2 9 , 2011

S h e e t

7 0 f 7

a t e n t

A p p l i c a t i o n

P u b l i c a t i o n

1000

O

1 ( J O - S p e c i ? c i t y

Figure ' 7

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

CVD ASSAY

[ 0 0 0 1 ] The r e s e n t i n v e n t i o n r e l a t e s t o an s s a y

method

o r

d e t e c t i n g p o t e n t i a l f o r

o r

p r o p e n s i t y

o c a r d i o v a s c u l a r

d i s e a s e

(cvD) i n a

s u b j e c t ,

e .

g .

a

human r

non-human

a n i m a l , e s p e

c i a l l y a mammal, and

n

p a r t i c u l a r t o a n a s s a y

method

Which

may e used o d e t e c t a p o t e n t i a l f o r CVD r a

p r o p e n s i t y

t o

CVD e f o r e t h e o n s e t o f CVD symptoms n o t i c e a b l e by

t h e

s u b j e c t .

[ 0 0 0 2 ]

CVD s

a

major

s o u r c e

of l l

h e a l t h

among

t h e

human o p u l a t i o n . I n 1 9 9 a p p r o x i m a t e l y 40% f l l d e a t h s i n

t h e Western

World Was

a

r e s u l t

of

CVD i . e . 1 i n

e v e r y

2 . 5

d e a t h s ) .

F o r 2 0 0 2 ,

i t

i s

e s t i m a t e d t h a t , i n t h e USA,

o v e r

one

m i l l i o n

people

W i l l s u f f e r from a n e W o r r e c u r r e n t

coronary

a t t a c k , a n d

more

h a n 40% f t h e p e o p l e

s u f f e r i n g

f r o m t h e s e

a t t a c k s W i l l d i e . Many

o f

t h e s e

p e o p l e

W i l l

d i e

s u d d e n l y

W i t h o u t

e v e r

h a v i n g been

o s p i t a l i s ed o r t r e a t e d . M an y i l l

n o t

have

e a l i s e d

t h a t

t h e y

Were

s u s c e p t i b l e

t o

CV D .

[ 0 0 0 3] E a r l y o r

p r e - e m p t i v e

t r e a t m e n t

s u c h

a s a

change

o f

d i e t ,

r e d u c t i o n o r c e s s a t i o n o f s m o k i n g , i n c r e a s e i n e x e r c i s e ,

r e d u c t i o n

o f

b o d y W e i g h t ,

e t c . ,

h a s , h o W e v e r , a

h i g h

s u c c e s s

r a t e

o f p r e v e n t i n g CVD r r e d u c i n g

t h e

p r o p e n s i t y

t o C V D .

Thus i f

CVD r p o t e n t i a l f o r o r

p r o p e n s i t y

t o

CVD can be

d e t e c t e d , e f f ec t i v e t r e a t m e n t i s a v a i l a b l e .

[ 0 0 0 4 ] There

s

a c c o r d i n g l y a

need

o r methods Which can

be

u s e d

to d e t e c t

CVD

and

e s p e c i a l l y , t h e

p o t e n t i a l f o r o r

p r o p e n s i t y

o CVD, e f o r e t h e

d i s e a s e

h a s

p r o g r e s s e d

b e y o n d

t h e s t a g e

W h e r e

t r e a t m e n t (eg

c h a n g e

o f l i f e s t y l e a n d / o r

h a b i t )

i s

r o u t i n e l y s u c c e s s f u l . I n

a r t i c u l a r ,

t h e r e i s a n e e d

f o r

methods

Which can

be

used

o d e t e c t CVD t

t h e

e a r l y s t a g e s

When

h e symptoms a r e not apparent

o

a s u b j e c t o r

t o

a t h i r d

p a r t y ,

eg

p h y s i c i a n ,

i . e .

m e t h o d s f o r

t e s t i n g “symptom

f r e e ” s u b j e c t s a r e r e q u i r e d .

[ 0 0 0 5 ]

Such

methods may

b e u s e d t o

s c r e e n

t h e

g e n e r a l

p o p u l a t i o n ( i . e .

i n mass s c r e e n i n g ) o r a t - r i s k g r o u p s

W i t h i n

t h e p o p u l a t i o n , e . g . m a l e s o v e r 4 0 , W o r k e r s i n h i g h s t r e s s j o b s ,

i n d i v i d u a l s W i t h u n h e a l t h y d i e t s , i n d i v i d u a l s s u f f e r i n g f r o m

c l i n i c a l o b e s i t y , s m o k e r s , e t c . I n c a s e s Where

p o t e n t i a l

f o r

CVD r p r o p e n s i t y to CVD

s

d i a g n o s e d ,

p r e - e m p t i v e

t r e a t

ment may

e

g i v e n a n d /

r t h e p a t i e n t

may

e

e n c o u r a g e d to

make a d j u s t m e n t s t o l i f e s t y l e a n d h a b i t .

[ 0 0 0 6 ]

L i k e W i s e ,

W h e r e

p o t e n t i a l f o r CVD r p r o p e n s i t y

t o

CVD

s

d e t e c t e d ,

a

p a t i e n t

may be s u b m i t t e d to

f u r t h e r

t e s t

i n g , eg s i n g more x p e n s i v e

o r

t i m e c o n s u m i n g t e c h n i q u e s ,

s u c h

s ECG,

i t h

a n d

W i t h o u t p h y s i c a l a c t i v i t y , r a d i o i s o t o p e

i m a g i n g o f

y o c a r d i a l

p e r f u s i o n , X - r a y e . g . C T )

y o c a r d i a l

a n g i o g r a p h y ,

MR

m y o c a r d i a l

a n g i o g r a p h y

o r

p e r f u s i o n

i m a g i n g ,

e t c .

T h u s b y c o n ? r m i n g

t h e p o s s i b l e

p r e s e n c e

o f ,

o r

p o t e n t i a l

f o r ,

o r p r o p e n s i t y t o , CVD y u s i n g t h e

c h e a p

a n d

f a c i l e

a s s a y method f

t h e

i n v e n t i o n

i n an n i t i a l

s c r e e n

( e g

i n a mass

s c r e e n

o f “symptom-free”

h e a l t h y

s u b j e c t s ) t h e

l i k e l i h o o d

o f

d e t e c t i n g o r i d e n t i f y i n g u n d i s c o v e r e d

CV D ,

o r

p o t e n t i a l

f o r

CVD,

b e f o r e

h e a l t h damage

e c o m e s i r r e v e r s

i b l e i s i n c r e a s e d

W h i l s t ,

a t t h e same i m e , u n n e c e s s a r y u s e of

e x p e n s i v e a n d t i m e - c o n s u m i n g t e s t s i s l i m i t e d .

[ 0 0 0 7 ]

By “ C V D ”

i s meant

a n y

c o n d i t i o n

o f t h e h e a r t ,

a r t e r i e s ,

o r

v e i n s

Which d i s r u p t s

t h e s u p p l y o f oxygen to

l i f e - s u s t a i n i n g

a r e a s

o f t h e body

s u c h

a s t h e

b r a i n ,

t h e

h e a r t

e t c . Examples

f CVDs r e a r t e r i o s c l e r o s i s , a c u t e m y o c a r d i a l

i n f a r c t i o n ,

a n g i n a p e c t o r i s , i s c h e m i c h e a r t d i s e a s e , c e r e

b r o v a s c u l a r d i s e a s e ,

s t r o k e , s u b a r a c h n o i d

h a e m o r r h a g e ,

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

i n t r a - c e r e b r a l

h a e m o r r h a g e ,

c e r e b r a l i n f a r c t i o n ,

c o n g e s t i v e

h e a r t f a i l u r e , a n g i n a , h e a r t a t t a c k , c a r d i a c a r r e s t a n d a r r h y t h

m i a .

[ 0 0 0 8 ]

The

p r e s e n t i n v e n t i o n i s b a s e d on t h e

s u r p r i s i n g

? n d i n g

t h a t

t h e p r o t e i n

c a l p r o t e c t i n

i s

a u s e f u l

“ m a r k e r ”

o r

“ i n d i c a t o r ” o f o t e n t i a l f o r

CVD

r p r o p e n s i t y t o

CVD

e f o r e

t h e

o n s e t o f CVD y m p t o m s ( i . e .

i n s y m p t o m - f r e e s u b j e c t s ) .

I n p a r t i c u l a r i t h a s

b e e n

s u r p r i s i n g l y f o u n d

t h a t

a b n o r m a l l y

h i g h


l e v e l s i n v a r i o u s b o d y ? u i d s

i s

i n d i c a t i v e o f

s u s c e p t i b i l i t y

to CVD e f o r e

t h e

o n s e t

o f

CVD ymptoms s

a p p a r e n t t o a s u b j e c t

o r

t o a t h i r d p a r t y ( e g a p h y s i c i a n ) .

[ 0 0 0 9 ] F o r t h e

a v o i d a n c e

o f d o u b t , t h e t e r m


i s

u s e d h e r e i n

synonymously W i t h “ L I

p r o t e i n ” ,

“MRP / 1 4 " , °

c y s t i c

? b r o s i s ( a s s o c i a t e d )

a n t i g e n

( C F A ) ”

n d “ c a l g r a n u l i n ” .

[ 0 0 1 0 ] C a i p r o t e c t i n e x i s t s i n b o t h d i m e r i c a n d t r i m e r i c

f o r m s .

As a d i m e r ,

c a l p r o t e c t i n c o m p r i s e s

t h e p o l y p e p t i d e

c h a i n s S100A8 and S100A9. A s a t r i m e r , c a l p r o t e c t i n

i s

a 36

kDa e t e r o t r i m e r i c

p r o t e i n

W i t h t W o h e a v y

( 1 4

kD) a n d o n e

l i g h t

c h a i n

( 8

k D ) n o n - c o v a l e n t l y

l i n k e d .

[ 0 0 1 1 ] C a i p r o t e c t i n

s

a

c a l c i u m

b i n d i n g

p r o t e i n

a n d

When

bound

to

c a l c i u m , c a l p r o t e c t i n i s r e s i s t a n t

to h e a t

and

to

p r o t e o l y s i s . T h i s may a l l o W f o r a Wide r a n g e

o f

a s s a y

t e c h

n i q u e s a n d c o n d i t i o n s t o b e e m p l o y e d .

[ 0 0 1 2 ]

E p i t o p e

m a p p i n g o f


s h o W s

t h a t

a n t i

b o d i e s W i t h

s p e c i ? c i t y

f o r t h e

c o m p l e x

a n d / o r t s s i n g l e p r o

t e i n c h a i n s may e p r o d u c e d . At

e a s t

f o u r s e p a r a t e immuno

g e n i c

s i t e s

h a v e been shoWn t o e x i s t

on t h e


c o m p l e x . Some

a n t i b o d i e s r e c o g n i s e

e i t h e r

t h e

h e a v y o r

t h e

l i g h t

c h a i n ,

W h i l s t o t h e r s

r e c o g n i s e

b o t h .

[ 0 0 1 3 ] C a l p r o t e c t i n

s

f o u n d i n e l l s , t i s s u e s

a n d ? u i d s

i n a l l

p a r t s o f

t h e

human o d y a n d i s

d e r i v e d

p r e d o m i n a n t l y

f r o m

n e u t r o p h i l s a n d m o n o c y t e s .

C a l p r o t e c t i n

i s p r o b a b l y

p r e s e n t

i n a l l

i n d i v i d u a l s s i n c e amongst

more h a n 5 , 0 0 0

i n d i v i d u a l s

t e s t e d ,

no

c a l p r o t e c t i n f r e e

i n d i v i d u a l

Was f o u n d . C a i p r o t e c

t i n

i s

a l s o

f o u n d

i n

r a t s ,

m i c e ,

r a b b i t s ,

s h e e p ,

c a t t l e

a n d

i g s .

I t i s

t h e r e f o r e

a n a b u n d a n t

u b i q u i t o u s m o l e c u l e .

[ 0 0 1 4 ] I n

v i v o , c a l p r o t e c t i n

i s

i n v o l v e d

i n numerous b i o

l o g i c a l

f u n c t i o n s i n c l u d i n g

i n t r a c e l l u l a r

s i g n a l

t r a n s d u c t i o n ,

n e u t r o p h i l a c t i v a t i o n , i n h i b i t i o n o f i n t r a c e l l u l a r e n Z y m e s

i n v o l v e d i n c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n t i m i c r o b i a l

a c t i v i t y

a n d i n

n e u t r o p h i l

d e f e n c e . C a l p r o t e c t i n

i s

a l s o a

r e g u l a t o r y p r o t e i n

i n

in?ammatory r e a c t i o n s and

i n

t h i s r o l e may f u n c t i o n t o

s t i m u l a t e i m m u n o g l o b u l i n

p r o d u c t i o n , c h e m o t a c t i c

f a c t o r

a c t i v i t y

a n d n e u t r o p h i l

i m m o b i l i s i n g f a c t o r .

[ 0 0 1 5 ] W h i l s t b o d y ? u i d s p r o b a b l y a l W a y s

c o m p r i s e

c a l p r o t e c t i n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f

a l p r o t e c t i n

i n v a r i o u s b o d y

? u i d s h a s

b e e n

f o u n d t o

c h a n g e , f o r e x a m p l e ,

t o

i n c r e a s e ,

i n

a

number f

i s e a s e c o n d i t i o n s

( e .

g . i n ? a m m a t o r y ,

i n f e c t i o u s

and

m a l i g n a n t d i s e a s e s ) .

Thus

measurement o f t h e c o n c e n

t r a t i o n

o f


i n

b o d y

? u i d

f r o m

p a t i e n t s s u f f e r i n g

f r o m

s u c h d i s e a s e c o n d i t i o n s ( i . e . i n

i n d i v i d u a l s

s h o W i n g

symptoms n o t i c e a b l e t o

t h e

s u b j e c t a n d / o r t o

a

t h i r d p a r t y )

a n d

c o m p a r i n g

t h e c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d

t o

t h a t i n body ? u i d

f r o m ,

f o r e x a m p l e , a h e a l t h y

( i . e .

a non

d i s e a s e d ) s u b j e c t

may e

used

s

a means

o f

d i a g n o s i n g

s u c h

d i s e a s e s .

[ 0 0 1 6 ] F o r e x a m p l e ,

W h i l s t t h e

symptoms o f a c t e r i a l a n d

v i r a l i n f e c t i o n s

a r e

v e r y s i m i l a r and

d i a g n o s i s

from t h e i r

symptoms

l o n e may

e i ? i c u l t , t h e c o n c e n t r a t i o n o f a l p r o

t e c t i n

i n t h e p l a s m a /

serum

o f t h e

i n f e c t e d s u b j e c t

i n c r e a s e s

a p p r o x i m a t e l y

1

to 2 t i m e s W i t h v i r a l i n f e c t i o n s b u t a r o u n d

t o 1 8 t i m e s

W i t h

b a c t e r i a l i n f e c t i o n s . T h u s t h e s u b j e c t

h a v i n g

n o t i c e d t h e symptoms

o f

i n f e c t i o n ,

c a n h a v e

t h e c o n c e n t r a

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

t i o n

o f


t h e i r body ? u i d m e a s u r e d

a n d

t h e i r

i n f e c t i o n d i a g n o s e d a n d t r e a t e d a c c o r d i n g l y .

[ 0 0 1 7 ] O t h e r

d i s e a s e s

i n Which a l p r o t e c t i n may e

u s e d

a s

a d i a g n o s t i c t e s t i n c l u d e :

r h e u m a t i c

d i s e a s e s (eg

h e u m a t o i d

a r t h r i t i s ,

j u v e n i l e

r h e u m a t o i d

r t h r i t i s ,

s y s t e m i c

l u p u s e r y t h e

m a t o s u s ) , S j o g r e n s s y n d r o m e ,

i n t r a o c u l a r

i n ? a m m a t o r y

c o n

d i t i o n s ,

c y s t i c ? b r o s i s , a c u t e a n d c h r o n i c l u n g d i s e a s e ,

l u n g

c a r c i n o m a

( s q u a m o u s

c e l l s ) , p u l m o n a r y

c a n c e r s ,

c o l o r e c t a l

c a n c e r , i n ? a m m a t o r y b o W e l

d i s e a s e ,

g a s t r i c c a n c e r , c o l o r e c

t a l

adenoma o r c a n c e r ,

C r o h n ’ s d i s e a s e ,

u l c e r a t i v e

c o l i t i s ,

g a s t r o i n t e s t i n a l m u c o s a l i n ? a m m a t i o n ,

u r i n a r y

s t o n e s , a l c o

h o l i c

l i v e r d i s e a s e ,

o r a l

i n ? a m m a t o r y m u c o s a l d i s e a s e , C NS


d i s e a s e (eg m u l t i p l e s c l e r o s i s a n d a c u t e

e n c e p h a l i t i s ) , HIV

n f e c t i o n , s e c o n d a r y CNS

i n f e c t i o n s i n

HIV n f e c t e d p a t i e n t s ,

u r i n a r y

t r a c t

i n f e c t i o n s ,

c y s t i t i s , p y e l o

n e p h r i t i s , e n d o g e n o u s p o s t e r i o r u v e i t i s , h a e m a t o l o g i c a l c o n

d i t i o n s

( e . g . l e u k a e m i a ) , f e b r i l e c o n d i t i o n s

( i n f e c t i o u s

a n d

n o n - i n f e c t i o u s ) ,

a c u t e

m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n a n d a p h e r e s i s .

[ 0 0 1 8 ] T h e

p l a s m a

c o n c e n t r a t i o n o f


h a s a l s o

b e e n

f o u n d

t o

i n c r e a s e d u r i n g

open

e a r t s u r g e r y

( S e m b , A .

G . e t

a l ,

E u r . J . C a r d i o - t h o r a c S u r g . ( 1 9 9 1 ) 5 1 3 6 3 - 3 6 7 ,

S a a t v e d t , K . e t a l . ,

S c a n d ,

J . T h o r . C a r d i o v a s c .

S u r g .

( 1 9 9 6 )

3 0 :

5 3 - 6 0 , M o e n , O . e t a l . ,

P e r f u s i o n

( 1 9 9 4 ) 9 : 1 0 9 - 1 1 7 ) .

More p e c i ? c a l l y , S a a t v e d t

e t

a l .

r e p o r t t h a t c a l p r o t e c t i n

c o n

c e n t r a t i o n

i s e s

a f t e r t h e

s t a r t

o f c a r d i o p u l m o n a r y b y p a s s a n d

p e a k s 4 8

h o u r s p o s t - o p e r a t i v e l y .

[ 0 0 1 9 ] I t

h a s noW u r p r i s i n g l y b e e n f o u n d h a t t h e p o t e n t i a l

f o r

CVD

r

p r o p e n s i t y t o CVD n

a

s u b j e c t can

be

s s e s s e d

by

d e t e r m i n i n g t h e

c o n c e n t r a t i o n

o f


i n a c a l p r o t e c

t i n - c o n t a i n i n g s a m p l e

t a k e n

f r o m s a i d

s u b j e c t .

I n

o t h e r

W o r d s , i t h a s been o u n d t h a t d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o n c e n t r a

t i o n

o f

a l p r o t e c t i n i n

a c a l p r o t ec t i n - c o n t a i n i n g

s a m p l e t a k e n

from a s u b j e c t

c a n

be used t o

p r e d i c t , p r i o r

t o t h e o n s e t

o f

symptoms

Which

a r e

n o t i c e a b l e

t o

t h e

s u b j e c t o r t o a

t h i r d

p a r t y

(eg

p h y s i c i a n ) W h e t h e r o r

hoW

i k e l y t h e

s u b j e c t

i s to

s u f f e r CV D .

[ 0 0 2 0 ] By

“ p o t e n t i a l f o r ”

o r

“ p r o p e n s i t y

t o ” i s m e a n t t h e

l i k e l i h o o d o r p r o b a b i l i t y

h a t

t h e c u r r e n t l y

s y m p t o m - f r e e s u b

j e c t b e i n g

t e s t e d W i l l s u f f e r CVD n

t h e

f u t u r e . T h i s m i g h t

t a k e

t h e

form f

a n i n d e x , r a t i o , p e r c e n t a g e o r s i m i l a r number

r e ? e c t i v e

o f

t h e

r e l a t i v e

r i s k o f

CVD n

t h e

f u t u r e ( e .

g .

i n

t h e

f o l l o W i n g 1 - 2

y e a r s ,

a t

l e a s t i n

t h e f o l l o W i n g 6 m o n t h s ) .

[ 0 0 2 1 ] Thus i e W e d from

n e

a s p e c t t h e i n v e n t i o n

p r o v i d e s

an

a s s a y method

f o r

t h e d e t e c t i o n of

o t e n t i a l f o r

CVD r

p r o p e n s i t y t o CVD n a

human

r

non-human n i m a l

s u b j e c t ,

s a i d

m e t h o d c o m p r i s i n g a s s e s s i n g t h e


o f


a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g s a m p l e t a k e n

f r o m

s a i d s u b j e c t ,

eg

a

s a m p l e

o f

b l o o d , p l a s m a , s e r u m ,

c e r e

b r o s p i n a l

? u i d ,

o r a l ? u i d , u r i n e , f a e c e s , s y n o v i a l o r empyema

? u i d .

[ 0 0 2 2 ]

By

“ a s s e d s i n g ”

i t

i s

meant

t h a t

a

q u a n t i t a t i v e o r

s e m i - q u a n t i t a t i v e v a l u e f o r t h e


o f


i s d e t e r m i n ed . T h i s may e t h e v a l u e f o r t h e C o n c e n t r a t i o n o f

t h e sample s

t e s t e d ,

e .

g . a f t e r t r e a t m e n t t o

remove h e c e l l s o r

o t h e r s a m p l e

c o m p o n e n t s

n o t b e i n g a s s a y e d f o r , o r t o c o n

c e n t r a t e

o r

d i l u t e

t h e sample o r t o

t r a n s f e r

t h e


t o

a s e p a r a t e

medium,

. g . s o l i d s u b s t r a t e.

[ 0 0 2 3 ]

A l t e r n a t i v e l y ,

t h e a s s e s s m e n t may s i m p l y b e q u a l i

t a t i v e , i . e .

t o

i n d i c a t e W h e t h e r t h e c a l p r o t e c ti n i s above o r

beloW

one

o r

more r e - s e l e c t e d

t h r e s h o l d v a l u e s ,

eg

a l u e s

i n d i c a t i v e

o f a b s en c e o f

p o t e n t i a l f o r

CVD

r

p r o p e n s i t y to

CVD s

d e t e c t a b l e by h e a s s a y .

The

r e c i s e v a l u e s f o r t h e s e

t h r e s h o l d v a l u e s o r

o t h e r

r e f e r e n c e v a l u e s

f o r


may

depend on

h e

n a t u r e

o f t h e s a m p l e ,

t h e a g e , W e i g h t , s e x

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

and s p e c i e s o f a s u b j e c t and may be

d e t e r m i n e d

i n a r o u t i n e

manner b y m e a s u r i n g

t h e

c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n

o f

t h e

r e l e v a n t

body

? u i d o f

e q u i v a l e n t

s u b j e c t s W i t h o u t CVD r

W i t h

CVD

t

v a r i o u s

s t a g e s o f

d e v e l o p m e n t .

[ 0 0 2 4 ]

A

a l u e

i n d i c a t i v e

o f



determined o r “ a s s e s s e d ” i n accordance With t h e method of

t h e

i n v e n t i o n

may be an b s o l u t e


o f c a l p r o t e c

t i n o r may a l t e r n a t i v e l y b e a n

i n d e x ,

r a t i o , p e r c e n t a g e o r

s i m i l a r number e ? e c t i v e o f h e


o f a l p r o t e c t i n .

[ 0 0 2 5 ]

A

o d y s a m p l e u s e d i n

t h e a s s a y method

o f

t h e

i n v e n t i o n may e

a n y c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g

s a m p l e , eg

body

? u i d o r t i s s u e s a m p l e ,

o r

a s u s p e n s i o n e t c .

P r e f e r a b l y ,

t h e s a m p l e i l l b e a b o d y u i d , e . g .

u r i n e , c e r e b r o s p i n a l

? u i d ,

o r a l ? u i d ,

s y n o v i a l

? u i d o r empyema ? u i d , o r more p r e f e r

a b l y , blood o r a blood e r i v e d s a m p l e .

When h i s

i s t h e c a s e

( i . e .

When

b l o o d

o r a

b l o o d d e r i v e d

s a m p l e

i s

u s e d ) , t h e

s a m p l e

u s e d

f o r

a n a l y s i s

W i l l

p r e f e r a b l y b e c e l l - f r e e

( e . g .

serum

o r p l a s m a ) . A l t e r n a t i v e l y f a e c e s may be s e d .

[ 0 0 2 6 ]

The

a m p l e

may

e t r e at e d p r i o r o b e i n g u s e d n t h e

a s s a y

method

o f

t h e

i n v e n t i o n .

Thus

t h e

s a m p l e

may

b e

t r e a t e d t o remove any c e l l s a n d / o r any s ample components

n o t

b e i n g a s s a y e d

f o r . The

s a m p l e may a l s o b e t r e a t e d

t o

c o n c e n t r a t e o r d i l u t e t h e

sample

r t o

t r a n s f e r

t h e c a l p r o t e c t i n

t o a s e p a r a t e medium, e . g . s o l i d

s u b s t r a t e . F o r example

t h e

s a m p l e

may

e d i l u t e d by a d d i n g

a b u f f e r

o r o t h e r

a q u e o u s

medium. A l t e r n a t i v e l y , a s a m p l e , p a r t i c u l a r l y a p l a s m a o r

s e r u m

s a m p l e ,

may e u s e d d i r e c t l y .

[ 0 0 2 7 ]

The s a m p l e i s

o p t i o n a l l y t r e a t e d W i t h c a l c i u m o r a

c a l c i u m m i m i c

( e . g . i o n s

o f

a n o t h e r a l k a l i n e e a r t h m e t a l ) ,

p r i o r t o

b e i n g u s e d

i n t h e

a s s a y method f

t h e i n v e n t i o n .

The

c a l c i u m

o r

c a l c i u m

mimic may be

a n y

form Which r o v i d e s

C a 2 +

i o n s ( e . g . C a C l 2 ) I f c a l c i u m i s u s e d

t h e n

p r e f e r a b l y

s u f ? c i e n t

calcium r calcium mimic

s

added

o

t h e sample o

s a t u r a t e t h e c a l c i u m

b i n d i n g

s i t e s o f

c a l p r o t e c t i n .

F o r

example,

a

t e n molar

x c e s s

of

calcium s o u r c e

may e d d e d ,

more r e f e r a b l y , a ?ve molar

e x c e s s

o r

e s p e c i a l l y

p r e f e r a b l y

a three molar excess.

[ 0 0 2 8 ]

While

s s a y s

f o r c a l p r o t e c t i n a r e knoWn

and

may

e

u s e d i n t h e

method

f t h e i n v e n t i o n , t h e r e

h a s n o t p r e v i o u s l y

been

any s u g g e s t i o n t h a t c a l p r o t e c t i n i s a

marker

r i n d i c a t o r

o f


CVD

r p r o p e n s i t y t o C V D . I n o t h e r W o r d s ,

t h e r e h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n a n y s u g g e s t i o n t h a t

t h e c a l p r o

t e c t i n c o n c e n t r a t i o n

o f s y m p t o m - f r e e s u b j e c t s m i g h t

b e

u s e d

a s a

marker

r

i n d i c a t o r of

o t e n t i a l f o r o r

p r o p e n s i t y t o CVD

a n d ,

i n p a r t i c u l a r , t h e r e h a s n o t b e e n a n y s u g g e s t i o n t h a t

c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n might

be

used

a s

t h e

marker

o r

i n d i c a t o r i n an a s s a y method s u i t a b l e f o r mass s c r e e n i n g of

h e a l t h y ( i . e .

s y m p t o m - f r e e )

s u b j e c t s .

[ 0 0 2 9 ]

Any knoWn a s s a y

method

o r

c a l p r o t e c t i n may

b e

u s e d i n t h e a s s a y method f t h e

i n v e n t i o n .

T h u s ,

f o r

e x a m p l e ,

t h e

method

i s c l o s e d i n

Us.

a t .

N o . 4 , 8 3 3 , 0 7 4 ( F a g e r h o l

e t

a l . )

f o r t h e

i s o l a t i o n o f

c a l p r o t e c t i n a n d f o r t h e

s u b s e q u e n t

p r o d u c t i o n o f m o n o s p e c i ? c a n t i - s e r a t h e r e t o may

e

u s e d

t o

produce a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s f o r u s e i n any conven

t i o n a l

a s s a y

m e t h o d .

The a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d i e s

p r o

d u c e d

may b e u s e d , f o r i n s t a n c e , i n enZyme

l i n k e d - a n d

r a d i o - i m m u n o a s s a y s .

[ 0 0 3 0 ] A

N y c o C a r d ® ( A x i s - S h i e l d

P o C ,

O s l o , N o r W a y )

i m m u n o a s s a y

f o r m a t f o r c a l p r o t e c t i n

may l s o , f o r

e x a m p l e ,

be u s e d . T h i s a s s a y

u s e s

a s o l i d p h a s e ,

sandwich-format

i n

Which t h e t e s t

d e v i c e

c o m p r i s e s a membrane c o a t e d W i t h

i m m o b i l i s e d a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s . T h u s t h e s a m p l e

( o p t i o n a l l y d i l u t e d )

i s

a p p l i e d t o t h e d e v i c e a n d

When t h e

s a m p l e

? o W s

t h r o u g h h e

m e m b r a n e , a n y

c a l p r o t e c t i n p r e s e n t

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

i s c a p t u r e d .

The

a l p r o t e c t i n , i m m o b i l i s e d on h e

membrane

i s

t h e n t r e a t e d

W i t h

a

g o l d - a n t i b o d y c o n j u g a t e Which i n d s to

t h e

c a l p r o t e c t i n - a n t i b o d y

c o m p l e x a n d t h e i n t e n s i t y o f

c o l o u r

( d u e

t o

t h e

g o l d

b e a d s ) ,

a s d e t e r m i n e d

by

a b s o r b a n c e o f r e d

l i g h t ,

i s

p r o p o r t i o n a l

to

t h e

amount

o f


The

c o n

c e n t r a t i o n of a l p r o t e c t i n can t h e r e f o r e be c a l c u l a t e d from a

c a l i b r a t i o n c u r v e

prepared

n

t h e c o n v e n t i o n a l

manner.

[ 0 0 3 1 ] A l t e r n a t i v e l y , t h e c o m m e r c i a l t e s t ( C a l p r e s t ® ) f o r

c a l p r o t e c t i n ,

f o r e x a m p l e ,

i n f a e c e s

( a v a i l a b l e

f r o m

E u r o s p i

t a l ® ) may

b e

u s e d .

T h i s a s s a y

u s e s a p o l y c l o n a l

a n t i b o d y

a g a i n s t


i n a n

enZyme

l i n k e d i m m u n o - s o r b e n t

a s s a y s y s t e m . T h u s c a l p r o t e c t i n

p r e s e n t i n

a s a m p l e

t a k e n

from s u b j e c t becomes bound o a n t i b o d y ,

Which

s a d s o r b e d

to t h e s u r f a c e o f a p l a s t i c W e l l .

A

u b s t r a t e f o r t h e enZyme s

t h e n a d d e d a n d

t h e i n t e n s i t y o f h e

c o l o u r e d p r o d u c t p r o d u c e d

i s

p r o p o r t i o n a l t o

t h e

amount f

enZyme

and

h e r e f o r e

t o

t h e

amount f

a l p r o t e c t i n .

The o n c e n t r a t i o n o f a l p r o t e c t i n c a n

t h e r e f o r e be

c a l c u l a t e d

from a

c a l i b r a t i o n

c u r v e p r e p a r e d

i n

t h e conventional manner.

[ 0 0 3 2 ] I n d e e d ,

b o t h

m o n o -

a n d p o l y c l o n a l

a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d i e s

a r e a v a i l a b l e

c o m m e r c i a l l y .

Egg

a n d

r a b b i t p o l y

c l o n a l s a r e ,

f o r e x a m p l e ,

a v a i l a b l e f r o m NorWegian n t i b o d

i e s A S

a n d

A x i s - S h i e l d

D i a g n o s t i c s

r e s p e c t i v e l y , W h i l s t

mouse monoclonal n t i b o d y

may e

o b t a i n e d from Dako

/

,

D e n m a r k . Any


a n t i b o d y o b t a i n e d , f o r

e x a m p l e ,

b y a n y c o n v e n t i o n a l

t e c h n i q u e f o r

m a k i n g a n t i b o d

i e s ,

may e

u s e d

i n t h e

method

f t h e i n v e n t i o n . F o r

i n s t a n c e ,

r a b b i t a n t i c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y

a s

W e l l

a s monoclonal a n t i

b o d i e s c a n

b e p r o d u c e d

a c c o r d i n g o t h e p r o t o c o l

d e s c r i b e d i n

H a r l o W a n d L a n e

( 1 9 8 8 ) , A n t i b o d i e s , A a b o r a t o r y M an u a l ,

C o l d

S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,

N e W

o r k ,

N Y.

[ 0 0 3 3 ]

A l t e r n a t i v e l y , a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s may

b e

p r e p a r e d b y r e g u l a r l y i n j e c t i n g a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g

s o l u t i o n i n t o c h i c k e n s , a n d

t h e n

c o l l e c t i n g t h e

y o l k s o f

t h e

c h i c k e n ’ s e g g s. C h i c k e n e g g p o l y c l o n a l

a n t i b o d y c a n t h e n

b e

i s o l a t e d

a c c o r d i n g

o

c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s a n d p u r i ? e d b y

a ? i n i t y

c h r o m a t o g r a p h y .

[ 0 0 3 4 ]

P r e f e r a b l y , t h e a s s a y

method

f h e

i n v e n t i o n s u s e d

f o r

m a s s s c r e e n i n g o f h e a l t h y ( e . g . CVD

y m p t o m - f r e e ) s u b

j e c t s .

Where

p o t e n t i a l

f o r CVD r p r o p e n s i t y t o CVD

s

d e t e c t e d ,

t h e s u b j e c t may e s u b j e c t e d t o f u r t h e r t e s t i n g (eg

u s i n g m o r e

e x p e n s i v e

t e c h n i q u e s s p e c i ? c o CVD)

o

con?rm

t h e

presence o r

absence

of

CVD.

[ 0 0 3 5 ]

I n

g e n e r a l ,

b e s i d e s

t h e s a mp l e u n d e r e v a l u a t i o n ,

c a l i b r a t i o n s a m p l e s W i t h knoWn a l p r o t e c t i n c o n t e n t W i l l a l s o

b e a s s e s s e d i n

t h e

p e r f o r m a n c e o f

t h e

a s s a y

m e t h o d .

Such

d e t e r m i n a t i o n s

can

be used t o

p l o t a c a l i b r a t i o n curve

from

W h i c h t h e c a l p r o t e c t i n c o n t e n t o f t h e s a m p l e u n d e r i n v e s t i g a

t i o n

may

e d e t e r m i n e d . The a t u r e o f

h e

c a l i b r a t i o n s a m p l e s

and

s e l e c t i o n o f c o n v e r s i o n

o r

a d j u s t m e n t f a c t o r s u s e d i n t h e

d e t e r m i n a t i o n

o f

t h e c a l p r o t e c t i n

may

v a r y d e p e n d i n g ,

f o r

e x a m p l e , on h e

manner

n Which h e


i s

d e t e c t e d

i n

t h e a s s a y t ec h n i q u e

a c t u a l l y

u s e d

a n d

on t h e r

a s p e c t s o f

t h e

method Which

f f e c t t h e a s s a y r e s u l t , f o r e x a m p l e , b u f f e r

c o m p o s i t i o n , a s sa y

c o n d i t i o n s e t c .

[ 0 0 3 6 ]

T y p i c a l l y c a l i b r a t i o n

s a m p l e s h a v i n g


c o n t e n t s o f

0

t o 5000 mg/ i l l be s e d . The e f e r e n c e

r a n g e

W i t h i n Which t h e v a l u e f o r c a l p r o t e c t i n


W i l l

g e n e r a l l y b e

f o u n d

i s 0 . 1 t o 1 0

m g / L .

[ 0 0 3 7 ] I n

g e n e r a l , t h e c o n c e n t r a t i o n o f


i n t h e

serum and

plasma

of humans W i t h

l i t t l e

o r no p o t e n t i a l f o r

CVD r

p r o p e n s i t y

t o CVD i l l be i n t h e

r a n g e 0 . 0 1 - 0 . 7 5

m g / L . More

p e c i ? c a l l y , t h e


o f a l p r o t e c t i n i n

t h e serum

and plasma o f s u c h

humans

W i l l

b e i n t h e

r a n g e

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

0 . 0 5 - 0 . 7 0 m g / L ,

e v e n more

s p e c i ? c a l l y 0 . 1 0 - 0 . 6 6 m g / L , f o r

i n s t a n c e ,

i n t h e

r a n g e 0 . 1 5 - 0 . 4 5

m g / L . F o r

e x a m p l e ,

t h e c o n

c e n t r a t i o n of a l p r o t e c t i n i n t h e serum r plasma of female

With

i t t l e

o r

no o t e n t i al f o r

CVD r p r o p e n s i t y

t o

CVD

i l l

b e

i n t h e

r a n g e

0 . 0 9 - 0 . 5 3

m g / L ,

f o r

e x a m p l e , a b o u t

0 . 3 1

mg/L

o r

0 . 3 0 mg/

. The

o n c e n t r a t i o n

o f c a l p r o t e c t i n

i n t h e

serum

o r

plasma

of a male With i t t l e o r no p o t e n t i a l f o r CVD r

p r o p e n s i t y

t o

CVD

i l l

b e i n

t h e

r a n g e 0 . 1 2 - 0 . 6 6 m g / L ,

f o r

e x a m p l e , 0 . 3 0 - 0 . 3 9 m g / L , e s p e c i a l l y

0 . 3 1

m g / L .

[ 0 0 3 8 ] A a l p r o t e c t i n , c o n c e n t r a t i o n i n serum r p l a s m a o f

g r e a t e r t h a n 0 . 7 5 mg/L i l l


v e r y s t r o n g l y i n d i c a

t i v e o f p o t e n t i a l f o r CVD r p r o p e n s i t y

t o C V D .

Thus

a

t h r e s h o l d

v a l u e above Which t h e a s s a y may

be

h e l d

t o be

p r e d i c t i v e o f

CVD o t e n t i a l o r p r o p e n s i t y

t o

CVD ay e n

e r a l l y b e n t h e

r a n g e

0 . 3 2 - 0 . 7 7

mg/ , f o r e x a m p l e , a b o u t 0 . 6 7

m g / L , p r e f e r a b l y

a b o u t

0 . 7 0 m g / L , e s p e c i a l l y

a b o u t

0 . 7 6

m g / L . More

r e f e r a b l y

t h e t h r e s h o l d v a l u e a b o v e W h i c h

t h e

a s s a y may be e l d t o be r e d i c t i v e o f

o t e n t i a l

f o r o r propen

s i t y

t o CVD s i n t h e r a n g e , 0 . 3 0 - 0 . 5 0 mg/L, even more

p r e f e r a b l y

i n

t h e

r a n g e

0 . 3 2 - 0 . 4 7

m g / L ,

f o r

e x a m p l e a b o u t

0 . 4 5

m g / L .

[ 0 0 3 9 ] I n g e n e r a l , t h e


o f c a l p r o t e c t i n i n t h e

f a e c e s

of humans

With

i t t l e o r no o t e n t i a l f o r CVD r

p r o

p e n s i t y t o

CVD

i l l

b e i n

t h e

r a n g e 0 . 0 1 - 1 0 m g / L . More

s p e c i ? c a l l y , t h e c o n c e n t r a t i o n

o f

a l p r o t e c t i n i n t h e f a e c e s

o f

such

humans W i l l be i n t h e

r a n g e 0 . 0 5 - 9 . 0

mg/L, even more

s p e c i ? c a l l y 0 . 5 0 - 8 . 0 m g / L .

[ 0 0 4 0 ]

A

a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n i n f a e c e s o f

g r e a t e r

t h a n 1 0 mg/ i l l g e n e r a l l y

b e s t r o n g l y n d i c a t i v e o f o t e n t i a l

f o r CVD r

p r o p e n s i t y

t o

CVD.

hus

a t h r e sh o l d v a l u e above

Which

h e

a s s a y

may

e

h e l d t o

b e

p r e d i c t i v e

o f CVD o t e n t i a l

o r

p r o p e n s i t y

t o

CVD

ay e n e r a l l y b e

a b o u t

9

mg/

,

more

p r e f e r a b l y a b o u t 1 0 . 5 m g / L , e s p e c i a l l y a b o u t

1 1

m g / L .

[ 0 0 4 1 ]

H o W e v e r ,

t h e t h r e s h o l d v a l u e s a r e b e t t e r c a l c u l a t e d

from a l p r o t e c t i n

d e t e r m i n a t i o n s u s i n g

t h e

same a s s a y t e c h

n i q u e s

f o r t h e same body ? u i d s a m p l e

t y p e

f r o m a

r a n g e

o f

p a t i e n t s

o f

s i m i l a r t y p e ( a g e , s e x , W e i g h t , s p e c i e s

e t c . )

f r o m

h e a l t h y

t h r o u g h e a r l y s t a g e

CVD o

s e r i o u s

C V D . Even more

p r e f e r a b l y , t h e t h r e s h o l d v a l u e s W i l l b e v a l u e s

d e t e r m i n e d

f o r

t h e s a m e p a t i e n t a t a n a r l i e r , h e a l t h y s t a g e . T h u s , p a r t i c u l a r l y

a t - r i s k ,

i n d i v i d u a l s c o u l d

m o n i t o r t h e i r


l e v e l s

on

a r o u t i n e

b a s i s ( e . g .

e v e r y 6-months

o 1

y e a r )

i n

mass s c r e e n

i n g p r o g r a m m e s .

[ 0 0 4 2] I n a p r e f e r r e d

a s s a y

method

f

h e p r e s e n t

i n v e n t i o n ,

s a i d m e t h o d f u r t h e r

c o m p r i s e s

a d d i t i o n a l l y a s s e s s i n g t h e c o n

c e n t r a t i o n o f a n o t h e r

marker f o r p o t e n t i a l t o

CVD n

t h e

s a m p l e

t a k e n

f r o m t h e

s u b j e c t .

E x a m p l e s o f u i t a b l e m a r k e r s

may e h o m o c y s t e i n e , a c t i v a t e d f a c t o r X I I ,

c h o l e s t e r o l ,

c h o

l e s t e r o l z H D L a t i o , ? b r i n o g e n ,

t i s s u e - t y p e p l a s m i n o g e n

a c t i

v a t o r ,

F a c t o r s V ,

V I I a n d

I I I , l i p o p r o t e i n

( a ) ,

von

i l l e b r a n d

f a c t o r a n t i g e n , p l a s m i n - 0 t 2 a n t i p l a s m i n c o m p l e x , p r o t h r o m

b i n , f r a g m e n t 1 + 2 , t h r o m b i n - a n t i t h r o m b i n

I I I

c o m p l e x ,

? b r i n o p e p t i d e A , ? b r i n d e g r a d a t i o n

p r o d u c t s ,

D - d i m e r ,

a c t i

v a t e d p r o t e i n

C - r e s i s t a n c e , f a c t o r V I I c

a n d V I I a , t h r o m b i n ,

serum

a m y l o i d

A ,

v a s c u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e s

and o r o n a r y

c a l c i u m . P r e f er a b l y

t h e s e c o n d m a r k e r

i s

s e l e c t e d from

h o m o c y s t e i n e

o r

C - r e a c t i v e

p r o t e i n .

[ 0 0 4 3 ] More p r e f e r a b l y t h e a s s a y method

o f

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

f u r t h e r c o m p r i s e s

a d d i t i o n a l l y

a s s e s s i n g

t h e c o n

c e n t r a t i o n

o f C - r e a c t i v e p r o t e i n ( C R P ) i n t h e s a m p l e

t a k e n

f r o m t h e s u b j e c t . P r e f e r a b l y , t h e c o n c e n t r a t i o n

o f

C RP

i s

a s s e s s e d s i m u l t a n e o u s l y o r s e q u e n t i a l l y t o s a i d c a l p r o t e c t i n

a s s a y .

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

[ 0 0 4 4 ] The

measurement f

CRP

ay

e

e f f e c t e d

u s i n g

a n y

s t a n d a r d

i m m u n o a s s a y

t e c h n i q u e

( e . g . E L I S A ,

RIA t c . ) o r

may b e

d e t e r m i n e d

b y

NycoCard® ( a v a i l a b l e f r o m

A x i s

S h i e l d

P o C , O s l o ,

N o r w a y ) .

[ 0 0 4 5 ]

A



i n

serum

r

p l a s m a

o f

g r e a t e r t h a n 0 . 7 5

mg/L

n a d d i t i o n

t o

a

CRP


o f

g r e a t e r t h a n 1 . 7 5 mg/L i l l


v e r y s t r o n g l y i n d i c a

t i v e o f p o t e n t i a l f o r CVD r p r o p e n s i t y t o C V D .


t h e

p r e s e n c e of

h e above-mentioned o n c e n t r a t i o n s i s more

s t r o n g l y

i n d i c a t i v e

o f


CVD r p r o p e n s i t y to

CVD h a n a c a l p r o t e c t i n o r

CRP

o n c e n t r a t i o n a l o n e .

[ 0 0 4 6 ]

T h u s t h r e s h o l d v a l u e s

o f

c a l p r o t e c t i n a n d C RP

a b o v e which h e

a s s a y

may

e

h e l d

t o b e h i g h l y

p r e d i c t i v e o f

CVD

o t e n t i a l o r

p r o p e n s i t y

to

CVD

ay e n e r a l l y b e

0 . 3 2

0 . 7 7

mg/L

n d

. 7 0 mg/L

e s p e c t i v e l y , more r e f e r a b l y a b o u t

0 . 6 7 mg/L

a n d 1 . 7 5

mg/L e s p e c t i v e l y ,

s t i l l

more

r e f e r a b l y

a b o u t

0 . 7 0 mg/L

n d

2 . 0 0 mg/L

e s p e c t i v e l y , e s p e c i a l l y a b o u t

0 . 7 6 mg/L

a n d

2 . 2 5 mg/L

e s p e c t i v e l y .

More r e f e r a b l y

t h e

t h r e s h o l d v a l u e s

above

which t h e

a s s a y

may be h e l d t o be

p r e d i c t i v e

o f

p o t e n t i a l f o r o r p r o p e n s i t y

t o

CVD

r e i n t h e

r a n g e ,

0 . 3 0 - 0 . 5 0 mg/L and

. 7 5

mg/L

e s p e c t i v e l y ,

e v e n more

p r e f e r a b l y i n

t h e

r a n g e 0 . 3 2 - 0 . 4 7 mg/L n d 0 . 7 5 mg/L e s p e c

t i v e l y ,

f o r

e x a m p l e a b o u t 0 . 4 5 mg/L a n d 0 . 7 5 mg/L e s p e c

t i v e l y .

[ 0 0 4 7 ] Viewed

from a

f u r t h e r a s p e c t ,

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n

p r o v i d e s an a s s a y k i t

f o r

u s e i n t h e method

f

t h e i n v e n t i o n ,

s a i d k i t

c o m p r i s i n g

r e a g e n t s a n d i n s t r u c t i o n s f o r t h e p e r f o r

mance o f t h e a s s a y

method

and f o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e

r e s u l t s a n d ,

o p t i o n a l l y ,

c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g

r e f e r e n c e

s a m p l e s ,

a n d

o p t i o n a l l y ,

a d e t e c t o r .

P r e f e r a b l y , s a i d

a s s a y k i t

f u r t h e r c o m p r i s e s t h e

r e a g e n t s

a n d i n s t r u c t i o n s f o r d e t e r m i

n a t i o n

o f

CRP

o n c e n t r a t i o n .

[ 0 0 4 8 ]

The

n s t r u c t i o n s

i n t h e k i t may

o r

e x a m p l e

b e

i n t h e

form

of

l a b e l , a

manual

o r an i n s t r u c t i o n l e a ? e t ; however,

t h e y may

n s t e a d t a k e t h e form

of

computer program o r a

d a t a

c a r r i e r , eg

computer

i s k .

[ 0 0 4 9 ] The e t e c t o r ; w h e r e p r e s e n t ,

w i l l

g e n e r a l l y b e o n e

c a p a b l e o f

d e t e c t i n g a r e p o r t e r

s p e c i e s , eg s p e c t r o m e t e r ,

a

n u c l e a r

r a d i a t i o n

d e t e c t o r , a

s c a t t e r e d

l i g h t d e t e c t o r , e t c .

[ 0 0 5 0 ] The e a g e n t s w i l l b e

a g e n t s

s u i t a b l e f o r c a l p r o t e c t i n

d e t e r m i n a t i o n ,

e . g .

s u i t a b l e r e a g e n t s a r e s p e c i ? e d i n t h e l i t

e r a t u r e a s s o c i a t e d

w i t h t h e a v a i l a b l e t e s t s f o r c a l p r o t e c t i n

s u c h s f r o m E u r o s p i t a l ® a n d NycoCard a v a i l a b l e

f r o m A x i s

S h i e l d ASA,

O s l o ,

Norway) c i t e d h e r e i n . The

e a g e n t s

men

t i o n e d

i n

US.

a t .

No.

4 , 8 3 3 , 0 7 4

may

a l s o be s u i t a b l e .

[ 0 0 5 1 ] A a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d a s s a y m e t h o d o r a s s e s s i n g

t h e


o f


t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n i s

a

p a r t i c l e - b a s e d i m m u n o a s s a y . T h i s i s a

s e n s i t i v e

t e c h n i q u e

which

s b a s e d on u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f t h e c a l p r o

t e c t i n

c o n c e n t r a t i o n .

T h e s e n s i t i v i t y p r o v i d e d b y

t h e

a s s a y

a d v a n t a g e o u s l y a l l o w s

f o r

t h e

r e l a t i v e l y

l o w

c o n c e n t r a t i o n s

o f a l p r o t e c t i n i n b o d y ? u i d e . g . p l a s m a o r s e r u m ) s a m p l e s o

be

e t e r m i n e d w i t h

a

h i g h l e v e l o f

r e c i s i o n . At h e same

i m e ,

r e l a t i v e l y

h i g h

c o n c e n t r a t i o n s o f


c a n a l s o b e

measured

i t h a c c u r a c y .

[ 0 0 5 2 ] T u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n a l s o h a s

t h e

a d v a n t a g e

t h a t n o

s o l i d

s u r f a c e i s

r e q u i r e d

f o r

p h y s i c a l

s e p a r a t i o n i n t h e

a s s a y and numerous

washing

a n d / o r s e p a r a t i o n s t e p s

a r e

n o t

r e q u i r e d .

T h u s c o m p a r e d

o p r i o r

a r t

t e c h n i q u e s

e .

g . E L I S A ) ,

t h e h o m o g e n o u s t u r b i d m i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f c a l p r o t e c

t i n i s q u i c k

a n d e a s y

t o

p e r f o r m a n d

m a y ,

f o r i n s t a n c e , b e

a u t o m a t e d . Compared

o

a u t o m a t i o n o f n o n - h o m o g e n e o u s

t e c h n i q u e s i n v o l v i n g , f o r

e x a m p l e

a s o l i d s u r f a c e , a u t o m a t i o n

o f

a t u r b i d i m e t r i c

b a s e d

a s s a y

i s r e l a t i v e l y

f a c i l e . A l s o , t h e

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

r e s u l t i n g

a u t o m a t e d

homogenous r o c e s s i s

o f t e n

more e l i

a b l e b e i n g l e s s p r o n e ,

f o r

e x a m p l e , t o b r e a k d o w n .

[ 0 0 5 3 ]

A n

u t o m a t e d t u r b i d i m e t r i c a s s a y s

a l s o

f a s t , a l l o w

i n g f o r a h i g h t h r o u g h p u t o f

s a m p l e s ,

a n d s r e l a t i v e l y c h e a p

t o r u n .

T y p i c a l l y i t c a n

be p e r f o r m e d

u s i n g a c o m m e r c i a l l y

a v a i l a b l e r o b o t ,

eg h e Cobas

Mira o r H i t a c h i 7 1 1 , b o t h o f

which a r e a v a i l a b l e from Roche D i a g n o s t i c s . Such an a u t o

m a t e d a s s a y

i s p a r t i c u l a r l y

a t t r a c t i v e

when

o u t i n e

t e s t i n g o f

i n d i v i d u a l s f o r p o t e n t i a l f o r o r p r o p e n s it y to

CVD s e n v i s

a g e d .

[ 0 0 5 4 ]

F o r

t u r b i d i m e t r i c

d e t e r m i n a t i o n o f

a l p r o t e c t i n c o n

c e n t r a t i o n ,

t h e c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g

s a m p l e w i l l g e n e r a l l y

b e

a body ? u i d , e .

g . u r i n e , c e r e b r o s p i n a l

? u i d ,

o r a l

? u i d ,

s y n o v i a l

?uid

r empyema

u i d , o r more

r e f e r a b l y ,

blood

r

a

b l o o d d e r i v e d s a m p l e . W he n h i s

i s

t h e c a s e ,

t h e

s a m p l e u s e d

f o r

a n a l y s i s

w i l l

p r e f e r a b l y b e c e l l - f r e e ( e . g . s e r u m o r p l a s m a )

[ 0 0 5 5 ]

Thus t h e sample may be

r e a t e d

to

remove

any e l l s

a n d / o r a n y s a m p l e c o m p o n e n t s n o t b e i n g

a s s a y e d

f o r . T h e

s a m p l e

may

l s o

be

r e a t e d

to

c o n c e n t r a t e o r

d i l u t e

t h e

sample

o r

t o

t r a n s f e r

t h e c a l p r o t e c t i n t o a s e p a r a t e

medium,

. g . s o l i d

s u b s t r a t e .

F o r i n s t a n c e , t h e s a m p l e may e d i l u t e d

b y a d d i n g

w a t e r ,

a

b u f f e r o r o t h e r , aqueous medium. A l t e r n a t i v e l y ,

a

s a m p l e , p a r t i c u l a r l y

a

serum r plasma s a m p l e , may e u s e d

d i r e c t l y .

[ 0 0 5 6 ]

The s a m p l e i s

o p t i o n a l l y t r e a t e d

w i t h

c a l c i u m o r a

c a l c i u m m i m i c , p r i o r

o

b e i n g u s e d i n t h e

a s s a y met

o l d .

The

c a l c i u m

o r

c a l c i u m

mimic may be

a n y

form which r o v i d e s

C a 2 + i o n s ( e . g . C a C l Z ) . I f c a l c i u m

i s

u s e d

t h e n

p r e f e r a b l y ,

s u f ? c i e n t calcium r calcium mimic

s

added

o

t h e

sample

o

s a t u r a t e

t h e

c a l c i u m

b i n d i n g

s i t e s o f

c a l p r o t e c t i n . F o r

example,

a

t e n molar x c e s s of

calcium

s o u r c e may e d d e d ,

more r e f e r a b l y , a ?ve

molar

e x c e s s

o r

e sp e c i al l y p r e f e r a b l y

a three molar excess.

[ 0 0 5 7 ] O p a c i t y ,

f o r



o f c a l p r o

t e c t i n c o n c e n t r a t i o n , w i l l

g e n e r a l l y

b e

g e n e r a t e d

b y

c o n t a c t

i n g

t h e c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g s a m p l e ,

d r

a n a l i q u o t

t h e r e o f ,

w i t h a n a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y ,

a n t i b o d y f r a g m e n t o r

mix

t u r e of

n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s

(e g

a

m i x t u r e of mono

c l o n a l a n t i b o d i e s ) .

T h e

e g g

p o l y c l o n a l

a n t i - h u m a n c a l p r o t e c

t i n

a n t i b o d y

c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e f r o m N o r w e g i a n

A n t i b o d i e s A S

a y , f o r e x a m p l e , b e u s e d

o

g e n e r a t e o p a c i t y .

Any

n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d y o b t a i n e d , f o r e x a m p l e , b y

a n y

c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e o r

m a k i n g

n t i b o d i e s , may e u s e d

n

t h e method f t h e i n v e n t i o n .

[ 0 0 5 8 ]

The a n t i b o d i e s ,

o r a n t i b o d y f r a g m e n t s , which a r e

used o r t u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f c a l p r o t e c t i n

concen

t r a t i o n

p r e f e r a b l y show

no o r l i t t l e c r o s s

r e a c t i o n s with t h e r

b l o o d

p r o t e i n s t h a t may e p r e s e n t i n t h e e l u a t e . The

u a n t i t y

o f

a n t i b o d y , o r a n t i b o d y f r a g m e n t,

u s e d s h o u l d o f

c o u r s e

b e

o p t i m i s e d

a g a i n s t c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g s t a n d a r d s a m p l e s

a s

o p a c i ? c a t i o n

a r i s e s

f r o m t h e

hook

f f e c t w h e r e b y

m u l t i p l e


b i n d i n g

g e n e r a t e s

t h e o p a c i ? c a t i o n c e n t r e s .

C a l p r o t e c t i n , a s

mentioned

above h a s numerous a n t i b o d y

b i n d i n g

s i t e s ,

a n d

s p a r t i c u l a r l y s u i t a b l e f o r d e t e c t i o n

i n

s u c h

an assay.

[ 0 0 5 9 ]

I n

o n e p r e f e r r e d e m b o d i m e n t , t h e a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y , o r a n t i b o d y f r a g m e n t, may

e

i m m o b i l i s e d

b y

b i n d

i n g o r c o u p l i n g , e i t h er d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y , t o a n y w e l l

known

s o l i d

s u p p o r t

o r

m a t r i x

which

s commonly s e d

f o r

i m m o b i l i s a t i o n . P r e f e r a b l y t h e s o l i d

s u p p o r t

o r

m a t r i x

t a k e s

t h e f o r m o f a r t i c l e s ,

p r e f e r a b l y n a n o p a r t i c l e s .

C o n v e n i e n t l y

t h e

s o l i d

s u p p o r t may e made o f g l a s s , s i l i c a , l a t e x , m e t a l

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

( e . g . g o l d )

o r

a

p o l y m e r i c

m a t e r i a l

(eg

o l y e t h y l e n e ) . P r e f

e r a b l y t h e s o l i d s u p p o r t i s

made

f a p o l y m e r i c m a t e r i a l

s u c h

a s p o l y e t h y l e n e .

[ 0 0 6 0 ]

B i n d i n g

o r

i m m o b i l i s a t i o n o f

t h e a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y

o r

a n t i b o d y

f r a g m e n t

may

b e

a c h i e v e d u s i n g

a n y

c o n v e n t i o n a l

t e c h n i q u e .

F o r

e x a m p l e , a v i d i n

( a v a i l a b l e

f r o m

P i e r c e Chemical Company) may be

m m o b i l i s e d

on chlorom

e t h y l a c t i v a t e d

p o l y s t y r e n e

n a n o p a r t i c l e s ( a v a i l a b l e f r o m

I n t e r f a c i a l

D y n a m i c

C o r p o r a t i o n ,

U S )

b y a g i t a t i o n i n b u f f e r

(eg

a t

room t e m p e r a t u r e f o r 2 4 h o u r s ) a n d t h e n

u s e d

i n

c o n j u n c t i o n

W i t h

b i o t i n

l a b e l l e d

a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s

( p r e p a r e d a c c o r d i n g t o c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s

i n

t h e

a r t ) .

T h u s , f o r

e x a m p l e ,

p l a s m a t a k e n

f r o m

t h e

s u b j e c t o

b e t e s t e d

f o r p o t e n t i a l

f o r ,

o r p r o p e n s it y

t o , CVD s

added o a s o l u t i o n

of v i d i n - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s i n a q u a r t z c u v e t t e of s p e c

t r o p h o t o m e t e r ,

f o l l o W e d

b y t h e

a d d i t i o n o f

b i o t i n l a b e l l e d

a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d y . T u r b i d i m e t r i c r ea d i n g s a r e

t h e n

t a k e n .

[ 0 0 6 1 ]

A l t e r n a t i v e l y , t h e b i o t i n l a b e l l e d a n t i b o d i e s

may

e

added p r i o r t o

t h e a d d i t i o n

of plasma o r

s e r u m .

I n o t h e r

W o r d s ,

W h i l s t t h e

same e a g e n t s

a r e t y p i c a l l y

u s e d

r e g a r d l e s s

o f

t h e

i n s t r u m e n t

u s e d

f o r t u r b i d i t y d e t e c t i o n ,

t h e p r e c i s e

sequence

i n Which h e v a r i o u s r e a g e n t s a r e added

may a r y .

G e n e r a l l y , t h e

s e q u e n c e

u s e d s h o u l d

b e

i n

a c c o r d a n c e W i t h

t h e i n s t r u c t i o n s a c c o m p a n y i n g t h e

s p e c t r o p h o t o m e t e r

u s e d

(eg

a ShimadZu UV-160 s p e c t r o p h o t o m e t e r ) .

[ 0 0 6 2 ]

T u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s

a r e

made ( i . e .

t h e

l i g h t

a b s o r p t i o n

a t a s u i t a b l e W a v e l e n g t h i s measured a t r e g u l a r

i n t e r v a l s )

a n d

t h e l i g h t

a b s o r p t i o n

r e l a t i v e t o a r e f e r e n c e i s

d e t e r m i n e d .

O p t i o n a l l y , m u l t i p l e

W a v e l e n g t h

i n s t r u m e n t s

may e u s e d t o make u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s and may r o v i d e

more r e c i s e

r e s u l t s .

S u i t a b l e i n s t r u m e n t s

f o r

t a k i n g t u r b i d i

m e tr i c r e a d i n g s

i n c l u d e

t h e

C o b a s

M i r a , R o c h e I n t e g r a a n d

M e r c k ’ s T u r b i q u a n t .

[ 0 0 6 3 ] I n

a n a l t e r n a t i v e e x p e r i m e n t a l

s e t - u p ,

t h e a n t i

c a i p r o t e c t i n

a n t i b o d y , o r

a n t i b o d y

f r a g m e n t , may

e

immo

b i l i s e d

d i r e c t l y

o n

c h l o r o m e t h y l a c t i v a t e d

n a n o p a r t i c l e s

( a v a i l a b l e f r o m I n t e r f a c i a l D y n a m i c C o r p o r a t i o n , U S ) . F o r

i n s t a n c e , a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y (eg

h e e g g

p o l y c l o n a l

a n t i b o d y

a v a i l a b l e f r o m

N o r w e g i a n A n t i b o d i e s AS)

may e

mixed

W i t h

t h e a b o v e - m e n t i o n e d a c t i v a t e d p a r t i c l e s i n a

b u f f e r ( 1 0 mM

o r a t e ,

1 5 mM

o d i u m c h l o r i d e , pH

. 0 ) a n d

a g i t a t e d

(eg

a t

room

t e m p e r a t u r e f o r 2 4

h o u r s )

t o f u r n i s h


a n t i b o d y - c o a t e d

n a n o p a r t i c l e s .

S u c h

n a n o

p a r t i c l e s may b e u s e d f o r t u r b i d i m e t r i c


o f


b y

a d d i n g

them o a s a m p l e o f

plasma

o r

s e r u m , t a k e n from t h e s u b j e c t

to

be t e s t e d f o r

p o t e n t i a l

f o r , o r p r o p e n s i t y t o C V D , i n a b u f f e r a n d t a k i n g


r e a d i n g s i n k i n e t i c

m o d e .

[ 0 0 6 4 ]

A l t e r n a t i v e l y , t h e plasma

r serum

may be added o

t h e



n a n o p a r t i c l e s .

I n o t h e r

W o r d s , W h i l s t t h e same e a g e n t s

a r e t y p i c a l l y

u s e d r e g a r d l e s s

o f t h e i n s t r u m e n t u s e d f o r

t u r b i d i t y

d e t e c t i o n , t h e p r e c i s e

sequence i n Which h e v a r i o u s r e a g e n t s a r e added may a r y .

G e n e r a l l y , t h e

s e q u e n c e u s e d s h o u l d b e

i n


t h e i n s t r u c t i o n s a c c o m p a n y i n g t h e

s p e c t r o p h o t o m e t e r

u s e d

(eg

a ShimadZu UV-160 s p e c t r o p h o t o m e t e r ) .

[ 0 0 6 5 ]

Examples

o f a u t o m a t e d r o b o t s Which

a r e

s u i t a b l e

f o r

t a k i n g t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s

i n

a c c o r d a n c e W i t h t h e a s s a y

method

f

t h e i n v e n t i o n i n c l u d e t h e

Cobas

Mira and H i t a c h i

7 1 1 , b o t h

o f

Which a r e a v a i l a b l e

from

Roche i a g n o s t i c s .

[ 0 0 6 6 ] The p a r t i c l e s t o W h i c h t h e a n t i b o d y , o r a n t i b o d y

f r a g m e n t ,

may

e bound a r e t y p i c a l l y s p h e r i c a l . The i Z e o f

t h e p a r t i c l e s u s e d i n t h e a s s a y

may

f f e c t t h e p r e c i s i o n

W i t h

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

Which t h e


c o n c e n t r a t i o n i s

m e a s u r e d .

W h i l s t

l a r g e r p a r t i c l e s

a l l o W

f o r

l o W e r c o n c e n t r a t i o n s o f


t o be e t e c e d , t h e i r reduced u r f a c e a r e a means h a t t h e y

have

a l o W e r

b i n d i n g

c a p a c i t y . F o r

e x a m p l e , d o u b l i n g

t h e p a r t i c l e

d i a m e t e r , h a l v e s t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f a

mass

u n i t

o f p a r

t i c l e s .

[ 0 0 6 7 ] A d d i t i o n a l l y i n c r e a s i n g

t h e

p a r t i c l e

d i a m e t e r

i n c r e a s e s t h e l e v e l o f

b a c k g r o u n d

l i g h t a b s o r b a n c e

a n d

l i g h t

s u s p e n s i o n a t t h e

W a v e l e n g t h s

t y p i c a l l y u s e d i n s u c h a s s a y s

(eg

3 3 0

o

6 0 0

n m ) .

T h u s W h i l s t l a r g e r

p a r t i c l e s

i n c r e a s e t h e

s e n s i t i v i t y o f

t h e

a s s a y , t h i s may b e a c c o m p a n i e d

by some

l o s s o f a c c u r a c y

and

n

p a r t i c u l a r ,

an n c r e a s e

i n

t h e number f

f a l s e

n e g a t i v e

e s u l t s

o b t a i n e d .

T h i s

i s

p a r t i c u l a r l y l i k e l y

t o b e

t h e c a s e W i t h s a m p l e s c o n t a i n i n g

r e l a t i v e l y

h i g h c a l p r o t e c t i n

c o n c e n t r a t i o n s ( i . e . t h o s e s a m p l e s o b t a i n e d

f r o m i n d i v i d u a l s

W i t h

a

h i g h

p o t e n t i a l

f o r o r p r o p e n s i t y t o

CV D )

h e r e i n t h e

n a n o p a r t i c l e - b o u n d

b i n d i n g s i t e s

may become

s a t u r a t e d

W i t h o u t

a l l

o f t h e c a l p r o t e c t i n b e c o m i n g

b o u n d .

[ 0 0 6 8 ] T h e s e c o u n t e r - a c t i n g e f f e c t s a s s o c i a t e d W i t h c h a n g

i n g

t h e

p a r t i c l e s i z e

(eg

n c r e a s i n g

t h e

p a r t i c l e s i Z e

i n c r e a s e s

s e n s i t i v i t y

b u t d e c r e a s es a c c u r a c y )

r e p r e s e n t s a

s i g n i ? c a n t

problem

to be

overcome

i n t h e

development

o f a

s e n s i t i v e

a s s a y

f o r

d e t e c t i n g t h e

r a n g e o f e v e l s

o f c a l p r o t e c t i n

p r e s e n t

i n b o d y ? u i d s .

[ 0 0 6 9 ] A l s o i t i s p r e f e r a b l e i n t h e

a s s a y

method o f t h e

i n v e n t i o n

t h a t t h e p a r t i c l e s used a l l o W f o r a Wide r a n g e o f

c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n s t o b e d e t e r m i n e d W i t h p r e c i s i o n .

T h i s may mean

h a t a

high

e v e l

of

con?dence

can be

a t t r i b

u t e d

t o

b o t h

a n e g a t i v e

r e s u l t ( i . e .

a


f a l l i n g

beloW t h e

t h r e s h o l d

v a l u e )

a s

W e l l

a s

a

p o s i t i v e

r e s u l t

I t

i s

p a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d

i n

t h e a s s a y method

o f

t h e i n v e n t i o n

t h a t

s a m p l e s h a v i n g

a


i n t h e

r a n g e

0 . 5 - 5 0 mg/L e . g . 1 - 4 0

m g / L )

c a n

b e m e a s u r e d .

[ 0 0 7 0 ]

The

p a r t i c l e s t o W h i c h

t h e a n t i b o d y , o r

a n t i b o d y

f r a g m e n t ,

may e

bound

r e t y p i c a l l y s p h e r i c a l

W i t h

a diam

e t e r

of

1-150

nm,

f o r example 10-90 nm r 15-60

nm, f o r

i n s t a n c e ,

44

nm. I n

a

p a r t i c u l a r l y p r e f e r r e d

a s s a y method o f

t h e i n v e n t i o n t h e p a r t i c l e s t o Which h e a n t i b o d y o r a n t i b o d y

fragments a r e

bound have

a diameter of 55-140 nm, more

p r e f e r a b l y

6 5 - 1 1 0

nm, f o r

e x a m p l e , 7 0 - 9 0

nm.

[ 0 0 7 1 ]

A l t e r n a t i v e l y t h e

d i a m e t e r

o f t h e p a r t i c l e s c a n b e

measured once

n t i b o d i e s

o r

a n t i b o d y

fragments a r e bound o

t h e i r s u r f a c e . I n t h i s

c a s e , t h e

d i a m e t e r o f

t h e

a n t i b o d y o r

a n t i b o d y

f r a g m e n t

c o a t e d

p a r t i c l e s

i s p r e f e r a b l y 6 5 - 1 4 0 n m ,

more

r e f e r a b l y 75-120 nm, t i l l

more

r e f e r a b l y 80-100 nm.

C o a t e d

p a r t i c l e s

o f

t h e s e

s i Z e s a r e e s p e c i a l l y

p r e f e r r e d

When

t h e

s a m p l e

t e s t e d i s p l a s m a .

[ 0 0 7 2 ] The a r t i c l e s ,

i n

b o t h t h e

“ n u d e ”

a n d c o a t e d

s t a t e s ,

p r e f e r a b l y

have

a d i a m e t e r Which d o e s n o t i t s e l f e n a b l e

a b s o r p t i o n o f h e W a v e l e n g t h o f i g h t u s e d

f o r

s p e c t r o p h o t o

m e t r i c

d e t e r m i n a t i o n .

Thus

t h e

s u s p e n s i o n

o f

c o a t e d

nano

p a r t i c l e s i s a p p r o x i m a t e l y

( e . g .

s u b s t a n t i a l l y )

t r a n s p a r e n t

u n t i l c a l p r o t e c t i n i n d u c e d a g g r e g a t e

f o r m a t i o n

o c c u r s r e s u l t

i n g i n

t h e

f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s h a v i n g

a

l a r g e r

d i a m e t e r .

S u c h a g g r e g a t e s

h a v e

t h e a b i l i t y

t o

a b s o r b t h e

W a v e l e n g t h

o f

l i g h t u s e d

b y

t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r .

[ 0 0 7 3 ]

F u r t h e r , t h e

p a r t i c l e s a r e p r e f e r a b l y s u b s t a n t i a l l y

a l l

of h e

same

i Z e ,

more s p e c i ? c a l l y

a l l of h e

same

d i a m e t e r .

P r e f e r a b l y , m o n o d i s p e r s e

m e t a l

( e . g . g o l d ) o r p o l y m e r p a r

t i c l e s a r e u s e d .

M o n o d i s p e r s e

polymer a r t i c l e s a r e a v a i l a b l e

f r o m

D y n a l

B i o t e c h A S , O s l o ,

N o r w a y .

[ 0 0 7 4 ] W h i l s t n o t W i s h i n g o b e bound by h e o r y , i t

may

e

t h a t t h e u s e o f


a n t i b o d y o r

a n t i b o d y

f r a g m e n t s

i n c r e a s es t h e

s e n s i t i v i t y o f

t h e a s s a y b y

i n c r e a s i n g t h e s i Z e o f

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

a n y c a l p r o t e c t i n d e r i v e d

o p a c i t y

g e n e r a t i n g s i t e s a n d

t h e r e

f o r e t h e

amount

f i g h t s c a t t e r e d t h e r e f r o m . By

s i n g

a s o l i d

s u p p o r t o r m a t r i x

( e . g .

n a n o p a r t i c l e s )

W h i c h

s s u b s t a n t i a l l y

a l l

o f t h e

same

s i Z e

i t

may

be t h a t t h e s e n s i t i v i t y

o f

t h e

t u r b i d i m e t r y

a s s a y

i s

f u r t h e r i n c r e a s e d .

[ 0 0 7 5 ]

As i s

r o u t i n e

i n

t u r b i d i m e t r i c a s s a y s , a p o l y m e r i c


e n h a n c e r , s u c h a s p o l y e t h y l e n e g l y c o l , i s p r e f

e r a b l y a l s o a d d e d t o t h e e l u a t e .

[ 0 0 7 6 ]

B e f o r e

t h e t u r b i d i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n

i s m a d e ,

t h e

f r a c t i o n , a n t i b o d y o r a n t i b o d y f r a g m e n t , p r e f er a b l y

b o u n d

o

a n a n o p a r t i c l e , and p t i o n a l l y

e n h a n c e r may e i n c u b a t e d f o r

a s h o r t p e r i o d , eg m i n u t e s t o

a n

h o u r ,

p r e f e r a b l y a b o u t 1 0

m i n u t e s ,

a t

room

t e m p e r a t u r e .

O p t i o n a l l y ,

i n d e t e r m i n i n g



u s i n g t h e

t u r b i d i m e t r y

t e c h n i q u e ,

a k i n e t i c r e a d i n g

mode

may

be

s e d .

[ 0 0 7 7 ] The i g h t u s e d

i n

t h e d e t e r m i n a t i o n

o f


s h o u l d h a v e

a n a p p r o p r i a t e

W a v e l e n g t h ,

f o r e x a m p l e , 3 0 0 - 6 0 0

nm. n

t h i s regard t

W a s found h a t use

of 300-450 nm l t e r ,

p r e f e r a b l y a 340 nm

r

a

405

mm l t e r , fumished a r t i c u l a r l y

good

e s u l t s .

Use

f a

560

nm

l t e r

may

l s o

y i e l d

e s p e c i a l l y

g o o d r e s u l t s .

[ 0 0 7 8 ]

I n g e n e r a l , i n

a d d i t i o n

t o t h e

s a m p l e u n d e r

e v a l u a

t i o n c a l i b r a t i o n s a m p l e s W i t h knoWn c a l p r o t e c t i n

c o n t e n t s

W i l l a l s o b e a s s e s s e d i n

t h e p e r f o r m a n c e

o f

t h e

a s s a y m e t h o d .

Such

d e t e r m i n a t i o n s can be used t o

p l o t

a

c a l i b r a t i o n curve

f r o m W h i c h t h e c a l p r o t e c t i n

c o n t e n t

o f t h e

s a m p l e

u n d e r

e v a l u a t i o n c a n b e d e t e r m i n e d . P r e f e r a b l y


s a m p l e s

h a v i n g

c a l p r o t e c t i n c o n t e n t s

o f u p t o 5 0 0 0 mg/L (eg 1 5 0 0 ,

1 0 0 0 , 7 5 0 , 2 5 0 , 1 0 0 ) o r u p o 1 0 0 mg/L (eg 5 , 5 0 , 2 5 , 5 , 1 . 0

a n d

0 . 5

mg/L)

W i l l b e

u s e d . More r e f e r a b l y t h e


s a m p l e s h a v e a c a l p r o t e c t i n c o n t e n t

o f p

t o

1 0

mg/L e . g . 1 0 ,

8 , 6 , 4 ,

2 m g / L ) , s t i l l m o r e p r e f e r a b l y u p t o 5 mg/L

5 ,

4 . 5 , 4 ,

3 . 5 ,

3 ,

2 . 5 ,

2 , 1 . 5 , 1 , 0 . 5

m g / L ) .

[ 0 0 7 9 ] The a b o v e d e s c r i b e d


a s s a y

f o r t h e


o f


i s

s u r p r i s i n g l y

r e l i a b l e ,

q u i c k ,

c h e a p ,

f a c i l e and

amenable

o

a u t o m a t i o n .

T h i s i s

i n c o n t r a s t

to

t h e c u r r e n t l y a v a i l ab l e a s s a y methods

Which

r e r e l a t i v e l y

complex

a n d

a r e

n o t

d i r e c t l y

a p p l i c a b l e t o

t h e

a u t o m a t e d

m u l t i - t a s k d i a g n o s t i c m a c h i n e s c o m m o n l y u s e d

b y

d i a g n o s

t i c

l a b o r a t o r i e s .

[ 0 0 8 0 ] Automation

s

p a r t i c u l a r l y d e s i r a b l e Where

numer

o u s

m i x i n g , a d d i t i o n a n d / o r

d i l u t i o n s t e p s ar e

i n v o l v e d s i n c e

t h e s e may b e a c h i e v e d W i t h a

h i g h e r d e g r e e o f

a c c u r a c y .

R o b o t s may a l s o o f f e r a h i g h e r l e v e l o f

r e l i a b i l i t y

a n d / o r

r e p r o d u c i b i l i t y . A u t o m a t i o n a l s o i n c r e a s e s t h r o u g h p u t .

[ 0 0 8 1 ]

The c u r r e n t l y a v a i l a b l e a s s a y m e t h o d s W h i c h

may

o f f e r r e a s o n a b l e

l e v e l s

o f

p r e c i s i o n ( e . g . ELISA) r e ,

hoW

e v e r ,

d i ? i c u l t t o a u t o m a t e . T h i s

i s a t

l e a s t i n p a r t

b e c a u s e

t h e y

t y p i c a l l y

i n v o l v e

n u m e r o u s W a s h i n g

a n d s e p a r a t i o n

s t e p s

( e . g .

a t t a c h m e n t

t o

a

s o l i d s u r f a c e )

and

a u t o m a t i o n o f

non

homogeneous r o c e s s e s i s o f t e n p r o b l e m a t i c . A l s o

t h e s e p r o

c e s s e s t y p i c a l l y

i n v o l v e

a r e l a t i v e l y l a r g e

number

o f s t e p s

W h i c h

i n c r e a s es t h e

c o m p l e x i t y o f a n y a u t o m a t e d p r o t o c o l .

O t h e r c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s f o r d e t e r m i n a t i o n o f

c a l p r o

t e c t i n ( e . g . n e p h e l o m e t r y ) o f f e r h i g h p r e c i s i o n b u t

r e q u i r e

s p e c i a l e q u i p m e n t to

c a r r y o u t th e

n e c e s s a r y m e a s u r e m e n t s .

S p e c i a l i s e d

e q u i p m e n t

i s

n o t

t y p i c a l l y

e a s y t o i n c o r p o r a t e

i n t o

a n

automated r o t o c o l .

[ 0 0 8 2 ]

I n d e e d

t h e r e

s

a

c o n t i n u i n g n e e d o r c h e a p , r e l i a b l e ,

q u i c k a n d f a c i l e c a l p r o t e c t i n a s s a y s f o r u s e i n d i a g n o s t i c

t e c h n i q u e s .

[ 0 0 8 3 ]

T h u s , a c c o r d i n g t o a f u r t h e r a s p e c t , t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n p r o v i d e s

an

a s s a y method o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

c a l p r o t e c t i n i n a


b o d y ? u i d , s a i d

m e t h o d

c o m p r i s i n g t h e s t e p s

o f :

[ 0 0 8 4 ] ( a ) o b t a i n i n g a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g l i q u i d

s a m p l e o f ,

o r

d e r i v e d f r o m , s a i d ? u i d ;

[ 0 0 8 5 ]

( b )

c o n t a c t i n g

s a i d

s a m p l e o f

s a i d

b o d y

? u i d

W i t h

a n , o p t i o n a l l y n a n o p a r t i c l e - b o u n d , a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d y

o r a n t i b o d y f r a g m e n t , t o b i n d s a i d c a l p r o t e c t i n ;

[ 0 0 8 6 ]

( c )

o p t i o n a l l y , a d d i n g a n o p a c i t y e n h a n c e r ;

a n d

[ 0 0 8 7 ]

( d )

a s s e s s i n g t h e c a l p r o t e c t i n c o n t e n t b y

t u r b i d i m

e t r y .

[ 0 0 8 8 ] Such a s

a s s a y may b e

u s e f u l

i n

t h e d i a g n o s i s

o f

v a r i o u s d i s e a s e

c o n d i t i o n s

Which r e c h a r a c t e r i s e d by b n o r

m a l l e v e l s

( e . g .

h i g h l e v e l s ) o f


S u c h d i s e a s e

c o n d i t i o n s i n c l u d e : r h e u m a t i c d i s e a s e s (eg r h e u m a t o i d

a r t h r i t i s , j u v e n i l e

r h e u m a t o i d

r t h r i t i s , s y s t e m i c

l u p u s

e r y t h e

m a t o u s ) , S j o g r e n s

s y n d r o m e ,

i n t r a o c u l a r i n ? a m m a t o r y c o n

d i t i o n s ,

c y s t i c ? b r o s i s , a c u t e a n d c h r o n i c

l u n g d i s e a s e ,

l u n g

c a r c i n o m a

( s q u a m o u s

c e l l s ) , p u l m o n a r y

c a n c e r s ,

c o l o r e c t a l

c a n c e r , i n ? a m m a t o r y

b o W e l

d i s e a s e ,

g a s t r i c c a n c e r , c o l o r e c

t a l

adenoma

o r ’ c a n c e r ,

C r o h n ’ s

d i s e a s e , u l c e r a t i v e

c o l i t i s ,

g a s t r o i n t e s t i n a l m u c o s a l i n ? a m m a t i o n ,

u r i n a r y

s t o n e s , a l c o

h o l i c

l i v e r d i s e a s e ,

o r a l


m u c o s a l

d i s e a s e , C NS


d i s e a s e (eg m u l t i p l e s c l e r o s i s a n d a c u t e

e n c e p h a l i t i s ) , HIV

n f e c t i o n , s e c o n d a r y CNS

i n f e c t i o n s

i n

HIV

n f e c t e d p a t i e n t s ,

u r i n a r y

t r a c t

i n f e c t i o n s ,

c y s t i t i s , p y e l o

n e p h r i t i s , e n d o g e n o u s p o s t e r i o r u v e i t i s , h a e m a t o l o g i c a l c o n

d i t i o n s ( e . g .

l e u k a e m i a ) , f e b r i l e c o n d i t i o n s

( i n f e c t i o u s

a n d

n o n - i n f e c t i o u s ) ,

a c u t e

m y o c a r d i a l

i n f a r c t i o n a n d a p h e r e s i s .

[ 0 0 8 9 ] Thus vieWed from

a

f u r t h e r a s p e c t

t h e

i n v e n t i o n

p r o v i d e s

a

method o f

d i a g n o s i s o f a n y

o f

t h e above-men

t i o n e d d i s e a s e s , c o m p r i s i n g t h e method s

d e s c r i b e d

h e r e i n

b e f o r e f o l l o W e d b y

c o m p a r i s o n

o f s a i d c a l p r o t e c t i n c o n t e n t

W i t h

a

p r e d e t e r m i n e d

t h r e s h o l d

v a l u e .

The t h r e s h o l d v a l u e

i n d i c a t i v e o f a n y p a r t i c u l a r

d i s e a s e

s t a t e may e d e t e r m i n e d

by a n y

c o n v e n t i o n a l method

knoWn

n

t h e a r t . P r e f e r a b l y t h e

method s

u s e d f o r t h e

d i a g n o s i s o f

C V D .

[ 0 0 9 0 ]

A

o d y s a m p l e u s e d i n t h e t u r b i d i m e t r i c

a s s a y

method may b e a n y


s a m p l e , eg

a

body

? u i d o r t i s s u e s a m p l e , o r a s u s p e n s i o n e t c . P r e f e r a b l y ,

t h e s a m p l e i l l b e a b o d y u i d , e . g .

u r i n e , c e r e b r o s p i n a l

? u i d ,

o r a l ? u i d , s y n o v i a l ? u i d o r

empyema

? u i d , o r more p r e f e r

a b l y ,

blood o r a blood

e r i v e d

s a m p l e . When h i s i s

t h e c a s e

( i . e .

b l o o d

o r b l o o d d e r i v e d s a m p l e i s u s e d ) , t h e s a m p l e

u s e d

f o r

a n a l y s i s

W i l l p r e f e r a b l y b e c e l l - f r e e

( e . g .

serum o r

p l a s m a ) . A l t e r n a t i v e l y f a e c e s may e u s e d .

[ 0 0 9 1 ]


t h e b o d y

s a m p l e i s

s e l e c t e d

t o p r o v i d e

t h e m o s t s e n s i t i v e i n d i c a t i o n o f

t h e d i s e a s e b e i n g

d i a g n o s e d .

Thus

W h i l s t b l o o d , p l a s m a o r

serum

i g h t

b e t e s t e d

t o d i a g

n o s e i n f e c t i o n s ( e . g . H I V , b a c t e r i a l i n f e c t i o n ) , r h e u m a t i c d i s

e a s e , l e u k a e m i a e t c . , f a e c e s

m i g h t

b e t e s t e d d u r i n g d i a g n o s i s

o f

d i s e a s e s a s s o c i a t e d

W i t h

t h e

g a s t r o i n t e s t i n a l

t r a c t ( e . g .

C r o h n ’ s d i s e a s e , u l c e r a t i v e c o l i t i s , c o l o r e c t a l c a n c e r s ) .

[ 0 0 9 2 ] VieWed

from

e t a f u r t h e r a s p e c t , t h e i n v e n t i o n

p r o

v i d e s

a

k i t f o r

a

d i a g n o s t i c


a s sa y a c c o r d i n g t o

t h e i n v e n t i o n , s a i d

k i t

c o m p r i s i n g :

[ 0 0 9 3 ] p r e f e r a b l y ,

a


s o l u t i o n

o f knoWn o n c e n

t r a t i o n

and

more r e f e r a b l y a set of such

s o l u t i o n s

having a

r a n g e o f a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n s ;

[ 0 0 9 4 ] one r more n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d i e s o r

a n t i b o d y

f r a g m e n t s , o p t i o n a l l y i m m o b i l i s e d on a

s o l i d

s u p p o r t

(eg

n a n o p a r t i c l e s ) ;

[ 0 0 9 5 ]


a

l i g h t

t r a n s m i t t i n g v e s s e l ;

[ 0 0 9 6 ]


a n o p a c i ? c a t i o n

e n h a n c e r ;

a n d

[ 0 0 9 7 ]


a d e t e c t o r .

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

[ 0 0 9 8 ] I f d e s i r e d a n a u t o m a t e d

a p p a r a t u s

may e a r r a n g e d

t o

r e c e i v e

a c a l p r o t e c t i n - c o n t a i n i n g

b o d y

? u i d s a m p l e , a p p l y

t h e a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y

o r a n t i b o d y

f r a g m e n t , o p t i o n

a l l y


on

a

s o l i d s u p p o r t

( e . g . n a n o p a r t i c l e s ) ,

o p t i o n a l l y

a p p l y

a n


e n h a n c e r ,

a n d

a s se s s c a l p r o

t e c ti n c o n t e n t . Such an

p p a r a t u s i s

a l s o deemed o f a l l W i t h i n

t h e s c o p e o f t h e

i n v e n t i o n .

[ 0 0 9 9 ] The i n v e n t i o n W i l l

noW b e

d e s c r i b e d

f u r t h e r W i t h

r e f e r e n c e

t o

t h e

f o l l o w i n g n o n - l i m i ti n g

E x a m p l e s a n d t h e

a c c o m p a n y i n g ? g u r e s

i n

W h i c h :

[ 0 1 0 0 ] F I G . 1 i s

t h e d i s t r i b u t i o n

c u r v e f o r c a l p r o t e c t i n i n

t h e

200

s u b j e c t s t e s t e d . The summary t a t i s t i c s f o r F I G . 1 a r e :

[ 0 1 0 1 ] A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y

T e s t

A 2 : 8 . 1 6 0

P - v a l u e : 0 . 0 0 0

M ea n

0 . 4 0 3

S t a n d a r d D e v i a t i o n 0 . 2 3 8

V a r i a n c e 0 . 0 5 7

SkeWness 1 . 6 7 9

K u r t o s i s 3 . 3 0 2

N

199

Minimum

0 . 0 7 0

1 s t Q u a r t i l e

0 . 2 4 0

Median

0 . 3 4 0

3 r d

Q u a r t i l e 0 . 5 0 0

Maximum 1 . 3 7 0

95

con?dence i m i t f o r Mu

0 . 3 7 0

0 . 4 3 6

9 5% con?dence i m i t f o r Sigma 0 . 2 1 7

0 . 2 6 4

95

con?dence i m i t f o r

Median 0 . 3 1 0

0 . 3 7 0

[ 0 1 0 2 ]

FIG. 2 i s

t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r

calcium

s c o r e i n

t h e

200 s u b j e c t s t e s t e d . The summary t a t i s t i c s f o r F I G .

2

a r e

[ 0 1 0 3 ]

A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y

T e s t

A 2 :

2 5 . 0 3 7

P - v a l u e : 0 . 0 0 0

M ea n

217.060

S t a n d a r d D e v i a t i o n 399.000

V a r i a n c e 159201

SkeWness 3 . 4 6 2

K u r t o s i s 1 5 . 3 4 1

N 200

Minimum 0 . 0 0

1 s t Q u a r t i l e 0 . 0 0

Median 7 8 . 0 0

3 r d Q u a r t i l e 2 5 9 . 2 5

Maximum 2794.00

95


1 6 1 . 4 2

272.70

9 5%

con?dence

i m i t

f o r

Sigma

3 6 3 . 3 5

442.46

95

con?dence i m i t

f o r

Median 0 . 0 0

1 1 7 . 3 3

[ 0 1 0 4 ]

F I G .

3

i s


hsCRP n

t h e 200

s u b j e c t s t e s t e d .

The summary t a t i s t i c s f o r

F I G .

3 a r e :

[ 0 1 0 5 ] A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y

T e s t

A 2 :

2 1 . 2 2 1

P - v a l u e : 0 . 0 0 0

M ea n 2 . 3 3 1

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

- c o n t i n u e d

S t a n d a r d D e v i a t i o n 2 . 9 7 0

V a r i a n c e

8 . 8 1 9

SkeWness

2 . 2 4 3

K u r t o s i s 5 . 1 0 3

N 197

Minimum 0 . 1 5 0

1 s t

Q u a r t i l e

0 . 5 4 0

Median 1 . 1 5 0

3 r d

Q u a r t i l e 2 . 5

8 0

Maximum 1 6 . 3 0

95


1 . 9 1 3

2 . 7 4 8

95% con?dence i m i t

f o r Sigma

2 . 7 0 3

3 . 2 9 6

95

con?dence i m i t f o r

Median 0 . 9 3 3

1 . 3 7 5

[ 0 1 0 6 ]

F I G . 4 i s

t h e d i s t r i b u t i o n

c u r v e

f o r

h o m o c y s t e i n e i n

t h e 200

u b j e c t s t e s t e d . The summary t a t i s t i c s f o r F I G .

4

a r e :

[ 0 1 0 7 ]

A n d e r s o n - D a r l i n g N o r m a l i t y

T e s t

A 2 : 2 . 5 3 5

P - v a l u e : 0 . 0 0 0

M ea n 8 . 3 9 1

S t a n d a r d D e v i a t i o n

1 . 9 6 6

V a r i a n c e 3 . 8 6 7

SkeWness

0 . 8 7 5

K u r t o s i s 0 . 7 3 0

N 1 9 9

Minimum 5 . 1 0 0

1 s t Q u a r t i l e

7 . 1 0 0

Median 8 . 1 0 0

3 r d Q u a r t i l e 9 . 6 0 0

Maximum

1 5 . 3 0 0

95

con?dence i m i t f o r Mu 8 . 1 1 7

8 . 6 6 6

95%

con?dence

i m i t

f o r

Sigma

1 . 7 9 0

2 . 1 8 1

95

con?dence i m i t f o r Median 7 . 6 2 0

8 . 4 0 0

[ 0 1 0 8 ] F I G .

5

i s a d o t

p l o t

f o r t h e d i s t r i b u t i o n o f


b e t W e e n t h e c a l c i u m p o s i t i v e a n d c a l c i u m n e g a t i v e r e s u l t s ;

and

[ 0 1 0 9 ]

FIGS. 6 and 7

a r e t h e

ROC

u r v e s f o r c a l p r o t e c t i n

a n d hsCRP f o r a l l

200

s u b j e c t s t e s t e d a n d f o r t h e

male

s u b

j e c t s

t e s t e d

r e s p e c t i v e l y .

EXAMPLE

A n t i - C a l p r o t e c t i n A n t i b o d y

( a )

I s o l a t i o n

o f


[ 0 1 1 0 ] C a l p r o t e c t i n may e i s o l a t e d a c c o r d i n g o t h e meth

o d s d e s c r i b e d i n Examples a n d

2

o f U . S . P a t . N o . 4 , 8 3 3 , 0 7 4

( F a g e r h o l ) .

[ 0 1 1 1 ] C a l p r o t e c t i n may a l t e r n a t i v e l y b e p u r i ? e d f r o m

human b u f f y c o a t s .

A

e l l - s u s p e n s i o n i n 2 . 5 mM DTA s

made

y

t h e

a d d i t i o n

o f E D T A 5 0 m M ,

pH

) t o

c e l l s . T h e

c e l l s

a r e t h e n Washed

n

1

60mM mmonium h l o r i d e / 1 0 mM

s o d i u m h y d r o g e n c a r b o n a t e f o r

3

m i n u t e s a n d c e n t r i f u g e d

( 1 6 0 > < g )

f o r 1 0

m i n u t e s a t 4 0 C . The

e s u l t i n g

p e l l e t

i s

Washed

i n E D T A 2 . 5 m M ) / N a C l

( 1 5 0 mM)

n d c e n t r i f u g e d ( 5 5 > < g )

f o r a

f u r t h e r

1 0

m i n u t e s

a t

4 0 C .

The e l l e t

s

t h e n r e s u s p e n d e d

i n 0 . 6 2 5 mM DTA/18.75 mM i e m a l ,

pH . 4

and r o Z e n a t

—700

C .

f o r

a t

l e a s t 24

h o u r s .

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

[ 0 1 1 2 ] F o l l o w i n g

t h a w i n g , t h e r e s u l t i n g m a t e r i a l i s c e n t r i

f u g e d

( a t

3 7 0 0

x g )

f o r 3 0

m i n u t e s , t h e n

t h e

s u p e r n a t a n t i s

removed and

? l t e r e d

( w i t h

a 0 . 4 5 [ m i ? l t e r

a v a i l a b l e from

M i l l i p o r e ) ,

t h e n l o a d e d o n t o

a

DEAE

( d i e t h y l a m i n o e t h y l )

S e p h a r o s e i o n - e x c h a n g e

c o l u m n

a v a i l a b l e

f r o m

P h a r m a c i a ) ,

p r e - p r e p a r ed u s i n g a

b i n d i n g

b u f f e r

( e . g . 0 . 6 3

mM

D T A / 1 8 .

7 5

mM i e m a l ,

pH . 4 ) . Any

n o n - b i n d i n g m a t e r i a l

p a s s e s

t h r o u g h

t h e column

n d

s e l u t e d . Once

l l

o f h e

n o n - b i n d i n g

m a t e r i a l i s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n ,

p u r e

c a l p r o t e c t i n s e l u t e d

u s i n g a c a l c i u m - c o n t a i n i n g e l u t i o n

b u f f e r

(eg

7 5

mM

D i e m a l

b u f f e r /

1 0

mM

a C l 2 ) .

About

2 5 mg a l p r o t e c t i n i s

o b t a i n e d p e r b u f f y

c o a t .

( b )

P r e p a r a t i o n o f

n t i - C a l p r o t e c t i n A n t i b o d y

[ 0 1 1 3 ]

A n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s

may b e p r e p a r e d

a c c o r d i n g t o

t h e

method e s c r i b e d i n Example

3 o f

US. a t .

N o .

4 , 8 3 3 , 0 7 4

( F a g e r h o l )

[ 0 1 1 4 ] C h i c k e n e g g p o l y c l o n a l s

may l t e r n a t i v e l y

b e

p r e

p a r e d . A o l u t i o n

c o m p r i s i n g c a l p r o t e c t i n

( 0 . 5 m g / m l ) a n d

F r e u n d ’ s a d j u v a n t

s

i n j e c t e d

n t o

c h i c k e n s e v e r y 1 4 d a y s

f o u r

t i m e s ( o r

f o r

two o n t h s ) , and h e n o n c e e v e r y

1

m o n t h . A f t e r

1 2

w e e k s ,

t h e e g g s o f t h e

c a l p r o t e c t i n - i n j e c t e d

c h i c k e n

may

b e

c o l l e c t e d

a n d

h e i r y o l k s

r e m o v e d ( w i t h o u t

t h e ? l m ) . F o l

l o w i n g d i l u t i o n i n H C l .

( 5

mM),

h e

y o l k s

c e n t r i f u g e d

a n d

t h e

s u p e r n a t a n t i s

c o l l e c t e d .

The s u p e r n a t a n t i s

t h e n ? l t e r e d

and

t r e a t e d

with s a t u r a t e d ammonium u l f a t e t o a ?nal con

c e n t r a t i o n

o f 3 . 8 M . The i x t u r e i s c e n t r i f u g e d and h e p r e

c i p i t a t e p r o d u c e d s c o l l e c t e d

a n d d i s s o l v e d

i n b u f f e r ( 0 . 1 1

M

s o d i u m

c e t a t e ,

0 . 1 5

M

a C l , pH . 4 ) . T h e

e s u l t i n g

s o l u t i o n

i s ? n a l l y

d i a l y s e d

w i t h

a

membrane h a v i n g

a p o r e

s i Z e o f

1 0 , 0 0 0 kD

n d t h e n

p u r i ? e d

b y a ? i n i t y

c h r o m a t o g r a p h y .

[ 0 1 1 5 ]

T h e

c o l u m n

t y p i c a l l y u s e d f o r a ? i n i t y c h r o m a t o g

r a p h y

c o m p r i s e s a n

a c t i v a t e d

m a t r i x

o f

s u c c i n i m i d e - a c t i v a t e d

s e p h a r o s e

( H i T r a p NHS c t i v a t e d a v a i l a b l e f r o m Amersham

P h a r m a c i a )

which

i s

s u i t a b l e f o r

t h e

i m m o b i l i s a t i o n

o f

c a l p r o t e c t i n . More s p e c i ? c a l l y , t h e a c t i v a t e d r e s i n r e a c t s

s p o n t a n e o u s l y , a t pH

- 8 ,

w i t h r e e a m i n e s

i n

t h e

a l p r o t e c t i n .

F o r

c h r o m a t o g r a p h y

t h e

d i a l y s i s s o l u t i o n

i s

u s u a l l y d i l u t e d o

a


o f

a b o u t

3

mg/ml

n PBS

r i o r to

i t s a p p l i c a

t i o n t o

t h e

c o l u m n . The a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s a r e

s u b

s e q u e n t l y

e l u t e d

u s i n g 6

M

r e a

i n i c e

c o l d

PBS o r 0 . 1 M

s o d i u m

c i t r a t e s o l u t i o n , pH . 0 . P r e f e r a b l y , 0 . 1

M o d i u m

c i t r a t e s o l u t i o n s

u s e d .

F o l l o w i n g e l u t i o n , t h e a n t i - c a l p r o t e c

t i n a n t i b o d y c o n t a i n i n g f r a c t i o n s a r e

i m m e d i a t e l y

d i l u t e d a n d

d i a l y s e d i n P B S .

EXAMPLE

T u r b i d i m e t r i c

A s s a y f o r


( a )

P r e p a r a t i o n

o f v i d i n - C o a t e d

N a n o p a r t i c l e s

[ 0 1 1 6 ]

600

[ m i

o f 4.2%

w/v

c h l o r o m e t h y l a c t i v a t e d

nano

p a r t i c l e s

( d i a m e t e r

4 4

nm)

a v a i l a b l e f r o m I n t e r f a c i a l

Dynamic C o r p o r a t i o n ,

US

a r e

d i a l y s e d a g a i n s t w a t e r

w i t h

a

membrane a v i n g a p o r e

s i Z e

of 0 , 0 0 0 kD. 0 . 5

ml

of b o r a t e

( 1 0 m M ) n d s o d i u m c h l o r i d e ( 1 5 m M ) o l u t i o n

a t pH

. 0

i s

added

and m i x e d . 1 0 mg

v i d i n ,

d i s s o l v e d i n 0 . 5 ml

of

1 0

mM o r a t e

and

1 5 mM

aCl

s o l u t i o n

a t

pH

( a v a i l a b l e from

P i e r c e

C h e m i c a l

Company)

s a d d e d a n d

t h e

m i x t u r e i s a g i

t a t e d

a t

room t e m p e r a t u r e f o r 2 4

h o u r s .

4 0 [ 1 . 1 o f g l y c i n e

s o l u t i o n ( 2 M , pH . 0 )

i s t h e n

a d d e d a n d

t h e m i x t u r e

i s

a g i

t a t ed f o r

a

f u r t h e r

4 hours at r o om t e m p e r a t u r e .

[ 0 1 1 7 ]

The a r t i c l e s

a r e t h e n

d i l u t e d t o a

volume

of 100 ml

and

d i a ? l t r a te d , ? r s t l y i n

500

ml o f a 1 0

mM o r a t e and

1 5

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

mM odium

h l o r i d e

s o l u t i o n a t

pH

. 0 and

s e c o n d l y i n a 2 5

mM r i s , 1 5 0 mM odium c h l o r i d e and 0.01% Tween® 20

s o l u t i o n t pH . 4 ( a v a i l a b l e f r o m S i g m a US) s i n g a P e l l i c o n

XL i l t e r ( c u t o f f

3 0 0 , 0 0 0 )

a n d a l a b s c a l e

TTF

S y s t e m ( a v a i l

a b l e

f r o m

M i l l i p o r e )

i n

a c c o r d a n c e w i t h

t h e

i n s t r u c t i o n s

s u p

p l i e d f r o m t h e i n s t r u m e n t s s u p p l i e r s . The

e s i r e d

c o n c e n t r a

t i o n o f a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r ‘ t i c l e s

i s

? n a l l y

o b t a i n e d

b y

c e n t r i f u g a t i o n a n d r e - s u s p e n s i o n o f t h e p a r t i c l e s i n a 2 5 mM

THIS, 1 5 0 mM odium h l o r i d e and 0.01% Tween® 20 s o l u

t i o n . Any a g g r e g a t e s

f o r m e d

d u r i n g t h i s p r e p a r a t i o n p r o c e

d u r e may

e

r e m o v e d b y

s l o w c e n t r i f u g a t i o n .

( b ) A s s a y f o r C a l p r o t e c t i n

U s i n g

A v i d i n - C o a t e d N a n o p a r

t i c l e s

[ 0 1 1 8 ]

A

u s p e n s i o n

h a v i n g a

c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t

0 . 3 0

mg a r t i c l e s o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r

t i c l e s p e r m l i s p r e p a r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d

r e - s u s p e n s i o n

o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d

p r e p a r a t i o n

i n a 2 5

mM

HIS, 1 5 0

mM aC1,0.1% Tween® 20 and 2 PEG 000 o l u t i o n t

pH

7 . 4

( a v a i l a b l e

f r o m

S i g m a ) .

5 0 0 1 . 1

o f

h i s p a r t i c l e

s u s p e n s i o n

i s mixed

w i t h

a

p l a s m a

s a m p l e ( a b o u t 2 0 [ 1 . 1 ) , t a k e n

f r o m

a

s u b j e c t b e i n g

t e s t e d

f o r p r o p e n s i t y t o

CVD,

i n

a

r e a d i n g

q u a r t z c u v e t t e

o f

a r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r (eg a S h i

madZu U V - 1 6 0 ) . The a b s o r p t i o n o f

340

nm

onochromatic

l i g h t

i s r e c o r d e d a n d

a f t e r 6 0

s , 7 5 [ 1 g o f


a n t i b o d y l a b e l l e d w i t h 0 . 1 5 nmol i o t i n ( e . g . b i o t i n l a b e l l e d

a ? i n i t y p u r i ? e d

e g g p o l y c l o n a l p u r c h a s e d f r o m

N o r w e g i a n

A n t i b o d i e s AS,

N o r w a y ) , d i l u t e d i n 5 0 1 . 1 o f a

2 5

mM H I S ,

1 5 0

mM

aCl

and

0.1% Tween®

20 s o l u t i o n a t pH 7 . 4 i s

added

o t h e q u a r t z c u v e t t e

and i x e d . The b s o r p t i o n o f 340

nm

monochromatic l i g h t i s

i m m e d i a t e l y

r e c o r d e d u s i n g a

r e f e r e n c e c u v e t t e

c o n t a i n i n g a s o l u t i o n

o f 2 5 mM RIS, 1 5 0

mM

aCl

and

0.1% Tween®

20 a t

pH

7 . 4 , and

a g a i n

a t

r e g u l a r n t e r v a l s ( e . g .

e v e r y

2 m i n u t e s ) u n t i l a b o u t 1 5

m i n u t e s

h a s

e l a p s e d .

The

i n c r e a s e

i n

a b s o r p t i o n

a t

e a c h t i m e

p o i n t

i s

c a l c u l a t e d i n

a c c o r d a n c e w i t h

s t a n d a r d

t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g

i n

k i n e t i c mode

r “ e n d - p o i n t ” r e a d i n g s . T h a t s , t h e i n c r e a s e

i n

l i g h t a b s o r p t i o n

a t

e a c h t i m e - p o i n t i s c a l c u l a t e d r e l a t i v e

t o

t h e r e a d i n g

made p r i o r

t o t h e

a d d i t i o n

o f a n t i b o d y - c o a t e d

n a n o p a r ‘ t i c l e s a n d / o r a t

t h e e n d

o f

t h e r e c o r d i n g .

[ 0 1 1 9 ] A a l i b r a t i o n

c u r v e s

c o n s t r u c t e d by a r r y i n g o u t a n

i d e n t i c a l p r o c e d u r e w i t h s t a n d a r d s h a v i n g

a

know n

concen

t r a t i o n o f c a l p r o t e c t i n .

The c o n c e n t r a t i o n

o f


i n

t h e sample can

h e n

be a l c u l a t e d from h e c a l i b r a t i o n c u r v e .

EXAMPLE

A l t e r n a t i v e T u r b i d i m e t r i c

A s s a y

f o r C a i p r o t e c t i n

( a )

P r e p a r a t i o n

o f

n t i - C a l p r o t e c t i n

A n t i b o d y C o a t ed

N a n o

p a r t i c l e s

[ 0 1 2 0 ] 1

m1 o f

4.2% w/v c h l o r o m e t h y l

a c t i v a t e d

n a n o p a r

t i c l e s

( d i a m e t e r

4 4

nm)

a v a i l a b l e

f r o m I n t e r f a c i a l Dynamic

C o r p o r a t i o n , US r e d i a l y s e d a g a i n s t

w a t e r

w i t h a

membrane

h a v i n g

a

p o r e s i Z e o f 1 0 , 0 0 0 kD. . 5

m1

f

a

1 0 mM o r a t e and

1 5

mM odium h l o r i d e

s o l u t i o n

a t

pH

. 0 i s t h e n

a d d e d .

2 7

mg

f u r i ? e d a n t i - c a l p r o t e c t i n a n t i b o d i e s ( e . g . a ? i n i t y p u r i

? e d

e g g

p o l y c l o n a l

a n t i b o d i e s

a v a i l a b l e f r o m N o r w e g i a n

A n t i b o d i e s AS, Norway)

r e

d i a l y s e d a g a i n s t a 1 0 mM o r a t e

and 1 5 mM odium h l o r i d e s o l u t i o n a t pH . 0 .

[ 0 1 2 1 ] F o l l o w i n g

a d d i t i o n

o f t h e n a n o p a r ‘ t i c l e s t o t h e

p u r i

? e d


a n t i b o d i e s th e

m i x t u r e i s a g i t a t e d f o r 2 4

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

h o u r s a t

room

e m p e r a t u r e .

40 l o f a

g l y c i n e

s o l u t i o n ( 2

M

t

pH . 0 ) i s t h e n

a d d e d a n d t h e

m i x t u r e i s

a g i t a t e d f o r a f u r t h e r

4 hours at room e m p e r a t u r e .

[ 0 1 2 2 ] The a r t i c l e s a r e t h e n d i l u t e d

t o

t o t a l

volume f 100

ml

and

i a ? l t r a t e d

a g a i n s t

1000

ml

f

a

1 0

mM

o r a t e

and

1 5

mM

odium

c h l o r i d e

s o l u t i o n

a t pH 9 . 0 t o Which

0.1%

Tween@ 20 and

3

mg/ml

e g g

a l b u m i n

i s

added s i n g

a

P e l l i

con

XL l t e r ( c u t o f 3 0 0 , 0 0 0 )

and

a l a b s c a l e TFF s y s t e m

( a v a i l a b l e

f r o m M i l l i p o r e ) i n

a c c o r d a n c e

W i t h

t h e

i n s t r u c t i o n s

s u p p l i e d from h e i n s t r u m e n t s s u p p l i e r s .

The

e s i r e d c o n c e n

t r a t i o n

o f a n t i - c a l p r o t e c t i n

a n t i b o d y - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s i s

? n a l l y o b t a i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d r e - s u s p e n s i o n

o f

t h e

p a r t i c l e s i n s o l u t i o n .

Any

a g g r e g a t e s

f o r m e d

d u r i n g

t h i s


p r o c e d u r e may e

r e m o v ed b y

s l o W c e n t r i f u g a

t i o n .

( b ) A s s a y f o r


U s i n g

A n t i - C a l p r o t e c t i n

A n t i

b o d y - C o a t e d N a n o p a r t i c l e s

[ 0 1 2 3 ] A u s p e n s i o n c o m p r i s i n g 4 0 0

u g

o f t h e a b o v e - d e

s c r i b e d


n a n o p a r t i c l e s i n

5 0

u l

o f

a

1 0

mM

b o r a t e , 1 5

mM a C l ,

0.1% Tween@ 2 0 , 3

g / l e g g

a l b u m i n

s o l u t i o n a t pH . 0 i s p r e p a r e d .

[ 0 1 2 4 ]

S i m u l t a n e o u s l y ,

2 0 u l o f p l a s m a , t a k e n f r o m t h e

s u b j e c t b e i n g

t e s t e d

o r p o t e n t i a l f o r

CVD, n

5 0 0 a s s a y

b u f f e r

( 2 5

mM R I S ,

1 5 0

mM

a C l ,

0.1% Tween@

20 and

2 E G

6 0 0 0 a t pH 7 . 4 ( a v a i l a b l e f r o m S i g m a )

i s

p u t i n a r e a d i n g


o f

a r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r ( e . g . S h i

madzu

UV-160) and t h e l i g h t a b s o r p t i o n

o f

340 nm mono

c h r o m a t i c l i g h t

i s m e a s u r e d . A f t e r 6 0

, t h e

a b o v e - m e n t i o n e d

s u s p e n s i o n c o m p r i s i n g

4 0 0

o f a n t i b o d y - c o a t e d a n o p a r t i c l e s

i s a d d e d , a n d mixed

i n

t h e

c u v e t t e . The l i g h t

a b s o r p t i o n

i m m e d i a t e l y a f t e r a d d i n g

t h e

a n t i b o d y - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s

i s r e c o r d e d ,

a n d

a g a i n a t r e g u l a r i n t e r v a l s ( e . g . e v e r y 2 min

u t e s ) u n t i l a b o u t 1 5

m i n u t e s h a s

e l a p s e d .

The n c r e a s e

i n l i g h t

a b s o r p t i o n

a t

e a c h

t i m e - p o i n t

i s

c a l c u l a t e d

r e l a t i v e t o

t h e

r e a d i n g made r i o r

t o

t h e a d d i t i o n o f a n t i b o d y - c o a t e d n a n o

p a r t i c l e s a n d / o r

a t

t h e e n d

o f

t h e r ec o r d i n g . I n o t h e r

W o r d s ,

t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g s

i n

k i n e t i c mode o r

“ e n d - p o i n t ”

r e a d

i n g s a r e made.

[ 0 1 2 5 ] A a l i b r a t i o n c u r v e

i s

a l s o

c o n s t r u c t e d by c a r r y i n g

o u t

an i d e n t i c a l

p r o c e d u r e W i t h s t a n d a r d s

h a v i n g

a

knoWn


o f

a l p r o t e c t i n . The


o f

a l p r o t e c

t i n i n

t h e

sample can

t h e n

be c a l c u l a t e d

from

t h e

c u r v e .

EXAMPLE

T u r b i d i m e t r i c A s s a y

f o r


( a )


t r e p t a v i d i n - C o a t e d N a n o p a r t i c l e s

[ 0 1 2 6 ] 600

pm

f 4.2% W/v

c h l o r o m e t h y l

a c t i v a t e d nano

p a r t i c l e s

( d i a m e t e r

6 7

nm)

a v a i l a b l e

f r o m


Dynamic

C o r p o r a t i o n , US

a r e d i a l y s e d a g a i n s t W a t e r W i t h a

membrane h a v i n g

a

p o r e s i z e of 1 0 , 0 0 0 kD. 0 . 5

ml

o f

a

p h o s p h a t e ( 1 0

mM)

a n d

s o d i u m c h l o r i d e ( 1 5 0 mM) u f f e r

s o l u t i o n a t pH . 4 i s a d d e d t o g e t h e r W i t h 1 0 mg t r e p t a v i d i n ,

d i s s o l v e d i n 0 . 5

ml

f

a 1 0

mM h o s p h a t e and 1 5 0 mM aCl

b u f f e r s o l u t i o n

a t

pH 7 . 4

( a v a i l a b l e

f r o m P i e r c e C h e m i c a l

Company)

and h e

m i x t u r e s

a g i t a t e d t

room e m p e r a t u r e

f o r

2 4 h o u r s . 4 0 p a o f l y c i n e

s o l u t i o n

( 2 M , pH . 0 )

i s

t h e n a d d e d

and

t h e m i x t u r e i s

a g i t a t e d f o r

a

f u r t h e r

4 h o u r s a t room


[ 0 1 2 7 ]

The a r t i c l e s a r e

t h e n

d i l u t e d t o a

volume

of 100 ml

and

d i a ? l t r a te d , ? r s t l y i n

500

ml o f a 1 0

mM o r a t e and

1 5

mM

odium h l o r i d e so l u t i o n a t pH

. 0

and s e c o n d l y

i n

a 2 5

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

mM r i s , 1 5 0 mM odium c h l o r i d e and 0.01% Tween@

20

s o l u t i o n t pH . 4 ( a v a i l a b l e f r o m S i g m a US) s i n g a P e l l i c o n

XL i l t e r ( c u t o f f 3 0 0 , 0 0 0 ) a n d a l a b s c a l e

TTF

S y s t e m ( a v a i l

a b l e

f r o m

M i l l i p o r e ) i n a c c o r d a n c e W i t h t h e i n s t r u c t i o n s

s u p

p l i e d f r o m t h e i n s t r u m e n t s s u p p l i e r s . The

e s i r e d

c o n c e n t r a

t i o n

o f a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r t i c l e s

i s

? n a l l y

o b t a i n e d

b y

c e n t r i f u g a t i o n a n d r e - s u s p e n s i o n o f t h e p a r t i c l e s i n a 2 5 mM

TRIS, 150

mM odium h l o r i d e and

0 . 0 1 0

Tween@ 20 s o l u

t i o n . Any a g g r e g a t e s

f o r m e d

d u r i n g t h i s


p r o c e

d u r e may e r e m o v e d b y

s l o W c e n t r i f u g a t i o n .

[ 0 1 2 8 ] The mean a r t i c l e s i z e o f t h e s t r e p t a v i d i n c o a t e d

n a n o p a r t i c l e s

Was measured

o be 8 2 nm y

S i n t e f f AS,

N o r

W a y .

( b ) A s s a y f o r C a l p r o t e c t i n U s i n g

S t r e p t a v i d i n - C o a t e d

N a n o

p a r t i c l e s

[ 0 1 2 9 ]

A

u s p e n s i o n

h a v i n g

a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t

0 . 6 0

mg a r t i c l e s o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d a v i d i n - c o a t e d n a n o p a r

t i c l e s p e r m l i s p r e p a r e d b y

c e n t r i f u g a t i o n

a n d r e - s u s p e n s i o n

o f t h e a b o v e - d e s c r i b e d


i n a 2 5

mM

RIS, 1 5 0

mM a C l , 0.1% Tween@ 20 and

1

PEG 000 o l u t i o n t

pH

7 . 4

( a v a i l a b l e

f r o m

S i g m a ) .

5 0 0 1 . 1

o f

h i s

p a r t i c l e s u s p e n s i o n

i s

mixed

W i t h

a

p l a s m a

s a m p l e

( a b o u t

5

u l ) ,

t a k e n

f r o m

a

s u b j e c t

b e i n g

t e s t e d f o r

p r o p e n s i t y t o

CVD,

i n

a r e a d i n g


o f

a

r e c o r d i n g

s p e c t r o p h o t o m e t e r (eg a S h i

madzu. U V - 1 6 0 ) .

The

a b s o r p t i o n o f 560 nm onochromatic

l i g h t

i s

r e c o r d e d

a n d

a f t e r 6 0

s , 7 5

u g

o f


a n t i b o d y

l a b e l l e d W i t h 0 . 1 5

nmol

i o t i n ( e . g . b i o t i n l a b e l l e d

a ? i n i t y p u r i ? e d

e g g

p o l y c l o n a l

p u r c h a s e d f r o m

N o r W e g i a n

A n t i b o d i e s AS,

N o r W a y ) , d i l u t e d

i n 5 0 u l o f a 2 5

mM R I S ,

1 5 0 mM

aCl and 0.1%

Tween@

20 s o l u t i o n

a t

pH . 4 i s

added o t h e q u a r t z c u v e t t e and i x e d . The b s o r p t i o n

o f 340

nm

o n o c h r o m a t i c l i g h t i s i m m e d i a t el y r e c o r d e d

u s i n g

a

r e f e r e n c e c u v e t t e

c o n t a i n i n g

a

s o l u t i o n

o f 2 5

mM RIS,

1 5 0

mM

aCl

and 0.1% Tween@ 20

a t

pH

7 . 4 ,

and

a g a i n

a t

r e g u l a r n t e r v a l s ( e . g . e v e r y 2 m i n u t e s ) u n t i l a b o u t 1 5 m i n u t e s

h a s e l a p s e d . The i n c r e a s e i n a b s o r p t i o n a t e a c h t i m e p o i n t

i s

c a l c u l a t e d i n


s t a n d a r d t u r b i d i m e t r i c r e a d i n g

i n

k i n e t i c mode

r

“ e n d - p o i n t ” r e a d i n g s . T h a t s , t h e i n c r e a s e

i n

l i g h t

a b s o r p t i o n

a t

e a c h

t i m e - p o i n t

i s

c a l c u l a t e d

r e l a t i v e

t o

t h e r e a d i n g made

p r i o r

t o t h e a d d i t i o n o f a n t i b o d y - c o a t e d

n a n o p a r t i c l e s a n d / o r

a t

t h e e n d

o f

t h e r e c o r d i n g .

[ 0 1 3 0 ]

A a l i b r a t i o n c u r v e s c o n s t r u c t e d by

a r r y i n g o u t

a n

i d e n t i c a l p r o c e d u r e W i t h s t a n d a r d s h a v i n g a

knoWn

concen

t r a t i o n o f c a l p r o t e c t i n . The c o n c e n t r a t i o n o f c a l p r o t e c t i n i n

t h e sample can

h e n

be

a l c u l a t e d from h e


c u r v e .

EXAMPLE

( a )


n t i - C a l p r o t e c t i n A n t i b o d y

C o a t e d N a n o p a r t i c l e s

[ 0 1 3 1 ] 1

ml o f

4.2% W/v c h l o r o m e t h y l

a c t i v a t e d

n a n o p a r

t i c l e s

( m e a n

d i a m e t e r 6 7 nm) a v a i l a b l e f r o m


Dynamic

o r p o r a t i o n ,

U S ,

a r e d i a l y s e d a g a i n s t W a t e r W i t h

a

membrane

a v i n g a

p o r e

s i z e o f

1 0 . 0 0 0 k D ,

and

h e n

d i l u t e d

t o

1 0 ml W i t h W a t e r .

2 7

mg f p u r i ? e d

e g g

p o l y c l o n a l

a n t i

b o d i e s

( e . g .

a f ? n i t y

p u r i ? e d

e g g

p o l y c l o n a l

a n t i b o d i e s

a v a i l

a b l e f r o m

N o r W e g i a n

A n t i b o d i e s A S , N o r W a y ) a r e d i a l y s e d

a g a i n s t a 1 0 mM o r a t e and 1 5 mM odium c h l o r i d e b u f f e r

s o l u t i o n

and n a l l y

d i l u t e d

t o 6 ml

n

t h e same 1 0

mM

o r a t e

and 1 5

mM odium

h l o r i d e

s o l u t i o n a t p H : 9 . 0 .

[ 0 1 3 2 ]

Under a g i t a t i o n , t h e

p a r t i c l e s

a r e mixed W i t h

t h e

a n t i b o d i e s ,

and

g i t a t i o n

s

c o n t i n u e d

t

room e m p e r a t u r e

f o r

2 4

h o u r s . 4 0 u l

o f

a g l y c i n e s o l u t i o n ( 2 M

t

pH . 0 ) i s t h e n

added

and h e

mixture

s

a g i t a t e d

f o r a f u r t h e r

4 h o u r s

a t

room


[ 0 1 3 3 ]

The p a r t i c l e s a r e

t h e n

d i l u t e d t o a t o t a l volume of

1 0 0

ml

i n 1 0

mM

o r a t e ,

1 5

mM

odium c h l o r i d e b u f f e r

t o

Which

0.1% Tween@ 20 and

3

mg/ml e g g a l b u m i n i s added

a n d

d i a ? l t r a t e d a g a i n s t 1 0 0 0 ml o f s a i d b o r a t e / sodium

h l o

r i d e

b u f f e r t o Which

0.1%

Tween@

20

and 3 mg/ml

e g g

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

a l b u m i n i s a d d e d , u s i n g

a

P e l l i c o n XL

l t e r ( c u t o f f 3 0 0 . 0 0 0

D )

a n d a l a b s c a l e

TFF s y s t e m ( a v a i l a b l e f r o m

M i l l i p o r e )

i n

a c c o r d a n c e W i t h t h e i n s t r u c t i o n s s u p p l i e d

f r o m t h e

i n s t r u

ment u p p l i e r s ,

and

n t h e

end

h e p a r t i c l e s a r e c o n c e n t r a t e d to

a

volume

of

40

t o

100

m l .

[ 0 1 3 4 ] The

mean

d i a m e t e r o f t h e

p a r t i c l e s

o b t a i n e d Was

measured o b e 8 1 nm y S i n t e f f AS, N o r w a y .

( b )

A s s a y

f o r C a l p r o t e c t i n U s i n g n t i - c a l p r o t e c t i n

A n t i b o d y - C o a t e d N a n o p a r t i c l e s

[ 0 1 3 5 ] A u s p e n s i o n o f

0 . 7

mg/ml

o f

t h e a b o v e d e s c r i b e d


a n t i b o d y c o a t e d

p a r t i c l e s i s

made

i n 0 . 2 5

mM R I S ,

0 . 1 5 M

aCl and 0.1% TWeen t pH . 0 .

[ 0 1 3 6 ]

5

[ 1 . 1 o f a p l a s m a s a m p l e , t a k e n f r o m t h e s u b j e c t

b e i n g

t e s t e d

f o r CVD, s

d i s s o l v e d i n

a s s a y b u f f e r ( 4 6 0 1 . 1 2 5

mM

R I S , 1 5 0

mM

a C l , 0.1% W e e n , 1 . 0 %

p o l y e t h y l e n e g

l y c o l

6 0 0 0 ,

pH

. 4 )

i n

a r e a d i n g

q u a r t z c u v e t t e i n

a r e c o r d i n g

s p e c t r o p h o t o m e t e r ( e . g . S h i m a d Z u U V - 1 6 0 ) a n d t h e l i g h t

a b s o r p t i o n o f

5 6 0 nm onochromatic i g h t i s m e a s u r e d .

A f t e r

6 0 s ,

1 0 0 [ 1 . 1 o f

t h e a b o v e m e n t i o n e d s u sp e n si o n c o m p r i s i n g

0 . 7 m g / m l o f a n t i b o d y c o a t e d n a n o p a r t i c l e s

i s

a d d e d ,

a n d

mixed

n t h e c u v e t t e .

The

i g h t

a b s o r p t i o n

b e f o r e

a n d

imme

d i a t e l y a f t e r a d d i n g t h e


n a n o p a r t i c l e s i s

r e c o r d e d ,

a n d

a g a i n

a t

r e g u l a r

i n t e r v a l s

( e g . e v e r y

2 0 s ) u n t i l

1 5 m i n u t e s

h a s

e l a p s e d . The i n c r e a s e

i n

l i g h t a b s o r p t i o n a t

e a c h t i m e

p o i n t

i s

c a l c u l a t e d e l a t i v e

t o

t h e r e a d i n g made

r i o r

t o t h e ad d i t i o n o f

a n t i b o d y c o a t e d

n a n o p a r t i c l e s and t t h e end

o f t h e r e c o r d i n g . I n o t h e r W o r d s , t u r b i d i m e t r i c

r e a d i n g s

i n

k i n e t i c

mode a n d / o r “ e n d p o i n t ” r e a d i n g s

a r e

m a d e .

[ 0 1 3 7 ]

A a l i b r a t i o n

c u r v e i s

a l s o

c o n s t r u c t e d by c a r r y i n g

o u t

a n i d e n t i c a l

p r o c e d u r e W i t h s t a n d a r d s h a v i n g a

known

c o n c e n t r a t i o n s o f


The c o n c e n t r a t i o n o f c a l p r o

t e c t i n i b t h e sample can

t h e n

be c a l c u l a t e d from h e c u r v e .

EXAMPLE

S t a t i s t i c a l A n a l y s i s

C o m p a r i s o n o f a l p r o t e c t i n a n d

O t h e r

M a r k e r s

f o r D e t e c t i o n

of

o t e n t i a l

f o r

CVD

r P r o p e n s i t y

t o

CVD

[ 0 1 3 8 ]

C o r o n a r y

c a l c i ? c a t i o n h a s

b e e n

shoWn t o

b e

s t r o n g l y a s s o c i a t e d W i t h t h e o c c u r r e n c e o f

CVD

nd a s a l s o

been d e m o n s t r a t e d t o be a u s e f u l method f o r p r e d i c t i n g


CVD e . g .

m y c o c a r d i a l i n f a r c t i o n o r , s t r o k e ) .

[ 0 1 3 9 ] The x t e n t

o f

o r o n a r y c a l c i ? c a t i o n s

q u a n t i t a t i v e l y

m e a s u r e d

u s e d e l e c t r o n - b e a m c o m p u t e d

t o m o g r a p h y

(EBCT) a n d i s r e p r e s e n t e d b y

a

c a l c i u m s c o r e ( C S ) . A i g h

calcium

s c o r e r e p r e s e n t s a

high

l e v e l

of

a l c i ? c a t i o n and a

h i g h r i s k o f d e v e l o p i n g

CVD.

[ 0 1 4 0 ] I n t h e

f o l l o W i n g

s t u d y t h e CS o f

2 0 0

s u b j e c t s ( 1 0 0

c o n t r o l s h a v i n g a C S <100

and 100

c a s e s h a v i n g a C S >100)

aged 45 o r

g r e a t e r

Was

t e s t e d

a s W e l l

a s t h e i r c a l p r o t e c t i n ,

CRP n d h o m o c y s t e i n e p l a s m a o r

serum

e v e l s . The s u b j e c t s

Were e i t h e r s e l f -

o r

p h y s i c i a n - r e f e r r e d asymptomatic i n d i

v i d u a l s and

had had

an EBCT

c a n W i t h i n t h e p r e v i o u s 2 y e a r s

( u s u a l l y W i t h i n t h e p r e v i o u s 6 m o n t h s ) t o t e s t i n g o f

t h e i r

plasma

o r

serum f o r t h e


o f

c a l p r o t e c t i n ,

CRP

a n d

h o m o c y s t e i n e .

Methods


[ 0 1 4 1 ] C a l p r o t e c t i n W a s m e a su r e d b y

t h e C a l p r e s t ® t e s t

( d i s t r i b u t e d

b y

E u r o s p i t a l ® , I t a l y ) a n d d a t a

W e r e su m m a r i s e d

f o r

t h e p a t i e n t a n d t h e

c o n t r o l

g r o u p u s i n g s t a n d a r d

d e v i a t i o n ,

m e d i a n , minimum a n d maximum. 9 5%

con?dence

n t e r v a l s

f o r median Were c a l c u l a t e d . The n d e r s o n - D a r l i n g c a l c u l a

t i o n W a s used

a s

a t e s t f o r n o r m a l i t y .

[ 0 1 4 2 ] C a l p r o t e c t i n

W a s a l s o s u m m a r i s e d

b y

g e n d e r

u s i n g

t h e

same s u mma r y

s t a t i s t i c s .

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

C a l c i u m S c o r e ( C S )

[ 0 1 4 3 ]

Calcium

s c o r e

Was d e t e r m i n e d by

Electron-Beam

Computed o m o g r a p h y (ERCT) s c a n n i n g .

D a t a

f o r c a s e a n d

c o n t r o l

groups

Were summarised.

High

S e n s i t i v e

C - R e a c t i v e

P r o t e i n

( h s C R P )

hsCRP

Was

d e t e r m i n e d b y D a d e

B e h r i n g ’ s “N

H i g h

S e n s i t i v i t y CRP”

a s s a y

( R o b e r t s

e t a l . , C l i n i c a l C h e m i s t r y , 2 0 0 0 , 4 6 : 4 , p

4 6 1

4 6 8 ) . D a t a Were summarised

f o r

t h e

p a t i e n t

and

t h e

c o n t r o l

g r o u p s u s i n g

m e a n , s t a n d a r d

d e v i a t i o n , m e d i a n , minimum

and

maximum.

H o m o c y s t e i n e

( H y c )

[ 0 1 4 4 ]

P l a s m a H o m o c y s t e i n e ( H c y ) W a s d e t e r m i n e d

b y t h e

A b b o t t

I M x method

( S h i p c h a n d l e r ,

M .

.

a n d Moore E .

G . ,

C l i n i c a l C h e m i s t r y , 1 9 9 5 , 4 1 : 7 , p . 9 5 1 - 9 9 4 ) .

D a t a Were

sum

m a r i s e d f o r t h e p a t i e n t a n d t h e c o n t r o l g r o u p s u s i n g s t a n d a r d

d e v i a t i o n ,

m e d i a n , minimum

a n d

maximum.

C o m p a r i s o n

B e t W e e n

C s a n d

C a l p r o t e c t i n , h s C R P ,

Hcy

( i ) C h i - S q u a r e d

[ 0 1 4 5 ]

The

h i - s q u a r e d e s t

Was

used o t e s t f o r

c o v a r i a n c e

b e t W e e n p a i r s

o f

m a r k e r s .

( i i ) O d d s R a t i o

[ 0 1 4 6 ] The o d d s r a t i o u s e d W i t h t h e 2x2

c r o s s - t a b u l a t i o n

( i e t h e

c h i - s q u a r e d

t a b l e ) i s t h e r a t i o o f t h e o d d s o f t W o t e s t s

c o - v a r y i n g

to t h e o d d s

o f

tWo e s t s d i s a g r e e i n g .

T h e r e f o r e , t h e

odds r a t i o ma y be i n t e r p r e t e d

a s

a

measure bf

h e

magnitude

of s s o c i a t i o n

betWeen

h e tWo e s t s .

[ 0 1 4 7 ] Odds a t i o Was c a l c u l a t e d f o r C S e r s u s c a i p r o t e c

t i n , hsCRP a n d H c y r e s p e c t i v e l y .

Comparison f Median a l u e s o f t h e

M a r k e r s

( i ) M a n n - W h i t n e y T e s t

[ 0 1 4 8 ]

T h i s i s

a

n o n - p a r a m e t r i c

( t h e d a t a d o e s

n o t

need o

be

o r m a l l y d i s t r i b u t e d )

Which

Was s e d

t o

t e s t i f t h e

median

v a l u e s of tWo m a r k e r s

a r e s i g n i ? c a n t l y

d i f f e r e n t . M i n i t a b

r a n k s a l l t h e d a t a from o t h s e t s

o f

d a t a i n o r d e r , a s s i g n i n g 1

t o

t h e l o W e s t up

o

200

o r

t h e

h i g h e s t .

The s o f t W a r e t h e n

a d d s

up t h e r a n k - s c o r e f o r t h e tWo

g r o u p s t o be

compared

and

r e p o r t s

t h e

“P”

a l u e

Which

n d i c a t e s

t h e

c h a n c e

t h a t

random

s a m p l i n g Would e s u l t i n medians s f a r a p a r t a s t h a t o b s e r v e d

i n t h e

e x p e r i m e n t .

[ 0 1 4 9 ]

C a l p r o t e c t i n , hsCRP

a n d

Hcy m e d i a n v a l u e s Were

compared

t o C S s p l i t i n t o

c a s e and

c o n t r o l g r o u p s

and t h e

Mann-Whitney e s t Was

used

o t e s t f o r s i g n i ? c a n c e .

( i i )

R O C - c u r v e s

f o r C a l p r o t e c t i n a n d

C a l c i u m

S c o r e

[ 0 1 5 0 ] The a b i l i t y of t e s t t o d i s c r i m i n a t e d i s e a s e d c a s e s

from normal a s e s c a n be v a l u a t e d u s i n g R e c e i v er O p e r a t i n g

C h a r a c t e r i s t i c (ROC) u r v e a n a l y s i s . ROC u r v e

a n a l y s i s

Was

used o r b o t h

c a l p r o t e c t i n and

hsCRP and s a comparison f

t h e tWo m a r k e r s .

[ 0 1 5 1 ] The ROC u r v e s Were

p r o d u c e d u s i n g

1 1 c u t - o f f

l i m i t s

f o r c a l c u l a t i o n o f

t h e

s e n s i t i v i t y ( y - a x i s ) a n d t h e

1 - s p e c i ? c i t y ( x - a x i s ) .

The

a t a

f r o m

t h e c o n t r o l and h e

c a s e

g r o u p s

Were o o l e d

t o g e t h e r

and a n k e d f r o m

l o W e s t t o

h i g h

e s t

v a l u e .

A n a l y s i s

Was

e r f o r m e d

on

h e

o t a l

p o p u l a t i o n

and

on

h e

male o p u l a t i o n . The r e a s under h e ROC

urves

W e r e

c a l c u l a t e d u s i n g t h e t r a p e Z o i d a l r u l e .

R e s u l t s

Summary t a t i s t i c s f o r C a l p r o t e c t i n

[ 0 1 5 2 ] F I G . 1 shoWs

t h e

d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r a l l 200

s u b

j e c t s t e s t e d .

[ 0 1 5 3 ]

T a b l e

1

beloW shoWs

t h e

summary

s t a t i s t i c s f o r


i n t h e

c o n t r o l

and

t h e c a s e

g r o u p s .

The

median

c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e c o n t r o l g r o u p i s 0 . 3 1 mg/L

compared o 0 . 3 8

mg/L

n t h e

c a s e

g r o u p .

The

median a l p r o

t e c t i n c o n c e n t r a t i o n s 0 . 3 1

mg/L o r

t h e m a l e s

a n d

0 . 3 0

mg/L

f o r

t h e f e m a l e s i n t h e c o n t r o l g r o u p . I n t h e c a s e group t h e

m e d i a n

c a l p r o t e c t i n c o n c e n t r a t i o n f o r m a l e s i s 0 . 3 9 mg/L

c o m p a r e d t o 0 . 3 1 mg/L

f o r f e m a l e s .

7/27/2019 US20110318847.pdf


US

2 0 1 1 / 0 3 1 8 8 4 7 A1 D e c . 2 9 ,

2 0 1 1

TABLE

Summary t a t i s t i c s f o r


C o n t r o l s Cases

C a l p r o t e c t i n A l l F e m a l e s

M a l e s

A l l

F e m a l e s M a l e s

N

100

59 4 1 100

1 5

8 5

SD 0 . 2 2 8 0 . 2 3 2 0 . 2 2 5 0 . 5 0 3 0.202 0 . 5 3 7

95 CI f o r median 0 . 2 8 - 0 . 3 4 0 . 2 8 - 0 . 3 3 0 . 2 7 - 0 . 3 9 0 . 3 4 - 0 . 4 3 0 . 1 9 - 0 . 4 7 0 . 3 4 - 0 . 4 5

Median ( m g / L ) 0 . 3 1 0 . 3 0

0 . 3 1

0 . 3 8

0 . 3 1

0 . 3 9

Min

( m g / L ) 0 . 0 9 0 . 0 9

0 . 1 1

0 . 0 7 0 . 0 8 0 . 0 7

Max m g / L ) 1 . 3 7 1 . 3 7

1 . 3 6

4 . 8 5 0. 7 3 4 . 8 5

Summary t a t i s t i c s f o r C a l c i u m S c o r e

[ 0 1 5 4 ]

F I G .

2

shows


a l l 200

s u b

j e c t s

t e s t e d .

[ 0 1 5 5 ]

T a b l e

2 below shows

t h e

summary


EBCT

calcium

s c o r e

i n

t h e c o n t r o l

and

c a s e g r o u p s .

The

median

a l c i u m

s c o r e i n t h e

c o n t r o l g r o u p i s 0

compared

t o

259 n

t h e

c a s e g r o u p . The median

calcium

s c o r e i s

0

o r

both

f e m a l e s and m a l e s i n

t h e

c o n t r o l g r o u p and 315 and

2 5 6 ,

r e s p e c ti v e l y , i n t h e c a s e g r o u p .

TABLE

Summar y

t a t i s t i c s f o r Calcium

s c o r e


Calcium s c o r e A l l Females Males A l l

Females

Males

N

100

59

41 100 1 5 8 5

SD

5 . 6

0 . 7 8 . 7 474.7

3 6 5 . 1

4 9 3 . 3

95

CI

f o r median

0 - 0

0 - 0 0 - 0

3 1 3 . 5 - 2 1 5 . 0 1 7 4 . 8 — 5 38 . 0 3 0 0 . 4 — 2 0 7 . 5

Median

0 0 0 259 315 256

Min 0 0 0 100 100 100

MaX 56 5 56 2 7 94 1507 2794

Summary

t a t i s t i c s f o r hsCRP

[ 0 1 5 6 ]

F I G .

3

shoWs


a l l 200

s u b


[ 0 1 5 7 ]

T a b l e

3

beloW shoWs

t h e

summary


hsCRP

n t h e c o n t r o l and a s e

g r o u p s .

The

median

hsCRP

n

b o t h

t h e c o n t r o l

g r o u p and

t h e

c a s e

g r o u p i s 1 . 2

mg/L. The

median

hsCRP i s 1 . 6 mg/L

f o r

f e m a l e s a n d 0 . 7 mg/L

f o r

m a l e s i n t h e c o n t r o l g r o u p a n d

1 . 3

mg/L a n d 1 . 1 m g / L ,

r e s p e c ti v e l y , i n t h e c a s e g r o u p .

TABLE

Summary

t a t i s t i c s

f o r hsCRP


hsCRP A l l

Females Males

A l l

Females Males

N 100 59 41 100 1 5 8 5

SD 6 . 6 3

8 . 3 6

1 . 5 3 1 2 . 7 0 3 . 1 6

1 3 . 7 1

95

CI

f o r median 0 . 7 9 - 1 . 4 7 1 . 3 6 - 2 . 7 4 0. 5 6 - 0 . 9 7 0 . 9 4 - 1 . 5 6 0 . 6 5 - 2 . 5 3 0 . 8 9 - 1 . 5 9

Median

( m g / L )

1 . 1 7 1 . 5 9

0 . 6 8

1 . 2 3 1 . 2 8

1 . 1 1

Min ( m g / L ) 0 . 1 5 0 . 1 5 0 . 1 5 0 . 1 7 0 . 3 4 0 . 1 7

Max m g / L )

6 2 . 1

6 2 . 1 9 . 2 9 1 2 0 . 0

1 1 . 9

1 2 0 . 0

7/27/2019 US20110318847.pdf


US 2011/0318847

A 1

1

2

Summary t a t i s t i c s f o r Hcy

[ 0 1 5 8 ] F I G . 4 shows t h e d i s t r i b u t i o n c u r v e f o r

a l l 200

s u b


[ 0 1 5 9 ]

T a b l e 4

b e l o w s h o W s

t h e

summary

t a t i s t i c s

f o r

Hcy

i n t h e c o n t r o l

and

a s e

g r o u p s .

The

median Hcy


i n t h e c o n t r o l g r o u p i s

7 . 5

u m o l / L compared o 8 . 5 u m o l / L

i n

t h e

c a s e

g r o u p .

The

median

Hcy


s

7 . 1 5

umol/L

f o r f e m a l e s and . 5 5

mol/L

o r

m a l e s

i n

t h e c o n t r o l g r o u p and

7 . 3 5

umol/L a n d 8 . 5 5 u m o l / L r e s p e c t i v e l y i n t h e

c a s e g r o u p .

TABLE

Summary

t a t i s t i c s

f o r Hcv


Hcy A l l F e m a l e s

M a l e s

A l l F e m a l e s

M a l e s

N 100 59 41 100

1 5

8 5

SD 1 . 9 4 1 . 5 8 2 . 1 8 6 . 0 3 2 . 1 8 6 . 4 6

95 CI 7 . 7 - 8 . 5 7 . 1 - 7 . 9 8 . 1 - 9 . 5 8 . 1 - 1 0 . 6 . 8 - 9 . 2 8 1 - 1 0 9

f o r median

Median 7 . 5 7 . 1

8 . 5

8 . 5 7 . 3 8 . 5

( p I n o l / L )

Min

( p I n o l / L ) 5 . 3 5 . 3 5 . 3 5 . 1 5 . 1 5 . 2

Max

p I n o l / L ) 1 4 . 7 1 1 . 8 1 4 . 7

6 5 . 8 1 2 . 4 6 5 . 8

C o m p a r i s o n b e t W e en

c a l c i u m s c o r e

a n d

a l p r o t e c t i n ,

h s C R P ,

H c y

( i ) C h i - S q u a r e d

T e s t

[ 0 1 6 0 ] U s i n g M i n i t ab , c h i - s q u a r e d t a b l e s W e r e

p e r f o r m e d

( s e e

t a b l e

5 b e l o W ) . T h i s

e s t

c o m p a r e s e x p e c t e d d i s t r i b u t i o n s

betWeen

s e t s

o f

d a t a ( a s s u m i n g a

random d i s t r i b u t i o n ) and

t h o s e o b s e r v e d .

The

s i g n i ? c a n c e v a l u e

i s

a

measure

o f

t h e

d e g r e e t o Which t h e d a t a

i s n o t

randomly d i s t r i b u t e d . F o r

e x a m p l e ,

c o n s i d e r i n g

t h e

d a t a

f o r

c a l p r o t e c t i n p o s i t i v e i t

Would e

e x p e c t e d

t h a t t h e r e Would e

an

even p i l t betWeen

c a l c i u m

p o s i t i v e

a n d

n e g a t i v e

( i . e .

3 0 . 5

e x p e c t e d

i n b o t h

c o l u m n s ) .

T h e o b s e r v e d s p l i t , h o W e v e r ,

i s

2 2 n e g a t i v e a n d 3 9

p o s i t i v e

i n d i c a t i n g

a

t e n d e n c y

f o r t h e c a l p r o t e c t i n p o s i t i v e s

t o

c o - v a r y

W i t h

t h e

c a l c i u m p o s i t i v e s .

[ 0 1 6 1 ] M i n i t a b

p r o v i d e s a n

o v e r a l l

measure o f

t h e s i g n i ?

c a n c e

o f t h e s e d i f f e r e n c e s ( b o t h a g r e e m e n t

a n d

d i s a g r e e

ment)

and

i n t h i s c a s e P s 0 . 0 0 9 . Thus t h e r e

i s

a s i g n i ? c a n t

c o - v a r i a t i o n o f c a l c i u m W i t h c a l p r o t e c t i n .

TABLE

C h i - S q u a r e comparison of a l p r o t e c t i n v e r s u s Calcium

s c o r e

C a l c i u m ( c o 1 0 0 )


N e g a t i v e

P o s i t i v e A l l

( c o 0 . 4 5 m g / L )

( N ) ( N ) ( N )

N e g a t i v e Obs 7 8

6 1

1 3 9

Exp 6 9 . 5 6 9 . 5

1 3 9

P o s i t i v e

O bs

22 39

6 1

Exp 3 0 . 5

3 0 . 5 6 1

A l l O bs

100 100

200

Exp 1 0 0 1 0 0 200

[ 0 1 6 2 ]

A n

a n a l o g o u s c o m p a r i s o n Was made

b e t W e e n

c a l p r o t e c t i n a n d hsCRP s e e

T a b l e

6

b e l o W ) .

D e c . 2 9 , 2 0 1 1

TABLE

C h i - S q u a r e

c o m p a r i s o n

o f a l p r o t e c t i n

versus hsCRP

P =

0 )

hsCRP

( c o

1 . 6 9 m g / L )

C a l p r o t e c t i n N e g a t i v e

P o s i t i v e A l l

( c o 0 . 4 5

m g / L ) ( N ) ( N ) ( N )

N e g a t i v e Obs 1 0 0 3 9

1 3 9

Exp 8 8 . 9 6 5 0 . 0 4

1 3 9

P o s i t i v e O bs

28 33

6 1

Exp 3 9 . 0 4 2 1 . 9 6 6 1

A l l O bs

128 72

200

Exp 1 2 8

7 2

200

( i i )

O d d s R a t i o

[ 0 1 6 3 ] Odds a t i o s can

e

d e r i v e d

from a b l e s 5 and 6 and

g i v e

a

measure

of

hoW

f a r

t h e

v a l u e s

observed

d e v i a t e

from

t h e e x p e c t e d . I f t h e e x p e c t e d a g r e e m e n t ? g u r e s

a r e

m u l t i p l i e d

t o g e t h e r

a n d

d i v i d e d

b y

t h e

p r o d u c t o f

t h e

d i s a g r e e m e n t

e x p e c t e d ? g u r e s

a

v a l u e o f

s h o u l d

b e

o b t a i n e d .

[ 0 1 6 4 ] T a k i n g t h e d a t a i n T a b l e 6 ,

f o r

i n s t a n c e , t h e o d d s

r a t i o on t h e e x p e c t e d v a l u e s i s 1 : ( 8 8 . 9 6 > < 2 1 . 9 0 / ( 5 0 . 0 4 > < 3 9 .

0 4 ) . 1 9 5 3 . 6 4 / 1 9 5 3 . 6 : 1 .

[ 0 1 6 5 ] The o d d s r a t i o

o b s e r v e d i n

t h i s

t a b l e

i s :

( l 0 0 > < 3 3 ) /

( 3 9 x 2 8 ) : 3 3 0 0 / 1 0 9 2 : 3 . 0 2 .

[ 0 1 6 6 ]

The

f u r t h e r t h e o d d s r a t i o from 1 t h e

more p r o

nounced h e

c o - v a r i a t i o n ; a n o d d s

r a t i o

o f

3

i s s i g n i ? c a n t .

[ 0 1 6 7 ] The e s u l t s of an odds

r a t i o

a n a l y s i s c a r r i e d o u t on

t h e c o - v a r i a n c e

d a t a

o b t a i n e d from t h e s t u d y a r e shoWn i n

T a b l e

7 .

TABLE

Summary f

O d d s - R a t i o

? n d i n g s

R i s k m a r k e r s

Odds

a t i o

( N l # p o s , N 2 # n e g ) C a l c i u m C a l p r o t e c t i n

CRP

Calcium Score

(co

100)

Calprotectin (co 0.45 mgL) 2. 27 i i

CRP c o 1 . 6 9 mgL)

1 . 0 0 3 . 0 2 i

Hcy c o 1 2 p I n o l / L ) 1 . 2 1 1 . 3 2 1 . 5 2

N1 =11,N2 = 1 8 9

( c o

10

p I n o l / L ) 1 . 6 3 1 . 5 5 1 . 1 2

co =

cutoff

[ 0 1 6 8 ]

A i g h

o d d s r a t i o

i n d i c a t e s a h i g h

d e g r e e

o f

c o

v a r i a t i o n betWeen h e e s t s . I t canbe e e n from a b l e 7 t h a t t h e

t e s t f o r c a l p r o t e c t i n g i v e s t h e h i g h e s t o d d s r a t i o t o c a l c i u m

s c o r e and h e r e f o r e t

can be

deduced h a t c a l p r o t e c t i n

h a s

t h e

h i g h e s t d e g r e e o f c o v a r i a n c e W i t h c a l c i u m

s c o r e

o u t o f

c a l p r o t e c t i n , CRP n d h o m o c y s t e i n e .

[ 0 1 6 9 ] A d d i t i o n a l l y ,

c a l p r o t e c t i n g i v e s a h i g h o d d s

r a t i o

W i t h

CRP,

a n o t h e r m a r k e r

f o r C V D .

C h i - S q u a r e d n a l y s i s U s i n g M i n i t a b

[ 0 1 7 0 ]

A h i - s q u a r e d e s t

on h e

a b o v e

d a t a ,

u s i n g

t h e

same

c u t - o f f s a s th e o d d s - r a t i o t e s t , shoWed s i g n i ? c a n t ( P 0 . 0 0 9 )

a g r e e m e n t

betWeen t h e c a l c i u m s c o r e and c a l p r o t e c t i n

7/27/2019 US20110318847.pdf


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