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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
NATHALIA MAÍRA CABRAL DE MEDEIROS
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES
DA VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-
AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).
NATAL/RN 2018
NATHALIA MAÍRA CABRAL DE MEDEIROS
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES
DA VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-
AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).
Tese apresentada ao programa de pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor(a) em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Kátia Castanho Scortecci.
NATAL
2018
i
ii
iii
Dedico essa obra
À Deus, meus pais, meu irmão, meus familiares, meus amigos e professores, pela paciência, incentivo e eterno apoio.
iv
AGRADECIMENTOS
Ao criador e a espiritualidade por me salvaguardar continuamente nessa longa caminhada rumo a evolução moral e intelectual.
Á minha família pelo incentivo a minha jornada acadêmica de estudos e experimentos, além do suporte emocional para persistir nessa referida jornada.
À minha orientadora, professora Profa. Dra. Kátia Castanho Scortecci, por me acompanhar desde a graduação, guiando-me no labirinto da ciência.
Aos meus colegas de laboratório pelo companheirismo e apoio nessa epopeia cientifica.
À CAPES e CNPq e demais órgãos de fomento pelo auxílio financeiro que culminaram no desenvolvimento desse trabalho aqui exposto.
v
Se o conhecimento pode criar problemas,
não é através da ignorância que podemos solucioná-los.
Isaac Asimov
vi
vii
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPONENTES DA VIA DE
EXCISÃO DE BASES (BER) EM CANA-DE-AÇÚCAR (SACCHARUM spp.).
RESUMO A produtividade de qualquer cultivar está diretamente relacionada com a preservação de seu código genético, pois qualquer alteração na sequência pode acarretar consequências que afetam diretamente o desenvolvimento/crescimento do vegetal. A resposta ao dano ao DNA ocorre por meio de seu reparo que transcorre por intermédio de diferentes vias, sendo uma delas a via de excisão de bases (BER), cujos estudos em plantas ainda são inferiores em comparação a outros organismos eucariotos. Um dos obstáculos no avanço dessas pesquisas é a complexidade do genoma vegetal presente em alguns cultivares de importância agroeconômica, de modo que muitos estudos utilizam organismos modelos diploides. Este trabalho propõe preencher a lacuna existente no conhecimento da via BER em relação a plantas não-modelos e poliploides, tendo como alvo a cana-de-açúcar. A primeira abordagem do trabalho, foi a identificação de componentes da via BER em cana-de-açúcar e comparar os resultados obtidos com as sequências de outros organismos vegetais para o aprofundamento na questão da conservação desta via. A segunda abordagem se utilizou de uma sequência homóloga a AP endonuclease de Arabidosis thaliana (AtARP) em cana-de-açúcar denominada de ScARP1. Esta foi alvo de um ensaio de caracterização enzimática. Para primeira abordagem, considerou-se os resultados de trabalhos anteriores, onde foi verificado uma duplicação em cana-de-açúcar para a sequência AP endonuclease (ScARP1 e ScARP3), além de trabalho recente de revisão da via BER em plantas. Desta forma, foi efetuada uma busca nos bancos de dados de sequências ESTs para cana-de-açúcar (SUCEST-FUN) por sequências pertencentes a via BER. Para verificar a ocorrência de duplicações, os resultados dessa busca foram submetidos a analises filogenéticas e inferências Bayesianas. As sequências encontradas foram caracterizadas quanto a presença de domínios conservados, além de algumas delas foram modeladas, criando modelos 3D hipotéticos. Algumas das presumíveis proteínas identificadas diferiram em sua estrutura com as proteínas de referência de A. thalina. Ademais, múltiplas cópias de sequência foram observadas em certas famílias vegetais em detrimento de outras. Para a segunda abordagem, a proteína ScARP1 foi clonada, expressa e purificada. Com esta foram realizados diferentes ensaios que visaram avaliar a sua eficiência enzimática (considerando temperatura, cofatores enzimáticos e concentração de sais), assim como os substratos que seriam reconhecidos por ScARP1. Observou-se que a proteína ScARP1 possui apenas atividade AP endonuclease. Além disso, observou-se uma complementação parcial de ScARP1 em extratos proteicos do mutante arp-
/- de A. thalina. Com esse trabalho foi possível identificar membros da via BER em cana-de-açúcar, além de caracteriza-los estruturalmente e filogeneticamente a qual possibilitou destacar diferenças entre sequências de monocotiledôneas e dicotiledôneas. Ademais, em relação a ScARP1, determinou-se que esta apresenta atividade Ap endonuclease essencial para a sua atuação em BER. Com isso, amplificou-se o conhecimento desta via em cana-de-açúcar, bem como em organismos vegetais de forma geral.
Palavras-chaves: Reparo de DNA, AP Endonuclease, cana-de-açúcar, caracterização bioquímica, Filogenia, Modelagem.
viii
IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION FROM BASE EXCISION REPAIR PATHWAY COMPONENTS (BER) IN SUGARCANE (SACCHARUM
spp.).
ABSTRACT
The productivity of any cultivar is directly related to the preservation of its genetic
code, since any change in the sequence can have consequences that directly
affect the development/growth of the plant. The response to DNA damage occurs
through its repair through different pathways, one of which is the base excision
pathway (BER), whose studies on plants are still inferior in comparison to other
eukaryotic organisms. One of the obstacles in the advancement of these
researches is the complexity of the plant genome present in some cultivars of
agroeconomic importance, so that many studies use diploid models organisms.
This work proposes to fill the gap in the knowledge of the BER pathway in relation
to non-models and polyploid plants, targeting the sugarcane. The first approach
of the work was to identify components of the BER pathway in sugarcane and
compare the results obtained with the sequences of other plant organisms to
deepen the question of conservation of this pathway. The second approach was
using a sequence homologous to the AP endonuclease of Arabidosis thaliana
(AtARP) in sugarcane denominated ScARP1. This was the subject of an
enzymatic characterization test. For the first approach, we considered the results
of previous studies, where a duplication in sugarcane was verified for the AP
endonuclease sequence (ScARP1 and ScARP3), in addition to recent work on
the BER pathway review in plants. Thus, a search of the ESTs sequences
databases for sugarcane (SUCEST-FUN) was done by sequences belonging to
via BER. To verify the occurrence of duplications, the results of this search were
submitted to phylogenetic analysis and Bayesian inferences. The sequences
found were characterized as the presence of conserved domains, besides some
of them were modeled, creating hypothetical 3D models. Some of the presumed
proteins identified differed in their structure with the reference proteins of A.
thalina. Furthermore, multiple copies sequences were observed in certain plant
families over others. For the second approach, the ScARP1 protein was cloned,
expressed and purified. With this, different assays were carried out to evaluate
its enzymatic efficiency (considering temperature, enzymatic cofactors and salt
concentration), as well as the substrates that would be recognized by ScARP1.
It has been observed that the ScARP1 protein has only AP endonuclease activity.
In addition, partial complementation of ScARP1 in protein extracts of the A.
thalina arp-/- mutant was observed. With this work it was possible to identify
members of the BER pathway in sugarcane, besides characterizing them
structurally and phylogenetically, which made it possible to highlight differences
between sequences of monocotyledons and dicotyledons. Furthermore, in
relation to ScARP1, it was determined that this presents Ap endonuclease activity
essential for his performance in BER. Thus, it amplified the knowledge this
pathway in sugarcane and vegetables on organisms in general.
Keywords: DNA repair, AP Endonuclease, sugarcane, biochemical
characterization, Phylogeny, Modeling.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Agentes genotóxicos e reparo do DNA, em plantas - 28
Figura 2 – Representação esquemática da via de excisão de bases (BER). - 33
Figura 3 - Metodologia de identificação de sequências putativas de componentes da via de
Excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar. - 46
Figura 4 - Análise e avaliação das sequências BER presumíveis de cana-de-açúcar. - 47
Figura 5 - Esquema didático representando as etapas metodológicas para a purificação da
proteína ScARP1. - 53
Figura 6 - Esquema representado as abordagens de avaliação e complementação enzimática empregadas na proteína ScARP1. - 66
Figura 7 – Substratos utilizados paras as respectivas atividades enzimáticas a serem
testas para ScARP1. - 61
Figura 8 – Modelo da presumível PCNA de Cana-de-açúcar. - 97
Figura 9 – Modelo tridimensional e sequências proteínas das PCNAs de plantas e humano.
- 98
Figura 10 – Modelos proposto para a presumível PCNA de cana-de-açúcar associado ao
DNA. - 99
Figura 11 – Modelo proposto para a putativa FEN1 de cana-de-açúcar. -. 101
Figura 12 – Complexo proposto de PCNA e FEN1 de cana-de-açúcar. - 103
Figura 13 - Analise das sequências de AP endonuclease AtARP, AtAPE2 e AtAPE1L (de A.
thaliana), ScARP1 e ScARP3 (cana-de-açúcar) e hAPE1 (Homo sapiens). – 107
Figura 14 – Modelos tridimensionais das Ap endonuclases de Arabidopsis thaliana e
Saccharum spp. - 110
Figura 15 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtARP. - 111
Figura 16 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE1L. - 112
Figura 17 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE2. - 113
Figura 18 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtARP
em Oryza sativa (LOC_Os01g58680.1 e LOC_Os01g58690.1). - 114
Figura 19 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE1L
em Oryza sativa (LOC_Os12g18200.1). - 116
Figura 20 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE2
em Oryza sativa (LOC_Os09g36530.2). – 117
Figura 21– Resultados da eficiência da atividade enzimática de ScARP1 em relação a
variação de concentração e temperatura – 118
Figura 22 - Resultado do efeito dos distintos íons e da concentração de NaCl sob a
atividade de ScARP1. – 126
Figura 23 - Resultado dos ensaios de atividade exonuclease, fostatase e 3´-
phosphodiesterase de ScARP1. – 129
x
Figura 24 - Resultado do ensaio de complementação de atividade Ap endonuclease em
extratos vegetais de A. thaliana. – 131
Figura 25 - Diagrama de comparação das AP endonucleas de Arabidopsis thaliana
(AtARP1) e de cana-de-açúcar (ScARP1). – .133
Figura 26 - Diagrama de comparação das AP endonucleas de Arabidopsis thaliana
(AtARP1) e de cana-de-açúcar (ScARP1). –. 166
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Cristal de proteínas do banco de dados PDB (Protein Data Bank) utilizados para
as análises. – 51
Tabela 2 – Sequências utilizadas na confecção dos substratos a serem utilizados nos
ensaios enzimáticos. – .62
Tabela 3 – Formação do substrato em relação ao ensaio enzimático específico. – 63
Tabela 4 – Proteínas envolvidas na via de excisão de bases (BER) selecionadas para o
estudo. – 70
Tabela 5 – Função de AP endonuclease de Arabidopsis thaliana e cana-de-açúcar. – 106
Tabela 6 – Comparação entre as sequências de AP endonuclease analisadas. – 109
Tabela 7 - Expressão mais relevantes dos genes de AP endonuclease de Arabidopsis
thaliana, Oryza sativa e Saccharum spp. – 120
Tabela 8 - Dados do projeto AtGenExpress referente a expressão das sequências
analisadas de Ap endonuclease de A. thaliana (ARP, APE1L e APE2) em relação aos
estresses abióticos. – 122
Tabela 9– Dados de expressão de sequências homólogas a Ap edonculease de A. thaliana
em Oryza sativa em relação ao estresse abiótico: por seca, sal e frio. – 123
xii
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS EROs - Espécie reativas de oxigênio; BER - Via de reparo por excisão de base; NER - Via de reparo por excisão de nucleotídeo; MMR - Via de rapro de DNA mismatch ou reparo de mal pareamento do DNA; HR - Via de reparo por recombinação homóloga; NHEJ - Via de reapro por recombinação não-homóloga. ESTs - expressed sequence tag -marcador de sequência genética; SSR - Simple Sequence Repeats - sequências simples repetidas; SNPs - Single-Nucleotide Polymorphisms - polimorfismo de nucleotídeo único; QTL - Mapeamento de loci de caracteres quantitativos; BAC - Cromossomo artificial bacteriano; AP - Apurínico/apirimídico; 5'dRP - 5' desoxirribose fosfato; 3´PUA - Aldeído β,α-insaturado; SN-BER - Single Nucleotide Base Excision Repair ou via curta de BER; LP-BER - Long Patch Base excision repair ou via longa de BER; MMS - Metanossulfonato de metila; Polβ - DNA polimerase beta; AtLIG1 - DNA ligase 1 de Arabidopsis thaliana; AtFPG - DNA-Formamidopirimidina Glicosilase de Arabidopsis thaliana; AtOGG1 - 8-oxoguanine DNA glicosilase 1 de Arabidopsis thaliana; 8-oxoG - 8-Oxoguanina; ZDP - DNA-3-fosfatase; AtPol λ - DNA Polimerase lambda de Arabidopsis thaliana; 5-mC - 5-Metilcitosina; AtXRCC1 - X-RAY REPAIR CROSS COMPLEMENTING 1 de Arabidopsis thaliana; PCNA - Antígeno Nuclear da Proliferação Celular; OsFEN1 - FLAP ENDONUCLEASE 1 de Oryza sativa; APE1 - Apurínica/apimínica (AP) endonuclease 1 de mamíferos;
xiii
AtUNG - Uracil-DNA glicosilase; MBP - Maltose-binding protein; BtMe - β-mercaptoetanol. EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético. TEMED - Tetrametiletilendiamina. APS - Persulfato de amónio. HEPES - Ácido 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonico. DTT - Ditiotreitol. OGG1 - 8-OXOGUANINA GLICOSILASE; NTH1 e NTH2 -ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 e 2; UNG ou UDG - URACIL-DNA GLICOSILASE; ROS1 - REPRESSOR OF SILENCING 1; DEM - ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER; DML3 - DEMETER-LIKE PROTEIN 3; MBD4L - METHYL-CpG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE PROTEIN; FEN1 ou SAV6 - FLAP ENDONUCLEASE 1; Pol λ ou POLL - DNA POLIMERASE LAMBDA; TDP1 - TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1; LIG1 - DNA LIGASE I (1); LIG4 - DNA LIGASE IV (4); ZDP - POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE; PCNA1 - ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1; PCNA2 - ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2; PARP1 - POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1; PARP2 - POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 2; XRCC1 - X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1; WRN - WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE; DNAss - Single strand DNA - DNA fita simples; DNAds - Double strand DNA - DNA fita dupla; WGD - Duplicação total do genoma.
xiv
SUMÁRIO
RESUMO VII
LISTA DE FIGURAS IX
LISTA DE TABELAS XI
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS XII
SUMÁRIO XIV
1. INTRODUÇÃO 20
1.1. CANA-DE-AÇÚCAR 20
1.1.1. ORIGEM E CARACTERÍSTICA DO CULTIVAR 20
1.1.2. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA 20
1.2. ESTRESSE GENOTÓXICO, REPARO DE DNA E PRODUTIVIDADE DO CULTIVO. 23
1.2.1. CONDIÇÕES ADVERSAS SEU EFEITO SOBRE AS PLANTAS. 23
1.2.2. RESPOSTA AO ESTRESSE E SUA RELAÇÃO AS VIAS DE REPARO DE DNA. 26
1.2.2.1. Pesquisas relevantes em cana-de-açúcar no reparo do DNA. 30
1.3. VIA DE EXCISÃO DE BASES (BER) 31
1.3.1. DESCRIÇÃO DA VIA E SUA RELEVÂNCIA PARA AS PLANTAS. 31
1.3.2. AP ENDONUCLEASE – UMA DAS ENZIMAS CHAVES DA VIA BER. 38
1.4. IMPORTÂNCIA DA ANÁLISE IN SILICO. 40
1.4.1. ANÁLISE FILOGENÉTICA. 40
1.4.2. MODELAGEM 41
2. OBJETIVO GERAL. 44
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 44
3. MATERIAL E MÉTODOS 45
3.1. IDENTIFICAÇÃO DE COMPONENTES DE BER EM CANA-DE-AÇÚCAR. 45
3.1.1. BUSCA POR SEQUÊNCIAS E AVALIAÇÃO. 45
3.1.2. ÁRVORES FILOGENÉTICAS GERADAS VIA TAXONTREE. 48
3.1.3. INFERÊNCIA BAYESIANA. 48
3.2. MODELAGEM. 49
3.2.1. REFINAMENTO E AVALIAÇÃO DOS MODELOS. 50
3.2.2. ANÁLISE DOS MODELOS 50
3.3. ANÁLISE IN SILICO DE AP ENDONCUCLEASE DE ARABIDOPSIS THALIANA, HOMO
SAPIENS E DE CANA-DE-AÇÚCAR. 51
xv
3.3.1. ANÁLISE IN SILICO DE SEQUÊNCIAS DE ARABIDOPSIS THALIANA. 51
3.3.2. MODELOS DE AP ENDONUCLASES DE A. THALIANA. 52
3.4. CLONAGEM E PURIFICAÇÃO DA AP ENDONUCELASE DE CANA-DE-AÇÚCAR: SCARP1.
53
3.4.1. MINIPREP (CTAB) E REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR). 54
3.4.2. EXTRAÇÃO DE DNA DE GEL DE AGAROSE. 55
3.4.3. LIGAÇÃO AO VETOR DE EXPRESSÃO PMAL-C5X. 55
3.4.4. COMPETÊNCIA E TRANSFORMAÇÃO RÁPIDA DA LINHAGEM BL21. 56
3.4.5. ENSAIO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA. 56
3.4.6. PURIFICAÇÃO. 57
3.4.7. GEL SDS-PAGE. 58
3.5. PROTEÍNA SCARP1 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE E COMPLEMENTAÇÃO ENZIMÁTICA.
59
3.5.1. REAÇÃO DE ENSAIO ENZIMÁTICO. 60
3.5.1.1. Substratos. 60
3.5.1.2. Protocolos de reação e precipitação. 64
3.5.1.3. Gel de acrilamida para os ensaios enzimáticos. 64
3.5.2. REAÇÃO DE COMPLEMENTAÇÃO ENZIMÁTICA. 65
3.5.2.1. Material vegetal utilizado. 65
3.5.2.2. Plantio de sementes em placas. 66
3.5.2.3. Extração das proteínas de A. thaliana e dialise. 66
3.5.2.4. Reação de complementação. 67
3.6. REVELAÇÃO DE IMAGENS. 67
4. RESULTADO 68
4.1. VIA DE EXCISÃO DE BASES EM CANA-DE-AÇÚCAR: IDENTIFICAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS PUTATIVAS. 68
4.1.1. 8-OXOGUANINA GLICOSILASE – OGG1 72
4.1.1.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – OGG1. 72
4.1.2. ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 E 2 73
4.1.2.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – NTH1 e NTH2. 74
4.1.3. URACIL-DNA GLICOSILASE - UNG OU UDG. 75
4.1.3.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – UNG. 75
4.1.4. ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER (DME), REPRESSOR OF
SILENCING 1 (ROS1) E DEMETER-LIKE PROTEIN 3 (DML3). 76
4.1.4.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ROS1, DME e DML3. 78
4.1.5. METHYL-CPG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE PROTEIN -MBD4L 78
4.1.5.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – MBD4L. 79
4.1.6. FLAP ENDONUCLEASE 1 - FEN1 OU SAV6. 80
4.1.6.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – FEN1A e FEN1B. 81
4.1.7. DNA POLIMERASE LAMBDA -POL Λ OU POLL. 81
4.1.7.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA polimerase Lambda.
83
4.1.8. TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 TDP1. 83
4.1.8.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – TDP1. 84
4.1.9. DNA LIGASE 1 -LIG1. 85
4.1.9.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase I. 86
xvi
4.1.10. DNA LIGASE IV - LIG4. 86
4.1.10.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase IV. 88
4.1.11. POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE – ZDP. 88
4.1.11.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ZDP. 89
4.1.12. ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1 (PCNA1) E ANTIGENO DE
PROLIFERAÇÃO CELULAR 2 (PCNA2). 90
4.1.12.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PCNA1 e PCNA2. 91
4.1.13. POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1 (PARP1) E POLI [ADP-RIBOSE]
POLIMERASE 2 (PARP2). 91
4.1.13.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PARP1 e PARP2. 93
4.1.14. X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1 - XRCC1. 93
4.1.14.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – XRCC1. 94
4.1.15. WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE- WRN. 94
4.1.15.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – WRN. 95
4.2. MODELAGEM. 96
4.2.1. MODELO DE PCNA_CANA. 96
4.2.2. MODELO DE FEN1_CANA. 100
4.2.3. INTERAÇÃO ENTRE OS MODELOS DE PCNA E FEN1. 101
4.3. ANALISE DAS SEQUÊNCIAS AP ENDONUCLEASES DE ARABIDOPOSIS, E CANA-DE-
AÇÚCAR. 104
4.4. COMPARAÇÃO DE MODELOS DE AP ENDONUCLEASE DE ARABIDOPSIS E CANA-DE-
AÇÚCAR. 109
4.5. ANÁLISE DO PADRÃO DE EXPRESSÃO DAS AP ENDONUCLEASES DE ARABIDOPSIS,
ARROZ E MILHO EM COMPARAÇÃO A CANA-DE-AÇÚCAR. 112
4.6. ENSAIOS DE REAÇÃO ENZIMÁTICA. 124
4.6.1. EFICIÊNCIA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EFEITO DA TEMPERATURA EM SCARP1.
124
4.6.2. EFEITO DOS ÍONS E CONCENTRAÇÃO DE NACL NA ATIVIDADE DE SCARP1. 127
4.6.3. ATIVIDADE EXONUCLEASE, FOSTATASE E 3´-PHOSPHODIESTERASE DE SCARP1.
129
4.6.4. ENSAIO DE COMPLEMENTAÇÃO DE ATIVIDADE AP ENDONUCLEASE EM EXTRATOS
DE A. THALIANA. 132
5. DISCUSSÃO 134
5.1. IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DA VIA BER EM CANA-DE-AÇÚCAR. 134
5.1.1. OGG1. 135
5.1.2. NTH1 E NTH2. 136
5.1.3. UNG. 137
5.1.4. DME, DMLE E ROS1. 138
5.1.5. MBD4L. 140
5.1.6. FEN1A E FEN1B. 141
5.1.7. POLLAMBDA. 142
5.1.8. TDP1. 144
5.1.9. DNA LIGASE 1 E DNA LIGASE 4. 144
5.1.10. ZDP. 146
5.1.11. PCNA1 E PCNA2. 147
5.1.12. PARP1 E PARP2. 148
xvii
5.1.13. XRCC1. 150
5.1.14. WRN. 151
5.2. DUPLICAÇÕES DE SEQUÊNCIAS DE COMPONENTES DE BER NOS ORGANISMOS
VEGETAIS. 152
5.3. ANÁLISE DOS MODELOS DE PCNA E FEN1 DE CANA-DE-AÇÚCAR. 155
5.4. CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE SCARP1. 157
6. CONCLUSÃO 165
7. REFERÊNCIAS 168
20
1. INTRODUÇÃO
1.1. Cana-de-açúcar
1.1.1. Origem e característica do cultivar
A cana-de-açúcar é uma planta nativa do sudeste da Ásia, com seu cultivo na
Índia datado desde 5000 anos atrás. Possui a fotossíntese do tipo C4, resultando em
uma forte acumulação de biomassa em condições tropicais e crescimento menos
vigoroso em regiões temperadas (BRADSHAW, 2016). Esse vegetal é uma
gramínea pertencente a família Poaceae que, por sua vez, é uma família de plantas
com sementes economicamente importantes que incluem entre os seus
representantes o milho (Zea mays), trigo (Triticum spp.), arroz (Oryza sativa) e o
sorgo (Sorghum bicolor).
A cana-de-açúcar utilizada para cultivo é um híbrido multiespecífico e recebe,
por isso, a designação de Saccharum spp. Os híbridos modernos de Saccharum são
altamente poliplóides e aneuploides com números de cromossomos em células
somáticas que variam de 100 a 130. Este genoma complexo é derivado de alguns
cruzamentos entre Saccharum officinarum L. (2n = 8x = 80), que é caracterizado por
acumular sacarose, e Saccharum spontaneum L. (2n = 5x a 12x = 40-128) que
apresenta resistência a doenças e levada taxa de crescimento em biomassa,
contudo com baixo teor de sacarose (D’HONT et al., 1998; IRVINE, 1999; GRIVET
& ARRUDA 2002; VICENTINI et al., 2012). As cultivares atuais de cana-de-açúcar
estimam ter cerca de 80-90% do genoma de origem da S. officinarum e 10 a 20% de
S. spontaneum (GRIVET et al., 1996; HOARAU et al., 2002; D’HONT, 2005;
PIPERIDIS et al., 2010).
1.1.2. Importância econômica
A cana-de-açúcar é uma cultura importante em todo o mundo, produzindo
80% do açúcar bruto mundial e é cada vez mais requisitada para a produção de
biocombustíveis tendo em vista os dados da European Commission - Agriculture and
development (https://ec.europa.eu/agriculture/sugar_en). De acordo com a
21
FAOSTAT (Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database), em
2016, a estimativa de área destinada à colheita de cana-de-açúcar foi de mais de 26
milhões de hectares (ha), já a produtividade (Yield) foi de, aproximadamente, 700 mil
hg/ha (hectograma por hectare) e a produção mundial foi de cerca de 1 bilhão de
toneladas.
A cana-de-açúcar pode ser considerada uma das principais alternativas para
o setor de biocombustíveis, segundo a própria Companhia Nacional de
Abastecimento (CONAB), isso ocorre em virtude de seu grande potencial na
produção de etanol e aos respectivos subprodutos, deste modo fazendo com que,
no agronegócio, a indústria brasileira da cana-de-açúcar exiba papel de destaque na
economia nacional. O Brasil é líder no complexo sucroenergético e maior produtor
mundial de cana-de-açúcar (CARVALHO & OLIVEIRA, 2006).
Para o crescimento ótimo da cana-de-açúcar a FAO (Food and Agriculture
Organization of the United Nations) informa que a safra floresce sob uma longa e
quente estação de crescimento com alta incidência de radiação e umidade
adequada. A temperatura ideal para germinação das gemas do caule é de 32 a 38
°C. O crescimento ótimo é alcançado com temperaturas médias diárias entre 22 e
30 °C. A temperatura mínima para o crescimento ativo é de aproximadamente 20 °C.
Sabe-se também que a cana-de-açúcar é moderadamente sensível à salinidade e
diminui o rendimento das culturas devido ao aumento da mesma. Outro fato
importante que deve ser ressaltado é a necessidade de uma umidade disponível
adequada ao longo do período de crescimento para obter rendimentos máximos,
pois o crescimento vegetativo é diretamente proporcional à água transpirada.
Estudos mostraram o impacto da redução da disponibilidade de água na produção
de cana-de-açúcar, devido a sua alta produção de biomassa o que requer grandes
quantidades de água para produção máxima (WIEDENFELD, 2008).
Em relação ao Nordeste brasileiro, conforme descrito pela CONAB segundo
o levantamento da safra de cana-de-açúcar feita em maio de 2018 (V. 5 - SAFRA
2018/19 N.1), se for comparado a produtividade de cana-de-açúcar por região,
percebe-se que a região Nordeste se encontra em último lugar em relação as outras
regiões do Brasil, dispondo da produção de 48,85 t/ha (toneladas por hectare), na
safra de 2017/18, e 50,85 t/ha, em 2018/19 (estimativa de maio de 2018). Os
22
primeiros lugares - região Centro-Oeste e Sudeste - exibem uma média de 75 t/ha
de produtividade. A própria CONAB indica como fatores negativos da baixa
produtividade do Nordeste está relacionado a falta de investimentos, renovação das
lavouras e o clima, a depender das chuvas para proporcionar um clima favorável
para a renovação das lavouras o que levaria ao aumento de rendimento. Além disso,
deve-se levar em consideração os custos de produção da região Nordeste que são
mais elevados em comparação aos da região Centro-Sul por causa da baixa
fertilidade dos solos, menor volume de chuvas e topografia inadequada para
mecanização (KOHLHEPP, 2010). Todos esses fatores culminam por resultar em
uma diminuição na produtividade, afetando negativamente a economia regional.
Ainda segundo a Companhia Nacional de Abastecimento, o estado do Rio
Grande do Norte exibiu uma produtividade (em kg/ha -quilograma por hectare) de
aproximadamente 43 mil na safra de 2017/18, ficando em último lugar dentre os
estados da região Nordeste, contudo na safra de 2018/19, até o momento,
apresentou a produtividade foi de 47 mil, ocupando o penúltimo lugar.
Além disso, outro fator a contribuir com a discrepância referente a
produtividade de cana-de-açúcar entre as regiões brasileiras seria os programas de
melhoramento desse organismo vegetal a qual parte dos seus cultivares são
desenvolvidos adaptados a condições edafoclimáticas típicas das regiões sul-
sudeste, logo, quando implantadas na região nordeste sofrem consequências
negativas expressas em sua produtividade (PEREIRA & TAVARES, 2017).
Contribuindo para cenário desfavorável para melhoramento vegetal da cana-de-
açúcar, a produção de um novo cultivar, se utilizando de metodologias do
melhoramento clássico, requer o tempo de 8 a 12 anos (CESNIK, 2007). Abordagens
biotecnológicas podem tornar-se cruciais para enfrentar as limitações do
melhoramento clássico, pois além do tempo de obtenção de um novo material ser
demasiadamente longo, a cana-de-açúcar é um organismo complexo, e a sua
elevada ploidia (aneuploidia e ploidia) e estrutura do genoma criam desafios para o
desenvolvimento de plantas transgênicas que favoreçam o desenvolvimento da
planta ideal o mercado, ou seja, planta essa que seja produtiva, com alto teor de
sacarose (riqueza), tolerância ao déficit hídrico, alta produção de etanol e de
biomassa (MORAIS et al., 2015).
23
1.2. Estresse Genotóxico, Reparo de DNA e Produtividade do Cultivo.
1.2.1. Condições adversas seu efeito sobre as plantas.
As plantas por terem uma natureza séssil, em um ambiente variável, tem que
lidar com uma infinidade de condições adversas (doravante denominado estresse)
onde a maioria destas condições pode atrasar o seu crescimento e desenvolvimento
e, mais importante, impedi-los de atingir o seu potencial genético em termos de
produtividade, tendo vista que essa produtividade é estritamente relacionada à
estabilidade do genoma (BALESTRAZZI et al., 2011).
A segurança alimentar é uma questão importante na agenda política mundial,
tendo em conta que nos próximos 40 anos, a demanda por produção de cereais
deverá aumentar em 60% à medida que a população irá crescer dos atuais 6,6 para
8,7 bilhões até o ano de 2050 (BENGTSSON et al., 2006). O aumento da
temperatura global, associado a chuvas limitadas e condições extremas de seca,
afeta severamente a produtividade das culturas dentro de um cenário em que as
previsões de escala global da futura dinâmica da vegetação se tornaram uma
prioridade para a comunidade científica (AHUJA et al., 2010; MCDOWELL et al.,
2011). São esperadas temperaturas sazonais crescentes e precipitações reduzidas,
acompanhadas de ondas de calor com maior frequência e maior duração
(AINSWORTH & ORT, 2010).
A segurança alimentar não é o único problema ser enfrentado pela a
humanidade em um futuro próximo, não se pode ignorar a crítica questão dos
combustíveis fósseis. É previsto que a produção mundial de petróleo deverá diminuir
de 25 bilhões de barris para 5 bilhões de barris até 2050 (CAMPBELL & LAHERREE,
1998). Todavia, com a nova descoberta do uso de biocombustível, a demanda atual
por esse tipo de combustível aumentou. A cana-de-açúcar é uma das principais
fontes de biocombustível que pode substituir o combustível fóssil nos próximos anos.
Tal fato não apenas contribuiria para a manutenção do equilíbrio ecológico, mas
também fortaleceria a indústria e colaboraria para a diversificação energética
mundial (LAM et al., 2009). Ademais, o uso de biocombustível tem impactos
positivos, uma vez que elimina os compostos de chumbo da gasolina, bem como a
redução da emissão venenosa de gases nocivos (GOLDEMBERG et al., 2008). Há
24
também a redução das emissões de CO2, pois o etanol de cana-de-açúcar requer
apenas uma pequena quantidade de combustíveis fósseis para sua produção.
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é agora considerada a cultura de energia
de primeira geração (produção de etanol a partir da fermentação de açúcares
vegetais) mais produtiva, além de também ter eficiência na produção de
biocombustível de segunda geração (A produção de etanol a partir de biomassa
lignocelulósica) (BECHARA et al., 2018). Os açúcares extraídos da cana de açúcar
podem ser facilmente fermentados para produzir etanol. Além disso, o bagaço
(biomassa remanescente após o suco ser extraído das hastes) é usado pelas usinas
de açúcar para gerar vapor e eletricidade (SALASSI & BREAUX, 2006; MAHMOOD-
UL-HASSAN et al., 2015). Levando-se em consideração as mudanças climáticas e
seu efeito negativo sobre a agricultura, inclusive na cultura de cana-de-açúcar, isso
também desencadearia consequências adversas na produção de biocombustível e,
logo, prejudicando a economia brasileira.
As plantas expostas a ambientes adversos sofrem estresse oxidativo,
resultando em lesões graves nos níveis celular e molecular. Exemplo desses
ambientes adversos seria a poluição ambiental, causada por atividades
antropogênicas, bem como o estresse hídrico e as condições de alta temperatura
associadas a mudanças climáticas rápidas que contribuem para a deterioração do
solo e, portanto, afetam a produtividade das culturas (AHMAD et al., 2009). Quando
as plantas estão diante do estresse oxidativo, as respostas protetoras, que incluem
uma rede complexa de eventos moleculares e celulares integrados, são ativadas. A
percepção inicial do estresse e a transdução do sinal de estresse são fatores-chave
que levam à modulação da expressão gênica e, finalmente, à resposta da planta que
pode garantir a tolerância e assim garantindo a sobrevivência do organismo
(BALESTRAZZI et al., 2009). Não obstante, a maioria das pesquisas focam nas
respostas das plantas aos estresses individuais, incluindo calor, seca, salinidade,
frio, osmose, nutrientes, bactérias, fungos, vírus e herbívoros (WANG et al., 2003;
NAKASHIMA & YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2006; FERREIRA et al., 2007;
RODRIGO et al., 2011; FÜRSTENBERG-HÄGG et al., 2013; SHAIK &
RAMAKRISHNA, 2013; SHANKER et al., 2014). Embora esses estudos forneceram
insights importantes sobre as respostas ao estresse das plantas, eles não permitem
prever as respostas das plantas em condições de campo as quais normalmente
25
englobam mais de um estresse simultâneo atuando sobre o cultivar (ATKINSON &
URWIN, 2012; ATKINSON et al., 2013; PRASCH & SONNEWALD, 2013;
RASMUSSEN et al., 2013 KISSOUDIS et al., 2014; SUZUKI et al., 2014; PANDEY
et al., 2015). Atualmente, esforços intensos são dedicados a compreender os
múltiplos aspectos da biologia molecular do estresse das plantas para adquirir novos
conhecimentos e fornece ferramentas/tecnologias avançadas para melhorar a
sobrevivência dos vegetais e garantir um ótimo desempenho agronômico.
A cana-de-açúcar, por sua vez, é considerado uma planta com algumas
peculiaridades, como as múltiplas cópias do genoma, que introduzem obstáculos
para abordagens fisiológicas, genéticas e bioquímicas para sua melhoria. O enorme
impacto do biocombustível na economia, a exploração bem-sucedida da cana-de-
açúcar em biocombustíveis e as mudanças climáticas mudaram o foco global e
identificaram a inevitável necessidade de pesquisas extensivas sobre a cana-de-
açúcar (AZEVEDO et al., 2011). Um exemplo de estresse que afeta a cana-de-
açúcar, principalmente relacionamento regiões de clima árido e semiárido, é o salino.
O estresse salino prejudica gravemente a produtividade e a qualidade do produto,
principalmente resultando na redução da atividade fotossintética (AKHTAR et al.,
2003) que eventualmente provoca a diminuição na concentração de sacarose na
haste de cana (ROZEFF et al., 1995).
Estudos voltados a identificação e caracterização de genes essências para a
tolerância a estresse abióticos e biótico ainda são escassos em cana-de-açúcar se
comparado a outros organismos vegetais, tais como a Arabidopsis thaliana. Pode-
se citar alguns exemplos, como o isolamento do gene de catalase peroximal
(ScCAT1) em uma variedade de cana-de-açúcar resistente ao patógeno Sporisorium
scitamineum, indicou que o gene responde a condições de estresse biótico e abiótico
que estaria envolvendo na proteção da cana-de-açúcar contra o estresse oxidativo
(SU et al., 2014). Augustine et al (2015) investigaram o efeito da super-expressão do
gene HSP70 (heat shock protein 70) de Erianthus arundinaceus (cana-de-açúcar
selvagem) em cana-de-açúcar moderna ocasionando, como consequência, a
formação de interdigitações anisotrópicas em resposta ao referido estresse. O gene
R2R3-MYB em cana-de-açúcar (ScMYB2) apresentou um splicing alternativo de dois
trainscritos (ScMYB2S1 e ScMYB2S2) que estariam envolvidos na via de sinalização
da senescência da folha mediada por ABA (ácido abscísico) e atuariam em um papel
26
positivo na resposta da senescência induzida por seca na cana-de-açúcar (GOU et
al., 2017). Zhang et al (2017) investigaram a subunidade 7 mediadora (MED7), uma
subunidade chave na modulação do complexo da RNA polimerase II, em cana-de-
açúcar (ScMED7), a qual foi observado que a sua transcrição está relacionado com
a presença de metais pesados, temperatura baixa e hormônios. ScMED7
desempenharia um papel importante na modulação das respostas da cana-de-
açúcar aos estresses bióticos e abióticos, e poderia atuar nas respostas
hipersensíveis e na defesa basal contra os patógenos (ZHANG et al., 2017). Liu et
al (2018) estudaram o gene ScAPX6 (L-ascorbate peroxidase 6) em cana-de-açúcar,
a qual exibiu como localização subcelular o cloroplasto, tolerância ao estresse por
cobre (Cu), tendo aumento de expressão em hormônios associados ao estresse
(ácido abscísico e metil jasmonato), sendo proposto que ScAPX6 estaria associado
a resposta a hipersensibilidade e imunidade da cana-de-açúcar. Como pode ser
observado, tais trabalhos citados anteriormente se concentram na analise de
expressão dos genes por eles estudados, tendo poucos estudos voltados para a
caracterização enzimática e modelagem das presumíveis proteínas para a cana-de-
açúcar.
1.2.2. Resposta ao estresse e sua relação as vias de reparo de DNA.
As plantas estão continuamente expostas a estresses ambientais, edáficos e
outros estresses antropogênicos. Estes incluem extremos de temperatura, seca, UV-
B (radiação ultravioleta do tipo B - 320–280 nm), bem como poluentes do ar e do
solo. Além de impactar severamente os componentes estruturais, enzimáticos e não
enzimáticos das plantas, esses estresses potencialmente ameaçam os genomas
vegetais (WASI et al., 2013). Os danos ao DNA que não foram devidamente
corrigidos podem gerar mutações, que podem acarretar instabilidade do genoma da
planta, dessa forma afetando o seu crescimento e produtividade, o que ameaça a
sobrevivência do organismo (SINGH et al., 2010, BIEDERMANN et al., 2011). As
plantas, por serem organismos sésseis, são susceptíveis aos impactos ambientais
desfavoráveis, logo o embate contra os agentes estressores e suas consequências
(lesões ao material genético, por exemplo) é a única alternativa para sua
sobrevivência e crescimento.
27
O estresse genotóxico nas plantas é essencialmente considerado como um
fator crítico que prejudica o fitness e a produtividade ao afetar a estabilidade do
genoma (TUTEJA et al., 2009; ROLDAN-ARJONA & ARIZA, 2009), tendo em vista
os efeitos do estresse oxidativo no compartimento nuclear onde o DNA pode se
tornar o principal alvo das espécies reativas de oxigênio (EROs). Vários estresses
abióticos (por exemplo: déficit de água, alto teor de sal, luz UV, radiação ionizante,
metais pesados e ozônio) podem desencadear o dano ao DNA, atuando diretamente
na estrutura de dupla hélice ou aumentando os níveis intracelulares de EROs
(TUTEJA et al., 2009). O dano oxidativo do DNA requer um reparo rápido para
manter a integridade do genoma e preservar a fidelidade da informação genética. A
resposta das células das plantas ao estresse genotóxico depende da atividade de
múltiplos caminhos de reparo do DNA que compartilham alguns elementos comuns
com células animais, mas também características próprias, únicas para o reino
vegetal (BALESTRAZZI et al., 2013).
Vários agentes genotóxicos podem simultaneamente causar danos ao DNA
dentro do núcleo e estresse oxidativo fora do compartimento nuclear, levando a uma
atividade molecular complexa que pode resultar na morte celular programada
(BALESTRAZZI et al., 2013). Além do estimulo ao reparo do DNA, mecanismos
antioxidantes são ativados dentro e fora do compartimento nuclear. No entanto,
enquanto a maquinaria antioxidante da planta tem sido amplamente investigada
(GILL & TUTEJA, 2010), a pesquisa no campo do reparo do DNA em organismos
vegetais ainda é limitada, apesar da relação relevante entre este aspecto da fisiologia
da planta e os problemas agronômicos atuais (BALESTRAZZI et al., 2011).
Geralmente, é aceito que a escolha de uma via de reparo e sua ação depende
principalmente do tipo de célula, seu status de proliferação, fase do ciclo celular, bem
como o tipo de lesão e seu contexto genômico (BRITT, 1999; MANOVA &
GRUSZKA, 2015). Fora algumas exceções, demonstrou-se que as plantas possuem
todos os mecanismos de reparo da molécula de DNA que foram inicialmente
descritos em maior extensão nos outros sistemas eucarióticos, como leveduras e
mamíferos (BRITT, 2002; MANOVA & GRUSZKA, 2015).
Em relação as vias de reparo (figura 1), temos a via de fotorreativação dos
danos induzidos por UV (radiação ultravioleta) na molécula de DNA, sendo um dos
28
mecanismos de reparação primário imprescindível para as plantas diariamente,
devido a necessidade inerente a exposição à luz solar para que a fotossíntese
ocorra. As duas formas clássicas de reparo de excisão, de base (BER) e de
nucleotídeos (NER), muitas vezes consideradas como "reparação de escuro",
também são encontradas no genoma das plantas (RASTOGI et al., 2010). O reparo
de DNA Mismatch (MMR), ou reparo de mal pareamento do DNA, tem sido implicado
na remoção de nucleotídeos emparelhados de forma incorreta e as fotolesões
induzidas por UV nos genomas de plantas superiores (CULLIGAN & HAYS, 2000;
LARIO et al., 2011.). As principais vias de reparo de quebra de fita dupla de DNA -
Recombinação Homóloga (HR) e Recombinação não-Homóloga (NHEJ)
demonstraram ser essenciais nas plantas para a preservação de sua estabilidade
genética (PUCHTA & HOHN, 1996; WATERWORTH et al., 2011). Alguns dos
mecanismos de reparo, como a fotorreativação, são altamente especializados para
um dano particular, no entanto, outros, como a via de excisão ou recombinação,
podem lidar com uma grande variedade de lesões (RIES et al., 2000; FATIMA et al.,
2017).
Figura 1 - Agentes genotóxicos e reparo do DNA, em plantas. A molécula de DNA nas plantas sofre ação de agentes genotóxicos que provocam danos ao seu material genético. As plantas, por sua vez, possuem várias vias de reparo do DNA como ilustrado acima para se protegerem. EROs – Espécies Reativas de Oxigêncio, UV- Ultravioleta.
A maior parte da pesquisa na área de reparo de DNA foi realizada em enzimas
bacterianas, todavia trabalhos adicionais demonstraram que há um nível alto de
29
conservação dessas proteínas entre os diferentes reinos, o que permite a análise via
homologia de sequências (SCHRÖPFER et al., 2014).
Em relação aos estudos de reparo de DNA em plantas, estes se concentraram
nas plantas superiores principalmente utilizando uma pequena dicotiledônea como
modelo: Arabidopsis thaliana (HAYS, 2002). O isolamento e a caracterização dos
primeiros genes de reparo do DNA nos vegetais estavam envolvidos no
fotorreativação, reparo por excisão, HR e NHEJ, todos esses foram inicialmente
baseados na informação da sequência homóloga disponível em outros organismos
(BATSCHAUER, 1993; BRITT et al., 1996; SANTERRE & BRITT, 1994; AHMAD et
al., 1997; JIANG et al., 1997; DOUTRIAUX et al., 1998; GARCIA et al., 2000;
HARTUNG et al., 2000; LIU et al., 2000; OSAKABE et al., 2002; TAMURA et al.,
2002; WEST et al., 2002.).
Além do modelo genético vegetal de Arabidopsis, outro modelo utilizado é o
arroz (Oryza sativa L.), estas duas espécies têm sido bem estudas, no caso das
plantas, para os mecanismos de reparo e sua relação com a influência de vários
fatores ambientais e de desenvolvimento vegetal, bem como sobre a identificação e
regulação dos genes envolvidos no reparo do DNA e nos diferentes mecanismos de
proteção (UEDA & NAKAMURA, 2011). A pesquisa intensiva realizada em
Arabidopsis e em arroz aumentaram enormemente os conhecimentos atuais sobre
os mecanismos de reparo de DNA nas plantas (HAYS, 2002; KIMURA et al., 2004).
Durante a última década também foram feitos progressos significativos na
caracterização molecular das vias de reparo e genes que medeiam esses processos
em importantes plantas de cultivo, como arroz, espinafre (Spinacia oleracea), pepino
(Cucumis sativus), tomate (Solanum lycopersicum), trigo (Triticum spp.), cevada
(Hordeum vulgare) e outras (MANOVA & GRUSZKA, 2015). O avanço da tecnologia
molecular tem expandido o número de genomas de culturas sequenciados e, assim,
contribuiu para os avanços realizados no campo de reparo do DNA nos vegetais
(SINGH et al., 2010; BALESTRAZZI et al., 2013). No entanto, esses estudos ainda
são poucos e devem ser expandidos para incluir um maior número de espécies se
quisermos ter uma imagem mais clara da capacidade dos genomas de plantas para
superar os impactos biológicos de diferentes agentes genotóxicos e para se adaptar
às mudanças nas diferentes condições de estresse ambiental. Além disso, ainda
30
existe a necessidade de aprofundar ainda mais nesse campo de pesquisa para
plantas poliploides de importância comercial tais como batata (Solanum tuberosum),
algodão (Gossypium L.) e cana-de-açúcar, cuja complexidade do genoma se torna
um obstáculo para um melhor entendimento desses mecanismos.
1.2.2.1. Pesquisas relevantes em cana-de-açúcar no reparo do DNA.
Desde o início dos anos 2000, pesquisadores da UNICAMP (Universidade
Estadual de Campinas, Brasil), ESALQ-USP (Instituto de Agricultura Luiz de Queiroz,
Piracicaba / SP), IAC (Instituto Agronômico de Campinas, Campinas / SP), e a
UFSCar (Universidade Federal de São Carlos, Araras / SP) se concentraram
amplamente em várias áreas relacionadas para assim promover o conhecimento da
estrutura genética e genômica da cana-de-açúcar. A pesquisa desses grupos é
principalmente dedicada a microsatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats -
sequências simples repetidas, TAUTZ, 1989) e SNPs (Single-Nucleotide
Polymorphisms - polimorfismo de nucleotídeo único), mapas de ligação e
mapeamento de loci de caracteres quantitativos (QTL), construção e avaliação de
cromossomo artificial bacteriano (BAC) e as análises do transcriptoma de vários
tecidos (DE SETTA et al., 2016).
As primeiras pesquisas públicas consistiam na construção do banco de dados
ESTs (expressed sequence tag -marcador de sequência genética) de cana-de-
açúcar (SUCEST) e posterior análise e anotação funcional dessas sequências
(VETTORE et al., 2001), além da identificação de genes relacionados ao reparo de
DNA por meio de sequências ESTs de cana-de-açúcar (COSTA et al., 2001),
também foi especificada a detecção de genes referentes a via BER (via de Reparo
por Excisão de Bases) (AGNEZ-LIMA et al., 2001). Essas pesquisas levaram em
consideração a utilização de ferramentas de bioinformática para permitir a
identificação de grupos de genes que participam de diferentes vias do reparo do DNA
em homologia com os genes de Arabidopsis, como discutido no tópico anterior.
Contudo, a procura de homólogos envolvidos na replicação e reparo do DNA é
particularmente difícil nas espécies cujas sequências genômicas completas não
estão disponíveis, como é o caso da cana-de-açúcar. Uma das soluções é o uso de
ESTs como base para a identificação de genes. Os ESTs são definidos como os
31
fragmentos de sequências de RNAm obtidas através de reações de sequenciamento
que são realizadas em clones selecionados aleatoriamente de bibliotecas de cDNA.
Os projetos de EST são usados principalmente para complementar os projetos de
genoma existentes ou para servir como alternativas para fins de descoberta de genes
(PARKINSON & BLAXTER, 2009). A tecnologia da sequência de EST oferece uma
alternativa relativamente barata ao sequenciamento do genoma integral e tornou-se
um recurso valioso para a identificação de genes (LINDLÖF, 2003). Logo, dispondo
do banco ESTs (SUCEST-FUN) foi determinado homólogos presumíveis de cana-
de-açúcar dos genes de Arabidopsis que se sabe que estão envolvidos no reparo do
DNA (LIMA et al., 2001; COSTA et al., 2001). Dispondo desses homólogos, trabalhos
complementares envolvendo caracterização de genes específicos da via BER foram
feitos, permitindo uma melhor compressão dessa via de reparo em um organismo
complexo como a cana-de-açúcar (MAIRA et al., 2014; SCORTECCI et al., 2007)
1.3. Via de Excisão de Bases (BER)
1.3.1. Descrição da via e sua relevância para as plantas.
Dentre os mecanismos de reparo, a via de reparo por excisão de base (BER)
seria aquela via responsável por conferir proteção a molécula de DNA contra as
formas mais comuns de danos "non-bulky" nas bases (ou seja, que não causam
alterações na estrutura espacial do DNA de modo que poderiam ser identificados e
corrigidos por outras vias de reparo). Esses danos em geral são causados por
aquilações, oxidações, deaminações e erros que podem ocorrer durante o processo
de replicação (BARNES & LINDAHL, 2004; FORTINI & DOGLIOTTI, 2007;
ZHARKOV, 2008). Grande parte do dano é o resultado de lesões espontâneas que
ocorrem naturalmente a molécula de DNA (LINDAHL, 1993), embora, outros danos
também possam ser causados por produtos químicos advindo do ambiente,
radiações ou tratamentos com drogas citostáticas (substâncias citotóxicas
destinadas a causar disfunção celular).
As etapas da via BER, como apresentada na figura 2, já foram bastante
estudados e se desenvolvem a partir de uma DNA glicosilase que identifica e retira
a base inapropriada. Esta base pode apresentar uma alteração química em sua
estrutura que pode vir a gerar consequências mutagênicas. Estas DNA glicosilases
32
clivam a ligação C1´-N-glicosídica e geram assim um sitio abásico
(apurínico/apirimídico – ou sítio AP) (STIVERS & JIANG, 2003; ZHARKOV &
GROLLMAN, 2005). O passo seguinte desta via de reparo corresponde ao
processamento deste sítio AP, já que este é considerado genotóxico. Não obstante,
deve-se enfatizar que nem todos os sítios AP são oriundos de ações das enzimas
DNA glicosilase, os sítios AP também podem ser resultantes da perda espontânea
de bases nitrogenadas que pode ocorrer naturalmente na molécula de DNA
(LINDAHL, 1993). As enzimas AP endonuclease ou as enzimas AP liases (também
denominadas de DNA glicosilase bifuncional) serão as responsáveis por processar
o sítio AP que, ao final, produzem extremidades 5´- e 3´- bloqueadas (5'dRP - 5'
desoxirribose fosfato, 3´PUA - aldeído β,α-insaturado). A ação de enzimas adicionais
da via atuam sobre essas extremidades não-convencionais, que impediriam
posterior ação das enzimas de reparo, e geram as extremidades corretas: 5´-P e 3´-
OH, respectivamente, pela ação de polimerase com a atividade dRPase, atuando
sob o 5'dRP, ou AP endonuclease com atividade 3´-fosfodiesterase, agindo sobre
3´-PUA (Figura 2) (LEVIN & DEMPLE, 1990; WIEDERHOLD et al., 2004). O
resultado é um gap (lacuna) na fita simples do DNA onde estava localizado o dano
original na base nitrogenada. Este gap vai ser então preenchido ou por um único
nucleotídeo, direcionando para uma sub-via de BER chamada de via curta (SN-BER
- Single Nucleotide Base Excision Repair), ou será preenchido por vários
nucleotídeos, direcionando para outra sub-via de BER, a via longa (LP-BER - Long
Patch Base excision repair) (figura 2) (FORTINI & DOGLIOTTI, 2007).
33
Figura 2 – Representação esquemática da via de excisão de bases (BER). O início da via se dá com o reconhecimento e remoção da base danificada (representado por uma estrela) por uma DNA glicosilase, essa enzima pode ser monofuncional, tendo apenas a capacidade clivar a ligação N-glicosídica, gerando um sítio abásico, ou pode ser bifuncional tendo também de clivar o esqueleto fosfodiestere do DNA (atividade liase), sendo que este último gera extremidades 5´fosfatase e 3 aldeído β,α-insaturado (PUA). A enzima Ap endonuclease identifica o sítio abásico, clivando o esqueleto fosfodiestere gerando extremidades 3´hidroxila e 5' desoxiribose fosfato (dRP). As extremidades PUA e dRP são extremidades não convencionais e necessitam ser processadas para se converterem em 3´hidroxila e 5´fosfato, respectivamente. Existem duas sub-vias de BER, via longa e curta, cuja diferença está na quantidade de nucleotídeos a serem adicionados na lacuna e nas proteínas que compõem tais vias. Proteínas que dão suporte a via BER estão indicando em cinza. Em verde está representado as enzimas que foram propostas atuarem na via BER dos organismos vegetais, contrastando com o que é apresentado em negrito referente as proteínas que atuam na via BER em mamíferos (Adaptado a partir de BAUTE & DEPICKER, 2008).
Até o momento, várias DNA glicosilases específicas para determinadas lesões
foram identificadas em plantas. Em Arabidopsis, 3-metiladenina-DNA glicosilase foi
o primeiro gene de reparo do DNA de planta clonada e mostrou remover as lesões
de DNA alquiladas induzidas pelo tratamento com MMS (Metanossulfonato de
metila) (SANTERRE & BRITT, 1994). Também foi observado em experimentos
utilizando extratos celulares de Arabidopsis que, quando esses extratos foram
expostos a molécula de DNA contendo a base Uracil, esta base foi retirada por
enzimas que se enquadrariam na família das uracil-DNA glicosilases (CÓRDOBA-
CAÑERO et al., 2009).
34
Evidenciou-se que ambas as vias BER podem ocorrer após as etapas de
incisão inicial, apesar da falta de homólogo da DNA polimerase beta (pol β) e DNA
Ligase III em plantas (figura 2), e as reações de reparo são finalizadas pela atividade
da AtLIG1 (DNA ligase 1) (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2009; 2011). Ademais, a via
curta de BER foi considerada como uma via de reparo essencial do DNA nas
mitocôndrias das plantas, pelo menos para a remoção da base Uracil, pois a
atividade da uracil-DNA glicosilase foi encontrada associada, predominantemente, à
membrana da organela tanto na planta modelo como nas espécies de cultivo
analisadas (BOESCH et al., 2009).
Em A. thaliana, as enzimas AtFPG (DNA-Formamidopirimidina Glicosilase) e
AtOGG1 (8-oxoguanine DNA glicosilase 1) apresentam atividades de
glicosilase/liase para iniciar a reparação da lesão oxidativa 8-Oxoguanina (8-oxoG)
e dos sítios apurínico ou apirimidínico (AP) endógenos. Os intermediários gerados
tornaram-se subsequentemente substratos para a DNA-3-fosfatase, ZDP, e a
endonuclease ARP. Haja vista o engajamento dessas enzimas no reparo de bases
oxidadas, a inativação dos genes AtFPG e AtOGG1 provocou um aumentou no nível
de lesões oxidativas na molécula de DNA dos genomas nucleares e mitocondriais,
enquanto a inativação das funções AtARP e AtZDP acelerou o envelhecimento das
sementes (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2014).
A proteína putativa AtPol λ (DNA Polimerase lambda) foi implicada no passo
de síntese da via longa de BER em Arabidopsis, tendo como base a Pol λ
anteriormente identificada em arroz que pertence a família X das polimerases. A
polimerase β, a enzima que atuaria na via BER em mamíferos, também seria
membro desta família, contudo não foi excluído a contribuição de outra DNA
polimerases de plantas ainda não identificada que também agiria na via longa de
BER (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2009, UCHIYAMA et al., 2009). Em relação as
enzimas de DNA ligase, cuja ação se situa na última etapa da via BER, experimentos
tem mostrado que até agora a proteína LIG1 é a única DNA ligase que pode ser
associada tanto com a via curta quanto com a longa da via de BER em plantas
(CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011).
O reparo da excisão base também está implicado no controle epigenético
(modificações da cromatina que não envolvem mudanças nas sequências de bases
35
do DNA, sendo de caráter hereditário), pois está ativamente envolvido na remoção
de 5-mC (5-Metilcitosina) e na sua substituição por uma citosina não-metilada em
eucariontes, incluindo as plantas. A metilação da molécula de DNA é uma
modificação epigenética associada a um estado da cromatina compactada que limita
a acessibilidade dos fatores de transcrição ou da maquinaria de reparo ao DNA
(GRAFI & OHAD, 2013). Sabe-se que os mutantes de Arabidopsis que são de forma
direta ou indiretamente afetados pela metilação exibem um fenótipo sensível ao dano
na molécula de DNA (GONG et al., 2002; ELMAYAN et al., 2005; SHAKED et al.,
2006; YAO et al., 2012). O processo de desmetilação pode resultar em lesões no
DNA, uma vez que requer o reparo por excisão de base para restaurar a sequência
(LEE et al., 2014).
A metilação do DNA é o mecanismo epigenético que está envolvido na
regulação da expressão gênica e na resposta ao estresse em plantas. Essa
modificação epigenética é mantida por uma rede altamente complexa de
mecanismos moleculares que apresentam uma grande sensibilidade a diferentes
sinais ambientais e do desenvolvimento. A metilação da molécula de DNA pode guiar
a deposição de outros marcadores epigenéticos e direcionar a atividade dos
complexos de remodelação da cromatina (ZILBERMAN et al., 2007). Após a
exposição ao estresse, a indução transcricional de genes específicos do estresse
frequentemente correlaciona-se com uma diminuição da metilação do DNA em seus
loci, sugerindo assim que a indução de genes relacionados ao estresse sob
condições de estresse naturais pode exigir a desmetilação de sequências
especificas (BOYKO & KOVALCHUK 2008; 2011). Portanto, o funcionamento
impróprio da via BER pode prevenir a desmetilação da molécula de DNA, já que essa
via estaria envolvida, como apresentado no início do texto, na identificação e retirada
da base metilada 5-mC, deste modo, pode afetar a regulação de genes e a atividade
de outras vias de reparo, alterando a expressão de seus genes. Várias proteínas
foram reconhecidas como essenciais para diferentes estágios do processos de
desmetilação mediada por BER em plantas, tais como o DNA glicosilase/liase
bifuncional ROS1, que removeria a base metilada e cortaria a cadeia de DNA, a
proteína ZDP que estaria envolvida no processamento dos intermediários
resultantes, bem como o homólogo AtXRCC1 (X-RAY REPAIR CROSS
36
COMPLEMENTING 1) de Arabidopsis, que estimula etapas do processamento da
extremidade 3´ e a etapa final de ligação (MARTÍNEZ-MACÍAS et al., 2013).
Outros membros da via BER, como PCNA (Antígeno Nuclear da Proliferação
Celular), um homotrimero que circunda a molécula de DNA, servindo de base para
o recrutamento de proteínas envolvidas nos processos de replicação, reparo,
remodelamento da cromatina e epigenética, teve homólogos identificados em
Arabidopsis e em várias espécies de plantas de cultivo, e alguns deles possuíam
uma segunda cópia funcionalmente ativa do gene (AMOROSO et al., 2001;
ANDERSON et al., 2008). As proteínas PCNA de plantas apresentam muitas
semelhanças estruturais e funcionais com as de outros organismos o que suportam
seu envolvimento no reparo por excisão, bem como nas vias replicativas da síntese
do DNA nos vegetais (STRZALKA & ZIEMIENOWICZ, 2011). De fato, foi mostrado
que as atividades das proteínas OsFEN1 (FLAP ENDONUCLEASE 1) e OsPOLλ no
arroz foram melhoradas pela interação com OsPCNA, considerando que uma das
funções dessa proteína é potencializar a atividade de polimerases e Flap
endonuclease 1, além de outras proteínas que a ela (PCNA) se associam
(SCHRÖPFER et al., 2014). Estudos de expressão gênica envolvendo a atividade
BER em arroz abrangendo a proliferação celular, demostrou níveis elevados de
transcritos OsPCNA, OsFEN1-a e OsPOL λ. Estes foram detectados principalmente
nos tecidos de arroz em desenvolvimento, mas não nas folhas maduras,
especialmente após o tratamento que provocou danos ao DNA (KIMURA et al., 2004;
UCHIYAMA et al., 2004). Esses resultados são condizentes com papel de proteína
PCNA na via BER que é necessário para a ancoragem das DNA polimerases
replicativas sobre o DNA e em aumentar a atividade da DNA polimerase. Além disso,
PCNA pode aumentar a estabilidade de ligação da proteína FEN1 e modular a
atividade da endonuclease por interação proteína-proteína (SCHRÖPFER et al.,
2014).
Em luzerna-cortada (Medicago truncatula), a regulação positiva das DNA
glicosilases MtOGG1 e MtFPG foi encontrada durante a embebição da semente que
coincidiu com a entrada de água e a produção de EROs (espécies reativas de
oxigênio), haja vista, que essas duas DNA glicosilases estão associadas com os
danos oxidativos (MACOVEI et al., 2011).
37
Em relação as plantas, em contraste com o rápido progresso observado em
mamífero, fungos e células microbianas, estudos em BER são ainda poucos.
Pesquisa efetuada na plataforma PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)
resultou em 4.233 artigos referente ao assunto reparo de DNA em organismos
vegetais, sendo que quando focado em Arabidopsis, referente ao mesmo assunto, o
total de artigos foi de 986. Entretanto, quando se pesquisou artigos relacionados a
via BER, sem restrigir a um organismo vivo em especifico, foi contabilizado mais de
111 mil artigos (destes 19 mil seriam relacionados a bactéria, 9 mil a levedura e 64
mil ao humano, aproximadamente).
A discrepância de trabalhos científicos voltadas para organismos vegetais, a
qual existe uma relativa homogeneidade das publicações, concentradas em
determinadas espécies, seria a complexidade do genoma vegetal de algumas
cultivares que se torna um obstáculo no desenvolvimento da pesquisa. Muitos
ensaios e estudos, em plantas, focam em organismos diploides, como já bastante
evidenciado nos exemplos expostos acima, na qual grande maioria dos
experimentos estavam voltados para o organismo modelo A. thaliana, enquanto a
cana-de-açúcar (alvo de estudo deste trabalho), apresenta a genética conhecida
como uma das mais complexas que existem no reino vegetal. O genoma nuclear
poliploide complexo e grandes genomas organelares da cana-de-açúcar
representam desafios para o sequenciamento do seu material genético e contribuem
para o fato da genômica desse organismo vegetal ficar atrás, em comparação com
outras espécies de gramíneas, como arroz, milho e sorgo
(THIRUGNANASAMBANDAM et al., 2018). Devido a isso, estudo voltados para
reparo de DNA, bem como a via BER, na cana-de-açúcar são poucos, muitos dos
mesmos limitados devido a natureza complexa deste organismo já exposto
anteriormente. À vista disso, demonstra-se a necessidade de estudos voltados a
organismos de importância econômica, a exemplo da cana-de-açúcar, cujos
resultados porventura obtidos podem ter aplicações na agroindústria, como a
descobertas de ferramentas no ramo da genética para amplificar o manejo e a
produtividade.
38
1.3.2. Ap Endonuclease – Uma das enzimas chaves da via BER.
A apurínica/apimínica (AP) endonuclease 1 de mamíferos (APE1) é
necessária para a reparação de sítios abásicos e outras lesões de DNA e é uma
enzima essencial do reparo por excisão de bases (BER) e das vias de reparo de
quebra de fita simples do DNA (KANE & LINN, 1981; ROBSON & HICKSON, 1991;
DEMPLE et al., 1991). A APE1 também possui funções importantes na regulação
transcricional e às vezes é referido como Ref-1 (BHAKAT et al., 2009). O substrato
dessa enzima seriam os sítios abásicos que são lesões mutagênicas e citotóxicas
que surgem por ruptura espontânea da ligação N-glicosil ou pela a ação de DNA
glicolisilases, que promovem, por sua vez, a excisão das bases danificadas do DNA
(LOEB, 1985; LINDAHL, 1993).
A APE1 é essencial para o desenvolvimento embrionário e a viabilidade
celular (XANTHOUDAKIS et al., 1996; FUNG & DEMPLE, 2005; IZUMI et al., 2005).
Além de também mediar o reparo de rupturas de fita simples e fita dupla do DNA
pela remoção de grupos de 3´- blocking (- bloqueada), gerando novamente uma
extremidade 3´-OH permitindo a subsequente ação de outros membros da
maquinaria de reparo (IZUMI et al., 2000; PARSONS et al., 2004).
O genoma de A. thaliana, uma planta modelo amplamente utilizada do grupo
das dicotiledôneas, contém três genes que codificam os homólogos da
endonuclease 1 humana (APE1): AtARP, AtAPE1L e AtAPE2. Em outras pesquisas,
foi mostrado que a proteína AtARP é uma AP endonuclease de classe II hidrolítica
que cliva o DNA duplex na posição 5 ' em um sítio abásico e gera uma quebra de fita
simples flanqueada com um 3'-hidroxil (3'-OH) e um 5' desoxirribose fosfato (5'-dRp)
(BABIYCHUK et al., 1994; CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011). A AtARP também
contém uma função redox análoga à do APE1 humano, que pode estimular a ligação
ao DNA pelo fator de transcrição humano AP-1 (BABIYCHUK et al., 1994). Na
presença de Mg+2, AtARP exibe maior atividade de clivagem do sítio abásico em
extratos celulares de A. thaliana (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011; CÓRDOBA-
CAÑERO et al., 2009). Curiosamente, os mutantes arp-/- crescem normalmente e
não exibem defeitos fenotípicos em condições laboratoriais, no entanto, são
hipersensíveis à presença de 5-Fluorouracil (5-fU) no meio de crescimento,
sugerindo que a AtARP é essencial quando um aumentado no número de sítios
39
abásicos é gerado pela ação da enzima monofuncional uracil-DNA glicosilase
(AtUNG) (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011).
Um estudo genético mostrou que as plantas de A. thaliana que são deficientes
em AP endonuclease (individualmente, em relação a cada um dos três homólogos a
APE1 nesse organismo vegetal) não apresentam fenótipos evidentes que
diferenciem do fenótipo do tipo selvagem (MURPHY et al., 2009). Todavia, foi
observado que duplos mutantes nos genes AtAPE1L e AtAPE2 seriam letais,
resultando em um fenótipo de aborto de sementes, enquanto que a inativação de
AtARP em combinação com AtAPE1L ou AtAPE2 não é prejudicial (MURPHY et al.,
2009). Essas observações sugerem que AtAPE1L e AtAPE2 são necessários para
reparar o dano no DNA endógeno que ocorre durante o desenvolvimento da semente
e para o processamento da extremidade 3´ durante a desmetilação iniciada pela
5mC-DNA glicosilases (CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011).
Os dados do genoma da cana-de-açúcar mostraram a presença de duas
sequências homólogas ao AtARP: ScARP1 e ScARP3 (AGNEZ-LIMA et al., 2001).
A identidade de sequência entre ScARP1 e AtARP foi de 59% e entre ScARP3 e
AtARP foi de 72%. Além disso, a análise filogenética mostrou que essas duas
sequências foram colocadas em clados parafiléticos (MAIRA et al., 2014). Os
resultados obtidos permitem propor que a proteína ScARP3 poderia reter uma maior
semelhança para com a sequência dos clados das dicotiledôneas. Por outro lado, o
ScARP1 poderia ser resultado de um novo evento de duplicação de genes, devido a
sua proximidade ao clado das monocotiledôneas. Esta sequência (ScARP1) pode
ter sofrido modificações nas regiões codificantes e de regulação o que seria um
resultado evidente de um processo de sub-funcionalização (MAIRA et al., 2014). Os
dados de qPCR mostraram que ScARP1 e ScARP3 foram detectados em todos os
tecidos de cana-de-açúcar analisados (raízes, folhas, flores e meristema apical) e
apresentaram um padrão de expressão ligeiramente semelhante (MAIRA et al.,
2014). No entanto, o padrão de expressão sugere que a sequência ScARP1 pode
responder ao estresse oxidativo de forma diferente da ScARP3, esse resultado
reforça a hipótese de que ScARP1 pode ser um resultado de sub-funcionalização
(MAIRA et al., 2014). Com base nesses dados, no presente trabalho, fizemos análise
in silico da AP endonuclease em Arabidopsis e cana-de-açúcar, bem como a
caracterização bioquímica in vitro da proteína ScARP1, que devido as suas
40
características próprias (regulação, estrutura e filogenia) que diferem da ScARP3,
proporcionará um melhor entendimento bioquímico da caracterização enzimática de
uma AP endonuclease oriunda da cana-de-açúcar.
1.4. Importância da análise in silico.
1.4.1. Análise filogenética.
A filogenia é a história da descendência de um grupo de taxa, como espécies e
de seus antepassados comuns, incluindo a ordem de ramificação e às vezes os
tempos de divergência. O termo "filogenia" é derivado de uma combinação de
palavras gregas. “Phylon” é "tribo" ou "clã" ou "raça" e "genia" significa "origem" ou
"fonte". Sendo um método de reconstrução filogenética que pode também ser
utilizado para ampliar a compreensão das relações evolutivas entre genes derivados
de um ancestral comum (BOGUSZ & WHELAN, 2017).
Na filogenia molecular, as relações entre os organismos ou os genes são
estudados comparando homólogos de DNA ou sequências de proteínas.
Dissimilaridades entre as sequências indicam divergência genética como resultado
da evolução molecular ao longo do tempo (AMIT, 2014).
De forma geral, enquanto a abordagem filogenética clássica depende de
características morfológicas de um organismo, as abordagens moleculares
dependem de sequências de nucleotídeos de RNA e DNA e sequências de
aminoácidos de uma proteína que são determinadas usando técnicas modernas. Ao
comparar moléculas homólogas de diferentes organismos, é possível estabelecer
seu grau de parentesco estabelecendo ou revelando uma hierarquia de
relacionamento em uma árvore filogenética. Tanto os métodos baseados em
morfologia clássica como os métodos baseados em análises moleculares são
evidências relevantes, uma vez que a estrutura biomolecular básica de todos os
organismos é semelhante e a morfologia de um organismo é, na verdade, as
manifestações dos seus perfis de genoma, proteoma e transcriptoma (AMIT, 2014).
Uma combinação dos métodos baseados na morfologia e dos métodos baseados
em análise molecular fortalece assim o exercício da determinação das relações
filogenéticas dos organismos em grande medida.
41
Inferir árvores filogenéticas a partir de dados de sequência molecular é um
método fundamental usado em estudos evolutivos e sistemáticos. A árvore
resultante pode fornecer informações diretas sobre as relações evolutivas entre
espécies individuais ou pode refletir aspectos importantes da história das
sequências, como a duplicação de genes (BOWERS et al., 2003) e a classificação
da linhagem (MADDISON & KNOWLES 2006). A árvore também é um componente
crítico de outros estudos, e pode servir para a melhor compreensão da evolução
adaptativa (YANG, 2006), estudando a aquisição de novas funções (CONANT &
WOLFE 2008) e datando os eventos de especiação (DOS REIS et al., 2016). A
estimativa da filogenia é uma tarefa difícil, uma vez que exige distinguir entre muitas
histórias evolutivas potenciais usando apenas dados moleculares do número
relativamente pequeno de sequências existentes à nossa disposição (BOGUSZ &
WHELAN, 2017). Muitos métodos de inferência de árvores foram propostos e a
abordagem atual da técnica é realizar inferência através de um processo em duas
etapas de alinhamento de sequência múltipla (MAS - multiple sequence alignment)
seguido de inferência estatística da árvore (FELSENSTEIN, 1988).
Cada organismo, bem como as moléculas proteicas que o compõem,
possuem uma história evolutiva a ser desvendada para, assim, aprofundar o
conhecimento da evolução da vida como um todo, além de possibilitarem aplicações
biológicas desse conhecimento.
1.4.2. Modelagem
Com o sucesso de uma série de expansões de projetos de sequenciamento de
genomas, o número de sequências de proteínas conhecidas foi aumentado
exponencialmente. Diante desse cenário, muitos genomas foram depositados no
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nihgov/genbank/). Os dados do GenBank para o mês
de maio de 2018 indicou que a plataforma possui armazenada cerca de 208 milhões
de sequências (estatísticas do site: https://www.ncbi.nlm.nihgov/genbank/statistics/)
já sequências advindas dos projetos de Whole Genome Shotgun (WGS), que se
tratam de genomas ou cromossomos incompletos de procariontes ou eucariontes
que geralmente estão sendo sequenciados por estratégia whole genoma shotgun,
se encontra em torno 621 milhões de sequências. No entanto, as sequências por
42
conta própria não podem dizer o que cada proteína faz na célula. Embora a
informação da estrutura proteica seja essencial para a compreensão da função, a
velocidade da determinação da estrutura proteica fica muito atrás do aumento das
sequências nucleotídicas descobertas, devido às dificuldades técnicas e à natureza
laboriosa das experiências da biologia estrutural. Até maio de 2018, cerca de 114
milhões de sequências de proteínas anotadas automaticamente e não revisadas e
557 mil sequências anotadas e revisadas foram depositadas no banco de dados
UniProtKB (BAIROCH et al., 2005) (http://www.uniprot.org/). Contudo, o número
correspondente de estruturas de proteínas em 3D no banco de dados da Protein
Data Bank (PDB) (BERMAN et al., 2000) (http://www.rcsb.org) é de apenas cerca de
140 mil.
O experimento para determinar estruturas proteicas por meio de difração de
raio-X se baseia na purificação e cristalização da proteína, no entanto, como já
mencionado anteriormente, essas técnicas requerem uma intensa mão de obra e
demora para se obter resultados. Alternativamente, a estrutura de uma proteína pode
ser determinada por meios não experimentais, como é o caso da modelagem
molecular. Assim, o desenvolvimento de algoritmos computacionais eficientes que
podem gerar previsões de estrutura 3D de alta resolução torna-se provavelmente o
único caminho para preencher as lacunas geradas pelo acumulo de dados advindo
dos projetos de sequenciamento.
Dependendo se as proteínas semelhantes foram resolvidas
experimentalmente, os métodos de predição da estrutura proteica podem ser
agrupados em duas categorias. Primeiro, se as proteínas a serem estudadas exibem
uma estrutura similar a outra proteína cuja estrutura tridimensional esteja disponível
dentro do banco de dados PDB, o modelo da sequência da proteína alvo pode ser
construído tendo como base a estrutura do template (cristal oriundo do PDB). O
procedimento é chamado de "modelagem baseada em um template" (SALI &
BLUNDELL,1993; KARPLUS et al., 1998; JONES 1999; SKOLNICK et al., 2004;
SODING 2005; WU & ZHANG 2008; YANG et al., 2011b). Se os modelos de proteína
não estiverem disponíveis, deve-se criar os modelos 3D a partir do zero. Este
procedimento recebeu nomes diferentes, modelagem ab initio (KLEPEIS et al. 2005;
LIWO et al., 2005; WU et al., 2007; TAYLOR et al., 2008; XU & ZHANG, 2012);
Modelagem de novo (BRADLEY et al., 2005a, b), modelagem baseada em física
43
(OLDZIEJ et al., 2005), ou modelagem livre (JAUCH et al., 2007, KINCH et al., 2016),
logo esse método se baseia na natureza físico-química dos resíduos, tentando
prever a disposição tridimensional dos mesmos e assim moldar a estrutura terciária
da proteína.
Com relação as plantas, efetuando uma busca dentro do banco de dados do
PDB pode-se observar que o mesmo possui 1.157 cristais pertencentes ao
organismo A. thaliana sendo que para humano existem 39.235 cristais disponíveis
para estudo (consulta efetuada em maio de 2018). Tendo em vista a necessidade de
aprofundar os estudos em organismos vegetais visando não só preencher lacunas
de conhecimento como também buscando aplicações das descobertas em
ferramentas biotecnológicas para melhoramento vegetal, previsões de estruturas
proteicas por meio de modelagem in silico se torna uma alternativa atraente para
suprir as necessidades da literatura e da agroindústria.
44
2. OBJETIVO GERAL.
Identificar e caracterizar (enzimaticamente e/ou in silico) genes de reparo associados
com a via de excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar (Saccharum spp.).
2.1. Objetivos específicos.
• Buscar e avaliar as sequências de reparo da via BER em banco de dados de
ESTs (SUCEST) de cana-de-açúcar;
• Analisar filogeneticamente as sequências obtidas buscando verificar presença
de múltiplas cópias das referidas sequências nas famílias de organismos
vegetais;
• Analisar estruturalmente algumas das sequências de reparo por meio de
modelos tridimensionais;
• Clonar e purificar a presumível AP Endonuclease ScARP1 de cana-de-açúcar.
Além de verificar a presença de atividades enzimáticas (endonuclease,
fosfatase, exonuclease e 3´diesterase);
• Avaliar a capacidade de complementação de atividade enzimática de ScARP1
em extratos da planta mutante de A. thaliana;
45
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Identificação de componentes de BER em cana-de-açúcar.
3.1.1. Busca por sequências e avaliação.
A identificação das sequências em Saccharum spp. envolvidas na via de
Excisão de Bases (BER) se baseou no trabalho de Spampinato (2017) a qual se
tratou de uma revisão referente a via BER, fornecendo sequências de Arabidopsis
thaliana de cada um dos membros de BER. As referidas sequências foram
identificadas no servidor Uniprot (http://www.Uniprot.org). A partir destas sequências,
que foram as querys para efetuar a busca, foi então feito um BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool), mais especificamente o Blastp (query é uma proteína em
busca de sequências proteicas), em relação ao próprio bancos de dados do servidor,
especificamente no grupo das plantas. Dos resultados obtidos, foram então
selecionadas as sequências pertencentes a família das Poaceae, a qual cana-de-
açúcar faz parte. Do grupo de sequências encontradas anteriormente, se escolheu
a sequência oriunda de Sorghum bicolor ou Setaria itálica para efetuar uma nova
etapa de busca via BLAST (Tblastn) agora no banco de dados de ESTs (expressed
sequence tag -marcador de sequência genética) de cana-de-açúcar: o SUCEST-
FUN (www.sucest-fun.org/), mais precisamente os bancos de dados Sugarcane
Transcripts Assembly - Trinity (All) e Sugarcane Transcripts Assembly - Trinity (only
Full-Length), desta forma buscando encontrar sequências homólogas em cana-de-
açúcar correspondente aos componentes de BER investigados. Tal metodologia de
identificação de sequências putativas para a cana-de-açúcar está apresentada na
figura abaixo.
46
Figura 3 - Metodologia de identificação de sequências putativas de componentes da via de
Excisão de bases (BER) em cana-de-açúcar. Sequência dos componentes da via de excisão de
bases (BER) segundo o artigo de Spampinato (2017) de Arabidopsis thaliana onde foram identificados
no banco de dados Uniprot e foram utilizadas como query para o Blast efetuado contra o mesmo
banco de dados, para assim identificar sequências pertencentes a família Poaceae, dessas
sequências foi selecionada aquelas oriundas do organismo Sorghum bicolor ou Setaria italica para se
tornarem querys de um novo Blast agora contra o banco de dados ESTs (SUCEST-FUN) e com isso
foi identificado sequências presumíveis de BER em cana-de-açúcar.
As sequências eventualmente encontradas foram avaliadas quanto a
possibilidade de serem empregados em estudos in silico posteriormente (figura 4),
logo foram analisadas quanto a presença domínios conservados se utilizando
primeiramente da ferramenta CD-search
(https://www.ncbi.nlm.nihgov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) do NCBI (National Center for
Biotechnology Information - https://www.ncbi.nlm.nihgov/) (MARCHLER-BAUER et
al., 2016; MARCHLER-BAUER et al., 2014; MARCHLER-BAUER et al., 2010;
MARCHLER-BAUER & BRYANT, 2004), depois a ferramenta ScanProsite
(http://prosite.expasy.org/scanprosite/) do Prosite
47
(http://prosite.expasy.org/prosite.html) (DE CASTRO et al., 2006), e também foi
considerado o tamanho de sequência tendo como base informações da literatura
científica e das anotações nos bancos de dados. Essas comparações foram feitas
por meio de alinhamentos múltiplos das sequências de referência extraídas do
servidor Uniprot (Arabidopsis thaliana, Setaria itálica, Sorghum bicolor, Oryza sativa
subsp. Japonica, Zea mays, Brachypodium distachyon) se utilizando do programa
Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Caso a sequência não se
enquadre nos parâmetros de tamanho e presença de domínios conservados esta
seria descartada. Por outro lado, as sequências que compartilham características
semelhantes com as outras sequências do banco de dados/literatura, contudo não
apresentam tamanho adequado para análises in silico posteriores, foram apenas
computadas como resultados positivos, sendo um indicativo do pressuposto da
existência daquele determinado componente de BER em cana-de-açúcar.
Figura 4 - Análise e avaliação das sequências BER presumíveis de cana-de-açúcar. As sequências presumíveis identificadas em cana-de-açúcar foram alinhadas via Clustal Omega com sequências de referência de plantas. A partir desse alinhamento foi observado correspondência quanto ao tamanho, presença de domínios conservados (CD-search e ScanProsite Tool) e anotações advindo das servidors Uniprot e NCBI, além de informações advindo de artigos científicos. Com essas análises e avaliações foi possível verificar e selecionar as sequências de cana-de-açúcar que de fato seriam pertencentes a via de excisão de bases (BER).
48
3.1.2. Árvores filogenéticas geradas via TaxOnTree.
As árvores filogenéticas foram geradas via a servidor TaxOnTree
(http://bioinfo.icb.ufmg.br/taxontree/) (SAKAMOTO & ORTEGA, 2016), tais árvores
são necessárias para presumir as relações evolutivas entre as sequências aqui
analisadas e a verificação de presença de múltiplas cópias das mesmas. Os dados
de entrada foram a sequência de proteína em formato FASTA para o caso das
sequências de cana-de-açúcar previstas para serem as proteínas da via BER. Além
disso, também foram utilizados identificadores de proteína, no caso do Uniprot
(UniprotKB), para as sequências oriundas de Arabidopsis thaliana e Zea mays. Após
efetuar esse passo inicial, a servidor executa uma busca via BLAST nos bancos de
dados disponíveis (RefSeq, RefSeq without fragmented proteins e Uniprot Reference
Proteome) esse resultado é então filtrado tendo em vista os seguintes parâmetros: o
E-value (1e-10), o limite de identidade (50%), excluindo as isoformas possíveis e
limitando a análise de sequência por analise (200 hits). Obtendo a lista de proteínas
selecionadas, essas foram alinhadas via MUSCLE (EDGAR, 2004) e depois aparada
(trimming), a partir desse resultado é gerado a árvore filogenética. A referida árvore
é produzida utilizando o método FastTree que é baseado no princípio de “evolução
mínima” (minimum-evolution) - tentando encontrar uma topologia que minimize a
quantidade de evolução ou a soma dos comprimentos das ramificações. O FastTree
utiliza uma variante heurística de neighbor joining (SAITOU & NEI, 1987; STUDIER
& KEPPLER, 1988) para encontrar rapidamente uma árvore inicial e usa os
intercâmbios de vizinhos mais próximos (nearest-neighbor interchanges - NNIs) para
refinar a topologia. Ademais, com esse servidor também é obtido o atributo
taxonômico. As árvores foram visualizadas e editadas via o programa FigTree v1.4.3.
3.1.3. Inferência Bayesiana.
Corroborando com as árvores resultantes da análise filogenética, foi, então,
gerado árvores oriundas de inferências bayesianas. Para isso, o alinhamento das
sequências dos componentes da via BER, mais precisamente o alinhamento o qual
não está incluída a sequência de cana-de-açúcar, dos organismos vivos, resultante
do TaxOnTree, foi utilizado para efetuar uma inferência bayesiana. Primeiramente
49
foi analisado o modelo de substituição adequado a ser aplicado a cada alinhamento,
isso foi executado com o programa ProtTest v3.4.2. (DARRIBA et al., 2011).
Dispondo dessa informação, através do programa BEAUti 2, foi possível criar o
arquivo com a extensão .XML com as instruções necessárias para dar início à
inferência e a criação das árvores que se efetuou no programa BEAST v2.4.8
(BOUCKAERT et al., 2014). Apesar das diferenças quanto o modelo de substituição
utilizado bem como proporção invariante, existe uma constante em todas as análises
feitas: o prior utilizado foi "coalescent constant population" e o comprimento da
corrente (chain length) foi de 1000000 (1 milhão). As árvores foram visualizadas pelo
programa DensiTtree - Tree Set Visualizer v2.2.6. Foi utilizado o TreeAnnotator
v2.4.8 para eliminar as árvores iniciais, no caso, na porcentagem de 15%, sendo que
o objetivo é excluir árvores que podem prejudicar a análise final dos dados, sendo
que estas árvores constituem parte inicial da cadeia do MCMC (Markov chain Monte
Carlos - cadeia de Markov de Monte Carlo), onde se aproxima da distribuição de
amostragem a partir do seu ponto de partida, sendo necessário serem descartada.
A árvore consenso final foi editada e visualizada via o programa FigTree v1.4.3.
3.2. Modelagem.
Analisando a conservação da sequência e estrutura terciária, e logo avaliando
a conservação funcional, de algumas das sequências presumíveis da via BER
identificadas em cana-de-açúcar foi construído modelos hipotéticos 3D.Os modelos
para as proteínas de cana-de-açúcar PCNA (Proliferating cell nuclear antigen -
Antígeno Nuclear da Proliferação Celular) e FEN1 (Flap endonuclease 1)
pertencentes a via BER foram preditos utilizando a servidor I-TASSER (Iterative
Threading ASSEmbly Refinement) (https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/I-
TASSER/) (YANG & ZHANG, 2015) que se utiliza de uma abordagem hierárquica
para a estrutura da proteína e a predição da função (YANG et al., 2015). Primeiro,
ele identifica os modelos estruturais do PDB (Protein Data Bank - um arquivo que
contém informações sobre a estrutura de proteínas, ácidos nucleicos e montagens
complexas experimentalmente determinadas) por meio da abordagem de
encadeamento múltiplo LOMETS (Local Meta-Threading-Server- um serviço web
on-line para a predição da estrutura proteica) que gera modelos 3D utilizando-se de
50
9 programas de encadeamento instalados localmente (-FFAS-3D, HHsearch,
MUSTER, pGENTHREADER, PPAS, PRC, PROSPECT2, SP3 e SPARKS-X) com
os modelos atômicos completos construídos por simulações de montagem de
fragmento de modelo iterativo (ZHANG, 2008; ROY, et al., 2010;YANG, et al., 2015).
O programa I-TASSER além da predição do modelo tridimensional também faz
predições acerca da função da estrutura analisada e isso é feito através do
encadeamento dos modelos 3D por meio do banco de dados da função de proteína
BioLiP (É um banco de dados curado semi-manualmente para interações de alta
qualidade e biologicamente relevantes de ligantes-proteínas).
3.2.1. Refinamento e avaliação dos modelos.
Os modelos hipotéticos necessitam ter a estrutura otimizada para, desta
forma, gerar uma estrutura 3D mais próxima da suposta proteína nativa, para isso
os modelos devem ser refinados e avaliados estruturalmente. O refinamento dos
modelos foi feito por meio do servidor ModRefiner
(https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/ModRefiner/) que se trata de um algoritmo de
refinamento de estrutura de proteína de nível atômico e de alta resolução (XU &
ZHANG 2011). Os átomos da cadeia lateral e do esqueleto são completamente
flexíveis durante as simulações de refinamento da estrutura, onde a análise
conformacional foi guiada pelo conhecimento físico estrutural. Um objetivo do
ModRefiner é desenhar os modelos de partida iniciais mais próximos do seu estado
nativo, em termos de ligações de hidrogênio, topologia do esqueleto e
posicionamento de cadeia lateral (XU & ZHANG, 2011).
A avaliação dos modelos gerados pelo I-TASSER e refinados via ModRefiner
se fez pelo servidor Molprobity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) (CHEN et al.,
2010).
3.2.2. Análise dos modelos
Dispondo dos modelos 3D de cana-de-açúcar estes foram comparados com
cristais das referidas proteínas depositadas no banco de dados PDB.
51
(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do). O cálculo do RMSD (Root Mean Square
deviation), sendo este uma medida frequentemente usada para indicar a diferenças
entre valores previstos por um modelo (cristal PDB) e os valores observados
(modelos 3D hipotéticos de cana-de-açúcar), foi efetuado pelo programa UCSF
Chimera (PETTERSEN et al., 2004). Tal programa também foi utilizado para
visualização tridimensional dos modelos. Os cristais utilizados estão expostos na
tabela abaixo:
Tabela 1 – Cristal de proteínas do banco de dados PDB (Protein Data Bank) utilizados para as análises.
PDB entry Macromoléculas Referência
6GIS PCNA de humano
associada a molécula de
DNA
DE MARCH et al., 2017
2ZVV PCNA1 de A. thalina
associada com o
peptídeo P21 humano.
STRZALKA et al., 2009
2ZVW PCNA2 de A. thalina
associada com o
peptídeo P21 humano.
STRZALKA et al., 2009
IUL1 Complexo constituído de
PCNA em associação
com FEN1, ambas
proteínas humanas.
SAKURAI et al., 2005
3.3. Análise in silico de AP endoncuclease de Arabidopsis thaliana,
Homo sapiens e de cana-de-açúcar.
3.3.1. Análise in silico de sequências de Arabidopsis thaliana.
A comparação entre as sequências de AP endonuclease de A. thalina, cana-
de-açúcar e humano seria necessária para verificar a preservação de sítios,
domínios conservados e perfis de expressão dessas proteínas. Para isso, as
sequências de AP endonuclease de plantas e de humano foram retiradas do servidor
Uniprot (http://www.Uniprot.org/) (UNIPROT CONSORTIUM, 2018): P45951
(ARP_ARATH), Q5XF07 (APE1L_ARATH), F4JNY0 (APE2_ARATH) e P27695
52
(APEX1_HUMAN), enquanto as sequências de cana-de-açúcar (ScARP1 e ScARP3)
foram oriundas de trabalho anterior do grupo de pesquisa (MAIRA et al., 2014).
Essas sequências foram alinhadas via Clustal Omega
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) e deste alinhamento foi verificado a
correspondência de sítio ativos, resíduos de ligação a metais, entre outros sítios
importantes compartilhada entre as sequências analisadas. Ademais, com essas
sequências foi efetuado uma análise evolutiva utilizando o MEGA7 (KUMAR et al.,
2016). Foi utilizado o método de máxima verossimilhança no modelo de matriz de
Dayhoff (SCHWARZ & DAYHOFF, 1979). A árvore de consenso foi obtida a partir de
1000 réplicas de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985). As árvores iniciais para a busca
heurística foram obtidas pela aplicação dos algoritmos Neighbor-Joining e BioNJ a
uma matriz de distâncias pairwise estimada usando um modelo JTT e, em seguida,
selecionando a topologia com uma maior probabilidade de log de valor. A topologia
da árvore foi observada no programa Figtree v 1.4.2.
Com as sequências de AP endonuclease de A. thalina foi possível efetuar
analises de perfil de expressão no servidor Bio-Analytici Resource for Planta Biology
- BAR) (WINTER et al., 2007) se utilizando das ferramentas Arabidopsis eFP Browser
(tendo como data source utilizados: Developmental Map, Abiotic stress AT-Tax,
Abiotic stress II) e Rice eFP Brower se utilizando do homólogos de arroz para as
sequências de Arabidopis citadas acima (tendo como data source utilizados: Rice
mas, Rice maize comparison, ricestress mas).
3.3.2. Modelos de AP endonuclases de A. thaliana.
Os modelos hipotéticos 3D de AP endonucleas de plantas (A. thalina e cana-
de-açúcar) foram alinhados para que assim fosse aferido a conservação estrutural e
funcional das proteínas analisadas. Para tanto, o modelo tridimensional de ScARP1
foi gerado a partir de um trabalho anterior publicado pelo grupo de pesquisa (MAIRA
et al., 2014). Já os modelos para as sequências de AP endonucleases oriundas de
Arabidopsis thaliana (AtARP, AtAPE1L e AtAPE2) foram gerados via I-TASSER
(https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/I-TASSER/) (YANG & ZHANG, 2015).
Refinadas via servidor ModRefiner
53
(https://zhanglab.ccmb.med.umichedu/ModRefiner/) e avaliadas via Molprobity
(http://molprobity.biochem.duke.edu/) (CHEN et al., 2010).
3.4. Clonagem e purificação da AP endonucelase de cana-de-
açúcar: ScARP1.
O resumo da metodologia empregada para a obtenção da proteína purificada
da presumível AP endonuclease de cana-de-açúcar (ScARP1) está exposta na figura
5. A descrição das referidas metodologias está exposta nos tópicos abaixo.
Figura 5 - Esquema didático representando as etapas metodológicas para a purificação da proteína ScARP1. (1) Primeiramente, as culturas de bactérias contendo o plasmídeo pBC com o inserto de interesse (ScARP1) foi obtido por meio da MiniPrep (CTAB). (2) Com o plasmídeo, foi efetuado a reação em cadeia da polimerase (PCR) a qual foi amplificado a sequência de ScARP1. (3) Foi verificado o resultado da PCR em gel de agarose e dele foi efetuado a extração do DNA. (4) A sequência ScARP1 foi ligada ao vetor de expressão pMal-c5x. (5) Com este vetor foi efetuado transformação de células competentes da linhagem BL21+dcm-. (6) Dispondo das células transformadas foi feito o ensaio de expressão de proteínas. (7) Após o ensaio foi obtido a proteína ScARP1 purificada.
54
3.4.1. Miniprep (CTAB) e Reação em cadeia da polimerase (PCR).
A obtenção da sequência de AP endonuclease de cana-de-açúcar, ScARP1,
para ser utilizada em procedimentos posteriores, foi feita por meio de Miniprep e
amplificação via PCR. Desta forma, primeiramente as culturas bactérias contendo o
plasmídeo (pBC) a qual apresenta o inserto de interesse (ScARP1) clonado a ele,
foram crescidas em meio LB (Luria-Bertani) acrescido de antibiótico clorofenicol em
agitação a 37 °C por um dia. Após esse período, o meio (LB + bactérias) foi
transferido a um tubo cônico de 1,5 mL e centrifugado a 13.400 rpm (12.044,8 g) por
1 minuto (MiniSpin Tubo eppendorf), sendo essa velocidade empregada em todas
etapas de centrifugação desse procedimento. Em seguida, o precipitado contendo
as células bacterianas foi ressuspendido em solução STET (8% Sucrose, 5% Triton
X-100, 50 mM EDTA e 50 mM Tris pH 8,0), acrescido de lisozima (10 mg/mL) e
RNAse (10 mg/mL). Após essa adição e a ressuspenção, as amostras foram
submetidas a um choque térmico a 100 °C por um minuto. Em seguida, o tubo foi
centrifugado por 10 minutos e depois se descartou o precipitado. Foi adicionado
CTAB 5% a solução (8% Sucrose, 0,1% Triton X-100, 50 mM EDTA pH 8 e 50 mM
TrisCl pH 8) e foi deixado a temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente,
este foi centrifugado por 10 minutos e se descartou o sobrenadante. O precipitado
existente foi ressuspendido em NaCl (1,2 M) e etanol 100% frio. Logo em seguida a
solução foi misturada utilizando o vortex (ms2 minishaker IKA) por 10 minutos a
temperatura ambiente. Depois, foi feita uma centrifugação por 10 minutos e foi
descartado o sobrenadante. Nesse momento, ao tubo cônico de 1,5 mL contendo o
precipitado foi adicionado 200 µL etanol 70% e este foi centrifugando (13.400
rpm/12.044,8 g) por 5 minutos. O etanol foi descartado e a amostra foi secada em
speed vacum (Heraeus pico 17 speedvac concentrader – Thermo Scientific). Com o
fim de todo esse procedimento, o precipitado final foi ressuspendido em 20 µL de
água ultrapura. Com este DNA plasmidial contendo a sequência ScARP1 foi
realizada uma reação de PCR para amplificação desta sequência utilizando a
VELOCITY DNA polimerase (BIOLINE), a qual apresenta uma capacidade de
revisão rápida do DNA devido apresentar a atividade de proofreading. Os primers
utilizados foram ScARP1_F1 (foward): GAA TTC ATG AGC TCC ACG TCT TCT CA;
ScARP1_R1 (reverse): GTC GAC CTA CAG CTT CAG CAC AAG GC
55
3.4.2. Extração de DNA de gel de agarose.
O produto da PCR foi separado em gel de agarose 0,7%. Utilizando-se o
QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) foi possível extrair o DNA contido no gel de
agarose cujo procedimento será descrito a seguir. Após o corte, o fragmento do gel
de agarose contendo o DNA foi colocado em um tubo cônico de 1,5 mL e
posteriormente este tubo com gel foi pesado para determinar quanto de tampão seria
adicionado. Foi adicionado 3 volumes do Buffer QC do kit para cada volume do gel.
Em seguida, incubou-se este tubo com tampão a 50 °C por 10 minutos. Em seguida,
acrescentou 1 volume de isopropanol e misturou o conteúdo. Este conteúdo foi
transferido para uma coluna QI Aquick spin column num tubo cônico de 2 mL. Esta
foi centrifugado por 1 minuto a 13.000 rpm/ 11.336,5 g (máquina MiniSpin eppendorf),
ao fim, descartou-se o liquido do tubo. Em seguida foi acrescentado o Buffer QC na
coluna QI Aquick spin column e centrifugou novamente por 1 minuto nas mesmas
condições anteriores. Depois, foi adicionado o Buffer PE e do mesmo modo anterior
se centrifugou e se descartou o líquido. Por fim, centrifugou-se a coluna sem nenhum
líquido acrescentado, para que se retirasse qualquer álcool residual. Terminado esse
processo, a QI Aquick spin column foi transferida a outro tubo cônico de 1,5 mL e foi
acrescentando água quente (50 °C) a coluna e depois a mesma foi centrifugada, o
liquido foi coletado e foi medido a concentração de DNA via NanoDrop (Thermo
Fisher Scientific).
3.4.3. Ligação ao vetor de expressão pMAL-c5X.
O vetor pMAL-c5X permite gerar fusões da proteína de interesse com a
proteína de ligação a maltose (MBP - maltose-binding protein), pois o gene a ser
transcrito será inserido no sítio de restrição do vetor na mesma janela leitura
transducional que o gene malE (que codifica a MBP). Esse vetor foi previamente
digerido com as enzimas EcoRI e SalI. Este foi desfosforilado com a Rapid alkaline
fosfatase (1 U/μL- Sigma-Aldrich). Após a desfosforilação foi realizada a ligação do
inserto (resultante do processo de amplificação via PCR) com o vetor de expressão
pMAL-c5X (New England BioLabs – NEB) na proporção de 1:1, a temperatura a 4
°C por 12 horas.
56
3.4.4. Competência e Transformação rápida da linhagem BL21.
O vetor de expressão contendo o inserto de interesse deve ser transformado
em bactérias Escherichia coli de linhagem que detenha a capacidade de conferir
eficiência na expressão proteica. Para isso, foi cultivado em meio LB líquido (em tubo
cônico de 15 mL) adicionado o antibiótico clorofenicol (34 μg/mL) as bactérias da
estirpe BL21 + dcm -, por 3 a 4 horas. Após transcorrido esse tempo, foi centrifugado
a 13400 rpm/ 12.044,8 g (MiniSpin eppendorf) a qual se evidenciou o precipitado
sendo retirado o excesso do meio líquido. Em seguida, o precipitado foi
ressuspendido em 0,1 M de CaCl2. Após esse processo, os tubos foram deixados
por 5 minutos no gelo, depois, centrifugou-se a 13.400 rpm/12.044,8 g e descartou-
se o sobrenadante. Novamente, foi ressuspendido o precipitado resultante em 0,1 M
de CaCl2, logo depois, foi colocado por mais 5 minutos no gelo. Ao fim desse
procedimento, as bactérias já estavam competentes, dessa forma, o processo de
transformação por choque térmico ocorreu. Para a ocorrência da transformação as
bactérias competentes foram colocadas em contato com o material proveniente da
ligação do vetor de expressão pMAL-5cX contendo o inserto na proporção de 1 μL
do inserto para 10 μL de bactéria. Após a adição, o tubo cônico de 1,5 mL contendo
as células e os plasmídeos foi deixado por 30 minutos no gelo. Posteriormente, o
mesmo foi colocado a 42 °C por 2 minutos, ocasionando o choque térmico, o que
possibilitou a incorporação do vetor + inserto no interior da célula, ao fim deste
processo, o tubo cônico novamente foi colocado no gelo.
3.4.5. Ensaio de expressão de proteína.
A expressão da proteína de interesse seria necessária previamente para
posteriormente se efetuar purificação. Desta forma, para o ensaio de expressão, se
utilizou de um erlemmeyer de 1 L, a qual foi acrescentado 250 mL de meio LB com
a adição de glicose (2 g/L) e a essa solução foi adicionada cloranfenicol (34 μg/mL)
(BL21 apresenta resistência a esse antibiótico, como indicado no tópico 3.4.4.), além
disso foi acrescentada carbenicilina (50 μg/mL) (resistência do vetor pMAL-c5X).
Depois, foi adicionada a bactérias da estirpe BL21 contendo o plasmídeo com o
inserto de interesse no meio. Em seguida, o erlemmeyer foi colocado em um Shaker
57
(infors ht multitron standard) a 225 rpm com a temperatura de 37 °C. Depois de ter
passado uma hora e meia, foi medida a absorbância a 600 nm (SmartSpec Plus
Spectrophotometer – Bio-Rad). Quando for atingindo o valor desejado de 0,1 e 0,2
A, foi reduzido a temperatura do Shaker para 23 °C e o erlemmeyer foi mantido em
seu interior sob agitação por mais 1 hora e meia. Transcorrido o tempo, foi medida a
absorbância que deveria estar entre 0,5 a 0,7 A. Verificando que a taxa de
crescimento se encontrou na faixa requerida, foi acrescentado 1 mM IPTG (Isopropil
β-D-1-tiogalactopiranosídeo) para induzir a expressão proteica e assim, esperou-se
4 horas. Depois de transcorrido o tempo, o conteúdo do erlemmeyer foi transferido
para potes e tubos cônicos de 50 mL. Em seguida estes foram centrifugados a 1.000
rpm/ 153,166 g por 20 minutos (Beckman J2-Hs) e parte do sobrenadante foi
descartado. O precipitado foi ressuspendido com o resto do líquido, após esse
processo foi centrifugado por 15 minutos a 7.800 rpm / 6.500 g. O sobrenadante foi
retirado e o tubo contendo o precipitado foi guardado a -80 °C.
3.4.6. Purificação.
Dispondo do precipitado congelado a -80 °C do item anterior (tópico 3.4.5.), o
passo seguinte foi a obtenção da proteína de interesse da amostra. Para isso, o
referido precipitado foi descongelado e ressuspendido em tampão Cb (20 mM Tris
HCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM BtMe, 1 mM EDTA e 50% glicerol) em gelo.
Depois, foi adicionado um inibidor de protease (1 μL/mL - Sigma-Aldrich) na
proporção 1:1. Em seguida, a amostra foi colocada para sonicar (Q55 Sonicator –
Qsonica) por 1 minuto, amplitude entre 50-60. Posteriormente, o tubo foi centrifugado
(centrifuge 5810r) por 40 minutos a 9.250 rpm/17.218,5 g a 10 °C. Após esse
procedimento, a amostra foi filtrada com acrodisc 25mm syringe filter 0,2 μm HT
Tuffryn® Membrane. As amostras resultantes foram colocadas na máquina AKta
prime, que se trata de um sistema de cromatografia líquida compacta e
automatizada, a qual a coluna de cromatografia fica conectada para assim permitir a
separação da proteína expressa (ScARP1) do montante celular. Tendo em vista que
o vetor pMAL-c5X, quando expresso, gerou a ScARP1 fundido ao MBP (maltose-
binding protein), foi possível que essa proteína fosse purificada por uma coluna
contendo resina a base de amilose. Para iniciar o processo de purificação, tal
58
máquina foi acoplada a um computador de modo que se verificou os picos no gráfico
projetado simultaneamente referentes a quantidade de amostra coletada nos tubos,
desta maneira, pode-se saber em quais tubos estariam a proteína de interesse. Foi
comprovado a eficiência da purificação e indução ao se colocar as amostras
(alíquotas) coletadas durante o ensaio de expressão (tópico 3.4.5.) em um gel de
SDS-page, a qual foi gerado um gráfico e o resultado da quantificação, tendo como
base a curva padrão BSA (bovine serum albumin ou albumina do soro bovino), foi
utilizado como base para o passo seguinte. Foi efetuado a dialise das amostras
segundo o gráfico, levando-se em consideração as amostras que apresentaram
maior eficiência na purificação e indução, como mencionando anteriormente,
utilizando dialysis tubing cellulose membrane (Sigma-ALDRICH), 25 mm. Esses
tubos contendo as amostras a serem dialisadas foram colocadas em um erlemmeyer
que continha tampão de diálise CB e foi deixado over-night (12 horas,
aproximadamente) com baixa agitação. Depois, o resultado da dialise foi distribuída
em tubos cônicos de 1,5 mL e armazenados em -80 °C.
3.4.7. Gel SDS-page.
Para a visualização de amostras dos ensaios de expressão e resultado da
purificação, tais amostras foram aplicadas em Gel de SDS-page, a qual o método de
preparo será descrito a seguir. Foi utilizado o sistema vertical da Bio-Rad. Primeiro
foi feito a solução low a 10% (LGB - Lower gel buffer - pH 8,8, Acrilamida 40% 19: 1,
TEMED e APS a 10%): Após feito a solução, essa foi colocada no espaço entre os
géis, esperou-se 15 minutos para que polimerizasse. Posteriormente, foi feito a
solução up (UGB - Up gel buffer - pH 6,81, Acrilamida 40% 19: 1, TEMED e APS a
10%). Logo, feito a solução, foi adicionado a mesma entre os vidros e colocado o
pente, a qual se moldou os poços onde foi aplicado as amostras, também foi
esperado polimerização (por volta de 15 minutos). Ao fim deste tempo, se retirou o
pente e se transferiu o gel para outro suporte aonde foi submetido a uma voltagem
e que, desta forma, as proteínas foram separadas por tamanho e peso. O suporte foi
preenchido com um tampão de proteína (250 mM Tris base, 1,92 M Glicina e 1%
SDS). Com o fim da preparação do gel, suporte e tampão, pode-se adicionar as
amostras nos poços e depois submeter o sistema a uma voltagem (80 V para
59
passagem no gel up e 100 a 150 V para passagem no gel low) por aproximadamente
3 horas, cada uma das amostras foram antes ressuspendidas em 30 μL da solução
loading buffer 1x (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 2,5% SDS, 0,002 % bromophenol blue,
0,7135 M (5%) β-mercaptoethanol e 10% glicerol).
3.5. Proteína ScARP1 – Avaliação da atividade e complementação
enzimática.
Dispondo da proteína purificada (ScARP1), foram efetuadas avaliações
quanto a determinação da atividade enzimática e os fatores que a influenciam,
ademais a complementação enzimática em extratos celulares de plantas mutantes
de Arabidopsis thaliana (figura 6). As metodologias para tais abordagens estão
descritas nos tópicos a seguir.
Figura 6 - Esquema representado as abordagens de avaliação e complementação enzimática empregadas na proteína ScARP1. Possuindo a proteína purificada de cana-de-açúcar, esta foi utilizada para efetuar a avaliação quanto a presença ou não de atividades enzimáticas, além de verificar as condições ótimas de atuação da presumível enzima de cana-de-açúcar, observando os fatores que influenciam a referida atividade. Além disso, a proteína ScARP1 foi utilizada na abordagem de complementação enzimática de extratos celulares de plantas mutantes de Arabidopsis thaliana.
60
3.5.1. Reação de ensaio enzimático.
As reações relacionadas aos vários ensaios enzimáticos deste estudo
seguiriam, basicamente, salvo algumas alterações especificais dependendo do
ensaio, os mesmos componentes dispostos a seguir:
• DNA (substrato);
• Tampão;
• Íon (cofator enzimático);
• Enzima;
• H2O (água Ultrapura)
Os tópicos posteriores serão centrados em cada um destes ensaios e os
substratos de DNA utilizados.
3.5.1.1. Substratos.
Cada ensaio enzimático para a caracterização bioquímica da proteína
ScARP1 apresentou seu substrato específico como indicado na figura 7. As
sequências, com a construção, estão apresentadas na tabela 2.
61
Figura 7 – Substratos utilizados paras as respectivas atividades enzimáticas a serem testas para ScARP1. O substrato utilizado nos ensaios de atividade endonuclease, trata-se de um DNA duplex (fita dupla de DNA) que apresenta tetrahydrofuran (THF) que simula um sítio abásico. No ensaio da atividade exonuclease foi utilizado um DNA duplex, contendo a extremidade hidroxila livre (-OH). Já no ensaio da atividade fosfatase foi utilizado DNA duplex e triplex que exibiam fosfatases livres. No ensaio de 3´-phosphodiesterase foi utilizado como substrato um DNA duplex com a extremidade PUA (Aldeído β,α-insaturado) livre.
62
Tabela 2 – Sequências utilizadas na confecção dos substratos a serem utilizados nos ensaios enzimáticos.
Nome Sequência de DNA* Fita Marcador**
Fl-UGF TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTCUGGT
CACGCTGACCAGGAATACC Superior
Fl na
extremidade
5 ´
Fl-
APGF
TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTCFGGTC
ACGCTGACCAGGAATACC Superior
Fl na
extremidade
5´
UGF TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTCUGGTC
ACGCTGACCAGGAATACC Superior -
CGR AGTGCCCTAGTTACACAAGAAAGTCGAGGCCAG
TGCGACTGGTCCTTATGG Inferior -
Al-
CGR
AGTGCCCTAGTTACACAAGAAAGTCGAGGCCAG
TGCGACTGGTCCTTATGG Inferior
Al na
extremidade
5 ´
Al-28P TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTC Superior
Al na
extremidade
5´
Al-
28OH TCACGGGATCAATGTGTTCTTTCAGCTC Superior
Al na
extremidade
5´
P30_51 GGTCACGCTGACCAGGAATACC Inferior -
*F = Análogo ao sítio AP (tetrahydrofuran).
**Fl = Fluoresceína; Al = Alexa fluor 647.
A preparação do substrato, como apresentado na tabela 2, se utilizou de
nucleotídeos sintetizados, alguns com fluoróforo (Fluoresceína e Alexa fluor 647)
para que possibilite a visualização quando exposto a um determinado tipo de
comprimento de onda. O cálculo básico para a construção do substrato para os
respectivos ensaios enzimáticos está exposto abaixo:
63
Tabela 3 – Formação do substrato em relação ao ensaio enzimático específico.
Identificação
do substrato /
Concentração
Ap
endonuclease
X1
Exonuclease
X1
Fosfatase
Duplex
X1
Fosfatase
Triplex
X1
Fl-APGF
(5 pmol/pL) 1 - - -
CGR
(10 pmol/pL) 1 1 1 1
Al 28-P
(5 pmol/pL) - - 1 1
Al 28-OH
(5 pmol/pL) - 1 - -
P30-51
(5 pmol/pL) - - - 1
TN 3 3 3 2
Volume final 5
Com relação ao substrato PUA (aldeído β,α-insaturado), o processo de
preparação se deu de forma diferente, pois consistiu em uma reação envolvendo
uma Uracil DNA glicosilase (UDG) e uma endonuclease III, desta forma gerando o
substrato adequado. A reação ocorreu por uma hora a 37 °C, depois disso, a solução
sofreu um processo de precipitação do DNA eliminando o sobrenadante residual
(mais detalhes no tópico 3.5.1.2) e foi ressuspendendido o precipitado em água
ultrapura, logo estando pronto para ser utilizado em uma reação.
Os outros substratos também passaram por uma reação que consistiu,
unicamente, de expor a solução contendo as duas fitas de nucleotídeos, sendo uma
contendo o marcador fluorescente e o outro apenas uma fita simples (sem
marcador), acrescido da solução TN (10 mM Tris HCl pH 8 e 20 mM NaCl) a uma
temperatura de 95 °C por 5 minutos e posteriormente foi deixado esfriar (lentamente)
em água morna, sendo assim, permitindo que essas duas fitas se anelassem,
formando o substrato desejado para os ensaios subsequentes.
64
3.5.1.2. Protocolos de reação e precipitação.
As reações dos ensaios, após seu preparo, foram colocadas em temperaturas
fixas, na máquina Thermo Statplus, por um determinado tempo (dependendo do
ensaio) para que a reação enzimática possa ocorrer. Após o termino deste tempo foi
adicionado proteinase K (20 mg/mL - Sigma-Aldrich) para cada reação. Com a adição
da proteinase K, a reação foi mantida em 37 °C por 30 minutos, posteriormente
adicionou-se a solução TE (10 mM Tris HCl pH 8 e 1 mM EDTA pH 8), etanol 100%
gelado e glicogênio (2 mg/mL). Com o acrescimento dos componentes descritos
anteriormente, esperou-se 30 minutos a –20 °C. Em seguida, os tubos foram
centrifugados por 13.300 rpm/ 17.000 g (heraeus pico 17 centrifuga) por 15 minutos
a 4 °C, depois foi retirado o sobrenadante e adicionou-se etanol 80% gelado.
Novamente, este tubo foi centrifugado a 13.300 rpm/17.000 g na mesma temperatura
já citada, por 5 minutos. Logo depois, foi retirado o sobrenadante e secou-se o tubo
cônico de 1,5 mL em speed vacum (Heraeus pico 17 speedvac concentrader –
Thermo Scientific) por 15 minutos. Ao secar totalmente o etanol, o precipitado foi
ressuspendido em formamida a 90%, sendo este o preparo da solução a ser aplicada
nos géis de acrilamida (item 3.5.1.3.). Posteriormente, a solução foi ressuspendida
e mantida a temperatura de 95 °C por 5 minutos para depois ser aplicada no gel.
3.5.1.3. Gel de acrilamida para os ensaios enzimáticos.
Após os ensaios enzimáticos os produtos foram separados em gel de
acrilamida, para isto foi preparado um gel utilizando 7 M de Ureia, 40% acrilamida/Bis
19:1, TBE 10%, APS a 10 % e TEMED. Este gel foi polimerizado over-night. No
momento da separação dos produtos dos diferentes ensaios enzimáticos estes
foram separados a 400 V e por aproximadamente 1 hora. Depois este material foi
visualizado via FLA5100 Fluor Imager (Fuji film).
65
3.5.2. Reação de complementação enzimática.
3.5.2.1. Material vegetal utilizado.
As sementes de plantas selvagens de Arabidopsis (WT- Wild type) e das
plantas do mutante arp-/-, plantas essas da linhagem mutante de Arabidopsis
SALK_021478 (ALONSO et al., 2003) que apresenta uma inserção de T-DNA no
gene da ARP, foram obtidas do Arabidopsis Biological Resource Center
(http://www.arabidopsis.org). Essas sementes foram plantadas em vasos
previamente esterilizados, estes foram preenchidos por terra autoclavada na
proporção 2 (terra úmida que foi pressionada manualmente se tornando mais
compacta): 1 (terra não-compactada), além disso, a água utilizada apresentou a
proporção 1:1 de fungicida (Duaxo- fungincida polivalente concentrado). As
sementes foram colocadas sobre a superfície da terra e depois o vaso foi coberto
com papel filme. Os vasos foram mantidos por 2 dias a 4 °C. Terminado este período,
foram feitos furos diminutos no papel filme e foi transferido os vasos para a câmara
de germinação nas condições de dia longo (16 horas de luz e 8 horas de escuro) e
temperatura de 23 °C. Após transcorrido dois meses, com regas regulares efetuadas
durante esse período, as plantas resultantes foram coletadas, cortadas logo acima
da raiz, colocadas em um envelope de papel e deixado secar a temperatura
ambiente. Após a verificação do ressecamento das plantas, estas foram retiradas
dos envelopes e foram separadas as sementes dos outros componentes vegetais
(restos de folhas e caules) com auxílio de uma peneira. As sementes foram colhidas
em tubos cônicos de 1,5 mL precisamente rotulados e datados. As sementes, depois,
foram desinfestadas, com a adição de etanol 100% e misturadas manualmente, em
seguida retirou-se o sobrenadante. Posteriormente, foi acrescentado hipoclorito de
sódio a 50% ao tubo, colocado no vortex (ms2 minishaker IKA) e deixado agitando
por 10 minutos, primeiro 5 minutos em alta intensidade (1800) e depois diminuir para
a agitação mínima (200). Depois o material foi levado ao fluxo laminar – AV-100
burdinola – para a retirada do hipoclorito de sódio –e depois foi adicionado água
deionizada ao tubo cônico de 1,5 mL e foi deixado por dois dias a 4 °C, após esse
período as sementes já estavam aptas para serem utilizadas em outros
experimentos.
66
3.5.2.2. Plantio de sementes em placas.
As sementes desinfestadas foram semeadas em placas de petri contendo
meio MS a 1% (Murashige e Skoog) com 3% de sacarose. Depois de semeadas por
sobre o meio, as placas foram lacradas com papel parafilme e então colocadas na
câmara de germinação em condições de dia longo (16 horas de luz e 8 horas de
escuro), deixando-as ali por 15 dias.
3.5.2.3. Extração das proteínas de A. thaliana e dialise.
As plantas de A. thaliana crescidas in vitro descritas no item anterior (3.5.2.2.)
foram retiradas das placas com ajuda de pinças, essas plantas foram colocadas
sobre papel laminado, pesadas e depois envolvidas com o mesmo papel como um
pacote, em seguida, foram colocadas em nitrogênio líquido. Esses pacotes
congelados foram abertos, seu conteúdo foi despejado em almofariz para ser
macerado com auxílio de um pistilo junto com nitrogênio líquido até que as plantas
congeladas tivessem virado pó. O resultado foi transferido à um tubo cônico de 2 mL,
foi, então, adicionado o tampão de extração (25 mM HEPES-KOH pH7,8, 100 mM
KCl, 5 mM MgCl2, 250 mM Sacarose, 10% glicerol, 1 mM DTT e Inibidor de protease
1 μL/mL), sendo que a quantidade a ser adicionado, em μL, foi igual a massa oriunda
da pesagem mencionado no início deste protocolo. Também foi adicionado o inibidor
de protease (1 μL/mL - Sigma-Aldrich) na proporção V: m. Em seguida, o tubo foi
mantido 45 minutos em gelo. Após transcorrido o tempo, este foi centrifugado por 45
minutos a 13.300 rpm/17.000 g (heraeus pico 17 centrifuga) em 4 °C. Com cuidado,
foi transferido o sobrenadante para outro tubo cônico de 2 mL e foi filtrado o líquido
por meio de malhas de nylon (monodur®-nylon - Clear Edge), posteriormente foi
realizado a dialise do material
Para o procedimento de diálise foi utilizado a membrana de 10 mm dialysis
tubing cellulose membrane (Sigma-ALDRICH), na razão de cada 1 cm de
comprimento da membrana para a 0,3 mL do volume da amostra a ser dialisada. A
amostra foi colocada na membrana de dialise cujas extremidades foram vedadas
com pinças de diálise. Todo este processo ocorreu no gelo. Após a aplicação, as
membranas com a amostras foram colocadas no tampão de diálise (DB) (25 mM
67
HEPES-KOH pH 7,8, 100 mM KCl, 10% glicerol e 1 mM DTT) e foi deixado over-
night com baixa agitação a 4 °C. Depois, o material da diálise foi distribuído em tubos
cônicos de 1,5 mL e guardados em -80 °C.
3.5.2.4. Reação de complementação.
A reação utilizou do extrato enzimático proveniente da planta selvagem (WT)
e da mutante (arp -/-), sendo o controle positivo a reação a qual apresenta a enzima
ARP funcional (extrato da planta selvagem) e logo sendo capaz de processar o
substrato com sítio abásico artificial, com o extrato arp -/- foi feito o controle negativo.
A reação de complementação foi efetuada com o extrato enzimático da planta
mutante com a adição das concentrações de 2 µM e 4 µM da proteína ScARP1. Com
esse extrato também foi adicionado AP endonuclease 1 humana – hAPE1- em uma
diluição 1:100 (0,1 U/μL) como controle. As reações ocorreram por 3 horas a 37 °C,
utilizando o tampão DB (25 mM HEPES-KOH pH7,8, 100 mM KCl, 10% glicerol e 1
mM DTT). Ao termino das três horas, as amostras foram precipitadas (descrito no
item 3.11) e depois foram aplicados no gel de acrilamida para visualização do
resultado.
3.6. Revelação de imagens.
Os géis de acrilamida foram fotografados utilizando a máquina Fijifilm Fla-
5100, a qual foi possível revelar a imagem de acordo com o comprimento de onda
adequado aos marcadores florescentes utilizados, permitindo a visualização do
substrato. O resultado em imagem foi quantificado pelo programa Multi Gauge 3.0V,
pois por meio dele foi possível avaliar a intensidade das bandas e gerar um resultado
numérico.
68
4. RESULTADO
4.1. Via de excisão de bases em cana-de-açúcar: identificação e
caracterização de proteínas putativas.
A cana-de-açúcar, como outros organismos poliploides (que apresentam mais
de dois conjuntos de cromossomos homólogos), geralmente, não possuem o
genoma totalmente sequenciado. A dificuldade concernente ao tamanho do genoma
referente a poliploidia resulta, em relação ao sequenciamento, em um processo
muitas vezes complexo e laborioso. A maior parte das informações de cana-de-
açúcar, desta forma, se encontra em bancos de ESTs e alguns BACs. Assim, nesta
etapa deste trabalho foi realizado uma busca no banco de dados ESTs disponíveis
para cana-de-açúcar (SUCEST-FUN) por componentes da via BER com o propósito
de investigar a existência de duplicação desses mesmos membros, haja visto que o
homólogo de AtARP em cana-de-açúcar exibe uma duplicação: ScARP1 (alvo de
estudo desse trabalho) e ScARP3 (MAIRA et al., 2014).
Em relação aos bancos de dados ESTs de plantas é importante enfatizar que
muitos dessas sequências não estão depositadas no NCBI (National Center for
Biotechnology Information), além disso, tais bancos são resultados de grupos de
pesquisas distintos o que significa que alguns dos dados armazenados podem
diferenciar entre si. Para a pesquisa relacionadas com cana-de-açúcar foi utilizado o
banco de dados o SUCEST-FUN que reúne diferentes bancos de dados de cana-de-
açúcar: como: o Projeto genoma Sugarcane Expressed Sequence Tags (SUCEST)
(http://sucest.lad.ic.unicamp.br/en/) (VETTORE et al., 2003), a Sugarcane Gene
Index (SGI), os catálogos SUCAST e SUCAMET, que incluem dados de expressão
(http://sucest-fun.org), o banco de dados GRASSIUS (YILMAZ et al., 2009) e
registros das características agronômicas, fisiológicas e bioquímicas de cultivares de
cana-de-açúcar.
A escolha dos representantes da via de BER se baseou no trabalho de
Spampinato (2017) como já descrito na metodologia (item 3.1). Os componentes de
BER identificados em cana-de-açúcar nesse estudo estão resumidos na tabela 4. A
tabela sintetiza as informações das proteínas: seu nome, função, sua funcionalidade
69
em BER, código do locus AGI (Arabidopsis genome initiative) fornecidos pelo artigo
de Spampinato e sua correspondente código no banco de dados Uniprot.
Os tópicos a seguir serão voltados para a caracterização de cada uma dessas
proteínas, além de avaliar se as mesmas estão presentes ou não no genoma de
cana-de-açúcar com as informações existentes no banco de dados SUCEST-FUN.
70
Tabela 4 – Proteínas envolvidas na via de excisão de bases (BER) selecionadas para o estudo.
PROTEÍNA SIGLA FUNÇÃO EM BER Código do locus AGI/ UniprotKB
8-OXOGUANINA GLICOSILASE
OGG1 É a enzima primária responsável pela excisão da 8-oxoguanina (8-
oxoG), um subproduto da base mutagênica que ocorre como resultado da exposição a espécies reativas de oxigênio (EROs).
Envolvidos na etapa inicial de BER, reconhecendo a
base danificada.
At1g21710 Q9FNY7
ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 e 2
NTH1 e NTH2 Geralmente está envolvida na remoção de lesões de pirimidina oxidada
através de reparo de excisão base.
At2g31450 e At1g05900 Q9SIC4 e B9DFZ0
URACIL-DNA GLICOSILASE UNG ou UDG Preveni a mutagênese eliminando a base uracil da molécula de DNA
por clivagem da ligação N-glicosídica. At3g18630
Q9LIH6
REPRESSOR OF SILENCING 1 ROS1 Envolvido no processo epigenético, catalisa a liberação da 5-
metilcitosina (5-meC) do DNA através do mecanismo glicosilase/liase.
At2g36490 Q9SJQ6
ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER
DEM At5g04560
Q8LK56
DEMETER-LIKE PROTEIN 3 DML3 Potencial ativador transcricional que pode agir cortando o promotor
alvo. Catalisaria a liberação do 5-metilcitosina (5-Mec) do DNA por meio de um mecanismo glicosilase/liase.
At4g34060 O49498
METHYL-CpG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE
PROTEIN MBD4L
DNA Glicosilase monofuncional que tem como alvo o mal pareamento dos nucleotídeos U: G e T: G. Catalisa a excisão dos derivados da
uracila e exibe uma preferência por um contexto de sequência CpG, independentemente do estado de metilação da cadeia complementar.
Aciona a via de reparo de excisão bases (BER).
At3g07930 Q0IGK1
FLAP ENDONUCLEASE 1 FEN1 ou SAV6 Remove 5' 'flaps' no reparo de DNA e processa as extremidades 5' dos
fragmentos de Okazaki no processo de replicação de DNA. Envolvido com a via longa
de BER. At5g26680
O65251
DNA POLIMERASE LAMBDA Pol λ ou POLL
É um membro da família X da DNA polimerases. Estaria envolvido na adição de nucleotídeos no reparo de recombinação não-Homóloga
(NHEJ - non-homologous end joining ) e também na via de reparo de quebra de fita dupla do DNA (DSB- double-strand break).
Substitui a Polimerase beta (que não apresenta homólogos em plantas), atuando na via curta de
BER.
At1g10520 Q9FNY4
71
PROTEÍNA (continuação da tabela 7)
SIGLA FUNÇÃO EM BER Código do locus AGI/ UniprotKB
TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1
TDP1 Enzima de reparo do DNA que pode remover uma variedade de adutos covalentes do DNA através da hidrólise de uma ligação 3'-fosfodiéster,
gerando uma extremidade 3' com fosfato livre.
Processamento de produtos intermediários
de BER
At5g15170 Q8H1D9
DNA LIGASE I (1) LIG1 Responsável por catalisar o processo de ligar ou religar nucleotídeos ou
fragmentos de nucleotídeos ao esqueleto do DNA. Está envolvido em mecanismos de recombinação e reparo de DNA (Homóloga e não-
homóloga).
Envolvido na via longa e curta de BER.
At1g08130 e At1g49250 Q42572 e
F4I1P7
DNA LIGASE IV (4) LIG4 Proposto estar envolvido
na via curta de BER. At5g57160
Q9LL84
POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE
ZDP Atuaria sobre os produtos gerados pela ação de OGG1 ou FPG Processamento de
produtos intermediários de BER
At3g14890 Q84JE8
ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1
PCNA1
PCNA é um homotrímero e atinge a sua processabilidade, circundando o DNA, onde atua como um suporte para recrutar as proteínas
envolvidas na replicação de DNA, reparação do DNA, a remodelação da cromatina e epigenética.
Envolvido na via longa de BER.
At1g07370 Q9M7Q7
ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2
PCNA2 Mesma descrição acima. Pode estar envolvido na resistência a radiação
ultravioleta. Envolvido na via longa de
BER. At2g29570 Q9ZW35
POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1
PARP1 Catalisando a poli(ADP-ribosil)ação de um número limitado de proteínas aceptoras envolvidas na arquitetura da cromatina e no metabolismo do
DNA. Esta modificação seguida de danos ao DNA é um passo obrigatório em uma via de detecção/sinalização que leva à reparação
de quebras de cadeia de DNA
Protege o substrato de BER, presente na via
longa de BER.
At2g31320 Q9ZP54
POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 2
PARP2 Não é essencial para o reparo de DNA na via
BER
At4g02390 Q11207
X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1
XRCC1 Está envolvido no reparo de quebra de fita simples do DNA, reparo de
excisão de base (BER) e reparo de excisão de nucleotídeos (NER). Envolvido na via curta de
BER. At1g80420
Q24JK4
WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE
WRN Uma helicase envolvida na manutenção da integridade do genoma. Interage com diversas
proteínas de BER: FEN1, PolB e PARP1
At4g13870 Q84LH3
72
4.1.1. 8-OXOGUANINA GLICOSILASE – OGG1
A DNA glicosilase OGG1 foi identificada no grupo das gramíneas, mais
precisamente na espécie Setaria itálica (OGG1_SETIT - K3YSU8), Sorghum
bicolor (OGG1_SORBI - C5XU78), Oryza sativa subsp. Japonica
(OGG1_ORYSJ - Q6ZI28), Zea mays (OGG1_MAIZE - B4FY38), Brachypodium
distachyon (OGG1_BRADI - I1IAG9) e Saccharum spp (OGG1_CANA).
Observou-se que existe uma diferença no tamanho das sequências de
monocotiledônea (média de 399 a 419 aminoácidos) em comparação com a
sequência de eudicotiledônea, sendo a OGG1 de Arabidopsis thaliana a que tem
de menor tamanho (365 aminoácidos). Todas as sequências apresentaram o
domínio da superfamília OGG1 (8-oxoguanina DNA glicosilase) . Com exceção
da sequência pertencente a Brachypodium distachyon (OGG1_BRADI) que
exibe também o domínio pertencente à família AccB (Biotin Carboxy carrier
protein), sendo este um domínio caracterizado por estar envolvido no transporte
e metabolismo de coenzima e lipídios. Todas as proteínas, compartilham os
mesmos resíduos nos sítios de ligação ao DNA e substrato (8-oxoguanina). A
conservação desses resíduos indicaria uma provável preservação da função
dessa enzima entre as sequências analisadas, inclusive com a de cana-de-
açúcar. Deve-se enfatizar que as sequências de gramíneas advindas do banco
do Uniprot aqui utilizadas para análise não foram revisadas pela a plataforma e
a maioria delas não apresentam anotação que as identifiquem como 8-
oxoguanina DNA glicosilase, categorizadas como proteínas preditas.
4.1.1.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – OGG1.
A árvore filogenética gerada pelo servidor TaxOnTree para OGG1 foi
possível notar que dentro do grupo da Poaceae o organismo Triticum aestivum
(trigo) apresenta três proteínas, A0A1D5VTA8, A0A1D5VKE2 e A0A1D5WWG0,
que exibem o tamanho, em aminoácidos, de: 437, 402 e 424, respectivamente.
Essas proteínas são sequências não caracterizada cuja proteína foi somente
predita, além disso, a posição no genoma dessas sequências é desconhecida,
sendo que a identidade compartilhada entre eles é acima de 90% e isso também
73
vale para o resultado referente a cobertura das sequências (Query cover), o que
poderia indicar que essas sequências provavelmente são isoformas. A
metodologia da plataforma TaxOnTree não excluiu as sequências de trigo do
alinhamento múltiplo que gerou a árvore filogenética, por não ser capaz de
avaliar tais sequências devido à ausência de informações contidas na plataforma
Uniprot (como o locus e a indicação que tais sequências seriam isoformas uma
das outras). Ademais, essas sequências, muitas vezes, são oriundas de
anotações automáticas e por não terem passado ainda por um processo de
revisão, podem conter informações redundantes. Fora esse caso, não se
observa dentro do grupo das gramíneas nenhuma duplicação de sequências,
isso também se repete em relação a todos os organismos representados na
árvore.
A inferência bayesiana suporta essas observações onde se observou que
ocorreu uma preservação na topologia, dando suporte as descrições feitas em
relação a árvore filogenética.
4.1.2. ENDONUCLEASE III-LIKE PROTEIN 1 E 2
Em A. thalina existem duas proteínas NTH (homólogas a endonuclease
III), como assinalado pelo o artigo de Spampinato (2017), sendo denominados
de 1 e outra de 2 (NTH1 e NTH2). Ambas sequências são DNA N-glicosilases
bifuncionais que estariam envolvidos na identificação de danos oxidativos as
bases pirimidinas. Essas proteínas, conforme anotação fornecida pela
plataforma Uniprot, possuem como localização subcelular o cloroplasto, mais
precisamente o seu núcleo. As sequências NTH1 e NTH2 se encontram em locus
distintos e em cromossomos também diferentes, cromossomo 2 e 1
respectivamente. Entretanto, quando efetuada a busca por homólogos dessas
duas proteínas em gramíneas só foi encontrado o equivalente para a sequência
de NTH1.
As sequências, tanto pertencentes ao grupo das gramíneas –
NTH1_SETIT (K3ZJ06) de Setaria itálica, NTH1_SORBI (C5YRT7) de Sorghum
bicolor, NTH11_ORYSJ (Q2R7H4) de Oryza sativa subsp. Japonica,
74
NTH1_MAIZE (A0A1D6ITB2) de Zea mays, NTH1_BRADI (I1IM16) de
Brachypodium distachyon e NTH1_CANA de Saccharum spp – quanto a
sequência Arabidopsis, exibem, aproximadamente, o mesmo tamanho, na faixa
de 362 a 379 aminoácidos). Além disso, as sequências conservam os resíduos
importantes para a função de DNA glicosilase. Estas também apresentam o sítio
ativo e sítio de ligação a metais (especificando ao ferro e ao enxofre). Este último
seria composto por cisteínas. As sequências de NTH analisadas também
apresentaram o domínio da superfamília HHH cujo nome advém do motivo
Hélice-Grampo-Hélice (helix-hairpin-helix) observado nas proteínas que fazem
parte dessa superfamília, a qual estaria incluso a Endonuclease III (NTH), tendo
esse motivo a função de se ligar ao DNA.
4.1.2.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – NTH1 e NTH2.
A árvore filogenética para a proteína NTH apresentou duplicações dentro
da família Brassicaceae, mais precisamente nas espécies Arabidopsis thaliana,
Arabidopsis lyrata, Brassica napus, Brassica oleracea, Eutrema salsugineum e
Arabis alpina Percebe-se que tais duplicações se encontram em ramos
separados, ou seja, dentro do grupo da família Brassicaceae, existem dois
subgrupos, sendo um deles composto por sequências semelhantes a NTH1 de
Arabidopsis e outro subgrupo por sequências similares a NTH2. Duplicações
dessas sequências também foram encontradas em outras famílias pertencente
ao grupo das eudicotiledôneas, já a família Poaceae não foi exibiu evidências de
sequências em múltiplas cópias.
Comparando a árvore filogenética com a oriunda da inferência bayesiana
nota-se a perpetuação, de forma geral, na topologia gerada pela a árvore da
plataforma TaxOnTree, apesar de algumas diferenças no posicionamento de
alguns grupos. Entretanto, estes não prejudicaram a intepretação evolutiva que
foi semelhante a já mencionada com a árvore filogenética, logo, tal preservação
conferiu maior veracidade aos resultados aqui obtidos.
75
4.1.3. URACIL-DNA GLICOSILASE - UNG ou UDG.
A proteína Uracil DNA glicosilase (UDG) tem a função de identificar e
catalisar o processo de excisão do Uracila que porventura foi incorporada, de
forma errada, ao DNA por uma DNA polimerase ou mesmo sendo derivado da
deaminação de uma citosina. Comparando a UDG advindo de Arabidopis
percebe-se que as sequências de gramíneas (UDG_SETIT (K3Z887) de Setaria
itálica, UDG_SORBI (A0A1B6PP12) de Sorghum bicolor, UDG_ORYSJ
(Q7XQA5) de Oryza sativa subsp. Japonica, UDG_MAIZE (B4FW30) de Zea
mays, UDG_BRADI (I1J398) de Brachypodium distachyon e UDG_CANA de
Saccharum spp.) exibiram um tamanho menor, aproximadamente 30
nucleotídeos a menos. Porém todos apresentaram o domínio da superfamília
UDG (em cor verde). Existem pelo menos cinco famílias UDG que foram
caracterizadas até agora. Essas famílias compartilham estruturas secundárias
semelhantes, motivos comuns e sitio ativo. Eles demonstram diferentes
especificidades de substrato, mas muitas vezes a função de uma enzima pode
ser complementada pela outra. As proteínas UDGs aqui analisadas pertencem
a Família 1 das UDGs que tem como alvo a uracila tanto no DNAss (single strand
DNA - DNA fita simples) quanto no DNAds (double strand DNA - DNA fita dupla)
e reconhecem o referido nucleotídeo explicitamente em uma conformação extra-
helical por meio de uma combinação de interações proteicas e com a molécula
d´água. As enzimas da Família 1 estão presentes em Eubacteria, Eukarya e em
alguns vírus eucarióticos.
As UDG de plantas também apresentaram a conservação do resíduo do
sítio ativo, um aminoácido ácido aspártico, o que serviria de indicativo para a
provável funcionalidade enzimática dessas proteínas no grupo das Poaceae.
4.1.3.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – UNG.
As relações filogenéticas das sequências UNG estão expressas na árvore
gerada pelo servidor TaxOnTree. Nesta referida árvore, podemos observar a
ocorrência de algumas duplicações das UNG-DNA glicosilases nos organismos
76
estudados, na família que compõem a dicotiledôneas, mas não na família
Poaceae.
Ao se comparar com a árvore principal da inferência bayesiana, observa-
se algumas diferenças, como o fato do grupo das monocotiledôneas apresentar
como grupo-irmão um grupo constituído por organismos advindo da família
Solanaceae, Phrymaceae e Apiaceae. Existem, desta forma, diferenças quanto
a topologia, principalmente no grupo das dicotiledôneas, por outro lado, na
família da Poaceae as relações previstas se preservam.
4.1.4. ATIVADOR TRANSCRICIONAL DEMETER (DME),
REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) E DEMETER-LIKE
PROTEIN 3 (DML3).
As sequências de ROS1, DML3 e DME em A. thaliana correspondem a
proteínas diferentes que atuam no processo de desmetilação do DNA. Essas
sequências, em Arabidopsis, estão localizadas em locus e cromossomos
distintos, nos cromossomos 2, 4 e 5 respetivamente, como também exibirem
tamanhos diferentes (DME - 1987 aa; ROS1 – 1393 aa e DML3 – 1044 aa).
Apenas ROS1 e DME compartilham 65% de identidade em suas sequências,
sendo que essas duas em comparação com DML3 exibem identidades inferiores
a 50%. DME, além de ser a maior das três sequências de Arabidopsis, exibe
domínios de superfamílias, mesmo que truncados, que não estão presentes nas
outras: Glutanin_hmw e TonB_N. A subunidade de glutenina de alto peso
molecular (High molecular weight glutenin subunit - Glutanin_hmw) é o grupo
composto por proteínas do glúten que seriam em grande parte responsáveis
pelas propriedades elásticas do glúten e, portanto, das massas. TonB região N-
terminal (TonB N-terminal region - TonB_N) é um domínio pequeno encontrado
apenas a downstream (a jusante) na extremidade N-terminal das proteínas TonB
ancorada na membrana citoplasmática, a função exata desse domínio não é
conhecida.
Em relação as sequências encontradas nas gramíneas, apesar de se
utilizar como query para a busca as distintas proteínas mencionadas
anteriormente, os resultados se repetiram entre si, de modo que não foi possível
77
a distinção de uma sequência específica para DME, ROS1 ou DML3. A maioria
das sequências de Poaceae presentes no banco de dados do Uniprot ainda não
foram revisadas, sendo então classificadas como proteínas não-caracterizadas,
a exceção a essa observação foi a sequência de milho que apresentou a
anotação de ser homóloga a ROS1 de A. thaliana.
As sequências do grupo das gramíneas (SETIT (K3ZPW2) de Setaria
itálica, SORBI(A0A1Z5R5E2) de Sorghum bicolor, ORYSI(B8AAK8) de Oryza
sativa subsp. Indica, ROS1_MAIZE(K7U9K6) de Zea mays, BRADI(I1I9S5) de
Brachypodium distachyon) tais como ROS1 e DML3, exibiram os mesmos
domínios das superfamílias: HHH, Perm-CXXC, RRM_DME. Hélice-Grampo-
Hélice (helix-hairpin-helix -HHH), domínio esse também foi encontrado na
proteína NTH1 e NTH2 (tópico 4.5.2), e teria a função de se ligar ao DNA. Nas
proteínas aqui analisadas tal domínio se mostrou truncado. Unidade Permutada
única Zf-CXXC (Permuted single zf-CXXC unit - Perm-CXXX) é um domínio
detectado em proteínas semelhantes a DEMETER normalmente encontrado em
plantas terrestres. RRM em DEMETER (RRM in Demeter - RRM_DME) é um
domínio presente na porção C-terminal de proteínas semelhantes a DEMETER,
RRM é predito que facilitaria a interação do domínio catalítico com o DNA ou
RNA.
A sequência de cana-de-açúcar identificada, não apresentou nenhum
domínio como também não apresentou o sítio de ligação ao metal Ferro-enxofre
(4Fe-4S). Embora exiba essas ausências, a sequência oriunda de cana-de-
açúcar apresenta alta identidade com as sequências de milho e Sorghum, além
de exibir uma identidade acima de 50% com as sequências de Arabidopsis. Vale
salientar que o alinhamento da sequência de cana-de-açúcar com as sequências
citadas se deu na porção N-terminal, justamente na região que nessas
sequências não apresenta os domínios ou sítios a serem destacados. Devido ao
tamanho da sequência de cana-de-açúcar ser menor que das outras proteínas
estudadas, pode-se cogitar que a busca efetuada no banco ESTs do SUCEST-
FUN tenha fornecido apenas o fragmento de uma sequência maior que
constituiria em uma provável sequência DME, ROS1 ou DML3 de cana-de-
açúcar.
78
4.1.4.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ROS1, DME e
DML3.
Como mencionado anteriormente, ROS1, DME e DML3, por serem
semelhantes em relação as suas sequências (compartilharem entre si
identidades superiores a 50%), acabaram por gerar um alinhamento englobando
sequências que fossem semelhantes a essas DNA glicosilases, de modo que o
servidor TaxOnTree gerou uma árvore com 553 sequências, sendo que todas
elas pertencem ao reino Viridiplantae.
A árvore filogenética ( exibe diversas duplicações e até mais do que isso,
pois, conforme assinalado no parágrafo anterior, por se tratar de uma árvore que
envolve mais de uma DNA glicosilase, significa que existirá sequências
diferentes de uma mesma espécie alusivos a cada uma dessas DNA glicosilases
indicadas. A inferência bayesiana, suporta as observações feitas anteriormente,
de modo que se pode notar que ocorreu uma preservação na topologia em
relação a árvore principal da inferência bayesiana e a filogenética.
4.1.5. METHYL-CpG-BINDING DOMAIN PROTEIN 4-LIKE PROTEIN -
MBD4L
A sequência MBD4L (Methyl-CpG-binding domain protein 4-like protein)
trata-se de uma DNA glicosilase monofuncional que tem como alvo para
correção do DNA o mal pareamento U:G e T:G (já mencionado na tabela 4). A
sequência de MBD4L advindo de Arabidopsis thaliana difere, principalmente em
relação ao domínio conservado, das sequências pertencentes ao grupo das
gramíneas (MBD4L_SETIT(K3Y6Z6) de Setaria itálica,
MBD4L_SORBI(A0A1Z5S7M7) de Sorghum bicolor, MBD4L_ORYSJ (B9G222)
de Oryza sativa subsp. japonica, MBD4L_MAIZE (A0A1D6LF32) de Zea mays,
MBD4L_BRADI(I1IVD5) de Brachypodium distachyon e MBD4L_CANA de
Saccharum spp.), já que MBD4L_ARATH exibi um domínio da superfamília HHH
(destacado em verde) – já descrito no tópico 4.1.2 – enquanto as outras
sequências, incluindo a de cana-de-açúcar, exibem o domínio Endo3c. A
superfamília da endonuclease III (Endo3c) é formada pela a própria
79
endonuclease III, Alquilabase DNA glicosilases (família Alka) e outras DNA
glicosilases. Entretanto, dentre as sequências de Poaceae, verificou-se que a
sequência de Brachypodium distachyon exibe, além do domínio Endo3c, o
domínio truncado da superfamília EBV-NA3 (Epstein-Barr virus nuclear antigen
3 - Antigénio 3 nuclear do vírus Epstein-Barr - EBV-NA3), essa família inclui
proteínas nucleares importantes para a infecção do vírus Epstein-Barr.
A diferença de tamanho das proteínas é bastante evidente nas
sequências de gramíneas, compreendendo a faixa de 479 até 858 aminoácidos.
Deve-se enfatizar, todavia, que tais sequências, em sua maioria, não foram
anotadas e nem revisadas pela plataforma Uniprot, logo podendo ter sido
inferidas a partir do transcrito primário do RNA mensageiro que ainda não sofreu
edição.
O sítio ativo das sequências e os resíduos que contribuiriam pela
especificidade de enzima para com a guanina, apesar das diferenças
enfatizadas anteriormente, se preservam entre as sequências de
monocotiledônea e a de eudicotiledônea. A sequência de cana-de-açúcar,
entretanto, exibiu um tamanho diminuto em comparação a sequências aqui
analisadas, mas por preservar o domínio conservado Endo3c e o sítio ativo,
haveria possibilidade de ser um fragmento derivado de uma provável proteína
funcional.
4.1.5.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – MBD4L.
A sequência MBD4L gerou duas árvores filogenéticas pelo servidor
TaxOnTree, pois seguindo a sua metodologia, só seriam incluídos no
alinhamento as sequências que tivessem identidade de 50% ou acima. De modo
que as sequências do grupo das gramíneas não foram abrangidas dentro das
sequências que envolvia as dicotiledôneas, e o mesmo ocorreu de modo inverso,
gerando assim duas árvores exclusivas, sendo uma específica para mono e a
outra para dicotiledôneas. Ambas árvores apresentaram múltiplas cópias de
sequência, que devido a alta identidade compartilhada entre elas, cogitasse a
possibilidade de se tratar de isoformas.
80
As duas árvores principais oriundas da inferência bayesiana da proteína
MBD4L, tendo em vista as árvores filogenéticas já discorridas anteriormente,
demonstrou uma preservação na topologia, conferindo veracidade nas
descrições e resultados aqui analisados.
4.1.6. FLAP ENDONUCLEASE 1 - FEN1 ou SAV6.
Flap endonuclease 1 é uma enzima essencial para a replicação e reparo
do DNA. Essa proteína é caracterizada por possuir dois domínios principais: N-
terminal (N_Domain) e o interno ou I (I_Domain), sendo domínios importantes
para atividade catalítica da enzima e sua ligação ao DNA. A importância desses
domínios pode ser evidenciada pelos sítios que se encontram precisamente
nesses referidos domínios, sítios esses de ligação ao DNA e também de ligação
ao íon metálico, que no caso seria o Magnésio. Além disso, existe uma
sequência disposta na posição C-terminal que é o local de interação com a
proteína de ancoragem PCNA.
Em gramíneas – Setaria itálica, FEN1A_SORBI (C5YUK3) e
FEN1B_SORBI (C5WU23) de Sorghum bicolor, FEN1A_ORYSJ (Q9SXQ6) e
FEN1B_ORYSJ (Q75LI2) de Oryza sativa subsp. japonica, FEN1A_ORYSI
(B8AW67) e FEN1B_ORYSI (B8AMS4) de Oryza sativa subsp. Indica,
FEN1A_MAIZE (B4FHY0) e FEN1B_MAZE (A0A1D6GDY1) de Zea mays e
FEN1A_CANA e FEN1B_CANA de Saccharum spp. – ao contrário do que foi
observando em Arabidopsis, existem algumas sequências que apresentam uma
segunda proteína flap endonuclease assim denominado de "FEN1B", que difere
em tamanho (por serem maiores que a Flap endonuclase 1 convencional que
recebe o sufixo "A") e a ausência da sequência de interação com PCNA. Nem
todas as espécies que pertencem a Poaceae exibem essa duplicação, como
observado pela sequência de Setaria Italica. Deve-se enfatizar que as
sequências FEN1A e FEN1B se encontram em locus e cromossomos diferentes
em seus respectivos organismos. Outra observação importante a ser feita é que
entre as sequências analisadas, sejam elas FEN1A ou FEN1B, existe uma
conservação não só nos resíduos que compõem os sítios de ligação, mas
81
também a posição desses mesmos resíduos se preservou, exceções seriam a
sequência de Setaria italica e FEN1B de Sorghum bicolor (C5WU23).
4.1.6.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – FEN1A e FEN1B.
As árvores filogenéticas da enzima FLAP ENDONUCLEASE (FEN1)
foram duas, uma destas referente a FEN1A e outra a FEN1B. Nestas árvores
pode-se observar que essas apresentam convergências quanto as duplicações
(ou mais repetições) tanto no grupo pertencente as dicotiledôneas quanto no
grupo das Poaceae.
Na inferência bayesiana, foi possível observar que existe algumas
diferenças quanto a arquitetura da árvore principal gerada, principalmente tendo
como o foco o grupo das monocotiledôneas, na árvore filogenética para FEN1B.
A árvore para FEN1A evidencia-se que embora a família Poaceae estivesse
subdividida em dois grandes ramos, esses permaneceram separados das
dicotiledôneas, algo que se repetiu para análise bayesiana. Já para a árvore
filogenética para FEN1B, nota-se que um grupo constituído por sequências
pertencentes a família Solanaceae seria grupo irmão de um conjunto maior
formado por um dos grupos da Poaceae que englobaria sequências classificadas
como FEN1A, além de sequências pertencentes a organismo mais basais das
angiospermas, monocotiledôneas e dicotiledôneas como membros da família
Bromeliaceae, Musaceae, Amborellaceae e Zosteraceae. Isso poderia indicar
que as sequências FEN1A das gramíneas seriam mais próximas as sequências
de FLAP ENDONUCLEASE I das dicotiledôneas, em detrimento das sequências
FEN1B que seriam mais basais.
4.1.7. DNA POLIMERASE LAMBDA -Pol λ ou POLL.
Em relação a via de Excisão de bases (BER), a polimerase lambda seria a
DNA polimerase que deveria substituir a polimerase beta, tendo em vista que em
plantas não foi encontrado um homólogo correspondente a essa enzima em
específico. As DNAs polimerase lambdas aqui analisadas (POLlambda_ARATH
82
(Q9FNY4) de Arabidopsis thaliana, POLlambda_SETIT (K3XW78) de Setaria
itálica, POLlambda_SORBI (A0A194YIA1) de Sorghum bicolor,
POLlambda_ORYSJ (Q67VC8) de Oryza sativa subsp. japonica,
POLlambda_MAIZE (A0A1D6NRF0) de Zea mays, POLlambda_BRADI
(I1GZF6) de Brachypodium distachyon e PoLlambda_CANA de Saccharum spp.)
exibem um tamanho similar tendo aproximadamente de 520 aa a 555 aa, e a
presença do domínio da superfamília Pol_Beta. O domínio da superfamília da
Polimerase Beta (Pol_Beta) é caracterizado por conter o domínio
nucleotidiltransferase (NT) que constitui, por sua vez, de dois aminoácidos, que
podem ser dois ácidos aspárticos (D ou Asp) ou um ácido aspártico e um ácido
glutâmico (E ou Glu), associados a um terceiro aminoácido distal, esses três
coordenarão a ligação com íons metálicos divalentes que são essenciais para a
catalise. Como observado nas sequências estudas, existem três ácidos
aspárticos (D) presente em todas as sequências analisadas que devem compor
o domínio NT e que são responsáveis pela ligação com o íon manganês (Mn +2).
A diferença notada entre as sequências foi a presença do domínio
pertencente a superfamília BRCT observado em algumas das sequências de
gramíneas como a Setaria italica (K3XW78), Zea mays (A0A1D6NRF0), Oryza
sativa (Q67VC8) e Brachypodium distachyon (I1GZF6). O domínio da proteína
supressora de câncer de Mama carboxi-terminal (Breast Cancer Suppressor
Protein carboxy-terminal -BRCT) é encontrado em muitas proteínas envolvidas
no reparo do DNA e nos pontos de checagem (chekpoint) do ciclo celular. A
sequência de Sorghum bem como a de cana-de-açúcar não exibiram esse
domínio BRCT.
Apesar da sequência cana-de-açúcar encontrada ter um menor tamanho
em comparação as outras sequências, esta exibe o domínio da superfamília da
DNA Polimerase Beta como também o sítio ativo, sítios de ligação a
desoxicitidina trifosfato (dCTP) e ao íon metálico (Manganês). O dCTP é um
trifosfato de nucleósido que contém a pirimidina base de citosina, a qual contém
fosfoanidrido de alta energia que liberam energia quando hidrolisado, as DNAs
polimerases usam essa energia para incorporar desoxicitidina em uma cadeia
sintetizada de DNA. Com base nisso, pode-se propor que a sequência de cana-
de-açúcar possa ser um fragmento de uma DNA polimerase lambda funcional.
83
4.1.7.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA polimerase
Lambda.
A árvore filogenética para a proteína DNA polimerase lambda gerada via
servidor TaxOnTree. Nela pode-se observar a presença de algumas duplicações
no grupo das dicotiledôneas, porém tal fato não é observado para o grupo das
gramíneas.
A árvore principal oriunda da inferência bayesiana, comparando com a
árvore filogenética resultante da metodologia efetuada pela plataforma
TaxOnTree, apresentam topologias similares, logo as observações destacadas
nos parágrafos anteriores foram suportadas pela análise bayesiana.
4.1.8. TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 TDP1.
TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 (TDP1) remove uma
variedade de adutos covalentes do DNA através da hidrólise da ligação 3'-
fosfodiéster, dando origem, no DNA, um fosfato na sua porção 3´. Esta proteína
também está associada ao reparo do DNA mediado por DNA topoisomerase
durante o metabolismo cromossômico. As sequências de TDP1 analisadas
exibiram, com a exceção da sequência de Setaria italica e cana-de-açúcar, um
tamanho de 600 a 671 aa (aminoácidos). Essas sequências foram:
TDPI_ARATH (Q8H1D9) de Arabidopsis thaliana, TDPI_SETIT (K3Y685) de
Setaria itálica, TDPI_SORBI(A0A1B6QEP1) de Sorghum bicolor, TDPI_ORYSJ
(Q7XHY3) de Oryza sativa subsp. japonica, TDPI_MAIZE (C0PDG6) de Zea
mays, TDPI_BRADI (I1GTU1) de Brachypodium distachyon e TDPI_CANA de
Saccharum spp. Quanto aos domínios conservados, todas as sequências
(exceto a sequência de cana-de-açúcar) exibiram o domínio da superfamília
Tyr_DNA_Prospho que envolve as Tirosil-DNA fosfodiesterases. Algumas
sequências apresentaram também o domínio da superfamília FHA. Domínio
associado a Forkhead (Forkhead associated domain - FHA) que é o domínio
presumível de sinalização nuclear e que poderia se ligar com a fosfoteronina,
fosfoserina e a fosfotirosina, muitas das proteínas que contêm domínio FHA
84
estão localizadas no núcleo, onde participam no estabelecimento ou
manutenção de pontos de controle do ciclo celular, no reparo do DNA ou
regulação transcricional. O domínio FHA não está presente na sequência de
Setaria italica e Oryza sativa.
A sequência de cana-de-açúcar além de ser bem menor que as outras
sequências de plantas usadas para comparação, exibe um domínio distinto
pertencente a superfamília PLFc_Sf, ou seja, um domínio catalítico da
fosfolipase D (Catalytic domain of phospholipase D - PLFc_Sf). A superfamília
do PLD (phospholipase D - Fosfolipase D) é composta por um grupo grande e
diversificado de proteínas, incluindo PLDs de plantas, mamíferos e bactérias
como por exemplo a cardiolipina sintase bacteriana (bacterial cardiolipin - CL),
fosfatidilserina sintase bacteriana (bacterial phosphatidylserine synthases- PSS),
fosfatidilglicerofosfato sintase de eucarioto (eukaryotic
phosphatidylglycerophosphate synthase - PGP), tirosil-DNA fosfodiesterase 1
sintase (Tdp1), e algumas endonucleases bacterianas (Nuc e BfiI), entre outras.
Deve-se levar em consideração que a sequência da cana-de-açúcar está
incompleta em tamanho, de modo que, caso tivesse completa, esse domínio
discrepante poderia não se apresentar, ademais, não se pode deixar de frisar
que o domínio PLFc_Sf também engloba as TDP1s. Além disso, a presumível
TDP1_CANA compartilhou alguns sítios importantes com as outras TDP1s aqui
analisadas, como o sítio ativo e o sítio de ligação ao substrato. Deve ser
enfatizado que, como mencionando antes, por ter um tamanho pequeno, dois
resíduos que compõem esses sítios importantes para TDP1 não puderem ter
correspondentes na sequência de cana-de-açúcar.
4.1.8.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – TDP1.
A árvore filogenética gerada para a proteína TDP1 apresenta alguns
eventos de duplicação, todos eles se encontram dentro do grupo das
dicotiledôneas.
85
Dispondo da árvore consenso resultante da inferência bayesiana,
percebe-se poucas diferenças quanto a topologia em comparação com a árvore
filogenética, de modo que tal resultado confere maior veracidade as observações
efetuadas anteriormente quando foi analisado na árvore filogenética de TDP1.
4.1.9. DNA LIGASE 1 -LIG1.
DNA ligase 1 (LIG1) é uma proteína essencial que sela os cortes da fita
dupla de DNA durante a replicação, recombinação e reparo do DNA. Em relação
ao reparo, a DNA ligase 1 estaria envolvida na quebra da fita simples (SSB -
single strand breaks) e dupla (DSB - double strand breaks). Existem duas formas
de DNA ligase, uma que requer ATP e outro NAD. As sequências de plantas
avaliadas apresentaram o domínio DNA_LIGASE_A3 (destacado em verde), ou
melhor, o domínio pertencente a família de DNA ligase depedente de ATP. As
sequências analisadas foram: DNLI1_ARATH (Q42572) e F4I1P7_ARATH de
Arabidopsis thaliana, DNLI1_SETIT (K4A636) de Setaria itálica, DNLI1_SORBI
(A0A1B6QK46) de Sorghum bicolor, DNLI1_ORYSJ (Q7XD67) de Oryza sativa
subsp. japonica, DNLI1_MAIZE (A0A1D6KSD8) de Zea mays, DNLI1_BRADI
(I1I4Y2) de Brachypodium distachyon e DNLI1_CANA de Saccharum spp. Essas
sequências retrataram diferenças quanto ao tamanho, possuindo sequências
menores com 657 aminoácidos enquanto existem outras com 931 aminoácidos.
A despeito dessa diferença, as sequências exibem a conservação de resíduos
importantes para atividade catalítica da enzima tais como o sítio ativo, sítio de
ligação ao ATP e ao íon metálico (Magnésio).
O trabalho de Spampinato (2017) propôs a existência de duas DNA ligase
1 que atuariam na via de excisão de bases: as sequências DNLI1_ARATH
(Q42572) (AtLIG1) e F4I1P7_ARATH (AtLIG1a). Essas sequências diferem
quanto o tamanho e estão ambas localizadas no cromossomo 1 da Arabidopsis,
mas se encontram em locus diferentes e distantes um do outro. A busca por
homólogos dessas duas sequências de Arabidopsis no grupo das gramíneas não
gerou como resultados duas sequências distintas, ou seja, usando como query
para a busca tanto DNLI1_ARATH (Q42572) quanto F4I1P7_ARATH o resultado
obtido foi o mesmo.
86
4.1.9.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase I.
O diagrama que representa as relações evolutivas entre os organismos
tendo como alvo a sequência de DNA LIGASE I e buscando destacar os
organismos vegetais se encontra apresentado na árvore filogenética gerada via
servidor TaxOnTree. Pode-se distinguir nele, duplicações e mais repetições
presentes dentro do grupo das dicotiledôneas, contudo o mesmo não foi visto
nas monocotiledônea.
A comparação da árvore filogenética e a árvore consenso originada da
inferência bayesiana, constata-se uma alteração da topologia e dessa forma
modificando as relações entre os grupos de organismos. Podemos observar, por
exemplo, na árvore principal, uma sequência da família Malvaceae, pertencente
a espécie Corchorus olitorius, que seria mais basal em relação as angiospermas,
algo não evidenciado na árvore filogenética. Ademais, a família Brassicaceae
passa ser grupo-irmão de um conjunto constituído por espécies que são
compostas tanto por monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, tal fato também
não foi observado na árvore filogenética. Apesar dessas diferenças, o grupo das
monocotiledôneas parece preservado nas duas árvores analisadas.
4.1.10. DNA LIGASE IV - LIG4.
A proteína DNA LIGASE IV é responsável por juntar eficientemente as duas
pontas de quebra de fita simples do DNA, sendo uma reação dependente de
ATP. Essa DNA ligase, especificamente, estaria envolvida no reparo por união
de extremidades não-homólogas (NHEJ - Non-homologous end joining). As
proteínas DNA LIGASE IV analisadas (DNLI4_ARATH (Q9LL84) de Arabidopsis
thaliana, DNLI4_SETIT (K3Y4S0) de Setaria itálica, DNLI4_SORBI
(A0A1Z5REU4) de Sorghum bicolor, DNLI4_ORYSA(B9FCD0) de Oryza sativa
subsp. japonica, DNLI4_MAIZE (A0A1D6E090) de Zea mays DNLI4_BRADI
(A0A0Q3KWA2) de Brachypodium distachyon e DNLI4_CANA de Saccharum
spp.) exibiram tamanhos acima de 1000 aminoácidos. Somente a sequência de
87
cana-de-açúcar apresentou um tamanho pequeno. O domínio da superfamília
CDC9 está presente na maioria das sequências, sendo esse um domínio
referente as DNA LIGASE dependentes de ATP. O domínio da superfamília
BRCT também está presente nas sequências, exceto na sequência de cana-de-
açúcar, sendo este um domínio encontrado em muitas proteínas envolvidas no
reparo do DNA e nos pontos de checagem (chekpoint) do ciclo celular, já
mencionado em itens anteriores.
As sequências pertencentes as gramíneas apresentaram o domínio
DNAL4 referente a família composta pela DNA LIGASE IV, as sequências de
Arabidopsis e de cana-de-açúcar diferem nesse quesito por não exibirem tal
domínio. Ademais, as sequências de Setaria italica, Zea mays, Brachypodium
distachyon e cana-de-açúcar apresentaram o domino conservado
DNA_ligase_A_N. DNA ligase N Terminus (DNA_ligase_A_N) é uma região
encontrado em muitas sequências das proteínas DNA LIGASE dependentes de
ATP, teorizasse que esse domínio estaria evolvido na ligação ao DNA auxiliando
a catalise da enzima.
A proteína DNLI4_ARATH apresentou um domínio truncado denominado
Neuromodulin_N, sendo uma região N-terminal de proteínas que promovem a
junção de lacunas (gaps) no DNA. A sequência putativa de DNA LIGASE IV de
cana-de-açúcar e a sequência de B. distachyon exibiram o domínio da
superfamília Adenylation_DNA_ligase_like. O domínio de adenilação de
proteínas semelhantes às ligases de polinucleótidos dependentes de ATP
(Adenylation domain of proteins similar to ATP-dependent polynucleotide ligases
- Adenylation_DNA_ligase_like) está presente em DNA e RNA ligases
dependentes de ATP e estaria envolvido na ligação do referente ATP. É proposto
que nesse domínio estaria localizado os resíduos importantes para o sítio ativo.
Isto pode ser comprovado ao evidenciar que os resíduos que compõem o sítio
ativo e sítios de ligação ao ATP e íons metálicos se encontram dispostos no
domínio Adenylation_DNA_ligase_like. A sequência de cana-de-açúcar, também
apresenta um domínio exclusivo (não encontrado nas outras sequências aqui
estudadas): OBF_DNA_ligase_family, que está associado ao domínio de ligação
a oligonucleótido/oligossacarídeo (OB). Sendo um módulo de ligação ao DNA
que é parte da unidade central catalítica da DNA ligase dependente de ATP.
88
DNALI4_CANA por ter o menor tamanho, possivelmente se tratar de um
fragmento de uma proteína maior, por isso, não exibe os domínios como BRCT
e DNAL4 presentes nas outras sequências na posição C-terminal. Entretanto, a
presumível sequência de cana-de-açúcar conservou os resíduos importantes
para a função catalítica da DNA LIGASE IV, podendo-se inferir que seria
provável a existência de uma DNA LIGASE IV funcional no organismo cana-de-
açúcar.
4.1.10.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – DNA ligase IV.
A árvore filogenética para DNA ligase IV, indicou a presença de
duplicações para algumas espécies dentro no grupo das dicotiledôneas, sendo
que esse mesmo fato não foi observado em monocotiledôneas. No caso do trigo
foram observadas duplicações, mas conforme foi discutido anteriormente existe
uma grande possibilidade dessas sequências se tratarem de isoformas.
Dispondo da árvore principal resultante da inferência bayesiana se
evidência, quanto a topologia, uma correspondência com a árvore filogenética.
Não obstante, vale salientar que a árvore bayesiana, cujo query foi a DNA ligase
4 de Arabidopsis, só exibiu sequências do reino Viridiplantae, não tendo, desta
forma, sequências do reino Metazoa e Fungi.
4.1.11. POLINUCLEOTIDEO 3'-FOSFATASE – ZDP.
POLINUCLEOTIDEO 3´-FOSFATASE (ZDP) é uma enzima envolvida na
via BER requerida para a ativação da desmetilação do DNA. As sequências de
ZDP de Arabidopsis e de alguns organismos pertencente ao grupo das Poaceae
– ZDP_ARATH (Q84JE8) de Arabidopsis thaliana, ZDP_SETIT (K3XGW7) de
Setaria itálica, ZDP_SORBI (A0A1W0VZC1) de Sorghum bicolor, ZDP_ORYSJ
(Q5JND9) de Oryza sativa subsp. japonica, ZDP_MAIZE (C0PDZ5) de Zea mays
ZDP_BRADI (A0A0Q3MZG3) de Brachypodium distachyon e ZDP_CANA de
Saccharum spp.– exibirem tamanhos que variavam de 460 a 694 aminoácidos.
Além do mais, pode ser observado um domínio conservado presente de forma
89
constante nas sequências analisadas: PARP_reg. Sendo este um domínio
regulador da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP). Outro domínio observado,
salvo em Arabidopsis, foi o domínio PNK3P. Este domínio trata-se de uma
superfamília a qual engloba as polinucleotideos kinases 3 fosfatases que são
proteínas que tem como papel principal atuarem na quebra de fita simples do
DNA induzindo por agentes genotóxicos como a radiação gamma. O domínio
PNK3P é caracterizado por catalisar a desfosforilação dos 3´-fosfatos do DNA.
A sequência de Arabidopsis e a de Sorghum exibem um domínio em
comum: o ZF_PARP, sendo a região Zn-finger das Poli(ADP-ribose) polimerases
e DNA ligases que funcionariam como um sensor para quebras no DNA (figura
31). A sequência de Arabidopsis apresenta ainda um domínio exclusivo que não
foi observado nas outras sequências de gramíneas estudadas: HAD_like, isto é,
hidrolase parecidas como haloácidos dehalogenase (Haloacid Dehalogenase-
like Hydrolases), uma superfamília que incluem proteínas que catalisam as
reações de substituição nucleofilicas nos centros de fosforo e carbono do
aminoácido, usando um ácido aspártico conservado em uma catalise covalente.
A sequência de uma possível ZDP em cana-de-açúcar apresenta
tamanho e domínios condizentes com outras sequências de ZDP usadas para
comparação, principalmente aquelas pertencentes ao grupo das gramíneas. É
importante observar os valores encontrados de identidade entre a ZDP_CANA e
as outras sequências de Poaceae contrastando com Arabidopis cuja
porcentagem é inferior a 50%. Este dado reforça ainda mais a hipótese de que
tal sequência encontrada na plataforma SUCEST-FUN poderia indicar uma
proteína ZDP funcional.
4.1.11.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – ZDP.
As inferências evolucionárias em forma de árvore das relações entre as
sequências de ZDP entre os seres vivos foi gerada via servidor TaxOnTree.
Nesta árvore foram ressaltados os organismos vegetais. Pode-se observar
duplicações de sequências em espécies que compõem o grupo das
90
dicotiledôneas, enquanto para o grupo das monocotiledôneas, precisamente das
gramíneas, não foram observadas essas duplicações.
A árvore principal oriunda da inferência bayesiana, ao se comparar com a
árvore filogenética resultante da metodologia efetuada pela plataforma
TaxOnTree, foi possível notar diferenças em suas topologias. Uma dessas
diferenças seria o fato de a família Solanaceae não ser o grupo mais basal em
relação as gramíneas e outros organismos pertencentes as dicotiledôneas, como
foi mostrado na árvore filogenética. Na árvore da inferência bayesiana a referida
família se encontra junto as outras dicotiledôneas. Seguindo a mesma lógica, as
sequências pertencentes a espécie Genlisea aurea (família Lentibulariaceae) e
Erythranthe guttata (família Phrymaceae) também abandonaram suas condições
mais basais na árvore da inferência bayesiana, acompanhando o grupo
composto pela família Solanaceae.
4.1.12. ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 1 (PCNA1) e
ANTIGENO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 2 (PCNA2).
O ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR (PCNA) trata-se
de uma proteína que atua como um grampo, envolvendo o DNA, e assim
servindo como plataforma de ancoragem para outras proteínas que atuariam na
replicação e reparo de DNA, também na remodelagem da cromatina e na
regulação epigenética. A revisão feita por Spampinato (2017) propôs a existência
de dois tipos de PCNA em Arabidopsis: PCNA1 e PCNA2. Essas proteínas se
encontram em cromossomos diferentes do organismo A. thaliana (cromossomo
1 e 2, respectivamente) e apresentam uma identidade de 96% entre si. Contudo,
efetuando a busca por homólogos dessas PCNAs dentro do grupo das
gramíneas não resultou na obtenção de duas sequências de PCNAs pertinente
a cada organismo analisado. As sequências de gramíneas para essa analise
inicial foram: PCNA_SETIT (K3YV19) de Setaria itálica, PCNA_SORBI
(C5XV51) de Sorghum bicolor, PCNA_ ORYSJ (P17070) de Oryza sativa subsp.
japonica, PCNA_MAIZE (Q43266) de Zea mays PCNA_ BRADI (I1IDN4
(A0A0Q3MZG3) de Brachypodium distachyon e PCNA_CANA de Saccharum
spp.
91
As sequências demonstraram uma alta conservação na disposição dos
domínios como também tamanho das proteínas, exibindo o comprimento de 263
aminoácidos. A sequência PCNA2 de Arabidopsis exibiu um aminoácido a mais
– 264 aa. Os domínios PCNA_1 e PCNA_2, correspondem a regiões
conservadas entre as proteínas caracterizadas como PCNAs, situadas na
porção N-terminal das sequências, sendo que PCNA_2 é o domínio que foi
proposto ser responsável pela ligação com o DNA.
A sequência de cana-de-açúcar exibiu os dois domínios descritos
anteriormente e a porcentagem de identidade compartilhada entre as outras
PCNAs de plantas foi superior a 80%, sugerindo que tal sequência deve ser
funcional dentro desse organismo vegetal.
4.1.12.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PCNA1 e PCNA2.
A árvore filogenética da proteína PCNA exibiu duplicações e triplicação de
sequências no grupo das dicotiledôneas e monocotiledôneas. Tais sequências
exibiram tamanhos de proteínas próximos entre si, além de alta identidade, tendo
diferenças, de uma em comparação, de apenas poucos aminoácidos.
A inferência bayesiana indicou na árvore consenso, a conservação das
relações evolutivas já assinalado na árvore filogenética, conferindo, desta forma,
maior veracidade as observações e descrições anteriormente.
4.1.13. POLI [ADP-RIBOSE] POLIMERASE 1 (PARP1) e POLI [ADP-
RIBOSE] POLIMERASE 2 (PARP2).
POLI(ADP-RIBOSE) POLIMERASE (PARP) está envolvida na via de
reparo de excisão base (BER), catalisando assim o poli(ADP-ribosil)lação. Em
Arabidopsis thalina existem duas PARPs denominadas de PARP1 e PARP2.
Estas sequências apresentam tamanhos e presença de domínios conservados
diferentes. É importante ressaltar que estas sequências se encontram em
cromossomos diferentes (2 e 4, respectivamente).
92
A proteína PARP1 apresentou dois motivos zinc-finger na porção N-
terminal de sua sequência que estariam envolvidos na ligação com fitas simples
de DNA. Esta também possui o domínio BRCT que já foi encontrado em outras
proteínas identificadas da via BER.
O domínio PARPalpha, se refere ao domínio alfa-helicoidal da PARP, a
qual é responsável por retransmitir o sinal de ativação emitido ao se ligar ao DNA
danificado. Além disso, existe o domínio PARPcatalytic que corresponde ao
domínio catalítico de PARP responsável por transferir a fração ADP-ribose do
seu substrato NAD (Dinucleótido de nicotinamida e adenina) para os
aminoácidos ácido aspártico e glutâmico. Esses dois domínios estão presentes
tanto em PARP1 quanto em PARP2. Os domínios SAP1 e 2, exibidos em PARP2
na sua região N-terminal, não apresentam uma função conhecida, sendo
também presente em outras sequências de PARPs das gramíneas.
A busca efetuada no Uniprot e no banco de dados ESTs (SUCEST)
retornou sequências homólogas a PARP1 e outras a PARP2. As sequências
identificadas e analisadas das gramíneas foram: PARP1_ ORYSJ (Q7EYV7),
PARP2A_ ORYSJ (Q5Z8Q9) e PARP2B_ ORYSJ (Q0JMY1) de Oryza sativa
subsp. japonica, PARP1_ MAIZE (Q9ZSV1) e PARP2_ MAIZE (O50017) de Zea
mays e PARP1_CANA e PARP2_CANA de Saccharum spp. É possível
evidenciar, para essas sequências, domínios característicos as respectivas
PARPs como também existem diferenças que parecem ser exclusivas das
sequências encontradas nas Poaceae. Verificou-se a presença de um domínio
SAP nas proteínas PARP1 de O. sativa, Z. mays e cana-de-açúcar. Em relação
a PARP2, foi encontrado dois subtipos de PARP2 em arroz: PARP2A e PARP2B
a qual diferem quanto a presença dos domínios SAPs, sendo que a o subtipo 2B
não os possuem.
A sequência de PARP1 de cana-de-açúcar parece estar completa, por
apresentar tamanho, disposição de domínios e motivos similar com as outras
sequências de PARP1 analisadas. Ademais, pode-se observar a alta identidade
com as proteínas de outras espécies. Entretanto, para PARP2_CANA nota-se
que se trata de uma sequência parcial, considerando seu tamanho como também
por não possuir o domínio catalítico.
93
4.1.13.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – PARP1 e PARP2.
As árvores filogenéticas para as proteínas PARP1 e PARP2 foramg
eradas via servidor TaxOnTree. Foram obtidas duas árvores com conjuntos de
proteínas distintos provavelmente pelas diferenças de tamanho e domínios
observados entre as PARPs. As duplicações exibidas em essas árvores também
diferiram, principalmente para PARP2, provavelmente devido a existência dos
subtitipos PARP2A e PARP2B.
As árvores consensos de PARP1 e PARP2, da inferência bayesiana,
repetiram as relações já observadas nas árvores filogenéticas das referidas
proteínas, sendo assim mantendo a topologia e garantindo confiabilidades nas
observações tecidas sobre as relações evolutivas entre as sequências
estudadas.
4.1.14. X-RAY REPAIR CROSS-COMPLEMENTING PROTEIN 1 -
XRCC1.
O papel de corrigir defeitos no reparo de DNA de fita simples e na troca de
cromátides irmãs promovidas por tratamento com agentes genotóxicos (radiação
ionizante e agente alquilantes) é associado a proteína XRCC1 (HOCH et al.,
2017). Além disso, também é proposto que essa proteína estaria envolvida na
epigenética por atuar na via de desmetilação do DNA (MARTÍNEZ-MACÍAS et
al., 2013). As sequências identificadas e analisadas foram: XRCC1_ARATH
(Q24JK4) de Arabidopsis thaliana, XRCC1_SETIT (K3XY04) de Setaria italica,
XRCC1_SORBI (C5Z3V7) de Sorghum bicolor, XRCC1_ORYSJ (Q5VQ75) de
Oryza sativa subsp. japonica, XRCC1_MAIZE (B4G1L6) de Zea mays,
XRCC1_BRADI (I1H1P9) de Brachypodium distachyon e XRCC1_CANA de
Saccharum spp. A partir destas sequências, pode-se evidenciar que existe uma
conservação quanto ao tamanho da sequência de XRCC1 que varia entre 344 a
355 aminoácidos, assim como da presença do domínio BRCT. Embora a
sequência de Arabidopsis thaliana exiba dois domínios BRCT, um disposto na
94
porção N-terminal e outra na C-terminal, nas gramíneas é encontrado apenas
um domínio BRCT.
A sequência de cana-de-açúcar dispõe do tamanho semelhante as outras
sequências de XRCC1 aqui analisadas e compartilha com elas altos valores de
identidade, principalmente entre as sequências do grupo das Poaceae. Além do
mais possui o referido domínio BRCT, o que reforça a hipótese que
XRCC1_CANA seja uma sequência funcional.
4.1.14.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – XRCC1.
A árvore filogenética para a proteína XRCC1 exibiu poucas duplicações,
sendo que essas se concentram em organismos pertencentes ao grupo das
dicotiledôneas.
Confrontando a árvore filogenética com a árvore consenso oriundo da
inferência bayesinana percebeu-se, de forma geral, que ocorreu uma
preservação da topologia e, desta forma, das relações previstas para os
organismos/sequências analisadas. Entretanto, a família Solanaceae,
apresentou uma duplicação na árvore bayesiana.
4.1.15. WERNER SYNDROME ATP-DEPENDENT HELICASE- WRN.
Helicase ATP dependente da síndrome Werner (WRN) é uma proteína
nuclear que atua na manutenção da estabilidade do genoma e desempenha um
papel importante no reparo do DNA, na replicação, na transcrição e na
manutenção dos telômeros. As sequências analisadas e identificadas foram: :
WRN_ARATH (Q84LH3) de Arabidopsis thaliana, WRN_SETIT (K3Y906) de
Setaria italica, WRN_SORBI (C5YBT8) de Sorghum bicolor, WRN_ORYSJ
(Q7XP25) de Oryza sativa subsp. japonica, WRN_MAIZE (B6TDG3) de Zea
mays, WRN_BRADI (Q7XP25) de Brachypodium distachyon e WRN_CANA de
Saccharum spp. Com estas sequências foi possível observar a existência de
uma evidente conservação da WRN entre os organismos vegetais estudados,
afinal, todos exibem o tamanho por volta de 292 a 311 aminoácidos, e
95
apresentam o domínio conservado da superfamília DNAQ_like_exo. A
superfamília do domínio DNAQ-like (ou DEDD) da 3´-5´ exonuclease
(DNAQ_like_exo) trata-se de um grupo com uma conservação estrutural que
engloba proteínas que catalisam a excisão de nucleosideos monofosfatos do
DNA ou RNA no sentindo 3´-5´, também é denominado de superfamília DEDD
devido a quatro aminoácidos invariantes presentes no sítio catalítico nos seus
membros. Dentro dessa superfamília temos a WRN, que se trata de uma DNA
helicase RecQ que exibe atividade exonuclease e logo possui o domínio DNAQ-
like ou DEDD.
A sequência de cana-de-açúcar além de apresentar o domínio referente
a superfamília DNAQ-Like, exibe alta identidade entre os organismos
pertencentes ao grupo das gramíneas (acima de 70% de identidade) , sugerindo,
assim, a probabilidade de funcionalidade da sequência prevista.
4.1.15.1. Árvore filogenética e Inferência Bayesiana – WRN.
A árvore que expressa as relações filogenéticas de WRN foi gerada via
servidor TaxOnTree. Nesta árvore pode-se observar duplicações de sequências
que ocorreram somente no grupo das dicotiledôneas.
A árvore consenso oriunda da inferência bayesiana (exibiu uma diferença
quanto a topologia, quando comparada a árvore filogenética originada da
plataforma TaxOnTree. Pode-se observar que o grupo constituído pelas
sequências pertencentes aos organismos da família Poaceae se encontra em
um grupo maior a qual apresentariam relação com os organismos mais basais
das angiospermas (como a família Bromeliaceae, Musaceae, Zosteraceae,
Amborellaceae e Nelumbonaceae) e estaria associado com famílias de
dicotiledôneas como a Solanaceae e Curcubitaceae. Esse grande grupo seria
grupo-irmão de um conjunto formado, por sua vez, por famílias pertencentes a
dicotiledôneas, tais como Fabaceae, Malvaceae e Brassicaceae. Esse tipo de
relação não ficou explícita na árvore filogenética.
96
4.2. Modelagem.
Os resultados a seguir são referentes as sequências das proteínas PCNA
e FEN1 de cana-de-açúcar que são proteínas que são previstas interagirem
entre si, sendo que PCNA serve de ancoragem para várias proteínas, inclusive
a FEN1 que aliás, como já descrito no item 4.1.6., possui uma sequência de
interação com PCNA na sua porção N-terminal. Ademais, tais modelos obtiveram
os melhores modelos via I-tasser, ou seja, tendo o melhor C-score previsto, além
de melhores avaliações via Molproby.
A previsão de modelos é importante para elucidar a estrutura das
proteínas presumíveis da via BER e, desta forma, permitiria a inferência quanto
a preservação da atividade enzimática, reconhecimento do substrato, presença
de sítios de ligação ao DNA, outras subunidades e interação com outras
proteínas necessárias para o desempenho de sua função. O trabalho anterior do
nosso grupo de pesquisa desenvolveu modelos tridimensionais das enzimas AP
endonucleases ScARP1 e ScARP3 de cana-de-açúcar (MAIRA et al., 2014).
Estes modelos serviram de base para a caracterização estrutural dessas
proteínas e predição de sua funcionalidade in vivo. Além disso, devido o escasso
número de cristais relacionados a proteínas de origem vegetal, o
desenvolvimento de modelos tridimensionais utilizando as diferentes
ferramentas de modelagem auxiliaria a compreensão dessas proteínas que
atuam não somente no reparo de DNA, mas em outras vias essenciais do
metabolismo do DNA.
4.2.1. Modelo de PCNA_CANA.
O modelo tridimensional da putativa PCNA de cana-de-açúcar se organiza
em arquiteturas homotriméricas em forma de anel, como destacado na figura 8,
nas cores azul, verde e rosa a qual, cada uma, representam três cadeias
idênticas de PCNA organizadas para formar o referido anel. Ademais, esse
modelo exibe alta similaridade de sequência e estrutural com outras PCNAs
avaliadas, conforme observado na figura 9, onde se evidencia os modelos de
97
PCNAs oriundos de cristais de A. thaliana e H. sapiens e constata-se uma
semelhança com o anel homotrimérico previsto para a PCNA de cana-de-açúcar.
Essa organização estrutural se apresenta conservada em todas as PCNAs até o
momento identificadas em diversos organismos pertencentes a diferentes reinos
(BAUER & BURGERS, 1990; WASEEM et al., 1992; ALMENDRAL et al.,1987;
MATSUMOTO et al., 1987; YAMAGUCHI et al., 1991; YAMAGUCHI et al., 1990;
HATA et al., 1992; LOPEZ et al., 1995; LÓPEZ et al., 1997; SUZUKA et al., 1991;
STRZALKA & ZIEMIENOWICZ, 2007; CANN et al., 1999).
Figura 8 – Modelo da presumível PCNA de Cana-de-açúcar. As estruturas destacadas em azul, verde e rosa tratam-se de cadeias individuas de PCNA que em conjuntam formam o anel homotriméricas.
98
Figura 9 – Modelo tridimensional e sequências proteínas das PCNAs de plantas e humano. Os modelos 3D exibem a conservação da estrutura arquiteturas homotriméricas em forma de anel.
PCNA geralmente é chamada de grampo deslizante (sliding clamp), pois
foi previsto que a dupla fita de DNA passaria pela abertura do anel do PCNA e
este serviria como plataforma de ancoragem para muitas proteínas envolvidas
no metabolismo do DNA. Foi verificado a possível preservação dessa função no
modelo de Saccharum spp., utilizando como base o cristal 6GIS, que se trata de
um modelo de PCNA humano que está associado com o DNA. Ao alinhar o cristal
com a PCNA oriundo de cana-de-açúcar (RMSD - Root Mean Square deviation-
entre os modelos foi na média de 0,653 Å), foi possível constatar a provável
conservação da interação com DNA (figura 44). Deve-se observar na figura 10,
destacado em rosa a região de ligação ao DNA que no modelo se encontra
voltado para o interior do orifício do anel, local em que a dupla fita de DNA
deveria passar. Tanto na figura 10a e 10b (que indicam ângulos diferentes de
visão do modelo), pode-se observar o DNA, representando por uma dupla fita
que constitui uma hélice de coloração azulada, passar pelo o referido orifício do
anel da PCNA de cana-de-açúcar.
99
Figura 10 – Modelos proposto para a presumível PCNA de cana-de-açúcar associado ao DNA. Destaca-se em rosa a região do PCNA que interage com o DNA a qual se encontra voltada para o interior do anel da estrutura homotrimérica. A dupla fita que constitui uma hélice de cor predominante azul é a representação tridimensional do DNA. (A) visão do modelo de PCNA de cana-de-açúcar interagindo com o DNA visto lateralmente. (B) visão frontal do já mencionado modelo.
100
4.2.2. Modelo de FEN1_CANA.
FEN1 é uma nuclease específica de estrutura (TSUTAKAWA et al.,2011)
que pode remover DNA flaps, que são estruturas de ácido nucleico normalmente
criadas pela DNA polimerase durante o processo de amadurecimento do
fragmento Okazaki (BALAKRISHNAN & BAMBARA, 2013). Os membros da
família FEN1 possuem um núcleo de nuclease conservado composto por regiões
N-terminal (região N) e interna (região I) (LIEBER, 1997). Essas referidas regiões
estão destacadas na figura 11, em verde (região N-terminal) e roxo (região
interna) no modelo proposto para a sequência de FEN1_CANA. Vale salientar
também, a região de interação com o PCNA, destacado em cinza (figura 11) que
se encontra em uma alça mais exposta que as outras regiões demarcadas.
As estruturas de cristal das proteínas da família FEN1 de diferentes
espécies revelaram que as regiões N e I formam um domínio globular
conservado contendo o site ativo (CESKA et al.,1996; MUESER et al., 1996;
HOSFIELD et al., 1998; HWANG et al., 1998; STORICI et al., 2002). Na maioria
dos membros da família FEN1, as regiões N e I são separadas por,
aproximadamente, 70 aminoácidos. Esta região formam um arco helicoidal que
está localizado acima do sítio ativo e desempenha um papel na ligação e catálise
do DNA (STORICI et al., 2002).
101
Figura 11 – Modelo proposto para a putativa FEN1 de cana-de-açúcar. Modelo de FEN1 de cana-de-açúcar. Destacado tanto no alinhamento quanto no modelo as regiões N-terminal
(verde), interna (I) (roxo) e região de interação com PCNA (cinza).
4.2.3. Interação entre os modelos de PCNA e FEN1.
PCNA, como já mencionado anteriormente, serviria como plataforma de
ancoragem de proteínas que exerceriam funções que variam de metilação de
DNA, reparo por excisão de base, reparo por excisão de nucleotídeos, reparo de
incompatibilidade, replicação de DNA e síntese de DNA de translesão (MAGA &
HUBSCHER, 2003). Desta forma, utilizando o cristal IUL1 que consiste da PCNA
humana associada com FEN1 (também humana) (SAKURAI et al., 2005), foi
verificado a possibilidade dos modelos previstos para cana-de-açúcar dessas
referidas proteínas também pudesse interagir entre si. O resultado, como exibido
na figura 12, demonstra que as FEN1 de cana-de-açúcar (modelo colorido em
azul) se apresentam associadas ao anel homotrimérica de PCNA (modelo de
coloração verde), em destaque em laranja está a sequência de interação ao
102
PCNA das FEN1s, sendo essa sequência, como demonstrado na figura, a
interface da interação PCNA e FEN1. O RMSD (Root Mean Square deviation)
entre os modelos de FEN1 (pertencentes ao cristal IUL1 e o modelo previsto
para cana-de-açúcar) foi em média 0,914 Å, enquanto entre os modelos de
PCNA, do cristal e o de cana-de-açúcar foi em média 0, 737 Å, foi feito uma
média pois o cristal apresenta três cadeias de FEN1 e de PCNA (que constituem
a estrutura em forma de anel).
103
Figura 12 – Complexo proposto de PCNA e FEN1 de cana-de-açúcar. (a) visão lateral do complexo. (b) visão frontal do complexo. Os modelos de FEN1 estão na coloração azul, os de PCNA em verde e íons Mg+2 estão destacados em amarelo. A sequência de FEN1 que interage com PCNA está destacada em laranja.
104
4.3. Analise das sequências AP endonucleases de Arabidoposis,
e cana-de-açúcar.
AP endonucleae é uma enzima essencial para a via de excisão de bases
(BER) por catalisar a etapa inicial da via, identificando e processando o sítio
abásico reminiscente da ação das DNA glicosilases ou mesmo gerado
espontaneamente. Sítios abásicos não reparados podem levar a mutação
durante a replicação semiconservativa, o que indica o quão importante é a ação
da AP endonuclease para a conservação do código genético.
Em Arabidopsis, existem três AP endonucleases homólogas a APE1 (AP
endonuclease 1 humana), denominadas de AtAPE1L, AtAPE2 e AtARP
(MURPHY et al., 2009). Primeiramente, na tabela 5 são apresentadas as
diferenças existentes entre as três sequências de AP endonuclease de
Arabidopsis thaliana para depois fazer a comparação com a sequência de cana-
de-açúcar. Como apresentado na tabela abaixo, podemos observar que AtARP
seria aquela que teria a capacidade de reparar danos oxidativos ao DNA e
poderia agir como um fator redox. Além disso, esta proteína exibi as atividades
de AP endonuclease e teria a capacidade de processar a extremidade 3´-PUA.
Tendo em vista a sua atividade 3´-fosfatase, existe uma divergência, pois em um
artigo é enfatizado que apresentaria uma significativa atividade in vitro (LEE et
al., 2014), enquanto em outro artigo indica que não existira essa atividade (LI et
al., 2015a). Esta proteína também apresenta uma forte afinidade não-específica
ao DNA. Para a proteína AtARP foi previsto como localização subcelular o
cloroplasto, mais precisamente o nucléolo dessa organela, logo essa AP
endonuclease estaria envolvida, possivelmente, no reparo por via excisão de
bases (BER) nos cloroplastos (GUTMAN & NIYOGI, 2009).
A proteína AtAPE1L, por sua vez, apresentaria atividade AP
endonuclease, contudo, diferente da AtARP, essa proteína estaria envolvida no
processo de desmetilação e gene imprinting (LI et al., 2015a). A proteína
AtAPE1L exibiria atividade 3´-fosfotase e converteria a extremidade 3´-PUA
gerada por ROS1 para 3´-OH. Como a proteína AtARP, ATAPE1L exibiria uma
forte afinidade não especifica ao DNA. Sendo essa enzima necessária, junto com
AtAPE2, para a viabilidade das sementes (MURPHY et al., 2009). Quanto a
105
localização subcelular, foi previsto que tal proteína iria para o núcleo e nucléolo,
sendo co-localizada com as proteínas ROS1 e ZDP (LI et al., 2015a).
No caso da proteína AtAPE2, esta possuiria a atividade 3´-fosfatase in
vitro (LI et al., 2015a; LEE et al., 2014; LI et al., 2018b), apesar que um artigo
sugira que na verdade AtAPE2 não apresentaria esta atividade enzimática (LEE
et al., 2014). Essa enzima não seria capaz de catalisar a conversão de 3´-PUA
em 3´-OH, como também não apresenta atividade 3´-fosfatase in vitro. Todavia,
apresentaria atividade 3´-5´exonuclease in vitro (LI et al., 2018b). Apresentaria,
ademais, uma forte afinidade não-específica ao DNA e teria como localização
subcelular o núcleo.
106
Tabela 5 – Função de AP endonuclease de Arabidopsis thaliana e cana-de-açúcar.
Nome/UniprotKB Atividade e função Localização Subcelular
AtARP1 (P45951 –
ARP_ARATH)
• Repara danos oxidativos ao DNA, também atua como fator Redox (BABIYCHUK et al., 1994);
• É uma enzima multifuncional e pode estar envolvida no reparo do DNA e na regulação da transcrição (BABIYCHUK et al., 1994);
• Apresenta atividade apurínica/apirimídica (AP) endonuclease (LI et al., 2015a; CÓRDOBA-CAÑERO et al., 2011; LEE et al., 2014);
• Catalisa a conversão do 3´aldeído β,α-insaturado (3´-PUA) para 3´-OH (LEE et al., 2014);
• Pode estar envolvido no reparo de excisão de bases nos cloroplastos (GUTMAN & NIYOGI, 2009);
• Apresenta significativa atividade 3´-fosfatase in vitro (LEE et al., 2014);
• Não apresentaria atividade 3´-fosfatase in vitro (LI et al., 2015a);
• Tem uma forte afinidade não especifica para com o DNA (LEE et al., 2014).
Nucléolo do cloroplasto (GUTMAN & NIYOGI,
2009).
AtAPE1L (Q5XF07 –
APE1L_ARATH)
• Atividade Apurínica/apirimídia (AP) endonuclease envolvida na desmetilação do DNA e no imprinting de genes (LI et al., 2015a);
• Possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LI et al., 2015a);
• Não possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LEE et al., 2014);
• Cataliza a conversão do grupo 3´aldeído β,α-insaturado (3´-PUA) a 3´-OH gerado por ROS1 (LI et al., 2015a; LEE et al., 2014);
• Tem uma forte afinidade não especifica com o DNA (LEE et al., 2014);
• Junto com AtAPE2 é necessário para a viabilidade de sementes (MURPHY et al., 2009).
Núcleo (LI et al., 2015). Nucléolo (LI et al.,
2015a). Co-localiza e com ROS1
e ZDP, dois componentes da maquinaria de
desmetilação do DNA (LI et al., 2015a).
AtAPE2 (F4JNYO –
APE2_ARATH)
• Não possui atividade bioquímica (LEE et al., 2014);
• Possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LI et al., 2015a; LEE et al., 2014; LI et al., 2018b);
• Possui atividade 3´-5´exonuclease in vitro (LI et al., 2018b);
• Não possui atividade 3´-fosfatase in vitro (LEE et al., 2014);
• Não é possivel catalisar a conversão do grupo 3´aldeído β,α-insaturado (3´-PUA) a 3´-OH(LI et al., 2015a; LEE et al., 2014);
• Tem uma forte afinidade não especifica com o DNA (LEE et al., 2014);
• Junto com AtAPE1L é necessário para a viabilidade de sementes (MURPHY et al., 2009).
Núcleo
Anotação PROSITE-ProRule
ScARP1 Dados aqui apresentados neste trabalho no item 4.4 Núcleo e cloroplasto (MAÍRA et al., 2014).
107
A proteína ScARP1 de cana-de-açúcar é homóloga a AtARP de A. thaliana.
Observa-se que tal como a AP endonuclease da planta de eudicotiledônea, a de
cana-de-açúcar também apresenta um direcionamento subcelular para o cloroplasto,
mas também exibe, divergindo da proteína AtARP, um direcionamento para o núcleo.
Além disso, as duas sequências diferem também no tamanho, sendo ScARP1 menor
que a AtARP figura 13 e tabela 6.
Figura 13 - Analise das sequências de AP endonuclease AtARP, AtAPE2 e AtAPE1L (de A. thaliana), ScARP1 e ScARP3 (cana-de-açúcar) e hAPE1 (Homo sapiens). (a) alinhamento múltiplo de sequências feito pelo método Clustal Omega, a qual o destaque em negro corresponde ao domínio da superfamília Exonuclease-Endonuclease-Fosphatase (EEP), as caixas em vermelho, bem como o destaque em cinza indica o sítio ativo das sequências. (b) Representação esquemática dos domínios conservados das sequências, a figura em azul se destaca o domínio da superfamília Exonuclease-Endonuclease-Fosphatase (EEP) e em verde o domínio SAP, também é possível observar os sítios de ligação a metais (losango em cinza) e o sítio ativo (losango em vermelho). (c) Analise filogenética das sequências de Ap endonucleases, se utilizando do método de Maximum Likelihood. A análise evolucionária foi conduzida via MEGA7 (KUMAR et al., 2015).
108
A figura 13a e 13b apresenta o alinhamento entre as já mencionadas
sequências de AP endonuclease a qual se destaca o domínio conservado
pertencente a superfamília Exonuclease-Endonuclease-Fosphatase (EEP), também
foi evidenciado o sítio ativo que é compartilhado pelas sequências. A diferença
exibida na sequência ScARP1 é que esta apresentou o domínio SAP algo não
observado nas outras AP endonucleases estudadas.
Verificando as sequências de AP endonuclease de cana-de-açúcar e de
Arabidopsis observa-se a conservação de sítios essenciais para a catalise e ligação
de metais (cofatores enzimáticos) o que indica, devido a essa conservação, a
atividade efetivamente funcional da enzima, tal resultado é evidenciado na tabela 6.
Nesta tabela constata-se a preservação destes sítios, exceto por algumas diferenças
como o sítio ativo da AtARP e ScARP1 serem constituído por Tirosina (Y) e Histidina
(H), enquanto a AtAPE1L e hAPE1 exibem como sítio ativo uma Tirosina e um ácido
Aspártico (D), por fim, AtAPE2, de acordo com os dados fornecidos pelo servidor
Uniprot, tem como sítio ativo uma Histidina. Na tabela 6 também foi apresentado a
porcentagem de identidade compartilhada entre as sequências em relação a
ScARP1, de modo que se conclui que a enzima de cana-de-açúcar apresenta maior
similaridade com AtARP (60%), enquanto com as outras proteínas exibe uma
correspondência abaixo de 50%, algo também observado na árvore filogenética
exibida na figura 13c, a qual nota-se que ScARP1 se encontra em um grupo formado
pela AtARP e ScARP3. Estes valores podem ser um indicativo de uma discrepância
na estrutura, composição de aminoácidos e talvez na função.
Em relação a ScARP3, sequência homóloga a AtARP de A. thaliana também
encontrada em cana-de-açúcar e alvo de análise de um trabalho anterior do grupo
de pesquisa (MAIRA et al., 2014), esta exibe uma diferença em relação a ScARP1,
como mostrado na figura 13b e 13c. A ScARP3 está mais próxima da sequência de
AP endonuclease da Arabidopsis (AtARP), apresentando até uma maior
porcentagem de identidade (75%). Maíra et al. (2014) também evidenciou que a
sequência ScARP3 seria mais próxima do grupo das plantas eudicotilédôneas
enquanto a ScARP1 estaria incluindo dentro das monocotiledôneas, mais
precisamente junto com os representantes da família das Poaceae.
Deve-se ressaltar os sítios de ligação a metais compartilhado ou não com as
sequências aqui analisadas, todas AP endonucleases compartilham quatro (4) sítios
109
em comum. As sequências AtAPE2, ScARP1 e AtARP apresentam apenas dois
sítios partilhados entre eles. Existem também sítios exclusivos, ou seja, que não
apresentam correspondência (quando alinhados) com nenhuma outra proteína, de
cada enzima, sendo encontrado um em hAPE1.
Tabela 6 – Comparação entre as sequências de AP endonuclease analisadas. Seus respectivos tamanhos, porcentagem de identidade quando comparada a ScARP1, sítios ativos e sítios de ligação a metais.
Proteína Tamanho
da sequência
Identidade vs
ScARP1 (%)
Sítio ativo
Sítio de ligação a
metais
Sítio estabilizador de estado de
transição
Sítio Importante
para a atividade catalítica
ScARP1 306 - Y161 H297
E86 D201
N203 D296 N56 H297
N203 D271
AtARP ** 536 60% Y389 H527
E313 D429 N431 D526 N282 H527
N431 D501
AtAPE1L* 364 28% Y182 D222
D222 N224
D342 E80 N224 D311
AtAPE2 **
610 27% H324 N196 N7
D323 E37
H324 D194
- -
APEX1h* 318 45% Y171 D210
D70 E96 D210 N212
D308 N212 D283
* Apresenta sítios de ligação a metais (Magnésio). **Apresenta sítios de ligação a metais (Magnésio e Manganês).
4.4. Comparação de modelos de AP endonuclease de Arabidopsis e
cana-de-açúcar.
Os modelos tridimensionais das enzimas AP endonuclease de A. thaliana e
cana-de-açúcar (figura 14) demonstram que os resíduos que se ligariam a metais
(sejam eles Magnésio ou Manganês) se encontram na região mais interna da
proteína, justamente no sítio ativo da mesma, pois alguns dos resíduos também
fazem parte dos sítio ativos previstos para as enzimas como já demonstrado na
tabela 6.
110
Figura 14 – Modelos tridimensionais das Ap endonuclases de Arabidopsis thaliana e Saccharum spp. (a) Modelo referente a proteína AtARP de A. thaliana. (b) Modelo referente a proteína AtAPE1L de A. thaliana. (c) Modelo referente a proteína AtAPE2 de A. thaliana. (d) Modelo referente a ScARP1 de Saccharum sp. Em todos os modelos estão destacados os sítios de ligação aos metais, enfatizados nas caixas negras ao lado dos respectivos modelos.
Alinhando as proteínas, como pode ser observado na figura 15, nota-se que
o modelo referente a ScARP1 se alinha com a região correspondente ao sítio ativo
das proteínas analisadas de A. thalina (AtARP, AtAPE1L e AtAPE2), o que seria um
indicativo da conservação do mesmo e da provável atividade enzimática da
presumível enzima de cana-de-açúcar – ScARP1.
111
Figura 15– Sobreposição dos modelos de Ap endonucleases de Arabidopsis thaliana e Saccharum sp. (a) Sobreposição dos modelos de AtARP (A. thaliana) e ScARP1 (cana-de-açúcar). (b) Sobreposição do modelo de AtAPE1L (A. thaliana) e ScARP1. (c) Sobreposição do modelo de AtAPE2 (A. thaliana) e ScARP1.
112
4.5. Análise do padrão de expressão das AP endonucleases de
Arabidopsis, arroz e milho em comparação a cana-de-açúcar.
Analisando o desenvolvimento de A. thaliana por meio do transcriptoma e
utilizando os dados do projeto AtGenExpress tendo como alvo a sequência AtARP
(efetuado via Arabidopsis eFP Browser na plataforma Bio-Analytici Resource for
Planta Biology - BAR) (WINTER et al., 2007) (figura 16), foi possível observar que
AtARP apresenta um aumento de expressão em estágios finais do desenvolvimento
da semente. Além disso, este aumento foi observado na semente seca como
também na semente embebida com água, por 24 horas. Outros estágios em que
AtARP se encontra upregulated (coloração alaranjada) seria no meristema apical na
fase vegetativa e essa expressão continua aumentada até a fase de inflorescência e
mesmo no botão floral. Verifica-se nesses dados um aumento de expressão na
planta nas folhas em senescência.
Figura 16 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtARP. O mapa foi gerado via Arabidopsis eFP Browser, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo A. thaliana. Figura adaptada do resultado do Arabidopsis eFP Browser.
113
Em relação a AtAPE1L (figura 16), semelhante ao que foi observado em
AtARP (figura 17), também exibiu um aumento de expressão no meristema apical,
sendo que esse aumento se intensificou conforme passava do estágio vegetativo
para o estágio de transição e, por fim, o estágio de inflorescência. As sementes, por
outro lado, exibiram diferenças na expressão em comparação a enzima
anteriormente analisada. As sementes demonstraram um aumento de expressão nos
estágios iniciais, sendo que nos estágios finais ocorre uma diminuição, isso também
é notado no caso da folha em senescência e outros estágios no desenvolvimento
das folhas. Outra semelhança com AtARP foi o aumento na expressão de AtAPE1L
nos estágios iniciais das flores, ainda em botão, sendo que um aumento adicional de
expressão foi observado no carpelo, contudo, uma diminuição na expressão ocorreu
nas sépalas e pétalas. AtAPE1L também exibiu o aumento da expressão nas
sementes embebidas por água, mas já nas sementes secas ocorre uma diminuição
de expressão. Logo, observa-se diferenças na expressão entre AtAPE1L e AtARP.
Figura 17 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE1L. O mapa foi gerado via Arabidopsis eFP Browser, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo A. thaliana. Figura adaptada do resultado do Arabidopsis eFP Browser.
114
Para a sequência AtAPE2 foi observado um aumento na expressão no
meristema apical (figura 18). Esta expressão foi aumentava como ocorria a transição
do ápice meristemático vegetativo para floral. Além disso, foi observado um aumento
na expressão de AtAPE2 nas flores (na fase de botão), sendo que esse aumento
também foi encontrado no carpelo e pétalas. Entretanto, diferindo de AtARP, a
sequência AtAPE2 exibiu uma diminuição de expressão nas sementes e nas folhas.
Ao contrário do que foi observado em AtAPE1L (figura 17), em estágio senescente,
as folhas exibiram aumenta de expressão de AtAPE2. Outra semelhança com AtARP
seria o aumento de expressão observado em AtAPE2 nas sementes embebidas.
Figura 18 - Mapa do desenvolvimento de expressão da sequência AtAPE2. O mapa foi gerado via Arabidopsis eFP Browser, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo A. thaliana. Figura adaptada do resultado do Arabidopsis eFP Browser.
Afim de fazer comparação quanto os dados de expressão do desenvolvimento
vegetal descritos acima com o grupo da Poaceae, haja vista que a cana-de-açúcar
faz parte do referido grupo, foi efetuado uma busca por sequências homólogas das
115
AP endonuclease de A. thaliana em Oryza sativa e estas foram analisadas utilizando
a ferramenta Rice eFP Brower, no servidor BAR, a qual se baseou no perfil de
expressão via array (expression profiling by array) do desenvolvimento dos tecidos
e órgãos do arroz, tendo em vista a expressão espacial e temporal dos genes (JAIN
et al., 2007; SHARMA et al., 2009).
LOC_Os01g58680.1 seria a sequência homóloga a AtARP em arroz e foi
observado (figura 19) que tal sequência apresentou um aumento de expressão nos
estágios iniciais da inflorescência, quando essa ainda estava se desenvolvendo e
diferenciado. Além disso, LOC_Os01g58680.1 exibiu um aumento de expressão no
meristema apical, contudo uma diminuição foi evidenciada nas sementes e na folha
jovem e madura.
Tendo em conta o trabalho de Maira et al. (2014) a qual foi evidenciado
duplicações da AP endonucleases homólogas a AtARP dentro do grupo das
gramíneas (Poaceae), foi encontrado outra sequência homóloga a AtARP em arroz
que seria LOC_Os01g58690.1. Os dois genes (LOC_Os01g58680.1 e
LOC_Os01g58690.1) se encontram no mesmo cromossomo (cromossomo 1),
próximo um do outro, diferindo no número de exons, LOC_Os01g58680.1 possui 12
enquanto LOC_Os01g58690.1 apresenta 8. LOC_Os01g58690.1 exibiu aumento de
expressão nos estágios finais da inflorescência e diminuição de expressão nos
iniciais, comportando-se de forma inversa a outra sequência de arroz
(LOC_Os01g58680.1). Outra diferença constatada foi o aumento de expressão nas
sementes e nas folhas maduras e jovens por parte da LOC_Os01g58690.1. A
congruência entre essas duas sequências de arroz seria que ambas exibem o
aumento na expressão no meristema apical.
116
Figura 19 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtARP em Oryza sativa (LOC_Os01g58680.1 e LOC_Os01g58690.1). O mapa foi gerado via Rice eFP Brower, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo O. sativa. Figura adaptada do resultado do Rice eFP Brower.
LOC_Os12g18200.1 seria o homólogo de AtAPE1L em arroz. Na figura 20
podemos observar que essa sequência exibiu um aumento de expressão nos
117
estágios inicias da inflorescência. Entretanto, nos estágios finais
LOC_Os12g18200.1 exibiu uma diminuição na expressão. Essa diminuição também
foi verificada nas sementes, sendo que nos estágios S1 e S2 ocorreu um aumento
de expressão enquanto nos estágios S3 e S4 houve uma diminuição. Também foi
evidenciado diminuição na expressão nas folhas jovens e maduras, em contrapartida
foi observado um aumento na expressão no meristema apical.
Figura 20 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE1L em Oryza sativa (LOC_Os12g18200.1). O mapa foi gerado via Rice eFP Brower, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo O. sativa. Figura adaptada do resultado do Rice eFP Brower.
Já para a sequência LOC_Os09g36530.2 (figura 21), homóloga a sequência
AtAPE2, esta exibiu um aumento de expressão nos estágios iniciais da inflorescência
e diminuição nos estágios finais. Entretanto, diferente do que foi notado nas
sementes de LOC_Os12g18200.1 (figura 20), o homólogo AtAPE2 em arroz exibiu
uma diminuição na expressão nas sementes, mostrando um aumento na expressão
no estágio S5. Ademais, o aumento de expressão foi observado nas folhas jovens e
maduras e no meristema apical.
118
Figura 21 - Mapa do desenvolvimento de expressão das sequências homólogas a AtAPE2 em Oryza sativa (LOC_Os09g36530.2). O mapa foi gerado via Rice eFP Brower, cujas as cores são um indicativo da expressão do determinado gene analisado (cor vermelha seria o maior aumento na expressão e azul o menor). O mapa exibe as principais fases de desenvolvimento e estruturas do organismo O. sativa. Figura adaptada do resultado do Rice eFP Brower.
O trabalho de Maíra et al. (2014) mostrou que a sequência ScARP1 seria
expressa nas raízes, folhas e meristema apical. Este padrão de expressão foi
evidenciado também nas análises do padrão de expressão de A. thaliana e O. sativa,
principalmente referente a expressão em folhas e meristema apical. Tal fato pode
ser melhor observado na tabela abaixo a qual resume os dados de expressão mais
relevantes das plantas estudas (A. thaliana, O. sativa e Saccharum spp.)
119
Tabela 7 - Expressão mais relevantes dos genes de AP endonuclease de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Saccharum spp.
Nome
Expressão mais relevante no
desenvolvimento vegetal de Arabidopsis
thaliana
Nome Expressão mais relevante no
desenvolvimento vegetal de Oryza sativa Nome
Expressão mais
relevante no
desenvolvimento
vegetal de
Saccharum spp.
AtARP
Aumento de expressão: Meristema apical
(vegetativo, transição e inflorescência);
Semente (estágios finais de
desenvolvimento); Folha senescente; Fases
iniciais de botão floral; Carpelo, Sementes
secas e embebidas.
Diminuição de expressão: Folha (em
desenvolvimento e maduras); Pétala e
sépalas (flor madura).
LOC_Os01g58680.1
(homólogo a
AtARP)
Aumento de expressão: Inflorescência (estágio
P1 a P5); Meristema apical.
Diminuição de expressão: Folha jovem; Folha
madura e sementes (estágio S2 a S5).
ScARP1
(homólogo a
AtARP)
Aumento de
expressão: folhas e
meristema apical.
LOC_Os01g58690.1
(homólogo a
AtARP)
Aumento de expressão: Inflorescência (estágio
P5); Meristema apical; sementes (estágio S1, S4
e S5); Folha jovem e Folha madura.
Diminuição de expressão: Inflorescência
(estágio P2 e P3).
AtAPE1L
Aumento de expressão: Meristema apical
(vegetativo, transição e inflorescência);
Semente (estágios inicias de
desenvolvimento); Folha início do
desenvolvimento; Fases iniciais de botão
floral; Carpelo e Sementes secas.
Diminuição de expressão: Folha
senescência; Pétala e sépalas (flor madura),
Pedículo e estágios finais do
desenvolvimento das sementes.
LOC_Os12g18200.1
(Homólogo a
AtAPE1L)
Aumento de expressão: Inflorescência (estágio
P1 e P2); Meristema apical; sementes (estágio
S1 e S2); Raiz de muda.
Diminuição de expressão: Inflorescência
(estágio P4 a P6); Sementes (estágio S3 e S4);
Folha jovem e Folha madura.
120
Nome
(continuaç
ão da
tabela -)
Expressão mais relevante no
desenvolvimento vegetal de Arabidopsis
thaliana
Nome Expressão mais relevante no
desenvolvimento vegetal de Oryza sativa
AtAPE2
Aumento de expressão: Meristema apical
(transição e inflorescência); Folha
senescente; Fases iniciais de botão floral;
fases de bulbo floral Carpelo; Pétalas;
Pedículo e Sementes embebidas.
Diminuição de expressão: Folha maduras e
Estágios intermediários de desenvolvimento
da semente.
LOC_Os09g36530.2
(Homólogo a
AtAPE2)
Aumento de expressão: Inflorescência (estágio
P1 e P2); Meristema apical; sementes (estágio
S5); Folha jovem e Folha madura.
Diminuição de expressão: Inflorescência
(estágio P6); Raiz da muda e Sementes (estágio
S1 a S4).
121
Em relação aos estresses abióticos, foi utilizado como base os dados obtidos
em AtGenExpress (KILIAN et al., 2007) apresentados na tabela 8 donde se
preocupou enfatizar os resultados dos diversos experimentos envolvendo estresses
abióticos que exibiram variação na expressão (Up ou Down, aumento ou diminuição,
respectivamente) das sequências AP endonucleases de A. thaliana, tendo em vista
o tempo em que a planta (Arabidopsis thaliana) foi exposta ao agente estressor.
Na tabela 8 pode-se observar que existe uma clara distinção no perfil de
expressão das AP endonuclease de Arabidopsis. O estresse por frio e osmótico
gerou uma diminuição na expressão de AtARP e AtAPE1L (downregulated),
entretanto, AtAPE2 exibiu um aumento na expressão (upregulated). Em
contrapartida, nos estresses genotóxicos e por radiação UV-B, ocorreu o inverso,
AtAPE2 mostrou uma diminuição na expressão enquanto AtARP e AtAPE1L
aumentaram. AtAPE1L demonstrou ter um aumento de expressão no estresse por
seca e por lesão, a qual as outras AP endonucleases apresentaram uma diminuição.
Já no estresse oxidativo, AtARP e AtAPE2 evidenciaram aumentos e diminuições de
expressão com o decorrer do tempo de exposição ao agente indutor do estresse
(metil viologênio). Embora exista divergências no perfil de expressão entre as
enzimas de Arabidopsis, as três exibiram diminuição na expressão no estresse
salino, ao passo que aumentaram a expressão no estresse por calor.
122
Tabela 8 - Dados do projeto AtGenExpress referente a expressão das sequências analisadas de Ap endonuclease de A. thaliana (ARP, APE1L e APE2) em relação aos estresses abióticos.
Estresse abiótico (KILIAN et al., 2007)
Tipo de estresse
Frio 4 °C contínuos
(câmara fria e sob gelo picado).
Osmótico 300 mM de Manitol.
Salino 150 mM de
NaCl.
Seca Exposto ao fluxo de ar por 15 min com perda
de 10% de peso fresco.
Genotóxico 1,5 μg/mL de
Bleomicina com 22 μg/mL mitomicina
C.
Oxidativo 10 μM metil viologênio (paraquat).
UV-B 15 minutos de luz
UV-B.
Lesão Perfurações na
folha.
Calor 3 horas a 38 °C
seguido pela recuperação a 25
°C
AtARP Dowregulated .Downregulated Downregulated Downregulated Upregulated Upregulated
Downregulated* Upregulated Downregulated Upregulated
AtAPE1L Downregulated Downregulated
Downregulated Upregulated Upregulated Downregulated Upregulated Upregulated
Upregulated
AtAPE2 Upregulated
Upregulated
Downregulated
Downregulated
Downregulated
Upregulated
Downregulated * Downregulated Downregulated
Upregulated
*Aumento e diminuição de expressão em determinadas fases do experimento
123
O trabalho de Jain et al (2007) tange aos resultados array em relação ao
perfil de expressão na Oryza sativa durante o estresse salino, por seca e frio
(indicado na tabela abaixo). Com base nesse trabalho, foi efetuado uma busca
por resultados referentes as sequências de arroz, homólogas as AP
endonuclease de A. thaliana (AtARP, AtAPE1L e AtAPE2), a qual foi verifica que
todas as sequências apresentaram uma diminuição na expressão durantes os
estresses abióticos testados.
Tabela 9– Dados de expressão de sequências homólogas a Ap edonculease de A. thaliana em Oryza sativa em relação ao estresse abiótico: por seca, sal e frio.
Homólogos em arroz Estresse abiótico
Seca Salino Frio
AtARP LOC_Os01g58680.1 Downregulated Downregulated -
LOC_Os01g58690.1 Downregulated - Downregulated
AtAPE1L LOC_Os12g18200.1 Downregulated Downregulated -
AtAPE2 LOC_Os09g36530.1 Downregulated Downregulated Downregulated
Maíra et al. (2014) constatou que ScARP1 aumentou sua expressão no
estresse oxidativo. Esse fato foi evidenciado ao analisar a expressão de ScARP1
em plantas de cana-de-açúcar que foram submetidas a uma concentração de 0
e 30 mM de H2O2 por oito horas. Em AtARP (tabela 8), quando exposta 1, 3 e 6
horas ao experimento de indução ao estresse oxidativo, apresentou aumento de
expressão. Por outro lado, AtARP também exibiu diminuição de expressão em
outros momentos do mesmo experimento (tabela 8). Estas diferenças podem
estar associadas as diferenças nas metodologias utilizadas pelos dois grupos de
pesquisa. No caso do perfil de expressão da sequência de Arabidopsis do projeto
AtGenExpress para a análise de estresse oxidativo, foi utilizado a aplicação de
10 μM de Paraquat (1,1'-dimetil-4,4'-bipiridina-dicloreto). Esta substância
apresenta uma atividade redox, consequentemente produz ânions superóxidos
gerando assim os danos oxidativos. Infelizmente a falta de mais dados de perfil
de expressão em gramíneas sobre os estresses abióticos impediu de comparar
os resultados de ScARP1 com outros na literatura.
124
4.6. Ensaios de reação enzimática.
Tendo o pressuposto que a proteína AP endonuclease de cana-de-açúcar
(ScARP1) poderia apresentar atividade enzimática funcional com base nos
resultados obtidos anteriormente. Então, a proteína ScARP1 foi purificada e, a
partir dela, foram realizados alguns ensaios bioquímicos para caracterizar essa
atividade enzimática, buscando por exemplo as condições ótimas de pH,
temperatura, concentração de enzima necessária para desempenhar a atividade
de reparo de DNA e qual poderia ser o substrato preferido. Os resultados obtidos
estão apresentados abaixo.
4.6.1. Eficiência da atividade enzimática e efeito da
temperatura em ScARP1.
A proteína purificada (ScARP1) foi exposta a um substrato de DNA
contendo um sítio abásico artificial que apresenta em sua constituição o
tetrahydrofuran (THF) (figura 22a). Considerando que o sítio abásico natural é
instável e normalmente gera quebras de dupla fita no DNA, não seria o substrato
ideal a ser escolhido para os ensaios, logo, foi preferível a escolha de um sítio
abásico artificial e mais estável o que permitiria ser reconhecido pela a enzima
e, desse modo, comprovar a atividade endonuclease da mesma
(SCHERMERHORN & DELANEY, 2013). Caso a proteína ScARP1 apresente
atividade AP endonuclease, esta seria capaz de clivar o substrato contendo a
lesão e assim formar um produto a ser visualizado no gel de acrilamida com 28
nucleotídeos de tamanho. Este fragmento teria também uma hidroxila livre em
sua extremidade 3´como apresentado no esquema da figura 56a. Em vista disso,
com o intuito de verificar se a proteína ScARP1 possuía atividade AP
endonuclease foram utilizadas diferentes concentrações em nM (nanomolar)
desta proteína em presença do já referido substrato. Como observado na figura
22b, em comparação ao controle positivo – a enzima AP endonuclease humana
(hAPE) (comercial na concentração de 0,1 U) – a proteína ScARP1 apresentou
a função de AP endonuclease, clivando o substrato resultando assim no acúmulo
de um produto com 28 nucleotídeos (figura 22b). Na figura 22c foi apresentado
um gráfico com a quantificação das bandas do gel de acrilamida observadas.
125
Com isso, pode-se evidenciar que na máxima concentração testada (40 nM) de
ScARP1 a porcentagem de atividade AP endonuclease foi, aproximadamente,
de 30 %.
Sabe-se que outro fator que poderia influenciar a conformação proteica,
bem como, a atividade enzimática seria a temperatura. Logo, com o intuito de
avaliar qual seria a temperatura ótima para a proteína ScARP1 foi realizado o
próximo experimento. O ensaio cujo resultado foi apresentado na figura 22d
mostrou como a AP endonuclease de cana-de-açúcar reagiu quando exposta a
diferentes temperaturas (20 a 37 °C). Nesta figura pode-se verificar que a
temperatura de 37 °C seria aonde a enzima ScARP1 exibiu maior atividade
enzimática. Estes dados podem ser observados também na forma de
representação gráfica como mostrado na figura 22e.
126
Figura 22– Resultados da eficiência da atividade enzimática de ScARP1 em relação a variação de concentração e temperatura. (a) representação esquemática do substrato utilizado nos ensaios de atividade endonuclease, trata-se de um DNA duplex em que apresenta tetrahydrofuran (THF) que simula um sítio abásico. Quando este e clivado pela a enzima AP endonuclease dá origem a um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). (b) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com concentrações diferentes da enzima (2, 5, 10, 20 e 40 nM), ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O controle positivo foi a AP endonuclease I humana (na concentração de 0,1 U). O marcador M1 é o substrato com o tamanho de 58 nucleotideos, DNA de fita dupla, já o marcador M2 trata-se de um DNA simples fita contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (c) Média da atividade enzimática de ScARP1 com diferentes concentrações da mesma (2, 5, 10, 20 e 40 nM). (d) Gel de acrilamida (19:1, 12 % com 7M de Ureia) de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com diferentes temperaturas (°C) por 1 hora. O controle positivo foi a hAPE1 na concentração de 0,1 U. O marcador (M) trata-se de uma fita simples de DNA contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (e) Gráfico com as médias da atividade enzimática de ScARP1 em relação a temperatura avaliada. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.
127
4.6.2. Efeito dos íons e concentração de NaCl na atividade de
ScARP1.
Tendo como base que íons podem servir como cofatores enzimáticos
atuando no sítio ativo e assim permitindo que uma proteína tenha uma boa
atividade, nesta etapa do trabalho foi avaliada quais íons que se associam a
proteína ScARP1 e quais deles seriam de grande importância para a sua
atividade enzimática. Para isto foi avaliado os íons bivalentes MgCl2, MnCl2 e o
CoCl2. Esta escolha de íons teve como base o fato da proteína AtARP de A.
thaliana possuir atividade na presença do íon MgCl2. O resultado do ensaio
demonstrou que a preferência da proteína em estudo (ScARP1) foi por MgCl2 e
MnCl2, sendo este último o que apresentou maior atividade enzimática,
principalmente na concentração de 2 mM (figura 23a). Essas observações
podem ser confirmadas ao analisar as bandas exibidas neste gel que foram
quantificadas e expressas em gráfico como apresentadas na figura 23b. Este
gráfico confirma que a porcentagem de maior atividade da enzima ScARP1 foi
em MnCl2, quando esse íon bivalente está entre 1 a 2 mM de concentração,
decaindo nas concentrações de 5 a 10 mM. Contudo, mesmo assim, os
resultados pertinentes ao MnCl2 foram melhores se comparados com os
resultados obtidos para o íon MgCl2.
128
Figura 23 - Resultado do efeito dos distintos íons e da concentração de NaCl sob a atividade de ScARP1. (a) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com diferentes íons (MgCl2, MnCl2, CoCl2) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O controle positivo (linha 1) foi a hAPE1 (0,1 U), o gel apresenta dois controles: C1 – Tampão CB (20 mM Tris HCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM BtMe, 1 mM EDTA e 50 % glicerol) + substrato +íons, C2 – substrato + enzima (ScARP1) sem a presença de íons. (b) Média da atividade enzimática de ScARP1 em relação a diferentes íons (MgCl2, MnCl2, CoCl2), o gráfico apresenta dois controles: C1 – Tampão + substrato +íons, C2 – Tampão + substrato + enzima (ScARP1) sem a presença de íons. (c) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250) ocorrendo a 37°C por 1 hora. O controle positivo foi a hAPE1 (0,1 U) (linha 8). ), o gráfico apresenta um controles: C1 – Tampão + substrato +íons.(d) Média da atividade enzimática de ScARP1 em relação a diferentes concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250).O marcador (M), para todos os géis, trata-se de um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.
A concentração de sal pode também influenciar na estrutura e solubilidade
da proteína em condição aquosa. Portanto, foi então avaliado como a
129
concentração de sal (NaCl) pode interferir na atividade enzimática da proteína
ScARP1 (figura 23). Na figura 23c foi apresentado o resultado obtido. Nesta
figura podemos verificar que com o aumento deste sal houve uma diminuição na
capacidade catalítica da proteína ScARP1. Os resultados podem ser
confirmados quando estes foram plotados na forma de gráfico (figura 23e).
Percebe-se que existe uma correlação entre as duas variáveis, porcentagem de
atividade e a concentração de NaCl, ocorrendo uma diminuição da primeira com
o aumento da segunda, sendo uma relação inversamente proporcional.
4.6.3. Atividade exonuclease, fostatase e 3´-phosphodiesterase de
ScARP1.
A atividade exonuclease caracteriza-se pela clivagem de nucleotídeos,
um de cada vez, a partir da extremidade (exo) de um polinucleotídeo de cadeia.
Nos ensaios anteriores (item 4.6.1 e 4.6.2) foi observado um grau de degradação
de DNA do substrato processado pela a enzima ScARP1 evidenciado por bandas
menores a 28 nucleotídeos. Devido a isso, pode-se levantar uma hipótese que
esta enzima apresenta um certo grau de atividade exonuclease além da
capacidade de endonuclease, deste modo, o ensaio subsequente foi avaliar o
grau desta atividade com a concentração crescente de NaCl (mM). Tendo em
conta que o sal pode influenciar a estrutura e eficiência da ação da proteína (visto
no item 4.6.2). Na figura 24a, não se pode observar os fragmentos que seriam
relacionados com a atividade exonuclease. Este ensaio se utilizou de um
substrato de DNA de fita dupla, sendo uma fita menor (com 28 nucleotídeos) que
apresenta uma extremidade com hidroxila livre (figura 24a). Quando a proteína
de cana-de-açúcar foi adicionada a reação nota-se, comparado com o marcador
a qual seria uma fita simples de 28 nucleotídeos com a hidroxila livre (o que
indicaria um DNA não degradado, tal como a fita menor que compõe o próprio
substrato), que não houve processamento e logo não ocorrendo a atividade
exonuclease, de modo que o resultado esperado seria bandas abaixo as
observadas do marcador, indicando fragmentos menores e, assim, degradação
do substrato.
130
As enzimas podem apresentar mais de uma atividade enzimática como já
exposto na tabela 5 referente as AP endonuclease de Arabidopsis, em especial
a própria AtARP a qual ScARP1 é homóloga. Dessa maneira, também foi
avaliado a potencialidade da proteína ScARP1 de exibir a capacidade de agir
como uma fosfatase. Para esse fim, a enzima alvo do estudo foi apresentada
substratos que possuem fosfato em suas extremidades, sendo estes divididos
em duplex (com duas fitas de DNA dispostas para formar uma fita dupla - -P) e
tríplex (com três fitas de DNA dispostas para formar uma fita dupla com um gap
(lacuna) – P-P) como apresentado nas figuras 24b e 24c. O resultado do ensaio
foi observado nas figuras citadas anteriormente, na qual evidencia-se, sempre
comparando com o marcador (constituído de DNA de fita simples de 28
nucleotídeos com a extremidade dispondo de fosfato livre) e com as reações que
não foram adicionadas enzimas (linha 6 e linha 12 da figura 24b), que a enzima
ScARP1 não possui atividade fosfatase pois o esperado era ter bandas abaixo
do marcador “M” indicando assim o processamento do substrato.
Outro ensaio foi realizado com o objetivo de também verificar a atividade
fosfatase, só que testando com outras variáveis, como os cofatores enzimáticos,
principalmente o MgCl2, tendo em vista que esse íon, em outros trabalhos como
de Joldybayeva et al (2014), estava relacionado em estimular a atividade
fosfatase. Ademais, se utilizou de uma fosfatase como controle positivo, além
dos marcadores constituídos de DNA de fita simples de 28 nucleotídeos com a
extremidade dispondo de fosfato livre e outra fita com a mesma quantidade de
nucleotídeos com uma hidroxila livre, analisando, assim, se houve ou não
atividade catalítica que converteria o fosfato em hidroxila. Desta forma, foi
possível comprovar com maior precisão os resultados obtidos. Na figura 24c,
verifica-se que ScARP1 não apresenta realmente a atividade fosfatase, pois não
reproduz o produto com a hidroxila, previsto na linha 7 quando se utilizou uma
fosfatase para processar o substrato (controle positivo) em que é perceptível a
existência de duas bandas, uma correspondendo a fragmento nucleotídeo com
hidroxila e outro com o fosfato.
131
Figura 24 - Resultado dos ensaios de atividade exonuclease, fostatase e 3´-phosphodiesterase de ScARP1. (a) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade exonuclease da enzima ScARP1 com concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O marcador (M) trata-se de um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). (b) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade fosfatase da enzima ScARP1 com diferentes substratos Triplex (P-P) e Duplex (-P), ambos contendo fosfatos livres, sendo o ensaio ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O marcador (M) é um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com um fosfato livre (-F). (c) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade fosfatase da enzima ScARP1 com diferentes íons MnCL2 (concentração de 0,02 mM) e MgCl2 (na concentração de 0,001 mM –linha1-, 0,0025mM –linha 2-, 0,005mM –linha 3-, 0,01 mM –linha 4-, 0,02 mM –linha 5-) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. Vale salientar a linha 8 em que representa o tampão, ou seja, reação sem a adição da ScARP1. Os marcadores são: M1 = DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH), M2 = DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com um fosfato livre (-F). (d) gel de acrilamida de ensaio envolvendo a capacidade de processamento do substrato PUA (phosphor-α,β-unsaturated aldehyde - aldeído β,α-insaturado) pela a enzima ScARP1 com diferentes íons MnCL2 (concentração de 0,02 mM) e MgCl2 (na concentração de 0,02 mM), sendo o ensaio ocorrendo a 37 °C por 1 hora. Também foi avaliado diferentes pH, a linha 7 apresenta pH 5, enquanto o restante se enquadra no pH 8. Outra variável que faz parte do experimento foi a concentração de sal (NaCl) em concentração, na linha 2: 100 mM, linha 3: 50mM e na linha 5: 100 mM. Os marcadores são: PUA – substrato utilizado no ensaio, M1 = DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, M2 =DNA fita simples contendo 29 nucleotídeos, M3 - DNA fita simples contendo 51 nucleotídeos. Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. Os substratos utilizados nos ensaios apresentam marcação da fluorescência Alexa Fluor 635 (FL*). Todos os géis foram revelados a 635 nm, 550V, canal Cy5, exceto o ensaio 3´-phosphodiesterase cujo gel foi revelado a 473 nm, 750V, canal LPB.
132
A via de excisão de bases (BER) origina, ao longo de suas diversas
etapas, extremidades não-convencionais na fita de DNA a qual bloqueiam a
atividade da polimerase, de modo que não se pode preencher a lacuna com
nucleotídeos, por conseguinte, se essas extremidades não-convencionais não
forem processadas e retiradas, perpetua-se um sitio altamente mutagênico no
material genético, além disso, o reparo não poderá ser efetivado. “PUA”
(phosphor-α,β-unsaturated aldehyde - aldeído β,α-insaturado) trata-se de uma
destas extremidades não-convencionais geradas durante o reparo. Assim sendo,
com o intuito de avaliar se ScARP1 tem a capacidade de processar tal substrato
foi realizado um ensaio utilizando um substrato composto de um DNA de fita
dupla (duplex), cuja uma das fitas exibe em sua extremidade 3´ - PUA (figura
24d). O resultado do ensaio, como mostrado na figura 24d, teve como foco tanto
avaliar se os íons (MgCl2 e MnCl2) como a concentração de sal, poderiam
influenciar nesta suposta atividade. O controle positivo utilizado foi a
endonuclease IV que apresenta essa capacidade de processar a PUA, em vista
disso, pelo que se comprova no resultado, observa-se que ScARP1 não possui
esse tipo de atividade (figura 24d).
4.6.4. Ensaio de complementação de atividade AP endonuclease
em extratos de A. thaliana.
Com os ensaios anteriores foi comprovado que a enzima ScARP1 tem
atividade endonuclease, sabendo que esta proteína é homóloga a AtARP de A.
thaliana, foi levantado a questão se ScARP1 seria capaz de complementar a
atividade endonuclease de um extrato proteico oriundo de plantas mutantes que
não expressam a proteína AtARP (plantas arp -/-). Portanto, foi feito o ensaio em
que se adicionou concentração de 40 e 80 nM de ScARP1 nesses extratos. O
resultado obtido está apresentado na figura 25a, a qual observa-se que na
concentração de 40 nM (linha 4) e 80 nM (linha 5) existe evidência da ação da
enzima, porém se comparado ao extrato selvagem (WT) na linha 2 constata-se
que todo o substrato foi processado, enquanto que ScARP1 não conseguiu
realizar este processamento por completo. Consequentemente se deduziu que
a complementação foi parcial. Essas observações também estão de acordo com
os dados na quantificação feita via Multi Gauge V3, exibidos no gráfico (figura
133
25b), a qual ratifica-se a porcentagem de atividade endonuclease nos extratos,
enfatizando que ScARP1 não processa todo o substrato e sua atividade é
contabilizada em, no máximo, 40%.
Figura 25 - Resultado do ensaio de complementação de atividade Ap endonuclease em extratos vegetais de A. thaliana. (a) Gel de acrilamida do ensaio de complementação enzimática de ScARP1, ocorrido a 37 °C por 3 horas. O arp-/- extract – extrato proteico de A. thalina mutante sem a enzima ARP, WT extract – extrato proteico de A. thaliana selvagem. O marcador (M) trata-se de uma DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (b) Gráfico com a média da atividade enzimática da ARP (no caso do extrato selvagem –WT–) e ScARP1 adicionado nos extratos das plantas mutantes arp. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.
134
5. DISCUSSÃO
5.1. Identificação e análise das sequências da via BER em cana-
de-açúcar.
A recente introdução de tecnologias de sequenciamento de nova-geração
desencadeou uma explosão de projetos de genoma de sequenciamento. No
caso das plantas, tendo como base os dados expostos pelo instituto Joint
Genoma (JGI - Joint Genome Institute), do seu programa com plantas:
Phytozome, existe, até o momento, 64 genomas vegetais liberados para estudo
(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!releaseNotes). Já em relação a
cana-de-açúcar, foco desse trabalho, sabe-se que o seu genoma haploide exibe
um tamanho relativamente pequeno (~ 1 Gpb). No entanto, os cultivares
modernas de cana-de-açúcar são poliploides derivados de hibridização
interespecífica entre S. officinarum L. e S. spontaneum L. (ROACH, 1969) o que
acarretou a constituição de 130 cromossomos distribuídos entre 12 grupos
homólogos, aproximadamente, (D'HONT 2005; GRIVET & ARRUDA 2002)
gerando como resultado um genoma de 10 Gpb (LE CUNFF et al., 2008). A
poliploidia, todavia, trata-se de um mecanismo importante para a evolução e
diversificação tanto para plantas como para animais, sendo associado ao
surgimento de novidades evolutivas, conferindo vantagens adaptativas e até
mesmo a formação de novas espécies (DUFRESNE et al., 2014; SATTLER et
al., 2016). Contudo a sua existência dificulta o sequenciamento, montagem e
anotação do genoma devido aos altos níveis de polimorfismo nos cromossomos
e a grande proporção de sequências repetitivas (SOUZA et al., 2011; YANG et
al., 2011a). Ademais, a cana-de-açúcar não apresenta progenitores diploides
para permitir uma montagem de genoma mais rápida e fácil (GARCIA et al.,
2013) da mesma forma que a batata (POTATO GENOME SEQUENCING
CONSORTIUM, 2011), algodão (LI et al., 2014) e banana (D'HONT et al., 2012).
Existe um consórcio mundial, envolvendo vários centros de pesquisa para
o sequenciamento e estudo do genoma da cana-de-açúcar, no Brasil, o principal
projeto seria o BIOEN-FAPESP, que se utiliza de duas abordagens principais:
uma usando uma coleção de BACs enriquecida com regiões gênicas e outra
135
seria sequenciamento Shotgun. Recentemente, uma coleção de 317 sequências
de BAC foi disponibilizada ao público (DE SETTA et al., 2014). Além disso, uma
tentativa adicional de sequenciar as regiões enriquecidas com genes que
exploram a filtração por metil (regiões metiladas) também disponibilizou dados
do genoma, embora com um alto nível de fragmentação que limita sua
aplicabilidade em estudos genômicos funcionais (GRATIVOL et al., 2014). Com
esse cenário, não há uma data prevista para a liberação de uma sequência
completa ou quase completa de genoma de cana-de-açúcar, forçando aos
pesquisadores a se utilizar de outras abordagens, como o uso de sequências
ESTs (expressed sequence tag -marcador de sequência genética) em suas
pesquisas.
As vias de reparo de DNA, incluindo a via de excisão de bases (BER),
apresenta uma alta conservação de suas proteínas entre os organismos, já
discutido por Aravind et al. (1999), a qual fez uma análise detalhada dos
domínios proteicos envolvidos no reparo de DNA, comparando as sequências
das proteínas de reparo de dois organismos modelo bem estudados, a bactéria
(Escherichia coli) e levedura (Saccharomyces cerevisiae), a todos os conjuntos
de sequências de proteínas codificadas em genomas completamente
sequenciados de bactérias, Archaea e eucariontes. Já Yoshiyama et al. (2013),
demonstraram que muitos fatores envolvidos na resposta ao dano do DNA (DDR
- DNA damage response) de animais estariam presentes no genoma de plantas,
chegando a essa conclusão se baseando na homologia das sequências. Do
mesmo modo, a busca empregada nesse trabalho por sequências homólogas a
componentes de BER em cana-de-açúcar se utilizando do banco de dados ESTs
levando-se em consideração a conservação dos domínios e sequências de
proteínas de reparo entre os organismos vivos.
A seguir será discorrido sobre as proteínas da via BER identificadas nesse
trabalho:
5.1.1. OGG1.
Uma das principais lesões mutagênicas no DNA causada pela exposição
das espécies reativas de oxigênio é a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG)
tratando-se da oxidação de uma guanina, sendo uma das lesões mais
136
abundantes (KASAI & NISHIMURA, 1993) e tendo comprovação de ser
altamente mutagênico in vitro e in vivo (MICHAELS et al., 1992; GROLLMAN &
MORIYA, 1993). O fato de ser mutagênico se deve a habilidade de 8-oxoG de
parear não só com a citosina como também com a adenina, possibilitando a
ocorrência de transversão de GC para TA (WOOD et al., 1990; SHIBUTANI et
al., 1991). Essa lesão (8-oxoG) é reparada via BER (via de excisão de bases),
sendo iniciada por uma DNA glicosilase capaz de identificar a lesão e a excisar
do DNA. A DNA glicosilase que age sobre 8-oxoG pode ser de duas diferentes
famílias estruturais, cujos o arquetípico dos membros seria a FPG (também
denominada de MUTM) da Escherichia coli e a OGG1 de levedura (BROOKS et
al., 2013).
Foi identificado, neste trabalho, uma OGG1 em cana-de-açúcar,
denominada de OGG1_CANA. Pode-se observar (item 4.1.1), que
OGG1_CANA, como também outras sequências pertencentes a família das
Poaceae e a representante dicotiledônea (Arabidopsis thaliana), exibem o
domínio conservado da superfamília OGG1, sendo que uma diferença
vislumbrada entre A. thaliana e as sequências das gramíneas é que essas teriam
um comprimento maior. Também foi observado a conservação em OGG1_CANA
dos resíduos de glutamina e fenilalanina que seriam responsáveis pelo
reconhecimento da base lesionada (GARCÍA-ORTIZ et al, 2001). Além disso,
com ensaios de mutagênese sítio dirigida em OGG1 humana foi verificado que
os resíduos lisina e ácido aspártico teriam papel essencial para a catalise
adequada da DNA glicosilase (NASH et al., 1997; BJØRÅS et al., 2002). A
conservação do domínios e resíduos importantes seria um indicativo do provável
papel funcional da OGG1_CANA.
5.1.2. NTH1 e NTH2.
As espécies reativas de oxigênio também oxidavam as pirimidinas do
DNA, sendo que esse dano é reparado pela Endonuclase III, cujo protótipo seria
a Endonuclease III de E. coli. Em A. thalina foi identificado um homologo para
essa proteína, denominado de AtNTH1 (Arabidopsis thaliana endonuclease
three homologue 1), a qual foi caracterizado e comprovado sua atividade
enzimática diante diversos substratos, pirimidinas danificadas por estresse
137
oxidativos, levando-se a conclusão que teria papel essencial na defesa da planta
contra esse estresse (ROLDÁN-ARJONA et al., 2000). Existe um segundo
homólogo de Endonuclease III em Arabidopsis, denominado de AtNTH2
(Arabidopsis thaliana endonuclease three homologue 2) a qual foi encontrado
junto com AtNTH1 e AtARP no núcleo do cloroplasto de Arabidopsis,
demonstrando a ocorrência da via BER nessa organela (GUTMAN & NIYOGI,
2009).
Em relação as gramíneas, não foi identificado uma sequência que seria
referente a NTH2. Conforme observando na árvore filogenética e a árvore
consenso da inferência bayesiana, tais diagramas de relações evolutivas
exibiram duplicações de sequências para organismos pertencentes ao grupo das
dicotiledôneas, porém não para as monocotiledôneas.
A NTH1_CANA, conforme exposto no item 4.1.2, pertence a superfamília
HHH (Helix-hairpin-Helix) sendo esse domínio conservado estando presente em
proteínas que fazem parte da via de excisão de bases (BER) (CHOI, 2002).
Ademais, vale ressaltar que a Endonuclease III de E. coli já foi super-expressa e
purificada (ASAHARA et al., 1989), além de cristalizada e sua estrutura analisada
(KUO et al., 1992a, b; THAYER et al., 1995), o que levou a conclusão que essa
endonuclease III possui o domínio Helix-Hairpin-Helix (HHH) além dos sítios de
ligação ferro-enxofre [4Fe-4S]. Esses referidos sítios seriam quatro cisteínas
conservadas que atuariam na química redox e na ligação com o DNA (THAYER
et al., 1995), ambos, motivo e sítios, estão conservados na presumível sequência
de cana-de-açúcar. Também vale frisar a conservação do ácido aspártic no sítio
ativo, sendo esse um resíduo preservado em outras DNA glicosilases além de
NTH1, como UNG e MBD4L (CHOI, 2002). A conservação observada indicaria
que NTH1_CANA poderia exercer um papel funcional na cana-de-Açúcar no
reparo de pirimidinas danificadas.
5.1.3. UNG.
A presença de Uracila no DNA pode ser pelo erro de incorporação de dUMP
(desoxiuridina monofosfato) ou pela deaminação hidrolítica da citosina. Essa
lesão relativamente comum no genoma é ativamente removida por BER, sendo
iniciada por uma uracila DNA glicosilase (UDG ou UNG).
138
Os UDGs são distribuídos em uma superfamília de proteínas composta por
cinco famílias (FRIEDBERG et al., 2006, CHUNG et al., 2003). A primeira UDG
identificada foi a enzima Ung de Escherichia coli (LINDAHL, 1974), que tipifica a
Família-1 das UDGs. Essa família altamente conservada engloba a maioria das
UNG das espécies até o momento analisadas, com algumas exceções como
Drosophila melanogaster e Archaea (ARAVIND & KOONIN, 2000). Enzimas da
família-1, reconhecem a uracila em uma conformação extra-helicoidal e atuam
tanto contra fitas duplas de DNA (dsDNA) quanto para fitas simples (ssDNA). A
sequência de UDG_CANA exibiu, tal como as outras sequências analisadas e
utilizadas para a comparação, o domínio conservado pertencente a superfamília
UDG, mais precisamente concernente a família-1, conforme já descrito
anterirmente. Além disso, apresenta a conservação do ácido aspártico como sítio
ativo.
Sabe-se que o gene UNG de humano codifica duas formas da proteína,
uma que é direcionada para a mitocôndria (UNG1) e outra para o núcleo (UNG2),
a UNG de Arabidopsis (AtUNG) parece ser homóloga a esses dois tipos de UNG,
sendo comprovado que AtUNG atua no DNA mitocondrial (BOESCH et al.,
2009). As sequências analisadas que compõe as árvores, em sua maioria,
apresentam anotações de previsão computacional que direcionada as UNGs
tanto para o núcleo quanto para a mitocôndria, levantando a questão se de fato
haveria apenas uma UNG para ambas organelas em plantas. Isso indica a
necessidade de mais pesquisas tendo com esse foco o direcionamento
subcelular.
5.1.4. DME, DMLE e ROS1.
A metilação do carbono 5 da citosina (5-meC) trata-se de uma modificação
epigenética que guia a formação de uma cromatina transcricionalmente
silenciada, além de permitir a transmissão de padrões específicos de atividade
de genes nas divisões celulares (BENDER, 2004, BIRD, 2002). Em eucariontes,
a metilação de DNA foi detectada nos protistas, fungos, plantas e animais
(COLOT & ROSSIGNOL, 1999) e exerce um papel importante no
desenvolvimento (HOLLIDAY & PUGH, 1975; RIGGS, 1975; ELHAMAMSY,
2016) e na defesa do genoma contra elementos genéticos moveis (YODER et
139
al., 1997). O nível de resíduos de 5-meC no genoma depende dos processos de
metilação e desmetilação do DNA (ELHAMAMSY, 2016). Evidências genéticas
e bioquímicas indicam que as plantas contêm várias DNA glicosilases/AP-liases
bifuncionais que provocam a excisão de 5-meC quando presentes no DNA
duplex e iniciam sua substituição por uma citosina regular se utilizando da via
BER (HE et al., 2011). Em Arabidopsis thaliana, uma família DNA glicosilases
que tem como alvo 5-meC é formado por ROS1 (REPRESSOR OF SILENCING
1), DME (DEMETER), DML2 (DEMETER-LIKE 2) e DML3 (DEMETER- LIKE 3),
todas essas proteínas estão envolvidas na regulação do imprinting e do
silenciamento gênico (HE et al., 2011).
ROS1 e DME são preditos codificarem proteínas grandes contendo
domínios pertencentes a DNA glicosilase com similaridade de sequência
significante com proteínas envolvidas em BER da superfamília HHH-GPD
(nomeadas por sua característica helix-hairpin-helix e loop rico em prolina e
glicina seguida por um aspartato conservado) (NASH et al., 1996). A superfamília
HHH-GPD de DNA glicosilases é disseminada nos três domínios da vida
(Bactéria, Archeae e Eucariontes) e seus membros, tipicamente, são compostos
por proteínas de 200 a 400 aminoácidos de comprimento (DENVER et al., 2003).
Contudo, claramente, ROS1 e DME são proteínas longas (1100-2000
aminoácidos) se comparada com DNA glicosilases usuais. Além disso, tais
proteínas são únicas para plantas, como pode ser evidenciado nas árvores
filogenéticas e a árvore resultante da inferência bayesiana, a qual percebe-se
que não têm representantes do reino Metazoa e Fungi. Ademais, existem
sequências presumíveis de DME e ROS1, presente nas briófitas e algas verdes
unicelulares, isso sugere que a desmetilação por meio da excisão de 5-meC
deve ter aparecido cedo durante a evolução das plantas (GROSJEAN, 2009).
DML2 e DML3 também são DNA glicosilases com alvo 5-meC (ORTEGA-
GALISTEO et al., 2008; PENTERMAN et al., 2007). Entretanto, DML2 apresenta
uma atividade fraca, pelo menos nas análises in vitro, enquanto DML3 possuem
atividade e substratos específicos em comum a DME e ROS1 (ORTEGA-
GALISTEO et al., 2008; PENTERMAN et al., 2007).
As sequências encontradas nas gramíneas, com a exceção de K7U9K6,
proteína de milho, não apresentam anotações que os especificaria como DME,
140
ROS1 tão pouco DML3, mas compartilham os principais domínios que
caracterizam esses tipos DNA glicosilases, tais como: o domínio HHH (já
discutido acima, pertencente a superfamília HHH-GPD), além do cluster (4Fe-
4S)+2 formado pelas quatro cisteínas conservadas. Os clusters Fe-S são muito
versáteis; suas funções podem ser amplamente agrupadas em portadores de
elétrons, catalisadores enzimáticos e reguladores gênicos, além desse cluster
ser requerido para ativar a desmetilação de DNA (BUZAS, 2016). Contudo, a
sequência identificada no banco de dados ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST-
FUN), não exibiu nenhum domínio ou sítios que o caracterize como uma DNA
glicosilase e logo não se pode concluir que a cana-de-açúcar possua tais
proteínas. Devido à importância dessas DNA glicosilases para o processo
epigenético, além que, conforme mostrado nas árvores, existe a presença
dessas enzimas em organismos próximos evolutivamente da cana-de-açúcar,
como o S. bicolor e S. italica, não se pode descartar a possibilidade da existência
das mesmas no genoma de Saccharum spp.
5.1.5. MBD4L.
A proteína MBD4 de mamíferos é uma glicosilase monofuncional que
excisa T (timina) e U (uracila) pareados com G (guanina), mas tendo preferência
por derivados U halogenados, como 5-hidroximetiluracil (5-hmU), essa
característica também é relatada para TDG (Timina DNA glicosilase da
superfamília UDG) (SJOLUND et al., 2013). Essa enzima (MBD4), devido a sua
função como DNA glicosilase, afeta o reparo do DNA, a progressão do tumor, a
apoptose e a expressão gênica. Além disso, o MBD4 liga-se e reprime os
promotores de genes hipermetilados, influenciado a sua transcrição (KONDO et
al., 2005). Por outro lado, MBD4 e TDG de mamíferos, bem como a DME
(glicosilases exclusivas de plantas) estão envolvidos na desmetilação ativa do
DNA associada à via BER. Enquanto DME, DML2, DML3 e ROS1 removem 5-
metilcitosina (5-meC), permitindo a sua substituição por citosina (C) (AGIUS et
al., 2006; ORTEGA-GALISTEO et al., 2008), MBD4 e TDG não eliminam
eficientemente 5-meC, requerendo um processo de múltiplos passos.
Ramiro-Merina et al. (2013) demostraram que Arabidopsis codifica uma
DNA glicosilase monofuncional homóloga a MBD4 de mamífero que foi assim
141
denominada de MBD4-like ou AtMBD4L (At = Arabidopsis thaliana). Nota et al.
(2015) indicaram que a ativação de AtMBD4L induziria a expressão de um gene
tardio da via BER AtLIG1 e como isso aumentaria a tolerância da planta ao
estresse oxidativo.
Comparando as sequências de gramíneas percebe-se que, diferindo da
sequência de Arabidopsis, exibem o domínio conservado referente a
superfamília Endonuclease III. As sequências da família Poaceae também
mostraram, em sua maioria, serem maiores em comprimento em relação a
AtMBD4L, exceção disso a sequência presumível de cana-de-açúcar. Essa
sequência, embora apresente conservados os domínios, sítios importantes,
como o sítio ativo e os resíduos envolvidos na especificidade com a guanina,
exibe tamanho abaixo do previsto o que leva a conclusão de não representar
uma proteína completa.
A diferença entre as sequências de MBD4L vegetais, principalmente
referente as sequências de dicotiledôneas e monocotiledôneas, foi tão grande
que foi gerado duas árvores filogenéticas com dois grupos distintos: um tendo
como foco dicotiledôneas e outra o grupo composto pelas gramíneas. Tais
resultados levantam questão sobre como essas diferenças afetariam a
funcionalidade da MBD4L nesses diferentes organismos vegetias e expõe a
necessidade de mais estudos em relação a essa enzima, especificamente.
5.1.6. FEN1A e FEN1B.
FEN1 é uma nuclease específica da estrutura (TSUTAKAWA et al., 2011)
que podem remover abas (flap) que são estruturas de ácido nucléico criadas pela
primase e DNA polimerase durante o processo de maturação do fragmento de
Okazaki (fita atrasada) (BALAKRISHNAN & BAMBARA, 2013). A FEN1 interage
com mais de 30 proteínas envolvidas em diferentes vias metabólicas do DNA,
incluindo a replicação do DNA, reparo do DNA, degradação do DNA apoptótico
e a manutenção da estabilidade dos telômeros (ZHENG et al., 2010).
Em relação as plantas, sabe-se que dois homólogos de FEN1 foram
identificados em arroz (Oryza sativa, OsFEN1a, OsFEN1b). Testes de
complementação funcional revelaram que apenas OsFEN1a seria capaz
142
complementar o mutante fen1/rad27 em levedura, sugerindo que os dois genes
podem ser funcionalmente distintos (KIMURA et al., 2003). Além disso,
OsFEN1a, expresso em Escherichia coli, possui atividade de nuclease flap
endonuclase e 5´- exonuclease (KIMURA et al., 2000). Em Arabidopsis thaliana,
um homólogo de FEN1 foi identificado por meio de uma pesquisa de homologia
(KIMURA et al., 2000). A caracterização bioquímica da proteína SAV6 (também
denominado de FEN1) revelou que, ao contrário do FEN1 animal, a proteína
SAV6 apresenta atividade Flap-endonuclease e gap (lacuna) endonuclease, mas
não possui atividade 5´-exonuclease. No entanto, como a FEN1 humana
(hFEN1), a SAV6 também é necessária para a manutenção da integridade do
genoma e resposta a danos no DNA de plantas (ZHANG et al., 2016a).
Tendo em vista a estrutura da Flap endonuclease, sabe que a FEN1
humana é composta pelo domínio N-terminal e o intermediário (Domínio I) além
de uma região C-terminal a qual é importante para interação de FEN1 com outras
proteínas, tais como PCNA e WRN (ZHENG et al., 2005; BROSH et al., 2001;
BROSH et al., 2002; KARANJA & LIVINGSTON, 2009). A sequência presumível
de FEN1 preserva os domínios descritos, porém, as FEN1B, tanto de cana-de-
açúcar como de outras sequências de gramíneas analisadas, não apresentam o
motivo de ligação ao PCNA na sua porção C-terminal, o que deve afetar o seu
mecanismo de ação na célula vegetal.
A existência desses dois subtipos de FEN1 está além do que se tem
anotado nos bancos de dados, como pode ser observado nas árvores
filogenéticas a qual duplicações de FEN1 com evidentes diferenças estruturais
(tamanho e presença/ausência do motivo de interação com PCNA) estão
distribuídas entre os representantes de dicotiledôneas e monocotiledôneas. Isso
monstra como é imprescindível maiores pesquisas concernente a FEN1A e
FEN1B, para melhor entender as funções e mecanismos a qual esses dois tipos
de Flap Endonucleases 1 exercem no metabolismo do DNA dos organismos
vegetais.
5.1.7. POLLambda.
As DNA polimerases da Família X estão envolvidas principalmente nas
vias de reparo e recombinação de DNA (RAMADAN et al., 2004; ROY et al.,
143
2011). A DNA polimerase λ de mamífero (Pol λ), um membro da família X
recentemente identificado, estaria difundida entre eucariontes superiores, tanto
em animais como em plantas. O DNA Pol λ humana é uma DNA polimerase que
compartilha um alto grau de homologia de sequência com o DNA Pol β de
mamífero (34% de identidade de aminoácido com Pol β humano). DNA Pol β tem
sido o membro mais extensivamente estudado desta família e foi demonstrado
que desempenha um papel essencial na etapa de síntese de DNA, no
preenchimento das lacunas (gaps) na via BER, mais precisamente na via curta
de BER (SINGHAL et al. 1995). Estudos com extratos de fibroblastos
embrionários de camundongos indicaram que a DNA Pol λ de mamíferos possui
a atividade da dRP liase (5´-desoxirribose fosfato liase) in vitro, sugerindo que
tal polimerase poderia ter função na via BER tal como a Pol β (GARCÍA-DÍAZ et
al., 2001).
Estudos demonstraram a existência de um homólogo de DNA Pol λ de
mamífero em arroz (UCHIYAMA et al., 2004) e Arabidopsis (GARCÍA-DÍAZ et
al., 2000). Aliás, análises genômicas em arroz e Arabidopsis sugeriram que o
DNA Pol λ poderia ser o único membro da família X em plantas superiores, já
que nenhuma sequência Pol-β foi identificada em genomas de plantas até o
momento. Portanto, em vegetais, o DNA Pol λ parece substituir a função de Pol
β para desempenhar um papel fundamental no reparo e recombinação de danos
no DNA nuclear.
Em relação a DNA polimerase λ, pode-se observar que as sequências
de plantas referentes a essa enzima possuem o domínio conservado da
superfamília da Polimerase Beta (β), contudo as sequências de gramíneas
exibiram uma diferença relacionada a presença de um domínio BRCT que não
foi previsto para a polimerases de Arabidopsis. Essas diferenças podem culminar
em discrepâncias nos mecanismos catalíticos dessas polimerases, contudo,
mais estudos voltados para caracterização bioquímica seriam necessários para
tecer inferências com maior certeza sobre a implicações dessas diferenças
estruturais.
144
5.1.8. TDP1.
A TDP1 (tirosil-DNA fosfodiesterase 1) é uma enzima especializada em
hidrolisar a ligação fosfodiéster entre um resíduo de tirosina e o 3´-fosfato do
DNA no complexo DNA-TOP1 (topoisomerase I) (YANG et al., 1996). O TDP1
foi identificado pela primeira vez em Saccharomyces cerevisiae (POULIOT et al.,
1999).
A proteína TDP1 pertence à superfamília de PLD (fosfolipase D), que
compreende proteínas que são onipresentes em bactérias, leveduras, plantas e
mamíferos (PONTING & KERR, 1996). Uma estrutura universal na superfamília
PLD é um motivo HKD catalítico repetido [HXK (X) 4D (X) 6 GSXN], que surgiu
como resultado de um evento de duplicação gênica (POULIOT et al., 1999;
INTERTHAL et al., 2001). Esses motivos de HKD têm resíduos altamente
conservados de histidina (H) e lisina (K) (INTERTHAL et al., 2001; DAVIES et
al., 2003; DAVIES et al., 2002; INTERTHAL et al., 2005; DAVIES et al., 2002b),
algo que é observado nas sequências presumíveis de TDP1 analisadas.
AtTDP é um ortólogo de TDP1 humano em Arabidopsis (LEE et al., 2010)
e ao contrário das proteínas TDP1 de levedura e humanas, essa enzima consiste
em dois domínios: um domínio SMAD / FHA (associado a forkhead) na região N-
terminal e um domínio TDP na região C-terminal. Percebe-se que sequência de
Setaria italica, Oryza sativa e a presumível sequência de TDP1 de cana-de-
açúcar exibiram o domínio FHA (Forkhead associated domain) na sua região N-
terminal. Tal fato indica a preservação da estrutura das sequências e possível
atividade catalítica funcional das mesmas.
5.1.9. DNA ligase 1 e DNA ligase 4.
As DNA ligases desempenham papéis essenciais em todos os
organismos, mantendo a estrutura física do DNA. Essas enzimas selam as
lacunas no esqueleto de açúcar-fosfato do DNA (uma reação dependente de
ATP) que surgem durante a replicação, danos e reparo do mesmo (WU et al.,
2001). Exemplo da importância dessas enzimas seria a DNA ligase 1 (LIG1) que
é um gene essencial com fenótipos knockout letais em leveduras, células de
145
mamíferos e Arabidopsis (JOHNSTON, 1979; PETRINI et al., 1995;
WATERWORTH et al., 2009).
O genoma de Arabidopsis codifica quatro DNA ligases: AtLIG1, AtLIG1a,
AtLIG4 e AtLIG6 (SUNDERLAND et al., 2006). A AtLIG1 realiza a reação de
ligação na replicação e no reparo por excisão de bases do DNA, enquanto o
AtLIG4 é responsável pela ligação do DNA na via de união de extremidade não-
homóloga (Non-homologous end joining - NHEJ) na resposta ao dano ao DNA
(TAYLOR et al., 1998; WATERWORTH et al., 2009; CÓRDOBA-CAÑERO et al.,
2011; WEST et al., 2000; VAN ATTIKUM et al., 2003). Não há papéis relatados
para AtLIG1a e AtLIG6 (LI et al., 2015b). AtLIG6 foi clonado a partir de arroz e
Arabidopsis (IKEDA et al., 2011; KINOSHITA et al., 2004), embora a função em
planta desta DNA ligase continua a ser indeterminada. Análises de transcriptoma
revelaram que o AtLIG1a provavelmente não é expresso, indicando que o AtLIG1
pode ser a única fonte de atividade da DNA ligase I em Arabidopsis (CÓRDOBA-
CAÑERO et al., 2011).
Além do que, A DNA LIGASE I de Arabidopsis (AtLIG1) é co-localizada
com ROS1, ZDP e APE1L in vivo (LI et al., 2015b). Ademais, LI et al. (2015b)
discutem que o AtLIG1 é essencial para a desmetilação e ativação dos genes
maternamente impressos FWA e MEA no endosperma, sendo que seus dados
sugerem que AtLIG1 é a principal DNA ligase que funciona na última etapa da
desmetilação ativa do DNA em Arabidopsis.
A DNA ligase 1 de Arabidopsis e das gramíneas estudadas demonstraram
preservação do domínio das DNA ligases dependentes de ATP
(DNA_LIGASE_A3, destacado em verde na figura) e dos sítios essenciais para
a funcionalidade adequada da enzima. A árvore filogenética para essa DNA
ligase exibiu duplicações dentro do grupo constituído pelas dicotiledôneas sendo
um reflexo da existência dos dois tipos previstos de DNA ligase 1 já
documentado em Arabidopsis: AtLIG1, AtLIG1a.
Em relação DNA ligase 4, percebe-se diferenças entre as sequências das
gramíneas com relação a Arabidopsis, pela presença de domínios como:
DNAL4, DNA_ligase_A_N e Adenylation_DNA_ligase_like. Aliás, nota-se que a
maioria das sequências apresentam o domínio BRCT, que como já foi discutido,
146
seria um domínio que envolveria a interação proteína-proteína, estando presente
em numerosas proteínas envolvida das no reparo do DNA e no controle do ciclo
celular (CALLEBAUT & MORNON, 1997). Os domínios BRCT das DNA ligase IV
humana e S. cerevisiae seriam aonde estariam presentes os sítios de ligação
das proteínas XRCC4 e LIF1 (CRITCHLOW et al., 1997; HERRMANN et al.,
1998), logo a preservação desses domínios nas sequências analisadas,
principalmente na presumível sequência de DNA ligase IV de cana-de-açúcar,
indica a manutenção de interações essenciais para o desempenho adequado da
função da enzima no contexto celular.
5.1.10. ZDP.
Em eucariotos, a classe da enzima polinucleotídeo quinase 3' -fosfatase
(PNKP) humana trata-se de uma proteína bifuncional que atua como uma
fosfatase na remoção de lesões bloqueadoras de 3'-fosfato, bem como uma
quinase na restauração dos terminais 5 '-fosfato. (KARIMI-BUSHERI et al., 1999,
JILANI et al., 1999). Embora totalmente competente na restauração de
terminações propensas a reparo, a PNKP humana é, por si só, incapaz de
localizar locais danificados de DNA (PETRUCCO et al., 2002).
A primeira enzima vegetal que catalisa o reparo de lesões de DNA 3´-
bloqueadas foi identificada no milho (BETTI et al., 2001). Além disso, tendo em
vista que FPG e OGG1 são necessários para a manutenção de níveis ótimos de
8-oxoG via BER em extratos de células de Arabidopsis, e que plantas mutantes
deficientes em ambas enzimas apresentam aumento do dano oxidativo ao DNA
(CÕRDOBA-CAÑERO et al., 2014). Somado a isso, Cõrdoba-Cañero et al.
(2014) mostraram que o DNA 3´-fosfatase ZDP (zinc finger DNA 3´-
phosphoesterase) e a ARP (AP endonuclease apurinic endonuclease redox
protein) estão envolvidas no processamento das extremidades 3´-bloqueados
gerados durante a reparação 8-oxoG e que ambos são necessários para manter
a capacidade de germinação após condições de deterioração da semente. Além
disso, outro trabalho demonstrou que ZDP é necessário para a desmetilação do
DNA mediada por ROS1 em Arabidopsis (MARTÍNEZ-MACÍAS et al., 2012).
No trabalho de Petrucco et al. (2002) foi caracterizada a enzima
denominada AtZDP para a DNA polinucleotideo 3´-fosfoesterase de Arabidopsis
147
thaliana, sendo uma proteína modular multifuncional com um domínio 3'-
fosfoesterase C-terminal e um domínio de ligação ao DNA da porção N-terminal
contendo PARP-like zinc finger, conhecido por estar envolvido no
reconhecimento da quebra de fita dupla em células eucarióticas (GRADWOHL
et al., 1990; IKEJIMA et al., 1990; PETRUCCO, 2003). O domínio Zf-PARP
(PARP zinc finger), foi somente encontrado na sequência de A. thalina e de
Sorghum, item 4.1.11. Ademais, nas sequências dos organismos advindo da
família Poaceae, foi encontrado na sua porção C-terminal o domínio da
superfamília PNK3P, que envolve as polinucleotideos kinases 3 fosfatases,
incluindo a ZDP, contudo na sequência de Arabidopsis nessa referida porção
exibe o domínio HAD_like. Essas mudanças levantam dúvidas referente ao
modo de ação da ZDP nas plantas, evidenciando a necessidade de mais estudos
nessa área.
5.1.11. PCNA1 e PCNA2.
O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma das proteínas
mais importantes em células eucarióticas. Estudos sobre o PCNA demonstraram
que ele desempenha um papel crucial não apenas na replicação do DNA, mas
também no reparo do DNA, regulação do ciclo celular e apoptose (MOLDOVAN
et al., 2007) Análises detalhadas dos PCNAs de levedura e animal levaram à
identificação e caracterização de mais de 50 proteínas de interação com PCNA
(KELMAN, 1997).
Em Arabidopsis, existem duas PCNAs, assim chamadas de AtPCNA1 e
AtPCNA2, a qual diferem uma da outra em 8 aminoácidos, além de que
AtPCNA2 possuir um resíduo a mais, no comprimento da proteína (ANDERSON
et al., 2008). Desses 8 aminoácidos distintos, em AtPCNA1 em relação a
AtPCNA2, foi avaliado que quatro destes são idênticos aos resíduos encontrados
em PCNAs de Brassica napus e em humano, sendo que nestes PCNAs, esses
aminoácidos, exibiram função em leveduras mutantes que não dispunham de
PCNAs funcionais (MARKLEY et al., 1997; WASEEM et al., 1992).
Anderson et al. (2008) demonstraram que é necessário a co-expressão
de POLH (DNA polymerase eta - Pol η) e AtPCNA2 (e não AtPCNA1) para
restaurar a resistência normal a radiação UV no mutante RAD30 em levedura. A
148
diferença se deu na lisina 201 presente na AtPCNA1 que inibiria a ubiquinação
da lisina 164, afetando assim a ligação desta com a Pol η e assim não sendo
capaz de atuar na TLS (translesion synthesis - síntese por translesão) e restaurar
a progressão da forquilha de replicação. A lisina (lys) na posição 201 da
AtPCNA1 pertenceria ao grupo composto por aminoácidos com cadeias laterais
eletricamente carregados, no caso da lys essa seria dotada de carga positiva, já
o correspondente na AtPCNA2 seria uma asparagina (Asn) que pertenceria ao
grupo de aminoácidos com cadeias laterais polares sem serem dotados de
carga. Em PCNA_CANA, o resíduo em questão correspondente seria uma
glutamina que concerne ao mesmo grupo que a Asn, o que leva a concluir que
a PCNA de cana-de-açúcar seria mais próxima AtPCNA2 do que a AtPCNA1 e
poderia, como tal, atuar no TLS.
Nas árvores filogenéticas e na árvore consenso da inferência bayesiana
observa-se a ocorrência de várias duplicações de sequências, tanto em
dicotiledôneas quanto em monocotiledôneas. Essas duplicações em PCNA
indicam que embora seja uma proteína conservada entre os seres vivos,
variações em apenas alguns resíduos podem gerar funções diferentes na célula,
como já mencionado em relação a AtPCNA1 e AtPCNA2.
5.1.12. PARP1 e PARP2.
As proteínas da família PARP estão presentes em todos os eucariotos,
exceto levedura. Eles são caracterizados por possuírem um domínio PARP
(KARLBERG et al., 2013). O membro mais estudado desta família de proteínas
é o seu membro fundador PARP1 humano (HsPARP1). Ativada por quebras da
cadeia do DNA, o HsPARP1 forma cadeias de poli (ADP-ribose) ligadas as
moléculas de ADP-ribose de proteínas nucleares, incluindo ele próprio, usando
NAD+ como substrato. Esta modificação rápida e transitória da proteína ativaria
a maquinaria de reparo de DNA (PINES et al., 2013). Em humanos, a família
PARP compreende 17 membros dos quais nem todos têm atividade PARP
(KARLBERG et al., 2013; PINES et al., 2013).
Na planta modelo Arabidopsis thaliana foram identificadas três proteínas
PARP canônicas, PARP1, PARP2 e PARP3 (LEPINIEC et al., 1995;
149
BABIYCHUK et al., 1998; DOUCET-CHABEAUD et al., 2001; HUNT et al., 2004).
Sabe-se que esses membros da família PARP possuem propriedades que estão
atreladas a melhoraria das respostas ao estresse vegetal (DE BLOCK et al.,
2005; JANSEN et al., 2009; GEISSLER & WESSJOHANN, 2011; SCHULZ et al.,
2012). Os PARPs estão envolvidos no reparo de DNA, crescimento de plantas,
germinação de sementes, tolerância a estresse abiótico e biótico (DE BLOCK et
al., 2005; VANDERAUWERA et al., 2007; ISHIKAWA et al., 2009; SCHULZ et al.
2012; JIA et al., 2013; LIU et al. 2014, RISSEL et al., 2014, SCHULZ et al., 2014,
FENG et al., 2015, PHAM et al., 2015, SONG et al., 2015, ZHANG et al., 2015).
Semelhante às suas contrapartes humanas, as proteínas PARP da Arabidopsis
desempenham um papel nas respostas de danos ao DNA e na manutenção da
integridade do mesmo em várias circunstâncias. Assim, eles medeiam o reparo
do DNA, mas também desencadeiam a morte celular programada, em resposta
ao estresse oxidativo do genoma (AMOR et al., 1998), e a expressão de PARP1
e PARP2 é induzida por radiação ionizante (DOUCET-CHABEAUD et al., 2001).
Consequentemente, mutantes knockout para ambos os genes são
hipersensíveis a agentes que danificam o DNA (JIA et al., 2013; BOLTZ et al.,
2014; SONG et al., 2015; ZHANG et al., 2015). Ambas as proteínas
demonstraram estar associadas à cromatina (BABIYCHUK et al., 2001) e
estarem envolvidas em uma via alternativa de junção de DNA não homóloga (JIA
et al., 2013). A atividade enzimática poli (ADP-ribosil) de PARP1 e PARP2 de
Arabidopsis já foi demonstrada e confirmada (BABIYCHUK et al., 1998; FENG
et al., 2015).
A AtPAPR1 apresenta três módulos funcionais: o domínio de ligação N-
terminal, que agiria como um sensor de "nick" (fresta/sulco) sendo responsável
pela localização nuclear. O domínio central de auto-modificação que contém o
domínio BRCT, sendo nesse modulo onde ocorre o recrutamento de enzimas
associadas a via BER. O terceiro domínio seria o domínio catalítico C-terminal,
sendo o mais conservado entre as PARPs (DOUCET-CHABEAUD et al., 2001).
O primeiro domínio (N-terminal) é caracterizado pela presença do Zinc-finger e
o domínio SAP, relacionados com a ligação ao DNA, sendo observado isso nas
sequências analisadas de PARP1 e 2 das gramíneas e de Arabidopsis, também
foi possível evidenciar o domínio central, com o BRCT, presente no PARP1 mas
150
não no PARP2, e o domínio funcional C-terminal catalítico, composto por
domínio alfa-helicoidal da PARP e PARPcatalytic.
Com relação as árvores filogenéticas geradas, nota-se que PARP2
apresenta anotações no Uniprot da existência de subtipos, precisamente nas
gramíneas, apesar de não se ter respaldo em trabalhos publicados. A diferença
estrutural desses subtipos se dá pela presença ou ausência de domínios e
diferenças de tamanhos, sendo chamados de :PARP2-A e PARP2-B. Devido a
isso, foi observado duplicações de sequências nas árvores que tem como foco
a proteína PARP2 (figura 45), sendo que essas duplicações estavam além das
gramíneas, se abrangendo para espécies do grupo da dicotiledônea, tais como
as famílias Brassicaceae e Malvaceae.
5.1.13. XRCC1.
Em células de mamíferos, a proteína XRCC1 desempenhe um papel
central na via curta de BER (TEBBS et al., 1999; DOGLIOTTI et al., 2001;
CALDECOTT, 2003).
Os homólogos de plantas XRCC1 foram identificados em Arabidopsis
(TAYLOR et al., 2002) e arroz (UCHIYAMA et al., 2008). Embora as proteínas
XRCC1 de mamíferos e outros vertebrados possuam um domínio N-terminal e
dois domínios BRCT (BRCT1 e BRCT2), a XRCC1 de Arabidopsis contém
apenas os domínios BRCTs, que exibe um alto grau de conservação de
sequência em todos os homólogos de XRCC1 (TAYLOR et al., 2002; UCHIYAMA
et al., 2008). Pode-se observar que as sequências de gramíneas estudadas, item
4.1.14, também apresentaram o domínio BRCT, contudo, apenas um, ao invés
de dois como exibido na sequência de Arabidopsis. Ademais, Martínez-Macías
et al (2013) relataram que XRCC1 de Arabidopsis interage com ROS1 e ZDP e
estimularia suas atividades enzimáticas in vitro, logo sugerem que a XRCC1
funcionaria durante a desmetilação ativa do DNA em Arabidopsis, esse fato
demonstra o quão é importante aprofundar os estudos das proteínas
pertencentes a BER, atreladas ao sistema epigenético, para ampliar o
151
conhecimento a cerca desses mecanismos de ação para outros organismos
vegetais além da planta modelo Arabidopsis thaliana.
5.1.14. WRN.
As helicases RecQ desempenham um papel importante na manutenção
da estabilidade do genoma (KAROW, et al., 2000; COBB et al., 2002; CHU et al.,
2009). Em humanos, várias doenças hereditárias foram correlacionadas com
mutações em helicases RecQ-like (ELLIS et al., 1995; YU et al., 1996; KITAO et
al., 1999). A doença mais proeminente é a síndrome de Werner (WS), uma
desordem genética autossômica recessiva caracterizada pelo início precoce do
envelhecimento (YU et al., 1996; OSHIMA et al., 2017) e anormalidades
genômicas, como rupturas cromossômicas, translocações cromossômicas
recíprocas (SALK et al., 1981) e deleções genômicas. (FUKUCHI et al., 1989). A
proteína Werner (hWRN-p), responsável pela WS, possui atividades de 3'-5´
exonuclease e 3´-5´ helicase (SHEN et al., 1998; KAMATH-LOEB et al., 1998),
sendo, então, pertencente à família das helicases RecQ.
Proteínas do tipo WRN também foram detectadas em camundongos (WU
et al., 1998) e Xenopus laevis (YAN et al., 1998). Foi identificamos sete
homólogos da família RecQ em Arabidopsis thaliana (HARTUNG et al., 2000).
No entanto, nenhum gene que codifica o homólogo completo da proteína WRN
foi encontrado no genoma desse organismo. Em vez disso, foi detectado um
pequeno ORF (AtWRNexo) codificando 285 aminoácidos, que mostrava uma
notável semelhança com o domínio de exonuclease da proteína da síndrome de
WS (HARTUNG et al., 2000).
As sequências de plantas, item 4.1.15, mostraram que exibem o domínio
da superfamília DNAQ_like_exo, a qual envolve a DNA helicase RecQ e a
própria WRN. Entretanto, existem poucos trabalhos na literatura voltada para
essa proteína, principalmente em plantas.
152
5.2. Duplicações de sequências de componentes de BER nos
organismos vegetais.
No trabalho de Singh et al (2010), por meio da comparação de genomas
vegetais disponíveis na época, tendo como objetivo comparar os genes que
estariam envolvidos no reparo e recombinação do DNA, foi encontrado que
FEN1 (flap endonuclease 1), no genoma de monocotiledôneas analisadas
(milho, arroz, Sorghum e Brachypodium) apresentaram duas copias dessa
endonuclease e que tais copias não seriam produtos de duplicações
intragenômicas. De fato, essas copias seriam os subtipos de FEN1: FEN1A e
FEN1B identificados nesse trabalho. Singh et al. (2010) também identificaram
apenas uma cópia FEN1 em dicotiledôneas, a saber Arabidopsis, Medicago
truncatula, Vitis venifera e Papaver somniferum, contudo Glycine max
apresentou duas copias de FEN1, sendo que nesse caso, tais copias seriam
produtos de duplicação intragenômica, ou seja, uma das cópias de um gene
duplicado (FEN1) está livre de restrições seletivas (uma vez que a outra cópia
fornece a função), permitindo assim que nessa cópia substituições ocorram e
novas funções sejam geradas. De forma geral, as árvores filogenéticas
demonstraram diferenças quanto presença ou não de duplicação de sequências
de componentes da via BER, existem casos que a duplicação foi observada nas
dicotiledôneas e não nas monocotiledôneas, exemplo do caso da NTH, PCNA e
DNA ligase 1, essa diferença observada, somada com diferenças estruturais
(tamanho, presença ou ausência de determinados domínios conservados)
indicaria uma diferença nos mecanismos de reparo de DNA entre as plantas.
Em trabalho anterior, foi discutido que um evento de duplicação do
genoma como um todo (WGD) estaria relacionado com a duplicação observada
para a sequência de AP endonuclease no grupo das gramíneas (MAIRA et al.,
2014), no trabalho aqui apresentado observa-se que duplicações estão
presentes em outros grupos vegetais além da Poaceae.
Sabe-se que o destino da grande maioria dos genes duplicados
decorrentes da duplicação segmentar é a não-funcionalização de um membro
do par (LYNCH & CONERY 2000, 2003a, 2003b) e isso deveria ocorrer dentro
de alguns milhões de anos na ausência de qualquer vantagem intrínseca da
153
cópia duplicada (WATTERSON 1983; LYNCH et al., 2001). Além disso, levando-
se em conta a grande variedade de tamanho dos genomas vegetais (como A.
thaliana e cana-de-açúcar, por exemplo) e a existência de eventos de WGD que
ocorreram diversas vezes na história das plantas, pressupõem-se que a
diminuição do tamanho desses genomas estaria atrelada ao fenômeno de
diploidização. Este fenômeno trata-se de processos que retornam um genoma
poliploide a um genoma de tipo diploide. A diploidização pode incluir perda de
genes duplicados e cromossomos, perda de DNA repetitivo e silenciamento
gênico (SOLTIS et al., 2015). Apesar disso, a maioria dos genomas que foram
estudados contém muitos genes duplicados, alguns dos quais são claramente
bastante antigos (LYNCH & CONERY, 2000).
Com base nessa observação, vários mecanismos foram propostos para
tentar explicar a preservação de genes duplicados (HUGHES, 1994; FORCE et
al., 1999; LYNCH et al., 2001; TAYLOR & RAES, 2004; LYNCH, 2007; INNAN &
KONDRASHOV, 2010): Alguns desses mecanismos seria: (1)
neofuncionalização, pelo qual uma cópia adquire uma nova função benéfica em
relação a função ancestral essencial; (2) subfuncionalidade, partição da função
ancestral; (3) seleção para aumento do produto genético; e (4) o mascaramento
de alelos não funcionais. Uma outra explicação simples para o grande número
de duplicações preservadas nos poliploides seria que, ao contrário das
duplicações de um único gene, as duplicações oriundas do WGD exibem uma
conservação completa das sequências reguladoras circundantes, ambientes
cromossômicos, etc. Embora isso possa contribuir um pouco para o padrão de
retenção em poliploides, não explica a observação de que diferentes tipos de
genes parecem estar preservados após WGD em comparação com duplicações
em menor escala. Este fato pode ser melhor explicado pela seleção do equilíbrio
da dosagem entre as proteínas. Devido às relações estequiométricas com outros
genes que interagem entre si (por exemplo, complexos multi-subunidades e
inúmeras vias envolvidas no metabolismo e regulação transcricional), as funções
de um subconjunto de loci codificadores de proteína podem ser altamente
influenciadas por desequilíbrios de dosagem (VEITIA, 2002; PAPP et al., 2003,
BIRCHLER et al., 2005; VEITIA et al., 2008).
154
Tendo em vista os genomas das plantas, especificamente, existem, em
média, 65% dos seus genes anotados que apresentam uma duplicação
(PANCHY et al., 2016). A maioria dessas cópias são derivadas de WGDs
consistente com a prevalência de eventos de paleopoliploidização na linhagem
de planta terrestre (PANCHY et al., 2016). Li et al. (2016) investigaram o destino
de genes duplicados de 40 diferentes espécies de plantas com flores, a qual
todas experimentaram pelo menos um ou mais eventos WGD ao longo de sua
história evolutiva. Foi observado a perda de genes logo após a duplicação do
genoma como um todo, de forma que os genes, rapidamente, retornaram ao
estado de única cópia (LI et al., 2016). Entretanto, alguns desses genes
preservaram o seu estado de multiplicas copias. Tais genes pertencem a famílias
de genes envolvidas na resposta a estresse biótico e abiótico, logo, sendo
importantes para a adaptação do vegetal ao ambiente. Desta forma, pode-se
correlacionar a duplicação e retenção dessas cópias com uma vantagem
adaptativa que tais genes podem conferir a planta, permitindo que esta possa
atuar de forma mais eficiente em reposta as variações ambientais. Os genes de
reparo estariam atrelados a essa hipótese, já que são necessários para
manutenção da estabilidade do genoma e preservação da informação genética,
além de que, muitos dos seus membros, já descritos nesse trabalho, atuam em
outros processos de importância adaptativa como a epigenética.
A preservação das duplicações observadas nesse trabalho poderiam ser
decorrentes de diversos fatores, no caso da ScARP1 foi postulado, em relação
a sua duplicação ScARP3, que haveria uma subfuncionalização, pois elas
apresentam padrões de expressão diferenciado e foi previsto que também
estariam direcionadas para organelas citoplasmáticas distintas (MAIRA et al.,
2014), o mesmo pode ocorrer com as sequências aqui estudas que exibiram
duplicações encontradas nas árvores filogenéticas, contudo um estudo mais
detalhado sobre as mesmas se faz necessário para tecer uma melhor hipótese
sobre o fato.
Em cana-de-açúcar, bem como em outros organismos vegetais, que não
as plantas modelos, exibem poucos trabalhos focados na caracterização e
analise estrutural de componentes individuais de vias metabólicas. Trabalhos
como de Manners e Casu (2011), a qual fizeram uma análise de genômica
155
funcional do transcriptoma de cana-de-açúcar, além de discutir as técnicas
empregadas para proporcionar um estudo genômico nesse organismo vegetal,
são escassos e corroboram para uma visão geral dos processos, deixando
lacunas na discussão mais restritas a determinados genes. Ademais, deve-se
levar em consideração que a estratégia tradicional de melhoramento está ficando
para trás da demanda da necessidade comercial devido à falta de conhecimento
sobre características relacionadas à tolerância ao estresse, falta de técnicas de
seleção eficientes e baixa variação genética e fertilidade (RODRÍGUEZ et al.,
2005). A evidente carência biotecnológica será suplementada com estudos
voltados para caracterização bioquímica e funcional de vias importantes e de
seus componentes, como a via de reparo de DNA, a exemplo desse trabalho da
via BER. Isso demonstra a importância dos resultados aqui demonstrados e sua
potencial aplicabilidade no melhoramento vegetal. Além disso, deve-se frisar a
importância desse trabalho para além da cana-de-açúcar, suplementando
informações e levantando questões sobre os componentes da via BER e sua
relação filogenética para os organismos vegetais, de forma geral.
5.3. Análise dos modelos de PCNA e FEN1 de cana-de-açúcar.
A proteína Antígeno Nuclear da Proliferação Celular (PCNA - Proliferating
cell nuclear antigen) comumente chamado de "grampo deslizante" (sliding
clamp) serve como plataforma de ancoragem para muitas proteínas envolvidas
no metabolismo de DNA. Outros estudos em PCNA demonstraram que essa
proteína desempenha um papel crucial não só na replicação do DNA, mas
também no reparo do mesmo, na regulação do ciclo celular e na apoptose
(MOLDOVAN et al., 2007). Tendo em vista que os reinos os quais são divididos
os seres vivos se distanciaram um do outro desde os tempos antigos, o
mecanismo mais básico responsável pela a replicação do DNA parece estar
altamente conservada entre todos os organismos. O melhor exemplo disso foi a
identificação de genes de PCNA e a conservação de sua sequência entre
diferentes espécies tais como leveduras: fermento de broto (Saccharomyces
cerevisiae) (BAUER & BURGERS, 1990) e levedura de fissão
(Schizosaccharomyces pombe) (WASEEM et al., 1992); animais: humano
156
(ALMENDRAL et al.,1987), rato (MATSUMOTO et al., 1987), camundongo
(YAMAGUCHI et al., 1991) e Drosophila (YAMAGUCHI et al., 1990); plantas:
cenoura (HATA et al., 1992), milho (LOPEZ et al., 1995; LÓPEZ et al., 1997)
arroz (SUZUKA et al., 1991) e feijão comum (STRZALKA & ZIEMIENOWICZ,
2007); bem como archaeon: Pyrococcus furiosus (CANN et al., 1999). O modelo
presumível de cana-de-açúcar também exibe uma alta similaridade com as
sequências de PCNAs de Arabidopsis thaliana e humana, tendo em vista que
tais sequências apresentam cristais depositados no banco de dados do PDB
(Protein Data Bank) (STRZALKA et al., 2009; SAKURAI et al., 2005; GULPIS et
al., 1996; PUNCHIHEWA et al., 2012; KONTOPIDIS et al., 2005).
A conservação da sequência e de estrutura tridimensional indicaria que a
proteína PCNA de cana-de-açúcar poderia substituir uma proteína PCNA em
outro organismo. Experimentos foram feitos anteriormente tendo essa
perspectiva, foi utilizado PCNAs de Drosophila e de levedura que mostraram
serem capazes de funcionalmente substituir o PCNA de mamífero em ensaios
de replicação de DNA (BAUER et al., 1988). Em relação a plantas, também foi
demonstra que um PCNA recombinante de arroz estimulou a atividade
enzimática da DNA polimerase δ de células humanas (MATSUMOTO et al.,
1994). Outro estudo demonstrou que PCNA oriundas de mamíferos foram
capazes de estimular a atividade e processividade de duas polimerases δ de
trigo (LAQUEL et al., 1993).
A proteína FLAP ENDONUCLEASE 1 (FEN1) é altamente conservado
entre as espécies. A importância da FEN1 pode ser observada no caso de ratos
com deleção da referida enzima o que resultou em serem embrionariamente
letais e hipersensíveis à radiação gama (LARSEN et al., 2003). Por outro lado,
os mutantes homozigotos fen1 nas células DT40 de frango eram viáveis, mas
eram sensíveis ao metil metanossulfonato (MMS - methyl methanesulfonate) e
aos agentes oxidativos que danificavam o DNA (MATSUZAKI et al., 2002). No
entanto, a nossa compreensão da FEN1 no reino das plantas é limitada.
A conservação da sequência, principalmente dos sítios de ligação ao
DNA, a metais e motivos de interação com proteínas, como também a
preservação da conformação tridimensional da proteína, oferece respaldo para
157
corroborar com a possibilidade de a atividade enzimática das sequências de
cana-de-açúcar aqui discutidas (PCNA e FEN1) terem funcionalidade real. Aliás,
Maíra et al. (2014) geraram modelos 3D de ScARP1 sendo que este serviu de
base para a formulação do trabalho aqui apresentado, o que demonstra a
importância dessas análises in silico para a formulação de futuros estudos in vitro
e in vivo.
A interação observada entre os modelos PCNA e FEN1 de cana-de-
açúcar demonstra a possível conservação do mecanismo de ação de ambas as
proteínas para a promoção de processos como reparo e replicação do DNA. Tal
proposta, confere uma maior compreensão desses referidos processos em
plantas, levantando a possibilidade de conservação dos mesmos no reino
Plantae.
5.4. Caracterização enzimática de ScARP1.
Atualmente, deve-se ampliar a visão acerca da via de reparo BER, já que
esta não estaria unicamente relacionada com a manutenção da integridade do
genoma (FENG et al., 2010; BELLACOSA & DROHAT, 2015). O mecanismo de
reparo pode estar associado também a outras vias necessárias para a planta
desencadear uma resposta adequada ao estresse presente no ambiente.
Estresses ambientais podem ocasionar um aumento na concentração de
espécies reativas de oxigênio (EROs) em células vegetais, esses acréscimos
ocorrem, por exemplo, em condições como alta concentração de sal, seca,
estresses combinados (seca seguida de inundação), contaminação do solo por
metais pesados, baixas temperaturas que poderem acarretar congelamento no
solo (BURDON et al., 1996; DEMIDCHIK, 2015; DAS & ROYCHOUDHURY,
2016; FOYER et al., 2017) e em combinação com alta incidência de luz e frio
(MICHAELI et al., 2001; HASANUZZAMAN, 2013; DAS & ROYCHOUDHURY,
2014). Os EROs seriam originados da cadeia transportadora de elétrons na
mitocôndria, além disso, em vegetais (especificamente), existe a adição da
reação de fotossíntese, no cloroplasto, que resulta na produção de superóxido e
oxigênio singlet, principalmente quando a taxa de fixação de carbono é baixa e
limitada pelo suprimento de CO2 e a temperatura (DEL RÍO, 2015).
158
Os EROs podem atuar também como um sinal de vida ou morte,
dependendo do contexto molecular e celular em que as espécies reativas de
oxigênio se acumulam. Os resultados dessa sinalização dependem de muitos
parâmetros, principalmente a natureza química da forma EROs produzida (ou
seja, superóxido, peróxido de hidrogênio ou oxigênio singlet) e a natureza do
parceiro interativo (proteína tiol, metabólito, lipídios ou molécula de DNA), bem
como a identidade celular, mas todos os tipos de modificação oxidativa
(reversível ou irreversível) podem ser vistos como parte da matriz de sinalização
redox porque induzem respostas regulatórias, de reparo ou de morte.
Juntamente com a tensão do oxigênio celular, EROs controlam muitos aspectos
cruciais da biologia animal e vegetal, como também a proliferação celular, a
homeostase das células-tronco e o comprometimento da linhagem de
diferenciação (MOHYELDIN et al., 2010; BIGARELLA et al., 2014; DEL POZO,
2016; CONSIDINE et al., 2016).
No caso da molécula de DNA, estas espécies reativas de oxigênio podem
reagir, por exemplo, com a guanina gerando assim um produto denominado de
7,8-dihydro-8-oxoguanina (8-oxoguanina) que é altamente mutagênico
(SHIBUTANI et al., 1991). Para remoção dessa lesão na molécula de DNA, a
célula se utiliza de enzimas presentes na via BER (WILSON et al., 2003). Estas
enzimas seriam as DNA glicosilases que seriam responsáveis pela identificação
e catalise do processo de retirada da base danificada ou lesada, este processo
gera um sítio abásico que é corrigido por outras enzimas downstream da via
BER, incluindo a AP endonuclease. Além disso, essa mesma enzima (AP
endonclease) pode desempenhar também papeis de controle do processo da
epigenética, como já foi analisado em relação a proteína AtAPEL1 de
Arabidopsis que funciona a downstream das proteinas ROS1 e DME, enzimas
estas que estão envolvidas no processo de desmetilação do grupamento metil-
citosina da molécula do DNA (LI et al., 2015a).
Tendo em vista os perfis de expressão dos genes AP endonucleases
,AtARP, AtAPE1L e AtAPE2, diante do desenvolvimento do organismo vegetal
de Arabidopsis thaliana (figuras 16, 17, e 18) e dos homólogos dos mesmos
genes em Oryza sativa (figuras 19, 20 e 21), além dos dados referente a
expressão de ScARP1 (AP endonucleasde de cana-de-açúcar) advindo de Maíra
159
et al. (2014), foi possível observar o aumento de expressão, como indicado na
tabela 7, em diversas fases do desenvolvimento. Nota-se que os estágios
desenvolvimento com expressão mais proeminente nos diferentes organismos
analisados foi o meristema apical, etapas do desenvolvimento das folhas e do
órgão floral, desenvolvimento do embrião e a semente. Sabe-se que a via de
excisão de bases (BER), como já mencionado no parágrafo anterior, está
envolvido no processo de desmetilação, sendo que AP endonucleases atuariam
como intermediários nesse processo. AtAPE1L, juntamente com ZDP, mediaria
reações a jusante (downstream) das vias de desmetiação de DNA de ROS1 e
DME (LI et al., 2018a). AtAPE2, por sua vez, teriam funções que seriam
sobrepostas a função da proteína ZDP e, deste modo, teria ação na manutenção
do epigenoma e a estabilidade genética nas plantas (LI et al., 2018b). Ademais,
esses processos de desmetilações estão associados ao desenvolvimento das
plantas, como, por exemplo no desenvolvimento: do estômato (YAMAMURO et
al., 2014), controlado por auxina (ARIEL et al., 2014), do embrião (CHOI et al.,
2002; GEHRING et al., 2006), da germinação do pólen (SCHOFT et al., 2011),
do endosperma (ONO et al., 2012), diferenciação de nódulos (SATGE et al.,
2016) e amadurecimento de frutos (LIU et al., 2015; LANG et al., 2017). Logo, à
vista disso, pode-se associar o aumento de expressão observado nos perfis de
expressão com processos de desmetilação acoplados ao desenvolvimento
vegetal.
A sequência utilizada nesse estudo, AP endonuclease homóloga a AtARP
de A. thaliana em cana-de-açúcar, sendo denominada ScARP1, foi originada de
análises anteriores (MAIRA et al., 2014) a qual foi proposto a estrutura
tridimensional da enzima e se verificou in silico que essa provavelmente poderia
ter atividade AP endonuclease. Agora, os estudos in vitro apresentados aqui,
além de reafirmar resultados anteriores, complementam o entendimento de
como a AP endonuclease de cana-de-açúcar atua na célula vegetal, reforçando
a sua importância na maquinaria de reparo.
Em outros trabalhos foi demonstrado que a família ExoIII das AP
endonucleases presente em humanos (hAPE1), E. coli (Xth) e plantas (AtARP
de A. thaliana) são absolutamente dependentes de cátions divalentes,
tipicamente Mg+2, para desempenhar, de forma adequada, suas atividades
160
catalíticas (BABIYCHUK et al., 1994; ROGER & WEISS, 1980; KANE & LINN,
1981). Logo, dispondo de um substrato marcado com 5´-fluoresceina e THF
(Tetrahydrofuran) que mimetizava o sítio abásico natural, foi possível observar,
sob a presença de diferentes íons divalentes (MgCl2, MnCl2 e CoCL2) que a
enzima ScARP1 apresentou atividade AP endonuclease tanto na presença dos
íons divalentes Mg+2 quanto Mn+2, sendo que o íon manganês resultou em maior
atividade da enzima. Sabe-se que os cristais disponíveis para a AP
endonuclease humana reportam a presença de ligação com metais Mg+2, Pb+2
ou Sm+3 (BEERNINK et al., 2001; MANVILLA et al., 2013; GORMAN et al., 1997),
sendo que o pressuposto seria que estes são necessários para a cristalização
adequada da enzima wildtype (tipo selvagem) ou a versão que apresenta a
extremidade N-terminal truncada. He et al. (2014), a partir de análises de cristais
de AP endonucleases humana, notaram uma plasticidade do sitio de ligação a
metais. Ademais, foi demonstrado em outro estudo que Mn+2 poderia substituir,
efetivamente, Mg+2 para promover assim a catálise de APE1 (SHERMERHORN
& DELANEY; 2013). Além disso, He et al (2014) propuseram que existem três
resíduos (D70, E96 e D308) da enzima humana que são essências para
estabiliza-la, estes podem utilizar tanto Mg+2 quanto Mn+2, como pode ser
observado na tabela 3, nas sequências de plantas analisadas, apenas os
resíduos E96 e D308 exibem correspondências nas AP endonucleases vegetais.
Além do que, existem resíduos relacionados com ligação a metais nas
sequências de AtARP, AtAPE2 e ScARP1 que não exibem equivalência em
hAPE1 humana, tais como N282, H527 (AtARP), N7, H324 (AtAP2) e N56, H297
(ScARP1), desta forma, deve existir diferença quanto a dinâmica do sítio de
ligação a metais entre as enzimas de origem vegetal e humana.
Córdoba-Cañero et al. (2011), propuseram que AtARP seria a principal
AP endonuclease ativa nos extratos celulares de Arabidopsis, sendo requerida
para a via BER nos sítios de Uracil e AP (sítio abásico) sintético em análises in
vitro. Ainda no mesmo estudo, ao utilizar as enzimas AP liases de trabalhos
prévios (CORDOBA-CAÑERO et al., 2009) notou-se que essa fora incapaz de
substituir a função de AtARP nos extratos mutantes arp -/-, o que levou a
conclusão que a enzima AtARP apresentaria atividade 3´-fosfodiesterase que
removeria grupos 3´-blocking (ou 3´-PUA). Ademais, completando o resultado
161
anterior de Cordoba-Cañero, foi reportado que AtARP e AtAPE1L foram capazes
de processar lesões 3´blocking gerados por DME (DEMETER) (LEE et al., 2014).
Sabe-se que o genoma de A. thaliana codifica três proteínas AP
endonculeases-like: AtAPE1L, AtAPE2 e AtARP (MURPHY et al., 2009).
Analisando individualmente cada uma destas enzimas, conclui-se que todas
apresentam atividade AP endonuclease in vitro, contudo AtAPE1L também
dispõe uma atividade 3´-fosfatase e é capaz de processar a extremidade 3´- PUA
gerando assim como produto 3´-OH (LI et al., 2014). Aliás, essas três enzimas
quando alinhadas apresentam diferenças, como por exemplo, embora todas
possuíssem o domínio EEP, AtAPE2 e AtARP apresentam um domínio adicional
zinc-finger (ZF) e o domínio SAP DNA binding domain (domínio de ligação ao
DNA), respectivamente. Essas diferenças podem estar indicando que essas
enzimas poderiam ter funções tecido especificas em A. thaliana (LEE et al.,
2014).
A enzima ScARP1 foi colocada em contato com substratos com
extremidades 3´dispondo de: OH (hidroxila), P (fosfato) e PUA (Aldeído β,α-
insaturado) em ensaios in vitro. Os resultados obtidos mostraram que a proteína
de cana-de-açúcar foi incapaz de processar estes substratos, a não ser aquele
já relacionado com o sítio abásico (atividade AP endonuclease). Deve-se levar
em consideração que trabalhos anteriores se utilizaram do banco de dados
SUCEST-FUN (AGNEZ-LIMA et al., 2001) para a identificação de homólogos de
genes da via BER em cana-de-açúcar, obteve não só ScARP1 como homologo
a AtARP, como também ScARP3. A análise filogenética feita em um trabalho
prévio (MAIRA et al., 2014) propôs que essas duas ScARPs foram originadas de
um evento de duplicação total do genoma (WGD), o que poderia resultar também
em uma um processo de sub-funcionalização. Foi observado em Maira et al.
(2014) que estas duas sequências poderiam ter uma sinalização para
compartimentos celulares diferentes, porém essa sub-funcionalização também
poderia estar atrelada a uma divisão de funções, logo se ScARP1 não apresenta
todas as atividades enzimáticas descritas para AtARP, isto poderia sugerir que
ScARP3 teria tais características, ou ainda uma outra proteína de cana-de-
açúcar não-homóloga a AtARP.
162
Joldybayeva et al. (2014) clonaram e caracterizaram um homólogo em
trigo da hAPE1 humana e da AtAPE1L de A. thalina que eles denominaram de
TaApe1L. Como resultados eles observaram que a enzima de trigo exibia
atividades: AP endonuclease, 3´-fosfodiesterase, 3´-fosfatase e 3´->
5´exonuclease, sendo que a metodologia empregada foi diferente do que a
utilizada para ScARP1, pois Joldybayeva e colaboradores propuseram como
hipótese que se deve utilizar detergente não-iônico para estabilizar a proteína e
assim mantê-la ativa. Ademais, as diferenças dos resultados poderiam estar
relacionadas ao fato que ScARP1 é homólogo a AtARP e não da proteína
AtAPE1L de Arabidopsis.
A proteína hAPE1 humana é uma enzima multifuncional que possui
atividades 3´-> 5´exonuclease (CHOU, 2002; CHOU & CHENG, 2003),
fosfodiesterase (SUH et al., 1997) e RNase H (BARZILAY et al., 1995), além
disso, a proteína possui um domínio N-terminal, domínio REF1, envolvido na
regulação transcricional redox-dependente, sendo esse domínio dispensável
para a função em BER (TIMOFEYEVA et al., 2009). Porém, quando se compara
a sequência de aminoácidos entre AtARP e APE1 humana em um alinhamento
nota-se que existem diferenças entre eles, não sendo observado uma homologia
conclusiva na porção N-terminal (BRITT, 2002). Logo, essa diferença poderia
estar relacionada as discrepâncias encontradas nas funções, do mesmo modo
se comparado com a sequência de cana-de-açúcar, pois, a proteína ScARP1
também exibe diferenças em seu alinhamento com o seu homólogo AtARP
(MAIRA et al., 2014).
Embora tenha sido avaliado a atividade exonuclease de ScARP1 e
obteve-se um resultado negativo quanto a sua presença (item 4.6.3, figura 24a),
foi ponderado a sua existência se baseado na visualização de bandas menores
assinalando fragmentos menores de DNA nos geis de acrilamida de outros
ensaios (figura 22 e 23), o que seria um indicativo de uma atividade exonuclease.
Foi proposto uma hipótese para tentar explicar esse fenômeno observado: a
enzima (ScARP1), ao se associar ao DNA devido o reconhecimento do sítio
abásico artificial, permaneceria ali acoplado o que resultaria na promoção da
atividade exonuclease, de modo que, para que essa dita atividade ocorresse se
faz necessário, primeiramente, o acoplamento da proteína e sua permanência
163
no substrato, o que não ocorreria nos experimentos propostos para a avaliação
da presença da atividade exonuclease se utilizando de outro substrato distinto
do sítio abásico, logo, seria imprescindível mais experimentos e estudos para a
comprovação dessa hipótese.
A complementação da atividade AP endonuclease do extrato celular
mutante arp-/- demonstrou que ScARP1 não substituiu em sua totalidade a
atividade de AtARP. Isso pode ter ocorrido devido ao extrato utilizado conter
todas as proteínas presentes na célula vegetal de Arabidopsis, portanto, também
estando incluído inibidores da via BER, como por exemplo, PARP que já foi
reportado ter efeito negativo nas taxas de reparo de BER em extratos celulares
(ALLINSON et al., 2003; 2004). Além do que, vale salientar que a enzima
estudada não pertence a A. thalina, sendo também distante filogeneticamente
da mesma, como pode ser evidenciado quando alinhado as sequências de
ambas as enzimas constatando que as mesmas não exibem uma alta homologia
(figura 13 e tabela 6), de modo que essa diferença estrutural e um ambiente
celular não-adequado podem culminar em um decréscimo na eficiência da
atividade enzimática, logo resultando em uma complementação parcial.
Sabe-se que o conhecimento sobre o reparo de DNA em plantas,
particularmente no genoma de plantas para colheitas (com valor comercial) é
insuficiente. O uso de Arabidopsis thaliana da mesma maneira que o arroz como
modelos vegetais, pois ambos compartilham características atrativas para
estudos genéticos e condições de manutenção em laboratório como: rápido ciclo
de vida, tamanho diminuto e simplicidade de seu genoma, possibilitou melhor
analise de mutações. Percebe-se, infelizmente, uma carência de trabalhos
focado mais em plantas de cultivo. Assim sendo, com a aplicação dos
conhecimentos advindo das plantas modelo de cultivares comerciais, seria
possível ter uma clara visão da capacidade dos genomas vegetais de superar os
impactos biológicos de vários e distintos agentes genotóxicos e se adaptar as
mudanças ambientais e condições de estresses (MANOVA & GRUSZKA, 2015).
A proteína ScARP1 é o primeiro trabalho envolvendo a caracterização
enzimática de uma enzima de reparo em cana-de-açúcar, planta
monocotiledônea e com metabolismo C4, sendo diferente fisiologicamente dos
modelos vegetais citados anteriormente (Arroz e Arabidopsis). Além de
164
suplementar a literatura cientifica, abre portas para possiblidades de estudos
mais aprofundados na via BER e o uso destas descobertas como instrumentos
biotecnológicos que poderão aumentar o rendimento desta planta de grande
importância para a agroindústria mundial.
165
6. CONCLUSÃO
O escopo principal desse trabalho foi elucidar mais sobre a via BER em
cana-de-açúcar, utilizando-se, para isso, a caracterização enzimática da AP
endonuclease ScARP1, além da identificação e análise de outros componentes
da via de Excisão de Bases (BER).
Para a enzima ScARP1, foi observada que a mesma apresentou atividade
endonuclease, além de se constatar as condições ótimas para a sua atuação:
temperatura (37°C), íons metálicos bivalentes (Mg+2 ou Mn+2), concentração de
sal (atividade da enzima é inversamente proporcional a concentração do sal).
Além disso, ScARP1 não exibiu nenhuma atividade exonuclease, fosfatase e
fosfodiesterase, mas foi capaz de complementar, parcialmente, os extratos
celulares advindos da planta mutante (arp -/-). Os dados in vitro reforçaram a ideia
que ScARP1 de cana-de-açúcar se trata de uma subfuncionalização e conservou
a atividade de Ap endonuclease, essencial para a sua atuação na via BER. Na
figura 26, pode-se comparar o resumo das características até o momento
apuradas de ScARP1, resultado deste e de outros trabalhos feitos por nosso
grupo de pesquisa, com relação o seu homólogo em Arabidopsis (AtARP1),
ressaltando as características em comum, como também discrepantes entre as
duas enzimas de BER.
166
Figura 26 - Diagrama de comparação das AP endonucleas de Arabidopsis thaliana (AtARP1) e de cana-de-açúcar (ScARP1). Destaca-se no diagrama as principais características descobertas para ScARP1 em comparação do que se sabe para AtARP1, tendo que vista que a AP endonuclease de cana-de-açúcar é homóloga a AP endonuclease de Arabidopsis. As referidas características seriam as atividades enzimáticas previstas, localização subcelular, íons metálicos bivalentes utilizados como cofatores enzimáticos e perfis de expressão - em relação ao desenvolvimento vegetal e diante ao estresse oxidativo-, tendo em vista, o aumento da expressão das referidas sequências analisadas.
Quanto aos componentes de BER que foram identificados, foi possível
observar evidentes diferenças entre as sequências das monocotiledôneas e
dicotiledôneas, além de duplicações apresentadas nas árvores filogenéticas que
vão além do grupo das gramíneas. Tais resultados geraram o levantamento de
diversas questões quanto a preservação e modificações nos mecanismos de
167
reparo de DNA entre os diferentes tipos vegetais, tendo em vista, a conservação
ou não de domínios conservados previstos, tendo como base a planta modelo
Arabidopsis, nas outras sequências vegetais. Isso enfatiza, a necessidade de
mais estudos que abranjam outros organismos que não as plantas modelos.
Os modelos tridimensionais de PCNA e FEN1 para a cana-de-açúcar
permitiram dar maior suporte aos dados referentes da identificação dos
componentes de BER, permitindo cogitar a preservação das interações entre tais
proteínas e, logo, a manutenção da funcionalidade das mesmas em cana-de-
açúcar.
Deve-se enfatizar que a importância desse trabalho, tendo em vista que
até o presente momento existem poucos estudos publicados de caracterização
enzimática de gene de reparo de cana-de-açúcar, como também existem
escassos trabalhados voltados a caracterização dos componentes da via BER
como foi aqui apresentado, o que traz algo novo e de impacto para o reparo de
DNA em plantas, principalmente para cana-de-açúcar.
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