universitatea de medicina si farmacie - umfiasi.ro doctorat/rezumat... · over) şi replicarea...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE
“Grigore T. Popa”-IASI
Specializarea Biochimie
REZUMAT
TEZA DE DOCTORAT
MECANISME MOLECULARE IMPLICATE IN
LEZAREA SI REPARAREA ADN
CONDUCATOR STIINTIFIC
Prof. Univ. dr MIRCEA GRIGORE RUSU
Doctorand,
Gabriela Bordeianu
2
PARTEA I –STADIUL CUNOAŞTERII
Capitolul I- Date teoretice referitoare la mecanismele moleculare de
reparare a ADN-ului
1.1 Date generale despre drojdia fisipară S. pombe
1.2 Ciclul celular
1.3 Căile de checkpoint la S. Pombe
1.4 Căi de reparare ale leziunilor ADN
1.4.1 Repararea directă
1.4.2 Repararea prin excizie de nucleotide
1.4.3 Repararea prin excizie a leziunilor determinate de radiaţiile
ultraviolete în S. pombe
1.4.4 Repararea prin excizia bazelor (BER)
1.4.5 Repararea nepotrivirilor de baze (MMR)
1.4.6 Repararea rupturilor dublu catenare
1.4.6.1 Unirea neomologă a capetelor leziunii (NHEJ)
1.4.6.2 Alinierea monocatenară (SSA)
1.4.6.3 Mecanismul recombinării omologe
1.5 Senzorii leziunilor ADN şi a blocajului replicării
1.6 Transducerea semnalului de checkpoint
1.7 Tintele căilor de checkpoint
1.8 Reglatorii ciclului celular
1.9 Consecinţele leziunilor dublu catenare
Capitolul II - Date teoretice privind structura şi funcţia proteinei Rad
52 precum şi a ortologului Rad22 la Schizosaccharomyces pombe
PARTEA II- Studiul funcţiei proteinei Rad22 la drojdia fisipară S.
pombe prin analiza a doi mutanţi rad22
Capitolul III - Realizarea unor tulpini de S. pombe cu mutaţii rad22 şi
etichetă fluorescentă ataşată.
3.1 Construcţia tulpinilor cu proteina Rad22 etichetată la
capătul C- terminal
3.1.1 Introducere
3.1.2 Material şi metodă
3
3.1.2.1 Pregătirea plasmidului pAW8-rad22 pentru etichetarea ulterioră
cu yEGFP
3.1.2.2 Ataşarea secvenţei EGFP la gena rad22
3.2 Construcţia tulpinilor cu proteina Rad22 etichetată
la capătul N- terminal
3.2.1 Introducere
3.2.2 Material şi metodă
3.2.2.1 Etichetarea rad22 la capătul N-terminal
3.2.2.2 Verificarea tulpinilor cu proteina Rad22 etichetată cu EGFP
prin Western blot
3.2.3 Discuţii
3.2.4 Concluzii
Capitolul IV - Studiul fenotipului mutanţilor rad22_D240A E241A şi
rad22_trunc
4.1 Compararea tulpinilor rad22_D240A E241A şi
rad22_trunc cu tulpina cu deleţia rad22.
4.1.1 Introducere
4.1.2 Material si metodă
4.1.3 Rezultate şi discuţii
4.2 Evidenţierea prin microscopie cu fluorescenţă a
etichetei EGFP la tulpinile sălbatice, precum şi la rad22 cu mutaţii
4.2.1 Introducere
4.2.2 Material şi metodă
4.2.3 Rezultate
4.2.4 Discuţii
4.2.5 Concluzii
Capitolul V- Determinarea frecvenţei de recombinare prin SSA în
cazul mutanţilor rad22
5.1 Determinarea frecvenţei de recombinare prin SSA cu
sistemul urg1:: Purg1lox-HO, LEU-HOcs-his3+-λ-EU2, his3-D1,
leu1-32 în cazul mutanţilor rad22
5.1.1 Introducere
5.1.2 Material şi metodă
4
5.1.2.1 Introducerea sistemului urg1:: Purg1lox-HO, LEU-HOcs-
his3+-λ-EU2, his3-D1, leu1-32 în tulpinile cu mutaţii în gena rad22
5.1.2.2 Inducerea endonucleazei HO cu uracil în tulpinile cu mutaţii la
rad22
5.1.3 Rezultate şi discuţii
5.2 Determinarea frecvenţei de recombinare indusă la
tulpinile cu mutaţii în gena rad22 şi purtatoare ale sistemului LEU-
HOcs-his3+-λ-Eu2 HO-DSR
5.2.1 Introducere
5.2.2 Material şi metodă
5.2.3 Rezultate
5.2.4 Discuţii
5.2.5 Concluzii
Capitolul VI - Studierea mutantului rad22_trunc cu ajutorul
reporterului de recombinare ade6-L469/pUC8/his3+/ade6-M375.
6.1Introducere
6.2 Material şi metodă
6.3 Rezultate
6.4 Discuţii
6.5 Concluzii
Discuţii generale
Concluzii generale
Anexă
BIBLIOGRAFIE
Stadiul cunoaşterii
Rupturile bicatenare ale ADN-ului celular sunt leziuni
frecvente care se produc în timpul replicării normale dar şi rezultate ale
agresiunii unor agenţi precum radiaţiile ionizante sau genotoxinele
(între care multe substanţe folosite pentru terapia cancerului). Rupturile
bicatenare sunt supuse procesului de reparare care, în general, este
5
benefic deoarece scade probabilitatea de apariţie a mutaţiilor cu 2-3
ordine de marime, dar uneori are şi potential oncogenetic.
Studiul lor detaliat este important pentru desluşirea şi prevenirea
acestui potential.
Există două categorii de mecanisme de reparare a rupturilor bicatenare:
ligaturarea non-homologă a capetelor (Non homologous end–joining
NHEJ) şi recombinarea omologă (Homologous recombination HR) (1).
HR are potenţial oncogenetic mai scăzut decât NHEJ dar nu
neglijabil. Recombinarea omologă are mai multe mecanisme posibile
(Fig.1) cu potential oncogenetic diferit (2). Recombinarea omologă
(HR) poate fi implicată în oncogeneză din două puncte de vedere: 1)
eşecul său poate avea ca efect apariţia unei mutaţii cu caracter
oncogenetic sau implicarea unui mecanism alternativ de reparare ce
eventual poate realiza rearanjări genice masive (cu potenţial
oncogenetic) şi 2) prezenţa sa poate determina o pierdere a statusului
heterozigot – parte importantă a procesului de oncogeneză. Diferitele
căi alternative implicate: aliniere monocatenară dependentă de sinteză
(SDSA – synthesis dependent strand annealing), repararea prin
rezoluţia cu crossing over a rupturilor bicatenare (DSBR+ crossig-
over) şi replicarea indusa de ruptură (BIR - break induced replication)
(Fig.1) asociază potenţiale oncogenetice diferite tocmai în masura în
care crează statusul homozigot în cazul unei gene supresoare de tumoră
aflată înaintea procesului în status heterozigot. SDSA determină o
pierdere a statusului homozigot doar în imediata apropiere a leziunii
reparate – o leziune heterozigotă la nivelul unei gene supresoare de
tumori capată caracter homozigot doar dacă leziunea o interesează în
mod direct sau se află în imediata sa apropiere. Probabilitatea de
apariţie a unei astfel de leziuni este redusă, drept pentru care se poate
considera că SDSA are un potenţial oncogenetic neglijabil. Pe de altă
parte Crossing over şi BIR determină înlocuiri de fragmente de
dimensiuni mari și probabilitatea transformării statusului heterozigot în
homozigot pentru o alelă supresoare mutantă fiind mare ceea ce face ca
riscul oncogenic asociat acestor mecanisme să fie important. Din
aceste motive este evident că anumite boli cu determinism genetic (de
6
tipul sindroamelor Bloom, Werner și Rothmund-Thomson) asociază
mutații cu pierdere a funcției la nivelul genelor pentru helicaze (3).
Pierderea funcției helicazelor reduce capacitatea de reparare prin
SDSA și promovează mecanismele de tip BIR sau DSBR cu crossing-
over (Fig 1).
Figura 1. Modalităţi de reparare a rupturilor bicatenare ale ADN (prelucrat
după Symington 2002) (2). Principalele procese sunt figurate schematic şi
prezentate cu un text scurt iar unele din proteinele care participă sunt
menţionate în paranteze. Toate modalitătile sunt iniţiate de procesarea
capetelor bicatenare prin scurtarea extremităţii 5’ a uneia din catene ca să
rezulte o coadă monocatenară terminată cu 3’ a celeilalte catene. Aceasta
procesare este făcută de complexul MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) şi de nucleaze
precum CpIP. Coada monocatenară este coafată de proteina replicativa A
(RPA). (A) In modalitatea DSBR cozile monocatenare terminate cu 3’ OH
ale ambelor capete, coafate cu RPA, invadează duplexul homolog intact (o
cromatidă-soră sau un cromozom homolog sau repetiţie homologă a aceleiaşi
cromatide; în acest proces proteinele Rad51 şi Rad52 au un rol important) şi
primează sinteza ADN care completează golurile rămase după procesarea
precedentă. După ligare se formează două joncţiuni Holyday care pot fi
rezolvate prin clivaj endonucleolitic ca să rezulte rezoluţie cu cross-over sau
fără cross-over, după locurile unde se face clivajul (teoretic, alegerea este
random şi are şanse egale). (B) In modalitatea SDSA, coada monocatenară 3’
a unuia din capete invadează duplexul homolog (proces dependent de Rad51
şi Rad52 şi alte proteine) formând bucla D care se poate extinde prin sinteza
ADN pornind de la extremitatea 3’ a catenei invadante sau se poate deplasa în
7
sensul sintezei sau în sens invers. Catena alungită este ulterior desfăcută de
noua matriţă şi revine la vechea matriţă (proces la care participă Rad54 şi o
serie de helicaze). După ligare, ADN duplu catenar este restaurat în intregime
la forma iniţială. (C) Paşii iniţiali în modalitatea BIR sunt aceiaşi ca în
modalitatea SDSA , dar sinteza ADN continuă pînă la extremitatea
cromosomului folosind catenele duplexului invadat ca matriţe. (D) In
modalitatea SSA, care se produce atunci cînd ruptura bicatenară se întîmplă
între două secvenţe repetitive, procesarea capetelor este extinsă pînă la cele
două secvenţe repetitive; acestea se aliniază prin complementare iar părţile
necomplementare sunt excizate endonucleolitic. Rezultă după ligare numai
una din secvenţele repetate; cealaltă împreună cu secvenţa dintre repetiţii se
pierde. Modalitatea SSA nu depinde de Rad51 dar depinde de Rad52. In
scheme, extremităţile 3 sunt figurate ca vârfuri de sageată (2).
Faptul că repararea leziunilor ADN prin recombinare homologă
poate fi pusă în raport cu oncogeneza, dă importanţă elucidarii
mecanismelor de reparare. Studiul reparării leziunilor prin recombinare
poate fi făcut la celule de metazoare (cu potenţial oncogenetic), dar
acest studiu este extrem de complex. Din fericire, multe din aceste
mecanisme ca şi proteinele participante sunt bine conservate în specii
de eucariote foarte diferite şi chiar procariote. Astfel abordarea lor la
organisme simple şi manipulabile genetic precum drojdiile poate duce
la lămurirea multor aspecte fundamentale general valabile, rămânând
ca studiul pe organismele complexe să lămurească problemele
specifice. Cele mai numeroase investigaţii au fost făcute pe drojdia de
bere Saccharomyces cerevisiae. Un alt organism model pe care aceste
studii se pot face este drojdia fisipară Schizosaccharomyces pombe.
Din multe puncte de vedere, acest organism este mai apropiat de
metazoare (4).
În studiul de faţă am urmărit funcţia proteinei Rad22 folosind
câteva variante ale acestei proteine, obţinute prin modificări la nivelul
genei rad22 la drojdia Schizosaccharomyces pombe. Proteina Rad22
este ortolog cu proteina Rad52 la om şi S. cerevisiae. Rad22 are 35%
similaritate şi 30% identitate cu proteina Rad52 de la S. cerevisiae. Cea
mai bună conservare este la nivelul regiunii N-terminale ce conţine un
domeniu Rad52/22 de omologie comună tuturor membrilor
8
superfamiliei Rad52 (5) spre deosebire de capătul C-terminal ce
prezintă o variabilitate mai largă (fig.10 din teză) (6).
Echivalentul funcţional al proteinei Rad52 la om este BRCA2,
iar omologul uman Rad52 are un rol de adjuvant important al BRCA2,
lipsa de funcţie a ambelor proteine ducând la moartea celulei (7).
Rad52 este cunoscută ca una din proteinele cu rol esenţial în
repararea rupturilor dublu catenare prin recombinare omologă la S.
cerevisiae şi S. pombe. Proteina Rad52 participă la toate mecanismele
de reparare prin recombinare omologă (DSBR, SDSA, BIR şi SSA,
vezi Fig.1); In primele 3 procese ea serveşte ca mediator pentru
formarea filamentului invaziv constituit din coada 3' monocatenară
rezultată din procesarea unui capăt de duplex ADN rupt (vezi fig 1A, B
şi C) şi recombinaza Rad51 precum şi la capturarea celei de-a doua
catene prin activitatea sa de aliniere în a completa SDSA. Rad52
favorizează în toate variantele de recombinare alinierea secvenţelor
complementare, în varianta SSA această funcţie fiind suficientă şi
independentă de Rad51(2).
Pe scurt, Rad52 (precum şi ortologul S. pombe Rad22) apare
ca o proteină multifuncţională. In general, caracterul multifuncţional
poate fi explicat în două moduri: 1) diferitele funcţii sunt alocate
diferitelor domenii ale proteinei sau 2) proteina are o singură funcţie
esenţială, dar exercitată în procese diferite, prin asociere cu proteine
diferite. De exemplu la S. cerevisiae şi S.pombe Rad22 se poate asocia
cu RPA (prin domeniul amino-terninal) sau cu Rad51 prin domeniul
carboxi-terminal (8).
Un studiu care să exploreze rolul asocierilor fizice prin
suprimarea posibilităţilor de asociere încă nu s-a făcut la S. pombe. In
această lucrare mi-am propus să modific gena codantă a proteinei
Rad22 în aşa fel încât interacţiunea cu RPA sau interacţiunea cu Rhp51
să nu poată avea loc şi să verific efectul asupra reparării leziunilor
ADN prin recombinare.
Pe de altă parte, studiul unei proteine in vivo este mult facilitat
de alipirea la această proteină a unor trasori fluorescenţi (etichete) cum
ar fi GFP (proteina verde fluorescentă de la Aeqorea), astfel că mi-am
propus să ataşez proteinei Rad22 (varianta integră şi variantele
9
modificate) eticheta EGFP (variantă îmbunătăţită a GFP) la
extremitatea amino şi la extremitatea carboxil.
Pentru a observa capacitatea proteinelor Rad22 mutante de a fi
implicate în mecanismele de reparare am indus experimental leziuni
ale ADN fie prin interferarea procesului de replicare (camptothecin,
hidroxiuree) sau prin radiaţii ionizante. Aceste leziuni se produc la
întâmplare în genom şi sunt de tipuri diferite. O alta metodă
experimentală folosită a fost inducerea de leziuni dublu catenare
controlate în genomul S. pombe. Sistemul este folosit mai ales la
Saccharomyces cerevisiae unde este indusă o secţiune bicatenară
produsă cu ajutorul unei endonucleaze specifice de locus (sistemul HO
endonucleazei şi sitului ei de recunoaştere MATa). Mi-am propus să
folosesc acest sistem introducând parte a secvenţei MATa (desemnată
în Fig. 3B ca HOcs) într-un loc definit din genomul S. pombe pentru a
produce controlat leziuni dublu catenare. Pentru aceasta, am plasat
secvenţa HOcs şi am pus gena endonucleazei HO sub controlul unui
inductor introdus recent în studiile experimentale (urg1). Sistemul mi-a
permis aprecierea cu acurateţe a reparării prin SSA a unei rupturi
bicatenare produse enzimatic (9).
Am folosit încă un sistem raportor de recombinare pentru a
aprecia raportul între recombinarea homologă (HR) şi SSA la tulpinile
normale şi la cele purtătoare de mutaţii în Rad22.
Rezultate și discuție
1. Modificari genomice
Obţinerea unei tulpini de S. pombe cu mutaţia D240AE241A în
proteina Rad22 cu sau fara eticheta EGFP la extremitatea C.
Aspartatul şi glutamatul din poziţiile 240 şi respectiv 241 par să fie
responsabile de asocierea Rad22 cu RPA. Înlocuirea lor cu resturi de
alanina ar putea îngreuna aceasta asociere (Y. Murayama – comunicare
personală). Tulpina etichetata cu EGFP la capatul C-terminal si cu
mutatia D240AE241A a fost obţinută prin mutageneză ţintită în
plasmidul pAW8_rad22 după care a avut loc transformarea într-o
10
tulpină de bază (Nt)- loxP-rad22-ura4+-loxM3 (Ct) ade6-704 leu1-32
ura4D-18h- (fig.2A).
Figura 2. A1. Schemă a protocolului de etichetare la capătul C–terminal a
proteinei Rad22 (figură preluată după (11)). Gena rad22 este fie în stare nativă
fie cu mutaţia D240AE241A obţinută prin mutageneză ţintită. Recombinarea
are loc la nivelul secvenţelor loxP şi loxM3 între caseta ce conţine eticheta de
pe plasmid şi gena ura4+ din cromozomul tulpinii de bază. Plasmidul conține,
pe lângă caseta de transferat (TAG în figură) un marker de selecție (LEU2)
pentru confirmarea prezenței plasmidului în tulpina transformată și gena Cre
recombinazei sub controlul unui promotor activ Pnmt. A2. Schema etapelor de
etichetare la capătul N–terminal a proteinei Rad22. Gena rad22 este fie în
stare nativă fie cu mutaţia rad22_trunc şi se construieşte împreună cu eticheta
pe plasmid. Recombinarea are loc între o casetă de pe tulpina de bază - loxP-
rad22-ura4+-loxM3 – şi caseta loxP-EGFP-rad22_trunc-loxM3 de pe
plasmidul pAW8. B. Teste de supravieţuire la iradiere gama în cazul
mutanţilor realizaţi. Tulpinile WT, CyEGFP-rad22 şi NyEGFP-rad22 cu
numarul de celule depuse de 105, 10
4, 10
3, 10
2, 10 (spoturile de la stânga la
dreapta) pe mediul YEA (B1) şi aceleaşi tulpini expuse la 200Gy (B2).
Tulpinile WT, rad22_WT, rad22_AA, rad22_trunc comparate prin teste de
supravietuire cu rad22_del în condiţii de neexpunere (B3) şi expuse la 200Gy
(B4). C. Imagini realizate în microscopia cu fluorescenţă la tulpinile
NyEGFP-rad22 (C1), CyEGFP-rad22 (C2), NyEGFP-rad22_trunc (C3) şi
CyEGFP_AA (C4) pentru evidenţierea focilor de EGFP în condiţiile
neexpunerii la genotoxice.
11
Obţinerea unei tulpini de S. pombe cu proteina Rad22
trunchiată de la aminoacidul 310 la 469, cu sau fără eticheta EGFP
la extremitatea N. Această modificare am facut-o prin introducerea
unui codon stop prematur. Domeniul eliminat este implicat în asocierea
fizică între proteinele Rad22/Rad52 cu Rhp51/Rad51. Etichetarea la
extremitatea carboxil sau amino terminală a proteinei Rad22 cu
mutaţiile mai sus menţionate am facut-o pentru verificarea ajungerii în
nucleu a proteinelor Rad22 cu mutaţii. Tulpina cu Rad22 trunchiată şi
etichetată la capătul N-terminal a fost obţinută cu ajutorul plasmidului
pAW8_rad22 şi a tulpinii de bază (fig.2A).
Obținerea de tulpini cu „reporteri” de recombinare pe fondul
modificărilor la nivelul genei rad22. Am folosit unul sau celălalt din
doi reporteri cunoscuți: 1) O repetiție a două alele mutante ale genei
ade6 separate de o gena marker his3 la o tulpină cu deleția genei his3
naturale (fig.3A) (10) și 2) O repetiție a două alele mutante ale genei
leu2 la o tulpină auxotrofică pentru leucină (fig.3B) care să conțină
între cele două alele leu2 o genă marker his3 și o secvență de
recunoaștere a endonucleazei HO (HOcs). In tulpinile cu reporterul 2)
am introdus și gena codantă a endonucleazei HO sub controlul
promotorului inductibil urg1, pentru a induce secțiuni bicatenare la
nivelul HOcs (9).
Tulpinile cu reporterul 1) pe fondul modificărilor rad22 au fost
obținute prin încrucișări naturale și combinarea markerilor genetici
potriviți. Tulpinile cu reporterul 2) și HO inductibil au trebuit
construite molecular prin intervenția directă în genom folosind metoda
schimbului de casete între un plasmid și cromosom, descrise în fig.2
(11). In același mod a fost introdusă și gena HO sub controlul urg1
(tehnicile sunt descrise în detaliu în teză).
2. Efectele mutațiilor genei rad22 asupra sensibilității la agenți
care lezează ADN
Înlocuirea resturilor glutamat și aspartat în pozițiile 240 și
241 (presupuse a fi responsabile de asocierea cu RPA) duce la o
ușoară sensibilizare la iradierea UV, iradierea gama,
12
camptothecina și hidroxiuree (fig. 2 B3 et B4 şi fig. 37A, B, C, D, E,
F din teza in extenso).
Trunchierea proteinei Rad22 cu aproape 1/3 de la
extremitatea C terminală duce la o creștere importantă
(comparabilă cu a deleției genei rad22) a sensibilității la iradiere
gama, camptotecină și hidroxiuree (fig. 2B3, B4 şi fig. 37A, B, C, D,
E, F din teza in extenso).
Atașarea de etichete EGFP la extremitatea N sau la
extremitatea C nu duce la creșterea sensibilității la iradiere sau
agenți genotoxici (fig. B1, B2). Acest rezultat arată că proteinele
etichetate au funcție normală, ceea ce face să poată fi folosite în
urmărirea proteinei în interiorul celulei.
Efectele mutațiilor genei rad22 nu se datorează lipsei de acces
a proteinei mutante în nucleu sau lipsei de recrutare la nivelul
leziunii. O primă ipoteză care să explice fenotipul mutațiilor ar putea fi
cea enunțată în subtitlu. Figura 2 C infirmă această ipoteză prin faptul
că proteina modificată în cele două moduri descrise (și etichetată cu
EGFP) se acumulează sub formă de foci în nucleu. Mai mult, numărul
de foci este mai mare când proteina Rad22 este trunchiată de partea C
terminală decât în cazul proteinei integre (fig.2 C3). Acest efect care se
întâlneşte şi în cazul lipsei funcţiei Rad22 (15) se poate datora lipsei de
cooperare cu Rhp51/Rad51 în lipsa interacțiunii fizice cu aceasta.
Interpretarea fenotipului mutațiilor rad22. Iradierea cu
ultraviolete duce la multiple leziuni datorate efectului oxidativ. Aceste
leziuni produc oprirea furcii de replicare și, împreună cu procesele de
reparare pot rezulta în leziuni bicatenare. Iradierea gama duce la
rupturi bicatenare acționând direct asupra ADN. Camptotecina este
inhibitor al topoizomerazelor I care produc secțiuni monocatenare
urmate de secțiuni bicatenare după trecerea furcii de replicare (12).
Hidroxiureea este inhibitor al dezoxi ribonucleotid reductazelor, oprind
astfel aprovizionarea cu dRTP necesari pentru sinteza ADN, oprirea
sintezei și decuplarea dintre helicaza replicativă și ADN polimeraze
13
(13). In tratament îndelungat (ca cel folosit în experimentele descrise)
ea duce în final la rupturi bicatenare.
Proteina replicativă A (RPA) este esențială în repararea
rupturilor bicatenare. Cu toate acestea, efectele mutației Rad22
_D240A E241A este mai degrabă discretă (fig.2 B3, B4). Acest lucru
poate fi interpretat în mai multe feluri: i) schimbarea celor doi
aminoacizi nu suprimă în măsură importantă asocierea fizică dintre
Rad22 și RPA, ii) asocierea fizică nu este strict necesară pentru
interacțiunea funcțională, iii) asocierea fizică ar fi intermediată de o
altă proteină. In prezent nu se poate distinge între aceste posibilități.
Trunchierea Rad22 de partea responsabilă pentru asocierea cu
recombinaza Rhp51 duce la o sensibilizare accentuată la agenții care
lezează ADN. Aceast fapt poate fi interpretat în sensul unei importanțe
mari a asocierii fizice a Rad22 cu Rhp51. Nu este exclusă și o
participare a acestei părți din moleculă la reparare în alt mod decît
asocierea cu Rhp51.
3. Efecte ale mutațiilor Rad22 asupra proceselor recombinării
Trunchierea proteinei Rad22 de 1/3 carboxi terminală duce la o
diminuare considerabilă a recombinării SDSA (fig 3A) dar nu la
anularea ei. Recombinarea prin SDSA este strict dependentă de
Rhp51/Rad51, ca atare ea lipsește în cazul deleției acestei proteine (fig
3A). Datele din figura arată că lipsa de interacțiune fizică între Rhp51
și Rad22 nu duce la lipsa completă de activitate a Rhp51, dar la o
diminuare considerabilă a ei. Datele din literatură (10) arată că Rhp51
poate fi activă chiar în lipsa completă a Rad22, cu condiția ca o
helicază Fbh1 să lipsească. Astfel, Rad22 ar avea mai degrabă un rol
protector asupra Rhp51 la acţiunea helicazei decât de recrutor sau
activator (10).
Trunchierea Rad22 nu diminuă ci crește recombinarea pe calea
SSA (Fig 3B). Acelaşi lucru se întîmplă şi prin deleţia genei rhp51
codificand recombinaza Rhp51/Rad51 (10). Creşterea frecvenţei de
recombinare prin SSA în condiţiile absenţei proteinei Rhp51a fost
interpretată ca o dirijare a recombinării spre SSA în condiţiile în care
14
recombinarea Rad51-dependentă SDSA nu poate avea loc. Rezultatul
din Fig.3B arată că secvenţa de aminoacizi care lipseşte Rad22/Rad52
trunc (1/3 de la extremitatea C) este importantă pentru diminuarea
recombinării prin SSA şi îndreptarea ei spre modalitatea mai benefică
SDSA iar asocierea fizică între Rad22/Rad52 şi Rhp51/Rad51 este
importantă pentru alegerea căii.
Figura 3. Recombinarea între două secvenţe direct repetitive (gene mutante).
Prin recombinare rezultă o genă integră. Intre cele două gene mutante se află o
a treia genă marker. In procesul recombinării aceasta poate fi pierdută (dacă
recombinarea s-a facut prin procesul SSA (independent de Rad51) sau pastrată
dacă recombinarea s-a facut prin SDSA (dependent de Rad51). A: Sus,
schema construcţiei genomice. Două alele mutante ale genei ade6 conferă
15
dependenţa de adenină pentru creştere (ade-). Recombinarea duce la formarea
unei gene integre (ade+), cu deleţia genei interpuse his3 dacă recombinarea se
face prin SSA sau cu păstrarea ei dacă recombinarea s-a facut prin SDSA.
Recombinarea are loc în cazul rupturilor bicatenare care se produc spontan
oriunde între cele două alele ade6; jos: Rezultatele unui test de fluctuaţie pe
10 colonii diferite ale fiecarei tulpini; pe ordonată – mediana numărului de
recombinanţi la 104 celule. Celulele au fost însămânţate pe medii fără adenină,
cu sau fără histidină pentru a depista numarul total de recombinanţi (mediul cu
histidină) sau numarul de recombinanţi SDSA (mediul fără histidină);
recombinanţii SSA sunt reprezentaţi de diferenţa între cele două mediane. B,
sus: Schema unui alt reporter de recombinare între două alele incomplete ale
genei LEU2 în repetiţie directă, separate de o genă his3 care are şi o secvenţă
de recunoaştere pentru endonucleaza HO. Atunci când endonucleaza este
indusă (HO se gaseşte altundeva în genom sub controlul promotorului urg1
activat de uracil (9), are loc o ruptură bicatenară la secvenţa HOcs care se
repară prin recombinarea între cele două alele incomplete ca să rezulte o alelă
completă LEU2. Repararea are loc numai prin mecanismul SSA în interiorul
aceleiaşi cromatide şi se face cu deleţia genei his3 (9). Jos: grafic arătând
dinamica recombinării; abscisa – durata inducţiei exercitate de uracil;
ordonata – procentaj de recombinanţi leu1 prototrofici (fiind indusă, frecvenţa
recombinării este mult mai mare decât cea prezentată la A).
Concluzii
Aportul ştiinţific al lucrării de faţă constă în:
1. Contribuţii la cunoaştere:
Este prima tentativă de disecţie funcţională a proteinei Rad22-Rad52 la
S. pombe prin studiul fenotipului proteinei modificate (mutaţia dublă la
poziţiile 240 şi 241 presupusă a fi responsabilă de asocierea fizică cu
proteina replicativă A (RPA) şi trunchierea proteinei de 1/3
carboxiterminală responsabilă de asocierea cu recombinaza
Rhp51/Rad51).
Dovedirea faptului că recombinarea prin SSA este asigurată de numai
2/3 aminoterminale ale proteinei în timp ce recombinarea prin SDSA
are loc în condiţii optime numai prin păstrarea a 1/3 carboxiterminală,
domeniu necesar interacţiunii fizice cu recombinaza Rhp51/Rad51.
16
Stabilirea faptului că 1/3 carboxiterminală a moleculei Rad22/Rad52
atenuează recombinarea, în special cea prin SSA, probabil datorită
asocierii cu Rhp51/Rad51.
2. Contribuţii metodologice:
Procedeu inovativ de etichetare la extremitatea N a proteinelor,
folosind o tehnică existentă de modificare genomică prin transfer de
casete.
Prima încercare reuşită de etichetare a proteinei Rad22 la extremitatea
N
Un procedeu inovativ care rezolvă letalitatea expresiei genei HO la
tulpini de S. pombe cu defecte de funcţie a proteinei Rad22 prin
atenuare datorată unui regulator al nivelului ARN mesager.
Construcţia de tulpini şi plasmide utile pentru alte cercetări atît nouă cît
şi altora prin depozitarea lor la bazele de tulpini sau schimbul între
laboratoare.
Inovaţie privind testarea nivelului oxidazelor celulare prin folosirea
alopurinolului ca substrat (14).
Bibliografie 1. Grabarz A, Barascu A, Guirouilh-Barbat J, Lopez BS. Initiation of DNA
double strand break repair: signaling and single-stranded resection dictate the
choice between homologous recombination, non-homologous end-joining and
alternative end-joining. Am J Cancer Res. 2012; 2(3): 249–268.
2. Symington LS. Role of RAD52 Epistasis Group Genes in Homologous
Recombination and Double-Strand Break Repair. Microbiol Mol Biol Rev.
2002 December; 66(4): 630–670.
3. Reliene R, Bishop AJ, Schiestl RH. Involvement of homologous
recombination in carcinogenesis. Adv Genet 2007; 58: 67-87.
4. Forsburg, S.L., The yeasts Saccharomyces cerevisiae and
Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravit Space
Biol Bull 2005; 18(2): p. 3-9.
5. Iyer, L.M., E.V. Koonin, and L. Aravind. Classification and evolutionary
history of the single-strand annealing proteins, RecT, Redbeta, ERF and
RAD52. BMC Genomics, 2002. 3: p. 8.
17
6. Octobre, G., et al., The Rad52 homologs Rad22 and Rti1 of
Schizosaccharomyces pombe are not essential for meiotic interhomolog
recombination, but are required for meiotic intrachromosomal recombination
and mating-type-related DNA repair. Genetics, 2008. 178(4): p. 2399-412.
7. Feng, Z., et al., Rad52 inactivation is synthetically lethal with BRCA2
deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(2): p. 686-91.
8. Suto K, Nagata A, Murakami H, Okayama H. A double-strand break repair
component is essential for S phase completion in fission yeast cell cycling.
Mol Biol Cell. 1999 Oct;10(10): 3331-43.
9. Watson, A.T., P. Werler, and A.M. Carr, Regulation of gene expression at
the fission yeast Schizosaccharomyces pombe urg1 locus. Gene, 2011. 484(1-
2): p. 75-85.
10.Osman, F., et al., The F-Box DNA helicase Fbh1 prevents Rhp51-
dependent recombination without mediator proteins. Molecular and Cellular
Biology, 2005. 25(18): p. 8084-96.
11. Watson, A.T., et al., Gene tagging and gene replacement using
recombinase-mediated cassette exchange in Schizosaccharomyces pombe.
Gene, 2008. 407(1-2): p. 63-74.
12. Staker BL, Hjerrild K, Feese MD, Behnke CA, Burgin AB Jr, Stewart L.
The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 26; 99(24):15387-92.
13. Koç A, Wheeler LJ, Mathews CK, Merrill GF. Hydroxyurea arrests DNA
replication by a mechanism that preserves basal dNTP pools. J Biol Chem.
2004 Jan 2; 279(1):223-30. Epub 2003 Oct 21.
14. Stoica BA, Bordeianu G, Stanescu R, Serban DN, Nechifor M. A new
method for the quantification of superoxide dismutase mimics with an
allopurinol-xanthine oxidase-lucigenin enhanced system. J Biol Inorg Chem.
2011 Jun; 16 (5):753-61
15. Meister, P., et al., Nuclear factories for signalling and repairing DNA
double strand breaks in living fission yeast. Nucleic Acids Res, 2003. 31(17):
p. 5064-73.