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LUCIANA ARAÚJO NASCIMENTO
ESTUDO SOBRE A FORMAÇÃO DE FILMES AUTOMONTADOS DE QUITOSANA COM
COMPLEXOS DE FERRO E RUTÊNIO NITROSIL
NATAL, RN
2016
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química, como um dos requisitos para obtenção do grau de
Doutora em Química, pela Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
Orientador: Prof. Dr. Ótom Anselmo de Oliveira
Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Facundo de
Brito Pontes
Catalogação da publicação na fonte. Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Sistema de Bibliotecas Biblioteca Setorial do Instituto de Química
Nascimento, Luciana Araújo. Estudo sobre a formação de filmes automontados de quitosana com complexos de ferro e rutênio nitrosil / Luciana Araújo Nascimento. - Natal, RN, 2016. 130 f. : il. Orientador: Prof. Dr. Ótom Anselmo de Oliveira. Coorientador: Profa. Dra. Ana Cristina Facundo de Brito Pontes. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós-Graduação em Química, 2016. 1. Quitosana - Tese. 2. Complexos nitrosil - Tese. 3. Filmes automontados - Tese. 4. Sensor eletroquímico - Tese. 5. Química - Tese. I. Oliveira, Ótom Anselmo de. II. Pontes, Ana Cristina Facundo de Brito. III.Título. RN/UF/BS-IQ CDU 547.995(043.2)
3
AGRADECIMENTOS
Quatro anos se passaram desde o início da caminhada do doutorado e esse período foi de
muitos acontecimentos, muitas mudanças, trabalho, esforço, e de aprendizado, não só acadêmico,
mas sobretudo, de vida. E é chegado o momento de agradecer a todas as pessoas que estiveram
ao meu lado nesse período, que me apoiaram, me encorajaram e que me deram suporte para a
concretização desse sonho.
Primeiramente, agradeço a Deus por me proteger e ter-me concedido o dom da fé e da
esperança. Por me fazer forte, capaz de superar todas as dificuldades com um sorriso no rosto e
tranquilidade no olhar, por me mostrar a cada dia que tudo o que vivemos não é em vão, mas que
Ele nunca nos abandona e está sempre ao nosso lado.
Aos meus pais, Francisco Elias e Ana Lúcia e, minha tia Maria do Socorro Pereira, que
me incentivam, acreditam em mim, vibram com minhas conquistas e que se orgulham da pessoa
que sou. Por entenderem (ou não) os meus momentos de ausência, por cuidarem de mim, por
quererem meu bem. Agradeço carinhosamente à Marina, Matheus, JH, JK, Marcinho, Angélica e
Carol por estarem sempre ao meu lado, torcerem por mim e por saber que posso contar
incondicionalmente com vocês.
Ao Prof. Dr. Ótom Anselmo de Oliveira e à Profa. Ana Cristina Facundo de Brito Pontes
que me receberam de braços abertos e foram de extrema generosidade comigo. Me deram muito
mais que conhecimento, me deram amizade, uma palavra amiga, um conselho quando
necessário. Só tenho a lhes agradecer pelos ensinamentos, dedicação, paciência e disposição por
estarem percorrendo esse caminho ao meu lado.
Ao Prof. Dr. George Dantas de Azevedo (coordenador do curso de medicina/EMCM-RN
- Caicó), à Profa. Dra. Elaine Lira Medeiros Bezerra (coordenadora do curso de medicina) e ao
Prof. Dr. Henio Ferreira de Miranda (Diretor do CCS), chefes que compreenderam a minha
necessidade de me qualificar e me deram todo o apoio institucional necessário.
Agradeço calorosamente às pessoas que, por 4 anos, foram minha família temporária: os
amigos que fiz no Laboratório de Química de Coordenação e Polímero (LQCPol) – Aimée,
Alexsandro, Anallicy, Andresa, Blenda, Clara, Dayanna, Francimar, Giullia, Kleber, Lenilton,
Mayara, Nayara, Thuanny, Roseane, Verônica e Wendy, e aos amigos do programa de pós-
graduação em química, na pessoa de Hélson Ricardo. Nossa convivência diária e trocas de
experiências fizeram com que cada um de vocês contribuísse com essa conquista.
À Paula Carvalho, Diogo Santos, Rafaella Paiva, Luanna Paiva e Kelly Joyce, anjos de
luz que Deus me permitiu conhecer e que me fazem perceber que amizade é um dos sentimentos
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mais profundos e verdadeiros que alguém pode sentir. Minha eterna gratidão a vocês por fazerem
parte da minha vida.
À central analítica, em especial aos técnicos Elane e Joadir; ao Prof. Dr. Carlos Alberto
Martinez Huitle, à amiga e Dra. Danyelle Medeiros de Araújo e a todos do Laboratório de
Eletroquímica Ambiental e Aplicada; ao técnico Igor Damasceno, do DMAT; ao técnico
Artejose Revoredo, do NUPPRAR e todos os servidores e funcionários do Instituto de Química
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte que contribuíram para a realização deste
trabalho.
5
RESUMO
A quitosana (Qt) possui grande aplicação tecnológica devido apresentar características
de atoxidade, biodegradabilidade e ser renovável. O fato de ser um polímero catiônico faz com
que seja capaz de formar filmes através da técnica de automontagem (self-assembly), permitindo
sua interação com compostos diversos. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo
avaliar a influência da purificação da Qt nas formas neutra, acetato e cloridrato na construção de
filmes automontados pela sua interação com complexos nitrosil (NPS e RubpyNO). Análises do
grau de desacetilação, viscosimetria, infravermelho e análise térmica mostraram que as Qt
purificadas apresentam características distintas. A formação dos filmes foi monitorada por
espectroscopia na região do Uv-Vis e caracterizados através das técnicas de espectroscopia por
infravermelho (FTIR), análise termogravimétrica (TG/DTG), voltametria cíclica (VC),
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e energia dispersiva de Raios-X (EDS). Os
resultados mostraram que as Qt neutra e acetato formam filmes com crescimento linear e
homogêneo, com a interação de ambos os materiais confirmada pela técnica de FTIR. Os
resultados de voltametria cíclica mostram que filmes de Qt neutra e acetato com os complexos
comportam-se como processos semi-reversíveis, exceto o filme de QtAcetato/RubpyNO, que
apresenta-se como um processo irreversível. Observou-se que o método de purificação da
quitosana interfere no processo redox apresentado pelos filmes devido à forma de interação mais
fraca ou mais forte das partículas de acordo com a carga apresentada pelos policátions e
poliânions em solução, durante a formação do filme automontado. As imagens obtidas por MEV
e EDS confirmaram a presença de camadas organizadas com uma cobertura uniforme e
distribuição homogênea dos elementos na superfície do filme. A análise de TG/DTG confirmou
a estabilidade térmica dos filmes antes e após serem submetidos a VC. Testes de reação dos
filmes com ácido ascórbico (AA) e cisteína mostraram que o filme de QtNeutra/RubpyNO foi o
que apresentou melhor resposta para ambas as substâncias. Uma equação da reta foi sugerida
para a determinação de AA pelo filme de QtNeutra/RubpyNO e, para a determinação da cisteína,
estudos complementares são necessários.
Palavras Chave: Quitosana, complexos nitrosil, filmes automontados, sensor eletroquímico.
6
ABSTRACT
Chitosan (Qt) has great technological application due to present atoxic features, biodegradable
and renewable. The fact that a cationic polymer makes it capable of forming films by self-
assembly technique, allowing its interaction with various compounds. In this context, this study
aimed to evaluate the influence of purification of Qt in the neutral, acetate and hydrochloride
forms in building self-assembled films by their interaction with nitrosyl complex (SNP and
RubpyNO). Analysis of the degree of deacetylation, viscometry, infrared and thermal analysis
showed that the purified Qt have different characteristics. The formation of the films was
monitored by spectroscopy in the Uv-Vis region and characterized through spectroscopic
techniques infrared (FTIR), thermal analysis (TG/DTG), cyclic voltammetry (CV), scanning
electron microscopy (SEM) and energy dispersive X-ray (EDS). The results showed that Qt
neutral and acetate forming films linear and homogeneous growth, with the interaction of both
materials confirmed by FTIR technique. The results show that cyclic voltammetry of the neutral
and acetate Qt films and the complex behave as semi-reversible processes, except the film
QtAcetato/RubpyNO, which presents itself as an irreversible process. It was observed that chitosan
affects the purification method presented in the redox process for the films due to the shape of
weaker or stronger interaction of the particles according to the load presented by polycations and
polyanions in solution during the formation of automounted film. The images obtained by SEM
and EDS confirmed the presence of layers arranged with uniform coverage and homogeneous
distribution of the elements in the film surface. The TG/DTG analysis confirmed thermal
stability of the films before and after being subjected to VC. Reaction rolls of film with ascorbic
acid (AA) and cysteine showed that the film QtNeutra/RubpyNO showed the best response to both
substances. A straight line equation has been suggested for the determination of AA by
QtNeutra/RubpyNO film and for the determination of cysteine, additional studies are required.
Keywords: Chitosan, nitrosyl complexes, self-assembled films, electrochemical sensor.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação das unidades repetidoras da quitina e quitosana.............. 23
Figura 2 - Comparação entre as estruturas químicas da quitina e celulose............... 26
Figura 3 - Estrutura do íon [Fe(CN)5(NO)]2-
............................................................ 30
Figura 4 - Estrutura química do íon complexo RubpyNO........................................ 33
Figura 5 - Estrutura química do ácido ascórbico (a) e do ácido desidroascórbico
(b)............................................................................................................. 34
Figura 6 - Estrutura química da cisteína................................................................... 37
Figura 7 - a) Representação das multicamadas de filmes automontados em um
substrato sólido. b) Detalhe da interação eletrostática entre o policátion
e poliânion................................................................................................ 41
Figura 8 - Representação esquemática dos principais componentes de um sensor
eletroquímico............................................................................................ 44
Figura 9 - Transições eletrônicas observadas na espectroscopia de Uv-Vis............ 46
Figura 10 - Modos vibracionais de ligações similares unidas por um átomo comum
(H–C–H). Os sinais + e – indicam os movimentos perpendiculares ao
plano da página....................….............................................................. 50
Figura 11 - Representação de uma cela eletroquímica................................................ 53
Figura 12 - Exemplo de um voltamograma típico em que: Epc é o potencial de pico
catódico; Epa, potencial de pico anódico; ipc, corrente de pico catódico;
e ipa, corrente de pico anódico.................................................................. 55
Figura 13 - Micrografias de discos de titânio revestidos com quitosana por SE (a) e
BSE (b)..................................................................................................... 57
Figura 14 - Imagem da seção de uma esfera de quitosana carregada com prata
obtida por MEV (a) e mapeamento por EDS quantitativo (b) e
qualitativo dos elementos carbono (c), oxigênio (d) e prata (e)............... 59
Figura 15 - Aspecto das amostras de quitosana purificadas nas formas: neutra (a),
acetato (b) e cloridrato (c)........................................................................ 70
Figura 16 - Proposta de estrutura para as quitosanas purificadas nas formas neutra
(a), acetato (b) e cloridrato (c).................................................................. 70
Figura 17 - Curvas condutométricas das amostras de quitosana neutra ( ), acetato
( ) e cloridrato ( ) solubilizadas em HCl 0,05 mol/L para
determinação do grau de desacetilação.................................................... 71
8
Figura 18 - Curva de viscosidade específica versus concentração da QtNeutra ( ),
QtAcetato ( ) e QtCloridrato ( ), em tampão ácido acético/acetato a 25 °C
± 0,1…………………………………………………………………….. 73
Figura 19 - Espectros vibracionais na região do infravermelho das amostras de
QtNeutra (___
), QtAcetato (___
) e QtCloridrato (___
) em pastilha de KBr............... 74
Figura 20 - Espectros vibracionais na região do infravermelho das amostras de
QtNeutra (___
), QtAcetato (___
) e QtCloridrato (___
) em pastilha de KBr na
região de 2000 a 500 cm-1
........................................................................ 75
Figura 21 - Relação inter ou intramolecular provocada pelo sal que desestabiliza a
cadeia (___
) e suas respectivas derivadas (----) das amostras de
quitosana purificadas nas formas neutra (a), acetato (b) e cloridrato (c) 77
Figura 22 - (a) Espectro eletrônico dos complexos NPS (___
) e RubpyNO (___
)
obtidos em metanol; (b) Destaque das bandas de absorção na região
entre 300 e 600 nm do espectro eletrônico do NPS................................. 80
Figura 23 - Espectro de absorção na região do infravermelho obtido em pastilha
KBr para (a) NPS e RubpyNO (b)............................................................ 82
Figura 24 - Voltamograma cíclico da solução de ferricianeto de potássio 0,1 mol/L
obtido em solução de KCl 0,1 mol/L, pH = 6,7 e eletrodo de referência
de Ag/AgCl............................................................................................... 84
Figura 25 - Voltamogramas cíclicos dos complexos (a) NPS e (b) RubpyNO,
obtido em solução de KCl 0,1 mol/L utilizando o eletrodo de carbono
vítreo como eletrodo de trabalho.............................................................. 85
Figura 26 - Acompanhamento do crescimento do filme de QtNeutra com NPS (a) e
RubpyNO (b), ambos com 20 bicamadas (bcm)...................................... 87
Figura 27 - Acompanhamento do crescimento dos filmes de QtNeutra/NPS
( ),QtAcetato/NPS ( ) e QtCloridrato/NPS ( ) a 270 nm (a) e dos filmes
de QtNeutra/RubpyNO ( ),QtAcetato/RubpyNO ( ) e
QtCloridrato/RubpyNO ( ) a 293 nm (b)...................................................... 88
Figura 28 - Espectros de IV dos filmes de (a) QtNeutra/NPS (___
) e QtNeutra/RubpyNO
(___
) depositados em placa de quarto........................................................ 90
Figura 29 - Curvas termogravimétricas (___
) e suas respectivas derivadas (- - - -)
dos filmes de QtNeutra/NPS (a), QtNeutra/RubpyNO (b) QtAcetato/NPS (c)
e QtAcetato/RubpyNO (d).......................................................................... 92
9
Figura 30 - Voltamograma cíclico do ITO em solução salina de KCl 0,1 mol/L,
velocidade de varredura de 50 mV.s-1
...................................................... 94
Figura 31 - Voltamograma cíclico do filme de NPS 77,2 mmol/L (a), do filme de
RubpyNO 35,3 mmol/L (b) com 1 bicamada obtido em solução salina
de KCl 0,1 mol/L e eletrodo de trabalho de Ag/AgCl...........................
95
Figura 32 - (a) Análise eletroquímica do filme de QtNeutra/NPS em solução de KCl
0,1 mol/L a diferentes taxas de varredura: 5 mV.s-1
(___
), 10 mV.s-1
(___
), 25 mV.s-1
(___
), 50 mV.s-1
(___
), 75 mV.s-1
(___
) e 100 mV.s-1
(___
).
(b) crescimento do pico de oxidação com a velocidade de varredura.
Dados obtidos em solução eletrolítica de KCl 0,1 mol/L e eletrodo de
referência de Ag/AgCl………………………………………………...... 97
Figura 33 - Voltamograma cíclico do filme de (a) QtNeutra/NPS, (b) QtAcetato/NPS,
(c) QtNeutra/RubpyNO e (d) QtAcetato/RubpyNO em KCl 0,1 mol/L.......... 98
Figura 34 - Relação da variação de potencial versus velocidade de varredura para o
filmes de QtNeutra/NPS ( ), QtNeutra/RubpyNO (
), QtAcetato/NPS (
) 101
Figura 35 - Estiramento dos filmes de QtNeutra/NPS (___
) e QtNeutra/RubpyNO (___
)
em (a), e, em (b), dos flmes de QtAcetato/NPS (___
) e QtAcetato/RubpyNO
(___
) em pastilha de KBr após a análise por voltametria cíclica............... 102
Figura 36 - Comportamento térmico dos filmes após estes serem submetidos a VC
em KCl 0,1 mol/L para QtNeutra/NPS (a) e QtAcetato/NPS (b).................... 103
Figura 37 - Imagens de MEV dos filmes de QtNeutra/NPS (a) e QtAcetato/NPS (b)....... 104
Figura 38 - Análise de EDS do filme de QtNeutra/NPS. Distribuição dos elementos:
(a) carbono, (b) oxigênio, (c) nitrogênio e (d) ferro................................. 104
Figura 39 - Representação da interação entre a QtNeutra e o (a) NPS e (b) RubpyNO. 105
Figura 40 - Comportamento voltamétrico da solução de AA nas concentrações 8
mmol/L (___
), 15 mmol/L (___
), 20 mmol/L (___
), 25 mmol/L (___
) e 30
mmol/L (___
) em KCl 0,1 mol/L quando analisados pelo filme de
QtNeutra/NPS.............................................................................................. 107
Figura 41 - Comportamento voltamétrico da solução de AA nas concentrações 8
mmol/L (___
), 15 mmol/L (___
), 20 mmol/L (___
), 25 mmol/L (___
) e 30
mmol/L (___
) em KCl 0,1 mol/L quando analisados pelo filme de
QtNeutra/RubpyNO..................................................................................... 107
Figura 42 - Crescimento da ipa com a concentração de AA para os filmes de
QtNeutra/NPS ( ), QtNeutra/RubpyNO ( ), QtAcetato/NPS ( ) e 108
10
QtAcetato/RubpyNO ( ).............................................................................
Figura 43 - Análise por VC da solução de cisteína 0,01 M (___
) e 0,1 M (___
) em
KCl 0,1 mol/L pelo (a) eletrodo de carbono vítreo e (b) filme de
QtNeutra/RubpyNO.....................................................................................
109
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dados de grau de desacetilação, viscosidade intrínseca e massa molar de
quitosanas purificadas................................................................................. 28
Tabela 2 - Comprimento de ligação entre os átomos que constituem o íon
nitroprussiato.............................................................................................. 31
Tabela 3 - Principais transições do NPS...................................................................... 32
Tabela 4 - Dados de infravermelho do composto RubpyNO....................................... 33
Tabela 5 - Fatores que influenciam as medidas de TG/DTG....................................... 51
Tabela 6 - Valores relativos ao Grau de Desacetilação (GD) da quitosana................. 72
Tabela 7 - Dados da viscosidade intrínseca () e massa molar viscosimétrica (Mv)
para as amostras purificadas de quitosana comparados com dados da
literatura...................................................................................................... 74
Tabela 8 - Atribuições das bandas de infravermelho para as amostras de quitosana
purificadas (δ = deformação; ν = estiramento)........................................... 76
Tabela 9 - Propriedades das quitosanas em suas diferentes formas purificadas.......... 79
Tabela 10 - Atribuições das bandas de Uv-Vis presente nos complexos...................... 81
Tabela 11 - Dados eletroquímicos dos complexos NPS e RubpyNO............................ 85
Tabela 12 - Dados da inclinação e índices de correlação dos filmes de quitosana
neutra, acetato e cloridrato com complexos nitrosil………....................... 89
Tabela 13 - Atribuições das bandas observadas no espectro de IV dos filmes de
quitosana com os complexos nitrosil depositados sobre lâmina de
quartzo........................................................................................................ 90
Tabela 14 - Temperatura dos picos de degradação dos filmes de quitosanas
purificadas com complexo e suas respectivas perdas de massa.................. 91
Tabela 15 - Dados eletroquímicos para os filmes de quitosana com os complexos
nitrosil em KCl 0,1 mol/L........................................................................... 100
Tabela 16 - Potenciais de pico anódico da análise das diferentes concentrações de
AA pelo filme de QtAcetato/RubpyNO.......................................................... 108
12
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
∆Ep Variação do potencial de pico
1H-RMN Ressonância Magnética Nuclear de Próton
AA Ácido ascórbico
Bpy 2,2'-bipiridina
CaCO3 Carbonato de cálcio
Cis Referente ao isômero de posição cis de um composto orgânico ou
inorgânico
DNA Ácido desoxirribonucleico
EDS Microscopia por Energia Dispersiva de Raios-X
Epa Potencial de pico anódico
Epc Potencial de pico catódico
GA Grau de acetilação
GD Grau de desacetilação
GlcN 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose
GlcNAc 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose
HOMO Orbital molecular ocupado de maior energia
ipa Corrente de pico anódica
ipc Corrente de pico catódico
IV Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho
LB Langmuir-Blodgett
LBL Layer-by-layer
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MLCT Transferência de Carga do Metal para o Ligante
Mv Massa molar viscosimétrica
NaOH Hidróxido de sódio
NP Íon nitroprussiato
NPS Nitroprussiato de sódio
PD Polidispersão
pH Potencial hidrogeniônico
pK Cologaritmo da constante de ionização
Qt Quitosana
RubpyNO Cis-[Ru(bpy)2ImN(NO)](PF6)3); hexafluorofosfato de cis-
13
bisbipiridinaimidazolnitrosilrutênio II
Uv-Vis Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível
VC Voltametria cíclica
14
LISTA DE SÍMBOLOS
Viscosidade intrínseca
Orbital molecular sigma
°C Graus Celsius
A Área
ν Frequência de estiramento
δ Frequência de deformação angular
π Orbital molecular PI
π* Orbital molecular pi antiligante
Ω Unidade de medida de resistência elétrica
Imn Imidazol
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 18
2 OBJETIVOS.................................................................................................. 21
2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................ 21
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................... 21
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA…............................................................ 23
3.1 QUITOSANA.................................................................................................. 23
3.2 COMPLEXOS INORGÂNICOS.................................................................... 29
3.3 ÁCIDO ASCÓRBICO..................................................................................... 34
3.4 CISTEÍNA....................................................................................................... 36
3.5 FILMES AUTOMONTADOS........................................................................ 38
3.6 SENSORES ELETROQUÍMICOS................................................................. 43
3.7 TÉCNICAS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE............................................ 45
3.7.1 Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível................. 45
3.7.2 Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho......................... 48
3.7.3 Análise Termogravimétrica e Termogravimetria Derivada...................... 50
3.7.4 Voltametria Cíclica........................................................................................ 53
3.7.5 Microscopia Eletrônica de Varredura......................................................... 56
3.7.6 Análise por Energia Dispersiva de Raios-X................................................ 58
4 PARTE EXPERIMENTAL.......................................................................... 62
4.1 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA...................... 62
4.2 CONSTRUÇÃO DOS FILMES AUTOMONTADOS................................... 63
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS MATERIAIS..................................................... 64
4.3.1 Determinação do Grau de Desacetilação (GD) das Quitosanas
Purificadas...................................................................................................... 64
4.3.2 Determinação da viscosidade intrínseca e massa molar viscosimétrica
(Mv)................................................................................................................. 64
4.3.3 Análise por Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho.... 65
4.3.4 Análise por Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e
Visível.............................................................................................................. 65
4.3.5 Análise Termogravimétrica (TG)................................................................ 65
4.3.6 Voltametria Cíclica........................................................................................ 66
16
4.3.7 Caracterização morfológica.......................................................................... 66
4.4 APLICAÇÃO COMO BIOSENSOR.............................................................. 66
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 69
5.1 PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA...................... 69
5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS.................................................. 79
5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES AUTOMONTADOS.......................... 86
5.4 UTILIZAÇÃO DO FILME COMO BIOSENSOR......................................... 106
6 CONCLUSÃO................................................................................................ 112
REFERÊNCIAS............................................................................................ 114
17
Introdução
18
1 INTRODUÇÃO
A manipulação de novos materiais a nível molecular é de interesse para nanociência e
nanotecnologia, uma vez que possibilita a obtenção de novos dispositivos adaptados com
propriedades otimizadas. Principalmente quando se faz uso da combinação de materiais. Como
exemplo tem-se a quitosana, polissacarídeo de origem animal, biodegradável e bastante
conhecido da literatura por possuir várias aplicações na indústria farmacêutica e química
(DAMIAN et al., 2005). A formação de novos materiais híbridos, utilizando a quitosana e
colágeno na formação de blendas e membranas tem sido descrito na literatura (TONHI E
PLEPIS, 2002), bem como na formação de nanoparticulas de quitosana com ácido metacrílico
(MOURA, AOUADA E MATTOSO, 2008). A literatura ainda relata uma vasta gama de
interações da quitosana com substâncias diversas a fim de produzir filmes para revestimento de
alimentos. Dentre eles tem-se o ácido acético (KERCH E KORKHOV, 2011; ADILA et al.,
2013), ácido salicílico (ZHANG, ZHANG E YANG, 2015), montmorilonita (GIANNAKAS et
al., 2014), compostos fenólicos e ácidos dicarboxílicos (CHENG, WANG E WENG, 2015).
Filmes polieletrólitos de quitosana com azeite de oliva e reforçados com nanocristais de celulose
também têm sido desenvolvidos (PEREDA et al., 2014).
A capacidade de formação de filmes com elevada organização a nível molecular e o
baixo custo tem colocado em evidência a técnica de layer-by-layer (LBL) (CRESPILHO et al.,
2006). Essa técnica tem por base a adsorção de um policátion com um poliânion em um
substrato, a partir de interações eletrostáticas, podendo também ocorrer outros tipos de
interações. A técnica permite a formação de novas configurações das moléculas, proporcionam
melhorias em suas características, desenvolvendo materiais com características mais atrativas.
A capacidade de formar complexos com metais também é uma característica importante
da quitosana, o que desperta interesse por parte dos pesquisadores, principalmente com relação à
obtenção de materiais nanoestruturados. Assim, devido às suas características de polieletrólito, a
quitosana é um material promissor para formação de filmes LBL (LVOV et al., 1998;
KRASEMANN E TIEKE, 1999; SERIZAWA et al., 2000; CAMILO et al., 2003;
CONSTANTINE et al., 2003; SANTOS JR. et al., 2003; THIERRY et al., 2003; KRAJEWSKA,
2004) e que pode apresentar propriedades que possibilitem a determinação de espécies
biológicas (CAMILO et al., 2003; CONSTANTINE et al., 2003; SANTOS et al., 2003;
KRAJEWSKA, 2004; ARAÚJO et al., 2012; PAVINATTO et al., 2015).
19
Assim essa tese visa contribuir no desenvolvimento de novos materiais através de
estudos da formação da técnica de automontagem, utilizando a quitosana e complexos
inorgânicos.
20
Objetivos
21
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem como objetivo de preparar e caracterizar filmes automontados de
quitosanas purificadas de diferentes formas com nitroprussiato de sódio (NPS) e Cis-
[Ru(bpy)2ImN(NO)](PF6)3, expresso como RubpyNO.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a influência do método de purificação da quitosana na formação dos filmes
automontados.
• Monitorar pela técnica de Uv-Vis o crescimento dos filmes automontados e a interação
do complexo/Quitosana.
• Caracterizar os filmes através das técnicas de Espectroscopia Vibracional na Região do
Infravermelho (IV), Análise Eletroquímica por Voltametria Cíclica (VC), Análise
Termogravimétrica (TG) e Termogravimetria Derivada (DTG), Microscopia Eletrônica
de Varredura (MEV) e Microscopia por Energia Dispersiva de Raios-X (EDS).
• Avaliar a possibilidade dos filmes atuarem como sensores eletroquímicos.
22
Fundamentação teórica
23
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 QUITOSANA
A quitina é um dos constituintes presentes em exoesqueletos de animais marinhos,
juntamente com CaCO3, proteínas, lipídeos e pigmentos (MATHUR E NARANG, 1990;
PERCOT, VITON E DOMARD, 2003; EINBU et al., 2004). É um polissacarídeo de cadeia
linear, constituída quase que exclusivamente por unidades de 2-acetamino-2-desoxi-D-
glicopiranose unidas por ligações β-(1→4) (ZHANG et al., 2000; EINBU et al., 2004). Já a
quitosana é um dos principais derivados de quitina, correspondendo a um copolímero constituído
de unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose (GlcNAc) e 2-amino-2-desoxi-D-
glicopiranose (GlcN) unidas pelo mesmo tipo de ligação glicosídica presente na quitina (Figura
1).
Figura 1- Representação das unidades repetidoras da quitina e quitosana.
Fonte: (BATTISTI E CAMPANA-FILHO, 2008).
O termo quitosana é empregado para identificar as quitinas que passaram por um
processo de desacetilação (redução do grupamento acetil presente do grupamento amino)
(ROBERTS, 1992; ACOSTA et al., 1993) e que sejam solúveis em soluções aquosas diluídas de
ácidos (LI et al., 1992), tais como ácidos acético e clorídrico, enquanto que quitina corresponde a
produtos muito mais acetilados e insolúveis na maioria desses solventes. A solubilidade
apresentada pela quitosana é atribuída à presença de grupos amino na sua estrutura, os quais são
protonados em meio ácido (ACOSTA et al., 1993), resultando em cargas positivas distribuídas
24
ao longo de suas cadeias e conferindo hidrossolubilidade ao polissacarídeo. Além da presença de
um número suficiente de grupos amino, a sua distribuição ao longo das cadeias também afeta a
solubilidade das quitosanas (ROBERTS, 1992).
A quitosana é obtida fazendo-se uso de soluções concentradas de hidróxido de sódio (40
a 50 %), o que costuma promover também reações de degradação do polímero. Esta reação de
hidrólise pode remover alguns ou todos os grupos acetila da quitina, disponibilizando grupos
amino que impõem a natureza catiônica da quitosana resultante, que consiste de uma mistura de
polímeros de diferentes tamanhos (YOMOTA, MIYAZAKI E OKADA, 1993; OTTOY et al.,
1996). A distribuição de massa molar, ou seja, a polidispersão é influenciada por vários
parâmetros, tais como: tempo, temperatura, concentração e condições atmosféricas empregadas
na reação de N-desacetilação. Desta forma as amostras de quitosanas podem ter características
diferentes quanto ao grau de desacetilação (GD), viscosidade e distribuição de massa molar, que
irão influenciar nas propriedades do polímero (CHEN E HWA, 1996).
As propriedades físicas e químicas da quitina e de seus derivados N-desacetilados
(quitosana) são muito diferentes. Quitosana comercial possui, geralmente, grau de desacetilação
variando de 70 a 95%, com massa molar na faixa de 104-10
6 g.mol
-1. Como muitas das
propriedades destes polissacarídeos estão intimamente relacionadas a estes dois parâmetros
(MIMA et al., 1983; ZHANG et al., 2000), torna-se imprescindível a determinação dos mesmos.
Deste modo, o conhecimento preciso do teor de grupos N-desacetilados (GD) e,
consequentemente, de grupos amino (NH2) é importante, de maneira a caracterizar qualquer
processo de desacetilação da quitina, assim como qualquer outra modificação química
(SANNAN, KURITA E IWAKURA, 1976; DAVIES E HAYES, 1988; RINAUDO E
DOMARD, 1989).
A literatura descreve vários métodos para determinação do percentual dos grupos
amínicos livres na quitosana. Hayes e Davies (1978) desenvolveram um método potenciométrico
em que o polímero é dissolvido em um excesso de ácido clorídrico (HCl) 0,3 M e diluído em um
grande volume de água destilada para permitir uma boa dispersão do precipitado formado após
ter sido efetuada a titulação com hidróxido de sódio (NaOH). A curva de titulação apresenta dois
pontos de inflexão; o primeiro é a neutralização do HCl utilizado na dissolução do polímero e o
segundo, a desprotonação dos grupos amínicos correspondente à diferença entre os volumes
relacionados com a quantidade de NaOH necessária para desprotoná-los. Domszy e Roberts
(1985) propuseram a técnica da espectroscopia de infravermelho para determinação do grau de
N-acetilação da quitosana. Métodos para detectar a remoção dos grupos acetila na quitosana
incluem cromatografia gasosa, reação colorimétrica com ninidrina e adsorção de corantes
25
(MUZZARELLI E ROCCHETTI, 1986; SABNIS E BLOCK, 1997; SINGH, E RAY, 1998).
Muzzarelli e Rocchetti (1986) sugeriram que a espectrofotometria de UV a 199 nm é o melhor
método para determinar o grau de desacetilação em amostras de quitosana. Com esta técnica, a
leitura de absorbância de N-acetilglicosamina é linearmente dependente da concentração e não é
influenciada pela presença de ácido acético.
A solubilidade da quitosana está relacionada com a quantidade de grupos amino
protonados (-NH3+) na cadeia polimérica. Quanto maior a quantidade destes grupos, maior a
repulsão eletrostática entre as cadeias e também maior a solvatação em água. Para uma dada
concentração de ácido, o grau de protonação depende do pK do ácido usado para solubilizar a
quitosana (RINAUDO, PAVLOV E DESBRIÉRES, 1999). A quitosana é insolúvel em água,
em solventes orgânicos e em bases, mas é solúvel na maioria das soluções de ácidos orgânicos
com pH inferior a 6. O ácido acético e o fórmico são os mais usados para a solubilização da
quitosana. Alguns ácidos diluídos, tais como: ácido nítrico, clorídrico, perclórico e fosfórico,
também podem ser usados para preparar uma dispersão da quitosana, mas somente após
prolongada agitação e aquecimento. Misturas como dimetilformamida com tetróxido de
dinitrogênio numa proporção de 3:1 também podem ser utilizados como solventes (DAMIAN et
al., 2005).
A quitosana é susceptível a mudanças estruturais, devido à grande quantidade de grupos
reativos como as hidroxilas e principalmente os grupos amino, especialmente em reações de N-
acetilação, N-alquilação, N-carboxilação, N-sulfonação e formação de bases de Schiff com
aldeídos e cetonas (PETER, 1995).
Por possuir características como bioatividade, biodegradabilidade, biocompatibilidade,
atoxicidez, e sua extração não causar problemas ao ecossistema, a quitina e seus derivados vêm
sendo extensivamente estudados por diversos grupos de pesquisa. Sua estrutura química é muito
semelhante à da celulose (Figura 2), outro tipo de polissacarídeo conhecido e amplamente
utilizado. Diferem apenas pelo fato dos grupos hidroxilas (-OH) do carbono-2 de cada unidade
glicosídica deste serem substituídos por grupos aminoacetilados (-NHCOCH3) (SYNOWIECKI
E AL-KHATEEB, 2003; FERREIRA et al., 2009). Devido à presença de grupos amínicos, a
quitosana é considerada mais versátil quimicamente do que a celulose.
Os maiores produtores de quitina e quitosana (Estados Unidos e Japão) têm aumentado
nos últimos anos a produção desses polímeros naturais em consequência do aumento da sua
utilização nas diferentes aplicações, principalmente na indústria de alimentos, quelação de metais
e produção de membranas simétricas para separação de gases (EIDEM, 1980).
26
Figura 1 - Comparação entre as estruturas químicas da quitina e celulose.
Quitina Celulose
Fonte: Próprio autor (2016).
Para a caracterização de um polímero, é necessário que este se apresente o mais puro
possível, caso contrário o estabelecimento da relação entre as características estruturais, com
suas propriedades físico-químicas será muito dificultado. Assim, a etapa de purificação de um
polissacarídeo é um processo importante e determinante nas suas propriedades (SIGNINI E
CAMPANA FILHO, 2001).
A ocorrência de agregação e a ausência de solubilidade se devem ao tipo de processo
geralmente empregado para a obtenção desses polímeros, que gera produtos não uniformes
(SCHULZ, BURCHARD E DÖNGES, 1996), mas também pode ser provocado pela natureza
associativa dos polissacarídeos (JUSTE E MAJEWICZ, 1985). Este é o caso de
carboximetilcelulose e de quitosana, obtidos por derivatização de celulose (HIRANO, 1986) e
por desacetilação de quitina (FENGEL E WEGENER, 1984), respectivamente. Assim, a
desacetilação de quitina e a carboximetilação de celulose em solução aquosa de NaOH se
processam heterogeneamente e geram produtos cujas cadeias são formadas por sequencias de
unidades modificadas quimicamente e unidades que não sofreram a modificação química
desejada (ROBERTS, 1992; LI, REVOL E MARCHESSAULT, 1997). As propriedades de
quitosana e carboximetilcelulose, incluindo solubilidade, dependem fortemente do grau médio de
carga dos polímeros e de sua distribuição ao longo das cadeias.
Ainda com relação ao estabelecimento de correlações entre estruturas e propriedades de
polissacarídeos polieletrolíticos é também muito importante que na amostra purificada apenas
um tipo de contra-íon esteja presente (RINAUDO, 1993). Dessa maneira, o comportamento em
função do ambiente (acidez, força iônica e presença de co-íons/contra-íons, temperatura) em que
o polieletrólito está dissolvido pode ser melhor estudado e compreendido. De maneira geral, os
polieletrólitos polianiônicos, isto é, aqueles portadores de sítios iônicos que desenvolvem cargas
negativas quando dissolvidos nos solventes aquosos apropriados, são purificados através de
procedimentos que envolvem as seguintes etapas sequenciais: i) dissolução em meio aquoso de
força iônica controlada; ii) filtração; iii) precipitação por adição de não-solvente e iv) lavagens e
27
secagem. Polieletrólitos assim purificados são formas salinas hidrofílicas e, em geral, são
solúveis em água à temperatura ambiente. A natureza do sal empregado para controlar a força
iônica na etapa de dissolução define previamente o tipo de contra-íon que estará presente na
amostra purificada.
De fato, para assegurar que apenas um contra-íon estará presente após a purificação, um
grande excesso molar de sal é adicionado em relação à quantidade de sítios iônicos do
polieletrólito. Uma vez que componentes insolúveis e agregados forem eliminados, por filtração
ou por centrifugação, a solubilidade do polieletrólito no meio é progressivamente diminuída
através da adição de um não solvente o qual, em geral, é um álcool ou uma cetona de cadeia
curta. Em função das concentrações de polímero e de sal adicionado, a precipitação do polímero
ocorrerá quando um teor crítico de não solvente tiver sido atingido, devido a sua pobre
solubilidade nesse meio. O polieletrólito, precipitado na forma salina, é então exaustivamente
lavado para eliminar o excesso de sal e submetido a secagem. Dessa maneira, polieletrólitos
polianiônicos portadores de grupos carboxílicos, tais como carboximetilcelulose, são purificados
como sais de sódio hidrossolúveis. Alternativamente, a solução aquosa do polieletrólito pode ser
submetida à diálise contra solução contendo um grande excesso do contra-íon desejado e o
polímero na forma salina é isolado por liofilização.
Signini e Campana Filho (2001) relatam três formas distintas de purificação da
quitosana: neutra, acetato e cloridrato. Em seu estudo eles caracterizaram e compararam quanto a
solubilidade, hidrofilicidade, morfologia de suas superfícies e cristalinidade. A amostra
purificada na forma neutra apresenta características e propriedades diferentes das formas salinas,
principalmente a purificada na forma de cloridratos. As morfologias das superfícies das formas
purificadas são semelhantes, mas cloridrato de quitosana obtido por liofilização apresentaram
poros que não foram observados nas outras amostras. Além disso, a quitosana purificada na
forma neutra não apresentou solubilidade em água, mas o acetato de quitosana é parcialmente
solúvel. Essas duas formas de quitosana apresentam hidrofilicidades e cristalinidades
semelhantes, mas no caso do cloridrato a presença de cargas e de contra-íons provenientes de um
ácido forte, utilizado no processo de purificação, aumenta a hidrofilicidade, conferindo
hidrossolubilidade e alterando significativamente as interações inter e intracadeias, modificando
o empacotamento no estado sólido e resultando em importante decréscimo de cristalinidade. No
caso de acetato de quitosana foi observado que os cristalitos são menores, o que pode ser
atribuído à protonação parcial dos grupos amino e à presença de ânions acetato. A Tabela 1
mostra os valores de algumas características da quitosana purificada de formas distintas. Os
dados mostram que, quanto aos graus de desacetilação, viscosidades intrínsecas e massas
28
molares viscosimétricas, independente do procedimento utilizado para purificação da amostra
comercial, as quitosanas purificadas são muito semelhantes, o que sustena a afirmação que os
métodos utilizados por Signini e Campana Filho (2001) são adequados à purificação da
quitosana.
Tabela 1 - Dados de grau de desacetilação, viscosidade intrínseca e massa molar da quitosanas
purificadas.
Tipo de purificação GD (%) (mL/g) Mv x 104 (g/mol)
Neutra 83,5 689 16,7
Acetato 89,4 725 17,2
Cloridrato n.d. 613 14,3
Fonte: Signini e Campanha Filho (2001).
A metodologia de purificação também afeta a estabilidade térmica, esta é geralmente
caracterizada pela temperatura na qual a decomposição do polímero se torna perceptível pela
formação de produtos. Um dos fatores determinantes da estabilidade térmica do polímero é a
energia das ligações da cadeia principal (LIM E WAN, 1995). A ligação C-C é uma das mais
resistentes à degradação térmica. A presença de átomos de hidrogênio na molécula do polímero
diminui a energia entre a ligação C-C, motivo pelo qual os hidrocarbonetos com elevada massa
molecular e seus derivados possuem comparativamente baixa estabilidade sendo facilmente
degradados com o aquecimento a temperaturas mais elevadas. Quitina e quitosana, quando
aquecidas a temperaturas mais elevadas sofrem degradação. A estabilidade térmica da quitina
aumenta com o grau de acetilação. Quando a forma acetilada prevalece, observa-se um pico
exotérmico em 320 °C, enquanto que, na forma desacetilada o evento ocorre a 280 °C
(PENICHE-COVAS E JIMÉNEZ, 1998).
Assim, essas características podem influenciar nas aplicações da quitosana, como
exemplo, o processo de geração de pró-fármacos que utilizam este polímero como um agente
transportador bastante eficiente, cuja liberação da droga ocorre no local-alvo permitindo
diminuir ou resolver inconvenientes que determinados fármacos apresentam, tais como os efeitos
adversos (SONG, ONISHI E NAGAI, 1993). O desenvolvimento de microesferas de quitosana,
para atuação como transportador de fármacos, gera importantes propriedades como
hidrofilicidade (melhora na dissolução de drogas fracamente solúveis), lipofilicidade (apresentou
29
efeito significativo sobre o metabolismo de gorduras no corpo) e estabilidade térmica aos
compostos terapêuticos (SINHA et al., 2004).
Os polímeros naturais são uma classe de suportes amplamente empregados na
imobilização de enzimas com vantagem por apresentarem baixo custo e fácil degradabilidade,
não causando danos ao meio ambiente. A aplicação de quitosana como suporte para a
imobilização de enzimas se deve às suas diferentes configurações geométricas como pó,
escamas, hidrogéis, membranas, fibras e outras, além da presença de diferentes grupos
funcionais, como hidroxila e amino, que permitem a utilização de diferentes métodos de
imobilização (MENDES et al., 2011). Diferentes corantes têm sido relatados por serem
eficazmente removidos por meio de modificações da quitosana. Isso ocorre principalmente
devido às suas propriedades como cationicidade, alta capacidade de adsorção, estrutura
macromolecular, abundância e preço baixo (VAKILI et al., 2014).
Outra aplicação da quitosana, apresentada por Airoldi (2008) está relacionada à
remoção de cátions metálicos, que acontece através dos efeitos interativos com os grupos amino
livres do polissacarídeo, que podem promover a coordenação com o metal. Este autor também
relatou a capacidade de uso da quitosana associada a polímeros inorgânicos como hidroxiapatita
para utilização como reparador de ossos, com sílica em polieletrólitos, e na confecção de
sensores eletroquímicos quando intercalado com montmorilonita ou associados à sepiolita na
formação de membranas híbridas. Também já são bem conhecidas as aplicações de filmes e
membranas de quitosana utilizadas no recobrimento de alimentos a fim de estender a vida útil de
frutas, legumes e sementes (ASSIS E ALVES, 2002; TANADA-PALMU et al., 2005; MACIEL
et al., 2012, VAN DEN BROEK et al., 2015), principalmente devido às propriedades
antimicrobianas da quitosana. Esta é explicada pela protonação dos grupos amínicos livres,
quando este polímero entra em contato com fluidos biológicos, resultando na aglutinação de
células microbianas e inibição do seu crescimento.
3.2 COMPLEXOS INORGÂNICOS
Embora a maior parte dos compostos no organismo humano tenha o carbono como
principal elemento, íons metálicos também estão presentes e desempenham funções necessárias
ao funcionamento do organismo e manutenção da vida. Alguns metais, como o sódio e potássio,
são encontrados como íons monoatômicos simples nos fluidos do organismo. Porém, íons
metálicos associam-se a ligantes e executam suas funções fazendo parte de complexos metálicos,
30
como no caso do ferro que se liga a porfirina no sangue para atuar no transporte de oxigênio pelo
organismo.
Compostos de coordenação têm sido usados ao longo dos anos para o tratamento de
várias doenças (GIRALDI e CAMPOLIM, 2014), um deles é o nitroprussiato de sódio (NPS),
com fórmula molecular Na2[Fe(CN)5(NO)], Figura 3. Ele é utilizado há mais de 50 anos como
vasodilatador em casos de emergência em ataques de hipertensão, controle de pressão sanguínea
em cirurgias e no tratamento da hipertensão crônica, pois este proporciona uma rápida resposta
sem necessidade de sua utilização em excesso (CÉSAR et al., 2001; STOCCHE et al., 2003;
SASS et al., 2007; VALENTI et al., 2009; FREITAS JR. et al., 2012). Há relatos da utilização do
NPS na determinação de compostos sulfurados em águas doces e salinas após a permeação do
sulfeto em uma membrana de silicone (SONNE E DASGUPTA, 1991), assim como, na
determinação de fenóis em sistemas aquosos bifásicos (RODRIGUES, SILVA E SILVA, 2010),
e, ainda na detecção de cefradina em comprimidos (ZHANG et al., 2008), porém, todos esses
através de determinação espectrofotométrica, pela utilização do NPS como agente cromogênico.
Chen e colaboradores (2015) relataram que a interação direta do polissacarídeo goma xantana
com NPS mostrou-se capaz de proteger células cartilaginosas da morte celular induzida pelo
complexo.
Figura 3 - Estrutura do íon [Fe(CN)5(NO)]2-
.
Fonte: Próprio autor (2016).
A preocupação com a administração do nitroprussiato é que ele também pode liberar
íons cianeto, que são convertidos em tiocianato in vivo também pela enzima rodanase. Por esta
razão, a duração do tratamento não deve ser superior a 72 horas, e a dosagem não pode exceder
os 10 mg/kg/min e a sua concentração em fluidos biológicos devem ser monitorado. A meia-vida
31
do nitroprussiato é de cerca de 10 min e 90 % da dosagem é encontrada no plasma humano a
níveis de concentração de 0,1 a 1 mg/mL (PEREIRA E ZANONI, 2007).
O NPS tem suas propriedades químicas e físicas baseadas na existência de orbitais d
semi-preenchidos do átomo de ferro. Quando sólido apresenta-se na forma de cristal
ortorrômbico, com simetria C4v e seus dados relacionados aos comprimentos de ligação estão
apresentados na Tabela 2. O comprimento da ligação Fe-NO é uma característica distinta de
complexos de ligação contendo ligantes NO, pois a distância metal – ligante é menor que nos
demais complexos, indicando que o grupo NO está fortemente ligado ao metal. Tal característica
sugere um caráter de ligação tripla, composta por uma ligação σ utilizando um orbital d vazio do
metal e o par de elétrons não compartilhados do nitrogênio e de duas ligações π formadas entre o
orbital π* do NO e o orbital d preenchido do ferro, ou então, devido a uma forte retrodoação
entre os orbitais do metal e do ligante. O átomo de ferro é ligeiramente deslocado em direção ao
grupo NO com relação ao plano estabelecido pelos quatro átomos de carbono. As ligações C-N e
Fe-C são todas equivalentes entre si. Além disso, o ângulo Fe-N-O é de 178° e o ângulo N-Fe-
Cequatorial é de 96° (SWINEHART, 1967).
Tabela 2 - Comprimentos de ligação entre os átomos que constituem o íon nitroprussiato.
Ligação Comprimento (em angstrons)
Fe-NO 1,67 ± 0,02
N-O 1,13 ± 0,02
CN 1,16 ± 0,02
Fe-C 1,93 ± 0,02
Fonte: (SWINEHART, 1967).
Os orbitais de maior energia ocupados (HOMO) do NPS no estado fundamental são
representados pelos níveis (dxz,yz)4(dxy)
2 e o orbital desocupado de menor energia é o orbital π*
do NO. As principais transições eletrônicas observadas nesse composto estão relacionadas na
Tabela 3.
A literatura traz vários estudos com relação às propriedades químicas e eletroquímicas
do íon nitroprussiato (NP), [Fe(CN)5NO]2-
(CARAPUÇA et al., 2000). O caráter eletrofílico e a
redutibilidade deste íon estão atribuídas ao ligante NO+. Estes estudos são interessantes não só
do ponto de vista das propriedades físico-químicas do grupo nitrosilo coordenado
32
(MCCLEVERTY, 1979; ESTRIN et al., 1996), mas também da compreensão do papel biológico
do NP como uma fonte in vivo de óxido nítrico (BUTLER E WILLIAMS, 1993).
Tabela 3 - Principais transições do NPS.
Transição Comprimento de onda Tipo de transição
dxy → π*NO 480 nm MLCT
dxz, dyz → π*NO 394 nm MLCT
dxy → dx2
-y2 330 nm d–d
dxz, dyz → dz2 264 nm d–d
dxz, dyz → dx2
-y2 238 nm d–d
dxy → π*CN 200 nm MLCT
Fonte: (SWINEHART, 1967).
Em solução aquosa a redução eletroquímica do NP é um processo que envolve a
redução de quatro elétrons. O processo de redução é dependente das condições do meio, como o
pH da solução e em geral ocorre em 3 processos (CARAPUÇA et al., 2000). O primeiro refere-
se ao processo (1) de redução de um elétron em que o ligante NO+ é reduzido para NO, obtendo-
se o íon [Fe(CN)5NO]3-
. Este íon em meio ácido sofre um processo de redução (2) gerando a
espécie [Fe(CN)4NO]2-
, liberando o ligante cianeto da posição axial (BAKHTIAR, E OCHIAI,
1999).
Processo I:
[Fe(CN)5NO]2-
+ e- [Fe(CN)5NO]
3- (1)
[Fe(CN)5NO]3-
[Fe(CN)4NO]2-
+ CN- (2)
Processo II:
[Fe(CN)4NO]2-
+ e- [Fe(CN)4NO]
3- (3)
Outra espécie doadora de NO é o composto Cis-[Ru(bpy)2ImN(NO)](PF6)3 –
hexafluorofosfato de cis-bisbipiridinaimidazolnitrosilrutênio II, (RubpyNO), um nitrosil
complexo de rutênio que apresenta boa ação inibitória de agentes transmissores da doença de
chagas. Esse complexo foi amplamente estudado e caracterizado por Silva e colaboradores
(2006) e a estrutura química do íon é apresentada na Figura 4.
33
Figura 4 - Estrutura química do íon complexo RubpyNO.
Fonte: Próprio autor (2016).
Este complexo nitrosilado apresenta uma intensa banda em torno de 296 nm, atribuída a
uma transição interna do ligante bipiridina do tipo π → π*(bpy) que geralmente aparece nesta
região para complexos do tipo bis-(2,2-bipiridina)rutênio(II), e outra banda em torno de 325 nm,
atribuída a uma transição de transferência de carga metal-ligante (MLTC) do tipo dπRuII →
π*(bpy). A forte interação da back-bonding do ligante NO+ provoca um maior desdobramento
dos orbitais dπ do rutênio resultando em um deslocamento das absorções, referente às transições
de transferência de carga metal-ligante do tipo dπRuII → π*(bpy), para região de maior energia
(em torno de 325 nm), em relação aos nitrito complexos (SILVA et al., 2006).
A Tabela 4 apresenta as bandas observadas no espectro vibracional do RubpyNO e suas
atribuições. A principal característica desse espectro é o aparecimento de um pico em 1944 cm-1
referente ao estiramento N-O do ligante NO coordenado ao centro metálico de forma linear.
Além de apresentar bandas características dos modos vibracionais da bipiridina.
Tabela 4 - Dados de infravermelho do composto RubpyNO.
Número de onda (cm-1
) Atribuição
3142, 3098 ν(C-H)
1452 ν(C=N)
1443 ν(C=C)
1944 ν(NO+)
765 δ(C-H)
840, 559 ν(P-F6-)
Fonte: (SILVA et al., 2006).
34
Uma observação importante a respeito desse complexo é que a sua utilização, assim
como o NPS, deve ocorrer na ausência ou exposição mínima à luz, a fim de evitar sua
decomposição fotoquímica que ocorre com rápida liberação do NO. Além disso, quando em
solução, é conveniente usar pH ácido pois, em pH mais alto esse nitrosilo-complexo se converte
em nitrito-complexo provocando consideráveis mudanças no espectro eletrônico.
3.3 ÁCIDO ASCÓRBICO
Ácido ascórbico (AA) é o nome comum dado ao ácido 3-oxo-L-gulofuranolactona (5R)-
5-[(1S)-1,2-diidroxietil]-3,4-diidroxifurano-2(5H)-ona, um sólido branco ou amarelado,
cristalino com ponto de fusão de 190 a 192 °C, massa molecular 176,13 g/mol, densidade 1,65
g/cm³, bastante solúvel em água e etanol absoluto, insolúvel nos solventes orgânicos comuns,
como clorofórmio, benzeno e éter. Ocorre naturalmente em alimentos sob duas formas: a forma
reduzida (geralmente designada como ácido ascórbico) e a forma oxidada (ácido
desidroascórbico) (Figuras 5a e 5b, respectivamente). Ambos são fisiologicamente ativos e são
encontrados nos tecidos orgânicos. Uma nova oxidação do ácido desidroascórbico para o ácido
dicetogulônico produz uma inativação irreversível da vitamina (ANDERSON et al., 1988).
Figura 5 - Estrutura química do ácido ascórbico (a) e do ácido desidroascórbico (b).
(a) (b)
Fonte: Próprio autor (2016)
Também conhecida como vitamina C, o AA é também um poderoso antioxidante pela
facilidade de oxidação devido a presença do grupo fortemente redutor em sua estrutura,
denominado de redutona, a qual se refere também as hidroxilas do grupo C=C (BOBBIO E
BOBBIO, 1992). As moléculas dessa vitamina sofrem oxidação antes que outras moléculas do
organismo se oxidem, impedindo e protegendo essas outras moléculas da oxidação além de ter a
35
capacidade de prevenir a doença escorbuto, causada pela deficiência dessa vitamina no
organismo.
Independente da forma que ocorra (hidrolíticas, oxidação enzimática, fotoxidação ou
autoxidação), a oxidação do AA basicamente envolve a adição de um átomo de oxigênio ou a
remoção de um átomo de hidrogênio das moléculas que constituem os alimentos, formando
ânions que apresentam atividade metabólica.
A vitamina C é transportada no plasma sob a forma de um ânion livre, sendo transferida
por difusão simples no interior dos leucócitos e dos eritrócitos. No ser humano adulto sadio, a
reserva de ácido ascórbico é de aproximadamente 1500 mg com uma ingestão média diária de 45
a 75 mg. Ingestões maiores que 220 mg/dia elevam a reserva orgânica total para um nível
compreendido entre 2.300 e 2.800 mg (GUILLAND E LEQUEU, 1995).
Distribuindo-se amplamente em todos os tecidos do organismo, as mais altas
concentrações de AA encontram-se no córtex supra-renal e na hipófise e em menor teor nos
músculos e tecido adiposo. Porém, quando administrado em altas doses, após atingir
concentração máxima nos tecidos, sofre eliminação do excesso pelos rins (ARANHA et al.,
2000).
A vitamina C é essencial para seres humanos, uma vez que age como antioxidante,
eliminador de radicais livres e nutre as células, protegendo-as de danos causados pelos oxidantes,
da mesma forma que o α-tocoferol e o β-caroteno (PADH, 1991). Em humanos, vários fatores
podem regular a biodisponibilidade do ácido ascórbico para os tecidos. Dentre eles pode-se citar
o consumo dietético, sua ligação a uma proteína no soro ou no plasma, e a forma em que este se
encontra (DHARIWAL et al., 1991).
As concentrações plasmáticas também variam com a ingestão. Uma ingestão adequada
está associada a concentrações superiores a 0,5 mg/dL (28 mmol/L), enquanto concentrações de
0,15 mg/dL (8,5 mmol/L) são observadas em indivíduos com escorbuto franco. Quando a dieta
não contém essencialmente nenhum ascorbato, as concentrações plasmáticas diminuem.
Contudo, uma ingestão equilibrada de AA atua na prevenção e tratamento de diversas patologias
tais como o apoio ao sistema imunológico pelo aumento da concentração de glóbulos brancos e
imunoglobulinas no sangue; regulação da síntese do colesterol; manutenção de ferro no estado
ferroso, mantendo assim a atividade completa das enzimas hidroxilases (DU, CULLEN E
BUETTNER, 2012) e proteção do organismo contra o desenvolvimento de câncer
(PATTERSON et al., 1997; LORIA et al., 2000; LONGCHAR E PRASAD, 2015; MIURA,
YAZAMA E TAI, 2015).
36
Geralmente as concentrações de AA no organismo são determinadas por métodos
enzimáticos (MARCHESINI et al., 1974), métodos cromatográficos com detecção fluorimétrica
(TSAO E YOUNG, 1985) e métodos eletroanalíticos. Estes se tornaram mais eficientes a partir
do desenvolvimento de eletrodos modificados uma vez que promovem uma detecção mais
seletiva, de maior sensibilidade e escala de concentração (KUMAR, LO E CHEN, 2008, LIN et
al., 2008 E MANJUNATHA et al., 2010).
Jirimali e colaboradores (2013) desenvolveram um eletrodo de carbono modificado com
quitosana e hidroquinona para a determinação eletroquímica de AA. Sha e colaboradores (2006)
construíram filmes multicamadas de nanotubo de carbono e polímero redox sob um eletrodo de
carbono usando a técnica da automontagem e obteve boa atividade eletrocatalítica para a
oxidação da vitamina. Deng, Xu e Li (2013) conseguiram realizar a determinação simultânea de
AA e rutina com um eletrodo de pasta negra de acetileno modificada com filme compósito de
nanotubos de carbono de paredes múltiplas com quitosana. O material exibiu bom desempenho
na determinação simultânea das substâncias, tais como rápida resposta voltamétrica, vasta gama
de concentração, baixo limite de detecção, excelente reprodutibilidade e boa estabilidade.
3.4 CISTEÍNA
O ácido (R)-2-amino-3-sulfanil-propanóico ou cisteína é um aminoácido, cujo nome
tem origem na palavra grega kustis (bexiga), pois foi isolada inicialmente a partir de cálculos
renais (sob a forma de cistina). Encontra-se presente em proteínas e enzimas naturais e
desempenham um importante papel em sistemas biológicos. Sabe-se que é ativo na função
catalítica de enzimas, outros peptídeos e proteínas sendo importante para o seu metabolismo e
atua como indicador de câncer, agente radioprotetor, antitoxina, antioxidante e eliminador de
radicais livres (SILVA et al., 2012).
Sintetizado in vivo, em condições fisiológicas normais, a cisteína apresenta o grupo
funcional tiol (R-SH) em sua cadeia, desempenhando um papel central na química dos tióis
biológicos. Tipicamente, as concentrações intracelulares da cisteína estão na ordem de 30 – 200
mmol.L-1
. Níveis anormais deste aminoácido estão relacionados com o desenvolvimento de
condições patológicas tais como doença de Parkinson e Alzheimer, leucemia, diabetes, doenças
do fígado e etc. Contudo, o mesmo também pode ser utilizado como suplemento alimentar
atuando como desintoxicante do álcool e poluentes ambientais (metais tóxicos), e auxiliando na
37
formação da queratina, pele e unhas (BRITO e VOLP, 2010; SILVA et al., 2012, CORRÊA et
al., 2013).
Figura 6 - Estrutura química da cisteína.
Fonte: Próprio autor (2016).
O átomo de enxofre da cisteína proporciona uma gama considerável de reatividade
química e flexibilidade estrutural do aminoácido. Seus seis elétrons de valência estão
distribuídos entre quatro orbitais do tipo sp3, sendo dois pares livres e duas ligações sigma com C
e H, respectivamente. Essa configuração permite que o átomo de enxofre estabeleça ligações
coordenadas covalentes com os principais átomos dos organismos vivos (C, H, O, N, P), que
forme complexos de coordenação estáveis com íons de metais de transição (Zn, Fe, Cu), e seja
estável à vários estados de oxidação (-SH, -SS-, -SO2-, -SO3
-). Em pH fisiológico, podem se
apresentar na forma de tiol (mais comum) ou como tiolato (mais reativo) (BUTTLE e MORT,
2004; GO, CHANDLER e JONES, 2015).
Esse aminoácido é submetido a uma série de modificações enzimáticas e não
enzimáticas, muitas vezes mediadas pela dependência do pH como a ionização para a forma de
tiolato (R-S-). A coordenação de R-S- com complexos de íon de metais é comum e é
amplamente utilizada para regular a estrutura da proteína, manutenção da homeostase de íon
metálico, ou sequestrar um agente metálico tóxico. R-S é sujeito à oxidação ([O]) para a forma
sulfenato (R-SO-) por H2O2 e outros oxidantes de dois elétrons. R-SO- pode reagir com óxido
nítrico através de vários meios de transferência de íon nitrônio (NO+) produzindo o composto
nitrosotiol (R-SNO) correspondente. O Cisteinil enxofre passa por uma variedade de outras
modificações covalentes reversíveis e irreversíveis, incluindo reações de formação de dissulfeto,
persulfurização, alquilação, arilação, e reações enzimáticas e que pode ter efeitos na regulação
redox, função e sinalização da cisteína (SOLOMONS e FRYHLE, 2009; BUTTLE e MORT,
2004; GO, CHANDLER e JONES, 2015).
38
Grossi e D’Angelo (2005) estudaram o processo de redução do NPS a [Fe(CN)5(NO)]3-
por tióis tais como a cisteína e a glutaniona. Segundo esses autores, a intermediação das espécies
radicais confirma que a liberação de NO se dá através de um mecanismo de transferência de
elétrons e não através de uma clivagem direta da ligação ferro-nitrosil. A formação de
nitrosotióis, que são considerados o armazenamento e os transportadores de NO in vivo, permitiu
a hipótese de que a ação de NPS em situações de emergência ocorre devido à liberação
espontânea de NO, uma vez que esta etapa acontece de forma rápida.
Devido à sua importância, a pesquisa em métodos de determinação da cisteína tem sido
alvo de muitos estudos recentes. Corrêa et al. (2013) expõe alguns desses métodos e suas
características. Os métodos espectroscópicos geralmente necessitam da derivação da cisteína
para introduzir uma porção cromogênica ou fluorogênica. A detecção através da cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) atinge o limite de detecção da ordem de fentomol, porém, pode
levar mais de 10 minutos para sua execução e também necessitam de derivação para a detecção
da fluorescência. Por outro lado, métodos eletroquímicos têm a vantagem de resposta rápida,
baixo custo relativo, simplicidade da instrumentação e alta sensibilidade, que os tornam mais
adequados para usos práticos. Assim, algumas técnicas eletroquímicas tais como amperometria,
biamperometria e voltametria, já foram utilizadas na determinação da cisteína. A dificuldade
encontrada nesse tipo de análise, e que deve ser contornada, é o alto sobrepotencial exigido por
alguns dos eletrodos convencionais (platina e carbono vítreo, por exemplo). A oxidação
eletroquímica a potenciais altamente positivos provoca a formação de óxidos na superfície do
eletrodo, reduzindo significativamente a seletividade da detecção.
3.5 FILMES AUTOMONTADOS
A necessidade de se obter novos materiais com elevada organização molecular
impulsionou à pesquisa por diversas técnicas de formação destas ferramentas de análise. Isto
ocorreu, principalmente, a partir da década de 60 quando da descoberta das propriedades ópticas,
elétricas e magnéticas de compostos orgânicos, permitindo a utilização dessas substâncias em
dispositivos eletrônicos e ópticos como sensores e eletrodos. Dentre estas técnicas de alta
organização molecular, destacou-se o estudo da formação de filmes ultrafinos, principalmente,
devido à possibilidade de ser realizado o controle da espessura desses filmes (PATERNO,
MATTOSO E OLIVEIRA JR., 2001; TRIVINHO-STRIXINO, PEREIRA E LOPES, 2004).
39
Pioneiros no estudo de formação de filmes finos, os pesquisadores Langmuir e Blodgett
desenvolveram, no início do século XX, de forma independente, o que levou ao nome da técnica
de Langmuir-Blodgett (LB). Nesta, os filmes são produzidos a partir do espalhamento de uma
pequena quantidade de material sob um líquido em uma cuba conhecida por cuba de Langmuir.
Os materiais, geralmente, utilizados para a fabricação desses filmes são moléculas anfifílicas
constituídas de uma parte hidrofílica (polar) e outra hidrofóbica (apolar), que são diluídas em um
solvente volátil e espalhadas em uma fase aquosa e, em seguida, transferidas a um substrato
sólido (PATERNO, MATTOSO E OLIVEIRA JR., 2001).
A partir da década de 80, Sagiv e colaboradores desenvolveram uma nova técnica de
formação de filmes ultrafinos como alternativa à metodologia LB (PATERNO, MATTOSO E
OLIVEIRA JR., 2001). Essa consistia na imersão de um substrato sólido, quimicamente
modificado, em uma solução contendo moléculas bifuncionais, como fosfonatos metálicos e
organossilanos. A formação de uma ligação química covalente com o substrato permitia que
essas moléculas bifuncionais permanecessem fortemente adsorvidas e que funcionassem como
suporte para a deposição de uma nova monocamada já que havia a existência de cargas livres na
superfície do filme formando filmes com moléculas adsorvidas muito próximas umas das outras
permitindo, assim, o surgimento de outras forças de interação como as forças de van de Walls,
ligações de hidrogênio, forças dispersivas ou de London, cujas intensidades tornam as
monocamadas compactas e fortemente adsorvidas.
Assim, de acordo com a literatura (CRESPILHO et al., 2006), podem existir quatro
tipos de forças envolvidas na produção de filmes automontados, que irão se diferenciar quanto ao
processo de adsorção das camadas:
1) A adsorção por interações iônicas em polieletrólitos altamente carregados;
2) Com interações iônicas em polieletrólitos parcialmente carregados;
3) Através de ligações secundárias como pontes de hidrogênio ou interações
hidrofóbicas, ou em conjunto com interações eletrostáticas;
4) Através de interações específicas.
A adsorção por interações iônicas tem como base as interações eletrostáticas entre
moléculas contendo grupos iônicos, como compostos anfifílicos e polieletrólitos (PATERNO,
MATTOSO E OLIVEIRA JR., 2001), a maioria destes filmes segue os trabalhos propostos por
Decher e colaboradores. O elevado grau de repulsão entre as cargas leva a formação de
multicamadas extremamente finas e bastante homogêneas. As multicamadas são formadas
devido a forte compensação de cargas quando uma camada de polieletrólito é depositada sobre
outra de sinal contrário, sendo confirmada por medidas de potencial zeta em filmes produzidos
40
com polo(vinil imidazol) e poli(ácido acrílico) (HOOGEVEN et al., 1996). Losche e
colaboradores (1998) realizaram estudo de reflexão de nêutrons em filmes automontados de
poliestireno sulfonado e polialilamina hidroclorada, neste estudo eles observaram que os filmes
obtidos possuem uma estrutura estratificada em que cada camada individual dos polímeros
carregados (cátions e os ânions) estão diretamente interligadas. Mesmo os filmes sendo obtidos
em superfícies atomicamente plana, foi observado uma rugosidade em cada camada depositada,
o que segundo o autor, parece levar a um aumento no número de locais propício a adsorção,
provocando um pequeno aumento na espessura da camada. Porém este aumento satura após certo
número de bicamadas devido interpenetração das camadas adjacentes.
Quando a formação de filmes ocorre com polieletrólitos fracos, a espessura destas
camadas depositadas sofre variação quando comparada àquelas obtidas com eletrólitos fortes. O
pH das soluções que contem o polieletrólito também afeta a espessura destes filmes. Zucolotto e
colaboradores (2004) mostraram que a espessura média de cada bicamada para filmes formados
com polialilamina hidroclorada variou de 1 nm a 24 nm ao alterar o pH (0-10) das soluções.
Além das interações eletrostáticas, o processo de adsorção pode ocorrer através de
ligações de hidrogênio, interações de Van der Waals ou hidrofóbicas, e ainda por um conjunto de
interações. Os primeiros autores a relatarem a formação de filmes automontados por ligações de
hidrogênio foram Stockton e Rubner (1997) para filmes automontados de polianilina com outros
polímeros não iônicos como polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, poliacrilamida e polióxido
de etileno. Segundo os autores a adsorção da polianilina com esses polímeros para a obtenção
dos filmes automontados somente é possível através das ligações de hidrogênio entre os grupos
amina e imina da polianilina.
Em 1987, MacDiarmid e colaboradores mostraram que polímeros condutores como a
polianilina e seus derivados encontram-se no estado carregado (dopados) quando em soluções de
baixo pH. Verificando-se que estes polímeros podem ser automontados a partir de soluções em
pHs elevados, ou seja, como se fossem polímeros neutros, chegaram à conclusão de que, neste
caso, o processo de automontagem é governado por interações não iônicas, como ligações de
hidrogênio. As ligações de hidrogênio também explicaram a formação de filmes multicamadas
de quitosana com lignosulfato desenvolvidas por Luo et al. (2012). Esta e outras publicações
ajudaram a consolidar a automontagem como uma técnica eficiente na interação da quitosana
com outros compostos.
Independente do tipo de interação, a formação dos filmes automontados consiste em
submergir o substrato em um béquer contendo a solução do policátion ou do poliânion por um
determinado período de tempo que, geralmente, não passa de alguns minutos. Como o substrato
41
foi quimicamente modificado e apresenta uma determinada carga em sua superfície, os poli-íons
adsorvem-se na superfície do substrato por interação eletrostática. Os substrato é lavado em uma
solução com pH próximo ao da solução para haver a remoção de moléculas que não foram
adsorvidas de maneira adequada e, posteriormente são secas em jatos de ar ou de N2. Por estar
devidamente carregado eletrostaticamente, o sistema substrato mais filme permitirá a adsorção
de uma nova camada carregada com carga oposta através de imersão em outra solução. Após a
adsorção desta segunda camada, o substrato é novamente lavado e seco. Filmes multicamadas
podem ser produzidos pela simples repetição deste procedimento, não havendo limite de
quantidade de bicamadas a serem adsorvidas pelo sistema. A Figura 7 ilustra a formação das
bicamadas realizada através dessa técnica.
Figura 7 - a) Representação das multicamadas de filmes automontados em um substrato sólido.
b) Detalhe da interação eletrostática entre o policátion e poliânion.
Fonte: (SANTOS et al., 2010).
Esta técnica, por promover a montagem de um filme pela deposição de camadas de
substâncias umas sobre as outras ficou conhecida como técnica Layer-by-layer (LBL) – que
significa camada-por-camada, ou técnica de automontagem ou de filmes automontados,
denominação esta oriunda do termo inglês self-assembly, e tem seu uso vastamente reportado na
literatura com finalidades diversas, sejam essas apenas para a caracterização de um novo filme
formado ou para a utilização destes para análises de soluções aquosas, interação com moléculas
diversas, dentre elas, o DNA e proteínas, proteção à corrosão, entre outras aplicações que estes
materiais podem assumir (BORATO et al., 1997; MACHADO, MANGRICH E LEHN, 2003;
QUAINO et al., 2005; URBANO et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2009; CABRITA, VIANA E
42
ABRANTE, 2010; CASTAÑEDA-URIBE et al., 2010; POSADA et al., 2011; SUN et al., 2011;
IOST E CRESPILHO, 2012).
Em comparação à técnica LB, a automontagem se configura em um mecanismo que não
requer equipamentos ou procedimentos sofisticados devido à sua simplicidade operacional, o que
gera um baixo custo para produção dos mesmos. Outra vantagem é possibilidade de utilizar a
água como solvente, muito embora este seja determinado pelo tipo de polímero que venha a ser
utilizado. Contudo, limitações relacionadas a esta metodologia são associadas ao menor grau de
organização das cadeias poliméricas formadas, à dificuldade de obtenção de monocamadas mais
espessas e os obstáculos relacionados à reprodutibilidade dos filmes produzidos, já que estes são
elaborados de maneira manual, ou seja, por intermédio de um operador. Um controle mais rígido
no tempo de imersão do substrato nas soluções de poli-íons e na realização dos demais
procedimentos permite uma reprodutibilidade razoável dos filmes, fazendo com que estes
apresentem características bem semelhantes de espessura e, consequentemente, das suas demais
propriedades.
Segundo Paterno, Mattoso e Oliveira Jr. (2001), o acompanhamento da formação dos
filmes através da técnica de espectroscopia de Uv-Vis, além de monitorar o seu crescimento,
também permite controlar a espessura dos filmes uma vez que a maioria dos materiais utilizados
para compor estas películas absorve luz na região de comprimento de onda do ultravioleta e
visível. Usualmente observa-se que a absorbância do filmes aumenta a cada bicamada depositada
no substrato. Esta constatação é importante, pois permite o controle da espessura do filme uma
vez que a absorbância é diretamente proporcional à quantidade de material absorvente, sendo
que, neste método, cada camada contribui aproximadamente com a mesma quantidade de
material. Alterações de parâmetros experimentais como força iônica, concentração do material
adsorvente, tempo de imersão, temperatura e pH das soluções empregadas, também, contribuem
para a construção de um filme de espessura mais uniforme (DECHER E HONG, 1991).
Filmes de quitosana já são bem descritos na literatura para aplicação de diversas formas.
Em 2009, Manna, Bharani e Patil, descreveram com sucesso a formação de filmes automontados
pela interação de quitosana com o ácido hialurônico em uma matriz de DNA formando um filme
multicamada estável sem a necessidade de utilização de agentes de reticulação. Recentemente,
Cheng, Wang e Weng (2015) desenvolveram filmes comestíveis e para revestimento de
alimentos a partir de quitosana e zeína (proteína extraída do milho) suplementados com ácido
ferúlico, ácido gálico ou ácidos dicarboxílicos que se mostraram eficientes para atuarem como
uma barreira de vapor de água e apresentaram boas propriedades mecânicas, atividade
antioxidante, e atividade antimicrobiana demonstrada pelos ensaios utilizando como micro-
43
organismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Filmes automontados de quitosana e
heparina foram desenvolvidos por Bhalerao e colaboradores (2015) com bom desempenho na
liberação de droga antimalárica. Eiras e colaboradores (2010), propuseram a interação
eletrostáticas como responsável pela formação de filmes automontados a partir de
polissacarídeos naturais como angico e chichá com poli(o-metoxianilina), a mesma justificativa
também foi apresentada por Radeva, Kamburova e Petkanchin (2006) para filmes de quitosana
com carboximetilcelulose. Estudos com ftalocianinas e quitosana para a produção de filmes
automontados justificam sua formação através de interações eletrostáticas entre o NH3+ da
quitosana e o SO3- das ftalocianinas (SIQUEIRA JR. et al., 2006) e ftalocianinas de cobalto
(SILVA et al., 2013).
3.6 SENSORES ELETROQUÍMICOS
Os primeiros relatos da utilização de sensores eletroquímicos são referentes à década de
50 (ELECTROCHEMICAL SENSORS, 2013). Desde então, foram desenvolvidos sensores com
funcionamento e aplicações variadas. Além de sua conhecida utilização no monitoramento e
controle ambiental, tais ferramentas também são amplamente utilizadas na medicina, alimentos e
na investigação do metabolismo e controle de processos biológicos (LIU, 2000; BRETT, 2001;
STRADIOTTO, YAMANAKA, ZANONI, 2003; BAKKER E QIN, 2006; PEJCIC E DE
MARCO, 2006; PRIVETT, SHIN E SCHOENFISCH, 2008; GUTH, VONAU E ZOSEL, 2009).
Definem-se sensores eletroquímicos como dispositivos que permitem a coleta de dados
qualitativos ou quantitativos havendo a manipulação mínima do sistema estudado, ou seja, estes
devem ser capazes de reagir de forma contínua e reversível e não alterar a amostra. Assim, os
resultados obtidos podem ser analisados e correlacionados com outros parâmetros do ambiente
em que estão inseridos. Dentre as várias características que têm gerado um incremento na
quantidade de pesquisas desenvolvidas sobre tais dispositivos podemos considerar sua habilidade
de determinação e quantificação de diversas substâncias com rapidez, estabilidade, seletividade,
sensibilidade e, principalmente, a possibilidade desta medida ser realizada “in loco” devido à
capacidade de miniaturização desses sistemas de detecção, ou seja, as análises e seus resultados
são obtidos em tempo real. Embora a maioria desses sensores sejam bem desenvolvidos e
possuam elementos suficientes que permitam a tomada de decisões, alguma delas de importância
vital, como no caso do sensores de medidas glicêmicas, análises minuciosas podem ser
necessárias, assim, os métodos instrumentais de grande porte, tais como a espectroscopia na
44
região do ultravioleta e visível, de fluorescência, raios-x, 1H-RMN, dentre outras, podem vir a
ser utilizados de maneira complementar, uma vez que estas técnicas possuem maior precisão,
sensibilidade e seletividade (LOWINSOHN E BERTOTTI, 2006).
Apesar de fisicamente os sensores eletroquímicos parecerem muito semelhantes entre si,
o tamanho físico, geometria, seleção dos componentes e sua posterior construção estão
intimamente relacionados com o uso pretendido, o que lhes garante funções marcadamente
diferentes e, por conseguinte, deve-se esperar que os mesmos apresentem desempenho variável
em termos de seletividade, sensibilidade, tempo de resposta e vida útil. Contudo, esses
dispositivos são constituídos, basicamente, por uma membrana que tem a finalidade principal de
realizar o reconhecimento do analito de interesse de maneira seletiva além de controlar a
quantidade de moléculas que atingem a superfície do eletrodo. Através de algum processo
químico, os dados do reconhecimento da espécie de interesse serão enviados a um transdutor que
converterá as informações químicas geradas pela membrana em dados analíticos (geralmente
sinais elétricos) a serem interpretados pelo operador a um detector. Neste, o sinal obtido é
processado, podendo ser filtrado ou amplificado, permitindo, assim, sua quantificação (BRETT,
2001). A Figura 8 apresenta uma representação esquemática dos principais componentes de um
sensor eletroquímico tomando como base as etapas descritas acima.
Figura 8 - Representação esquemática dos principais componentes de um sensor eletroquímico.
Fonte: Próprio autor (2016).
Os biosensores representam ferramentas promissoras para suplementar as técnicas
existentes, devido às suas características únicas, tais como: seletividade, relativo baixo custo de
construção e estocagem, potencial para miniaturização, facilidade de automação e possibilidade
de construção de equipamentos simples e portáteis (MISHRA et al., 2012). Contudo, estas
ferramentas não podem ser encaradas como uma substituição das técnicas analíticas clássicas,
mas sim como um complemento a estas, pois algumas delas podem apresentar problemas de
estabilidade.
45
O funcionamento de um biosensor, de uma forma geral, envolve a especificidade e alta
sensibilidade do componente biológico com o substrato de interesse. Em seguida, variações de
um ou mais parâmetros físico-químicos são gerados como produto desta interação entre a
molécula biológica e o substrato, produzindo íons, elétrons, calor, luz, variação de massa,
fluorescência ou gases, que são convertidos em um sinal elétrico quantificável e processável pelo
uso de um transdutor adequado (DANIELSSON et al., 1981). Os biosensores, além de se
apresentarem como instrumentos promissores para o monitoramento ambiental rápido e
contínuo, possuem um amplo mercado potencial de aplicação, cobrindo as áreas de diagnose
clínica, militar, controle de processos, alimentícia, de bebidas e agricultura (PRIVETT, SHIN E
SCHOENFISCH, 2010; KIMMEL et al., 2012).
Guan e colaboradores (2012) relataram o desenvolvimento de filmes automontados
utilizando quitosana na identificação de pesticidas organofosfatos. A determinação de dopamina
e ácido ascórbico através de biosensores formados de filmes automontados de quitosana e
metaloftalocianinas de cobre, ferro e níquel mostraram resultados promissores (SIQUEIRA JR.
et al., 2006). Ftalocianinas tetrasulfonadas de níquel foram utilizadas, juntamente com quitosana,
para modificar um eletrodo de carbono vítreo no trabalho de Santos e colaboradores (2012).
3.7 TÉCNICAS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
3.7.1 Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível
A espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta e visível (espectroscopia Uv-Vis) é
uma técnica que permite identificar as transições eletrônicas sofridas por uma determinada
substância, a partir da interação de uma amostra com radiação eletromagnética das regiões do
visível e do ultravioleta do espectro. É, por vezes, chamada de espectroscopia eletrônica porque a
energia é usada para excitar as espécies para níveis de energia eletrônicos mais altos. Assim,
constitui-se em uma das técnicas analíticas mais empregadas, em função de robustez, custo
relativamente baixo e grande número de aplicações desenvolvidas (LOBINSKI E
MARCZENKO, 1992; SHRIVER E ATKINS, 2008).
O princípio fundamental da espectroscopia por Uv-Vis (uv = 180 – 400 nm, visível =
400 – 780 nm), é que a absorção de energia nessas regiões produzem modificações na energia
eletrônica da molécula em consequência da transição dos elétrons de valência. Estas transições
46
implicam na excitação de um elétron de um orbital molecular ocupado (geralmente um orbital
não ligante ou um orbital pi ligante) ao orbital de energia superior ( geralmente o primeiro orbital
antiligante pi ou sigma). Chama-se orbital não ligante aquele que contém os elétrons não
envolvidos diretamente na ligação de um dado elemento, ainda que situados na camada de
valência. Ao dizermos que a molécula passou para um nível eletrônico mais elevado, significa
que um elétron passou de um orbital para outro de maior energia. As transições de energia
envolvidas são: σ → σ*, σ → π *, n → σ*, n → π* e π → π* e estão representados na Figura 9.
Figura 9 - Transições eletrônicas observadas na espectroscopia de Uv-Vis.
Fonte: Adaptado de (PAVIA et al., 2010).
O espectro de absorção correspondente à excitação eletrônica das moléculas por
radiações compreendidas na região do ultravioleta e do visível, ou em ambas, geralmente entre
comprimentos de onda entre 180 e 780 nm. A absorção de energia depende da estrutura
eletrônica da molécula, e por isso, a espectroscopia na região do Uv-Vis tem ampla aplicação na
caracterização de uma série de propiedades de diversas espécies orgânicas e inorgânicas. Como a
energia absorvida é quantizada, o espectro de uma única transição eletrônica deveria
corresponder a uma linha discreta. Esta previsão não se confirma, uma vez que a absorção
eletrônica se sobrepõe a subníveis rotacionais e vibracionais; assim, um espectro de UV tem o
aspecto de uma banda larga (PAVIA et al., 2010).
As principais características de uma banda de absorção são a sua posição e sua
intensidade. O baricentro da absorção corresponde ao comprimento de onda da radiação cuja
energia é igual à necessária para que ocorra a transição eletrônica e a intensidade depende,
principalmente, da interação entre a energia e o sistema eletrônico.
47
As medidas de absorção de radiação nas regiões ultravioleta, visível e infravermelho do
espectro eletromagnético são matematicamente fundamentadas pela lei de Lambert-Beer. Ela
fornece a relação entre a intensidade da luz incidindo na solução (I0), e a intensidade da luz
saindo da solução (I) e estabelece que a absorbância é diretamente proporcional ao caminho (b)
que a luz percorre na amostra, à concentração (c) e a absortividade molar (ε):
A= log(I0/I) = εbc
A absortividade molar é uma propriedade de cada transição eletrônica e está relacionada
com a permissividade de ocorrência de uma transição. Quanto maior a intensidade de uma
banda, maior a absortividade molar e maior a probabilidade dessa transição ocorrer.
Os complexos metálicos apresentam, em geral, quatro tipos característicos de bandas
em seus espectros que são atribuídas às seguintes transições eletrônicas.
1. Transições de campo ligante (d → d) – Ocorrem entre os níveis de energia originados
pelo desdobramento dos orbitais d dos íons metálicos, decorrentes das interações
eletrostáticas com os ligantes.
2. Transições de transferência de carga ligante-metal (LMCT) – Ocorrem devido às
transferências de densidade eletrônica dos orbitais dos ligantes para os orbitais de
energias mais apropriadas no metal.
3. Transições de transferências de carga metal-ligante (MLCT) – Ocorrem devido às
transferências de densidade eletrônica dos orbitais dπ do metal para os orbitais de
energias mais apropriadas nos ligantes.
4. Transições interna dos ligantes – São geralmente provenientes das transições n → π*
e π → π* que os ligantes livres de coordenação apresentam em seus espectros
eletrônicos.
Além de permitir identificar as transições eletrônicas que sofre uma substância, a
técnica de Uv-Vis é muito útil no processo de produção de filmes automontados. Comumente
encontra-se esta técnica associada ao acompanhamento do crescimento de filmes finos. Segundo
Paterno, Mattoso e Oliveira Jr. (2001) a absorbância obtida a cada camada formada de um filme
é diretamente proprocional à quantidade de material adsorvido na deposição destas camadas.
Assim, se há um crescimento linear da absorbância, pode-se dizer que quantidades equivalentes
dos materiais foram adsorvidos. Estevam e colaboradores (2015), Li e colaboradores (2014),
Eiras e colaboradores (2007, 2010) e Santos e colaboradores (2010) são exemplos de alguns
autores que utilizaram a técnica para esse fim.
48
3.7.2 Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho
A Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho (IV) é uma das mais
importantes técnicas instrumentais atualmente utilizadas. Além de já ser bem estabelecida, pode
ser utilizada tanto para trabalhos de rotina como o controle de qualidade, quanto à elucidação de
estruturas moleculares razoavelmente complexas (STUART, 2004).
A radiação infravermelha corresponde aproximadamente à parte do espectro
eletromagnético situada entre as regiões do visível e do microondas. A porção de maior utilidade
na análise e identificação de materiais está situada entre 4000 e 400 cm-1
(2,5 e 25 µm), o
chamado infravermelho médio.
A espectroscopia por IV é baseada nas vibrações dos átomos numa molécula com a
radiação eletromagnética. As ligações covalentes que constituem as moléculas estão em
constante movimentos axiais e angulares. A radiação IV faz com que os átomos e grupos de
átomos da molécula vibrem com amplitude aumentada ao redor de suas ligações. O processo é
quantizado, ou seja, apenas certas frequências são absorvidas e essa absorção corresponde a
variações de energia na ordem de 8 a 40 kJ/mol (PAVIA et al., 2010), porém, o espectro
vibracional costuma aparecer como uma série de bandas, porque cada mudança de nível de
energia vibracional corresponde uma série de mudanças de níveis de energia rotacional, desta
forma, as linhas se sobrepõem dando origem às bandas observadas no espectro (SILVERSTEIN,
2000).
Cada frequência de absorção presente num espectro no IV corresponde a uma
frequência de vibração de uma parte de uma molécula da amostra e as posições das bandas nos
espectros geralmente são apresentadas em número de onda (cm-1
), e as intensidades das bandas
em porcentagem de transmitância (%T). A transmitância é a razão entre a energia radiante
transmitida por uma amostra (I) e a energia radiante que nela incide (I0), conforme a equação a
seguir:
%T = I
x 100 I0
As vibrações moleculares podem ser classificadas em deformações axiais e angulares.
Uma vibração de deformação axial é um movimento rítmico ao longo do eixo da ligação que faz
com que a distância interatômica aumente e diminua alternadamente. As vibrações de
deformação angular correspondem a variações ritmadas de ligações que tem um átomo em
comum ou o movimento de um grupo de átomos em relação ao resto da molécula sem que as
49
posições relativas dos átomos do grupo se alterem. Assim, por exemplo, as vibrações de
deformação angular envolvem a alteração dos ângulos de ligação em relação a um conjunto de
coordenadas arbitrário da molécula (SILVERSTEIN, 2000).
De uma forma geral, as ligações moleculares podem vibrar em seis modos. Nas
vibrações de estiramento os átomos se movem na direção da ligação sem alterar o ângulo de
valência. No estiramento simétrico os átomos de hidrogênio se afastam e se aproximam a
distâncias iguais do átomo central de carbono. No estiramento assimétrico, um átomo de
hidrogênio se aproxima e outro se afasta do átomo de carbono. Quando o sistema triatômico faz
parte de uma molécula, tem-se quatro tipos de vibrações de flexão ou deformação que causarão
oscilações nos átomos, no grupo como um todo e perpendicular a sua ligação química. Na
vibração de deformação angular assimétrica fora do plano (“twist”, torção), a unidade estrutural
oscila de um lado para outro em torno da ligação que a une ao resto da molécula; na deformação
angular simétrica no plano (“scissor”, tesoura), os átomos conectados ao átomo central se
aproximam e se afastam entre si com alteração do ângulo devalência simétrico ao plano; na
deformação angular assimétrica no plano (“rocking”, balanço), a unidade estrutural oscila de um
lado para outro no plano de simetria da molécula; e deformação angular simétrica fora do plano
(“wagging”, sacudida) – a unidade estrutural oscila de um lado para outro em um plano
perpendicular ao plano de simetria da molécula (HOBART, MERRIT E DEAN JR., 1988). A
Figura 10 apresenta os modos de vibração de ligações similares unidas por um átomo comum
(H–C–H).
Apesar da técnica de IV possibilitar a análise de compostos nos estados líquido e
gasoso, a análise na forma sólida é a mais comum. Normalmente são dissolvidos e analisados
como solução diluída e, quando insolúveis, o material é triturado em pequenas partículas e
misturado com brometo de potássio, comprimido e prensado, formando um disco de 2 cm de
diâmetro espessura variável em função da substancia em análise, permitindo obter espectros que
qualificam os compostos. Nestes, as bandas podem ser qualificadas quanto à sua intensidade
como forte (F), média (m) e fraca (f).
A observação das intensidades das bandas e do número de onda onde ocorrem permite
identificar os tipos de vibrações sofridas pelas moléculas, permitindo utilizar a técnica em
diversas aplicações. Dentre elas é possível citar a detecção de traços de constituintes (DAI et al.,
2015), identificação de estrutura e grupos funcionais em compostos (BEPPU, ARRUDA E
SANTANA, 1999; SANTOS et al., 2003; PAL, SAINI E KUMAR, 2016), determinação da
concentração de compostos (LEIVA et al., 2010), estudo da cinética de reação (RODRIGUES E
50
NEUMANN, 2003; BARNDÕK, 2016), medida de espessura de camadas (BASS E FREGER,
2015; FUNKE et al., 2015), dentre outras.
Figura 10 - Modos vibracionais de ligações similares unidas por um átomo comum (H–C–H).
Os sinais + e – indicam os movimentos perpendiculares ao plano da página.
Estiramento simétrico
Estiramento assimétrico
+ -
Deformação angular assimétrica fora do
plano
Deformação angular simétrica no plano
Deformação angular assimétrica no plano
+ +
Deformação angular simétrica fora do plano
Fonte: Próprio autor (2016).
3.7.3 Análise Termogravimétrica e Termogravimetria Derivada
A análise termogravimétrica (TG) é uma técnica termoanalítica que mede a variação da
massa de uma amostra em função do tempo ou programação de temperatura. Já a
termogravimetria derivada (DTG) é apenas um arranjo matemático no qual a derivada da
51
variação do tempo (dm/dt) é registrada em função da temperatura ou tempo. Em outras palavras,
a DTG é a derivada primeira da TG.
Na análise por TG, as medidas são feitas usando-se uma termobalança, a qual consiste
de uma microbalança eletrônica, um forno de temperatura programável e um controlador que
permite que a amostra seja ao mesmo tempo aquecida e pesada. A amostra é pesada em um
porta-amostra (cadinho) e fica suspensa na balança dentro do forno. A temperatura do forno
geralmente sofre um aumento linear, mas esquemas de aquecimento mais complexos,
aquecimentos isotérmicos e protocolos de resfriamento também podem ser usados. A balança e o
forno estão situados dentro de um sistema fechado, de forma que a atmosfera pode ser controlada
e ser inerte ou reativa, dependendo da natureza da investigação, ou ainda estática ou em fluxo.
Uma atmosfera em fluxo é de grande importância no caso de amostras que liberem gases durante
o aquecimento, pois para evitar que estes gases retornem e se condensem na parte eletrônica do
aparelho, é necessário realizar uma purga do sistema (arraste de qualquer espécie volátil ou
corrosiva), com ar sintético para ensaios realizados em atmosfera oxidante e com nitrogênio
gasoso para ensaios realizados em atmosfera inerte (SHRIVER E ATKINS, 2008). Os resultados
da análise são apresentados nas formas de curvas de TG e DTG. As vantagens na obtenção das
curvas de DTG estão relacionadas à exatidão com que indicam as temperaturas correspondentes
ao início da decomposição e ao instante em que a velocidade de reação é máxima, os picos
agudos permitem distinguir claramente uma sucessão de reações, e as áreas dos picos
correspondem à perda ou ganho de massa sofrida pelo composto e podem ser utilizadas, por
exemplo, em determinações quantitativas.
Os fatores mais comuns que podem afetar as medidas de TG/DTG estão apresentados
na Tabela 5 a seguir.
Tabela 5 - Fatores que influenciam as medidas de TG/DTG.
Fatores instrumentais Fatores da amostra
Razão de aquecimento do forno Quantidade de amostra
Atmosfera do forno Solubilidade dos gases envolvidos
Sensibilidade da balança Tamanho das partículas
Posição do suporte da amostra e do forno Empacotamento da amostra
Geometria e composição do suporte da amostra Condutividade térmica
Fonte: (IONASHIRO, 2004).
52
Os fatores acima expostos são bem discutidos por Ionashiro (2004). Quanto à razão de
aquecimento do forno, de um modo geral, a diminuição desta provoca uma diminuição nas
temperaturas aparentes das reações de decomposição. No caso do efeito da atmosfera do forno
quando há a liberação de substâncias gasosas durante a decomposição da amostra, um aumento
na pressão do gás (ou de vapor) provoca um decréscimo na velocidade de reação. A utilização do
gás de purga (geralmente um gás inerte como He, N2, Ar e CO2) se dá para diminuir este efeito,
porém, o tipo de gás de purga utilizado também pode afetar a curva de TG, pois mesmo que não
havendo nenhuma reação entre a amostra e a atmosfera, gases com maior condutividade térmica
provocam um aumento na velocidade de decomposição da amostra. Os demais fatores
instrumentais são controlados pelos fabricantes dos sistemas termoanalíticos.
O aspecto das curvas TG também depende de fatores ligados às características das
amostras. De um modo geral, quanto maior a massa da amostra, maior será a temperatura inicial
e final de decomposição térmica, a diminuição do tamanho das partículas de uma amostra
provoca uma diminuição das temperaturas nas quais a reação de decomposição se inicia e
termina. Os efeitos de solubilidade de gases em sólidos e de empacotamento, quantidade e
condutividade térmica da amostra são menos estudados. O primeiro por ser um fator que
dificilmente será eliminado ou medido, contudo, para minimizar seu efeito, sugere-se a utilização
de cadinhos rasos e sem tampa, e a distribuição da amostra na forma de camadas finas e fazendo
fluir um gás inerte através do forno ou a utilização de taxas de aquecimento lenta para permitir a
secagem do material. O segundo se dá pelo fato de ser difícil reproduzir um conjunto bem
definido de condições experimentais, pois a condutividade térmica de uma amostra depende da
sua densidade, e esta do tamanho das partículas e da sua compactação. Além disso, a densidade
de uma amostra pode variar devido aos processos de fusão, conversão em subtância diferente,
sinterização e estufamento que vão ocorrendo à medida que a reação ocorre. A quantidade de
amostra também influi, pois massas maiores requerem maior temperatura de decomposição
(IONASHIRO, 2004).
Algumas das aplicações da termogravimetria são: composição de misturas complexas,
ou seja, determinação do teor de voláteis e cargas em materiais poliméricos; umidade, voláteis e
teor de resíduos em materiais inorgânicos. Em estudos recentes a TG foi utilizada avaliar
estabilidade térmica de um revestimento entumescente de poli(aliamina) em um tecido de
poliamida formado pela técnica da automontagem, onde atuou alterando a via de decomposição
do tecido, tornando-o mais resistente ao calor (APAYDIN et al., 2014). O mesmo efeito foi
observado por estes autores em (2015) quando projetaram um revestimento de poli(alilamina),
com polifosfatos de sódio e nanopartículas de TiO2 pela técnica da automontagem. Outros
53
trabalhos que utilizam a técnica para caracterizar as etapas de decomposição térmica de filmes
finos de polímeros, dentre eles a quitosana, foram desenvolvidos por Lin e colaboradores (2009),
Zhou e colaboradores (2014), Carosio e colaboradores (2015), Fang e colaboradores (2015), Pan
e colaboradores (2015), e Xue e Chan (2015).
3.7.4 Voltametria Cíclica
A voltametria é uma técnica eletroanalítica que se baseia na medida da corrente em uma
célula eletroquímica sob condições de completa polarização de concentração, na qual a oxidação
ou redução do analito é limitada pela velocidade de transferência de massa do analito para a
superfície do eletrodo havendo um consumo mínimo desse. É amplamente empregada em
estudos de processos de oxidação e redução em vários meios, processos de adsorção às
superfícies e mecanismos de transferência de elétrons em superfícies modificadas de eletrodos
(SKOOG et al., 2009).
Figura 11 - Representação de uma cela eletroquímica.
Fonte: Adaptado de (BORGO et al., 2003).
No desenvolvimento de medidas voltamétricas, a célula eletroquímica, representada na
Figura 11, é constituída de três eletrodos imersos em uma solução com um excesso de um
eletrólito não reativo chamado eletrólito de suporte. Este se constitui em um sal, geralmente de
metal alcalino, adicionado em excesso à solução do analito, que reduz os efeitos da migração e
resistência da solução. Um dos eletrodos é o eletrodo de trabalho, cujo potencial em relação a
um eletrodo de referência varia linearmente com o tempo. É através dele que o analito sofre as
54
reações redox. O eletrodo de referência possui um potencial que permanece constante durante
todo o experimento. O terceiro é o contra-eletrodo que, frequentemente é um fio de platina. A
fonte do sinal é uma corrente contínua variável; a faixa de potencial pode ser ajustada de acordo
com a necessidade do operador e o voltímetro possui uma resistência tão elevada (> 1011
Ω) que,
essencialmente, não há passagem de corrente pelo circuito contendo o medidor e o eletrodo de
referência. Portanto, pode-se dizer que toda a corrente oriunda da fonte flui entre o contra-
eletrodo e o eletrodo de trabalho.
A voltametria cíclica (VC) é uma variação da voltametria, que embora não seja utilizada
com frequência em análise quantitativa, encontra ampla aplicabilidade no estudo de reações
redox, na detecção de intermediários de reação, na observação e no acompanhamento de reações
envolvendo produtos formados nos eletrodos. Na VC, a aplicação do potencial inicia-se de um
valor no qual nenhuma redução ocorre. Mas, com o aumento do potencial para regiões mais
negativas (catódica) ocorre a redução do composto em solução, gerando um pico de corrente
proporcional à concentração deste composto. Quando o potencial já tiver atingido um valor no
qual nenhuma reação de redução ocorre, o potencial é varrido no sentido inverso, até o valor
inicial e, no caso de uma reação reversível, os produtos que tiverem sido gerados no sentido
direto (e se localizam ainda próximos à superfície do eletrodo) serão oxidados, gerando um pico
simétrico ao pico da redução. O perfil de voltamograma gerado depende do tipo de mecanismo
redox que o composto em questão sofre no eletrodo, o que faz da voltametria cíclica uma
ferramenta valiosa para estudos mecanísticos. Estes experimentos podem envolver um ciclo
inteiro, um ciclo parcial ou ainda vários ciclos.
O resultado desse tipo de análise é um voltamograma semelhante ao apresentado na
Figura 12, onde é demonstrado como determinar os potenciais e correntes de pico catódico e
anódico.
Para uma reação reversível, como ilustrado na Figura 12, os picos de corrente catódico e
anódico são aproximadamente iguais em valores absolutos, mas com sinais opostos. Neste tipo
de reação, a diferença entre os potenciais de pico está relacionada com o número de elétrons
envolvidos na semi-reação da seguinte maneira:
∆Ep = |Epa – Epc| = 0,059
(2) N
em que n é o número de elétrons envolvidos na semi-reação. Em reações irreversíveis, causadas
por cinéticas lentas de transferência de elétrons, os valores de ∆Ep excedem os valores previstos.
55
Há reações que, sob baixas velocidades de varredura, podem parecer reversíveis. No entanto, o
aumento dessa velocidade pode provocar o aumento de ∆Ep, caracterizando a irreversibilidade da
mesma. Por isso se faz necessário utilizar diferentes taxas de varreduras na análise de um
determinado analito.
Figura 12 - Exemplo de um voltamograma típico em que: Epc é o potencial de pico catódico; Epa,
potencial de pico anódico; ipc, corrente de pico catódico; e ipa, corrente de pico anódico.
Fonte: Próprio autor (2016).
Para a química de coordenação, esta técnica eletroanalítica é bastante útil na
determinação do potencial redox de complexos, podendo fornecer informações sobre a
capacidade doadora ou receptora dos ligantes em um determinado composto, através das
comparações dos valores dos potenciais anódicos e catódicos, bem como dos valores dos
potenciais de meia-onda em sistemas reversíveis.
Na literatura podem ser encontrados muitos exemplos de estudos que utilizam a
voltametria cíclica para caracterizar filmes automontados. Um exemplo é descrito por Intema
(2011) que preparou e caracterizou filmes automontados contendo polieletrólitos inorgânicos e
goma do cajueiro para a determinação de dopamina. Seus resultados indicam que os filmes
contendo a goma apresentaram maior estabilidade em função do número de ciclos voltamétricos
em relação aos que não a possuíam.
A voltametria cíclica tem sido uma técnica importante na caracterização dos filmes,
como também na sua identificação como biosensor. Desta forma, filmes automontados utilizando
56
a goma do chichá e ftalocianinas mostraram boa estabilidade eletroquímica e reversibilidade,
além disto, foi testado com relação à possibilidade de detecção da dopamina (ZAMPA et al.,
2007). Caracterização do filme de quitosana automontado para identificação de pesticidas
organosfosfatos também foi realizado por esta técnica (GUAN et al., 2012). Estes são apenas
alguns dos exemplos de utilização da voltametria ciclica para a caracterização dos biosensores.
3.7.5 Microscopia Eletrônica de Varredura
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um dos mais versáteis instrumentos
disponíveis para a observação e análise de características microestruturais de objetos sólidos. A
principal razão de sua utilidade é a alta resolução que pode ser obtida quando as amostras são
observadas; valores da ordem de 2 a 5 nanômetros são geralmente apresentados por instrumentos
comerciais, enquanto instrumentos de pesquisa avançada são capazes de alcançar uma resolução
melhor que 1 nm (NAGATANI et al., 1987).
Outra característica importante do MEV é a aparência tridimensional da imagem das
amostras, resultado direto da grande profundidade de campo. Permite, também, o exame em
pequenos aumentos e com grande profundidade de foco, o que é extremamente útil, pois a
imagem eletrônica complementa a informação dada pela imagem óptica.
O princípio de funcionamento do MEV é bem descrito por Dedavid, Gomes e Machado
(2007). Segundo estes, consiste em utilizar um feixe de elétrons de pequeno diâmetro para
explorar a superfície da amostra, ponto a ponto, por linhas sucessivas e transmitir o sinal do
detector a uma tela catódica cuja varredura encontra-se sincronizada com a do feixe incidente.
Nessa técnica o feixe é guiado de modo a varrer a superfície da amostra e o sinal de imagem
resulta da interação do feixe incidente com a superfície da amostra. Esse feixe pode ser acelerado
a uma faixa de tensões variando entre 1 a 50 kV criando uma alta tensão que é focalizada por
uma série de lentes eletromagnéticas. O feixe interagindo com a amostra produz elétrons e fótons
que podem ser coletadas por detectores adequados e convertidas em um sinal de vídeo.
A imagem formada a partir do sinal captado na varredura eletrônica de uma superfície
pode apresentar diferentes características, uma vez que a imagem resulta da amplificação de um
sinal obtido de uma interação entre o feixe eletrônico e o material da amostra. Diferentes sinais
podem ser emitidos pela amostra. Dentre os sinais emitidos, os mais utilizados para obtenção da
imagem são originários dos elétrons secundários e/ou dos elétrons retroespalhados.
57
Os elétrons secundários (“secondary electron” – SE) são de baixa energia (< 50 eV), e
formarão imagens com alta resolução (3-5 nm) cujo contraste é dado, sobretudo, pelo relevo da
amostra, que é o principal modo de formação de imagem no MEV. Ou seja, esse modo de análise
permite a visualiazação da topografia da amostra em elevada profundidade. Já os elétrons
retroespalhados (“backscattering electron” – BSE) possuem energia que varia entre 50 eV até o
valor da energia do elétron primário. A imagem gerada por esses elétrons decorre das diferenças
de número atômico dos elementos que compõem a amostra: números atômicos mais elevados
retroespalham mais elétrons resultando em pontos mais brilhantes na amostra. Desta forma, a
imagem virtual resultante dá idéia da heterogeneidade da composição da amostra (DEDAVID,
GOMES E MACHADO, 2007). A diferença entre essas imagens podem ser observada na Figura
13 que mostra micrografias de discos de titânio revestidos com quitosana por ambos os modos de
análise.
Figura 13 - Micrografias de discos de titânio revestidos com quitosana por SE (a) e BSE (b).
Fonte: (D’ALMEIDA et al., 2015).
A microscopia eletrônica de varredura é utilizada em várias áreas do conhecimento,
sendo amplamente utilizada para estudar os aspectos de superfície dos materiais. O uso desta
técnica vem se tornando mais frequente por fornecer informações detalhadas do estado de
cristalização de produtos obtidos por diferentes técnicas de complexação ou dispersão com
polímeros (DUARTE et al., 2003; RIBEIRO et al., 2008).
Assis e Silva (2003) já haviam demonstrado que filmes finos de quitosana são estáveis,
apresentando poucas falhas aparentes e ausentes de macroporos. Recentemente Kang e
colaboradores (2015) realizaram experimentos de construção de filmes automontados pela
interação de composto orgânico (biopolímero goma de gelano) com um inorgânico (óxido de
grafeno) os quais apresentaram superfícies planas com rugosidade em nano escala. Buron e
58
colaboradores (2014) utilizaram a técnica de MEV para caracterizar morfologicamente filmes
automontados de polímeros como quitosana e polianilina com a enzima urease. Observando as
imagens obtidas, concluíram que a estrutura obtida é de nanofios entrelaçados que conduzem a
uma estrutura ramificada, uniformemente fibrilar e altamente poroso, típica de filmes de
polianilina. Diversos outros autores têm relatado a utilização do MEV para caracterização de
superfícies de filmes automontados de quitosana com sucesso (LUO et al., 2006; HAN et al.,
2015; MAO et al., 2015; PAN et al., 2015, XUE E CHAN, 2015).
3.7.6 Análise por Energia Dispersiva de Raios-X
Apesar da técnica Energia Dispersiva por Raiox-X (EDS) ser uma análise de
espectroscopia, ela é usualmente apresentada juntamente com a MEV ou com EPMA
(Microanálise por feixe de elétrons) pela sua disponibilidade nestes equipamentos. As
informações, qualitativas e quantitativas, sobre os elementos presentes são obtidas pela captação
dos raios-X característicos resultantes da interação do feixe eletrônico com a amostra.
Tal como a espectroscopia de Uv-Vis e de IV, seu princípio está relacionado à
quantização da energia nos orbitais atômicos. Após uma determinada amostra ser bombardeada
por um feixe de elétrons, e a transição eletrônica ocorre removendo um elétron de uma camada
interna (K, L, M, N) o átomo fica em um estado excitado de energia permitindo que um elétron
de uma camada mais energética decaia para preencher o orbital vazio. Este decaimento ocorre
com emissão de energia na forma de um fóton de raios-X. Como as diferenças de energia são
bem definidas e específicas dos elementos estes fótons são denominados raios-X característicos e
permitem identificar o elemento que está emitindo a radiação, obtendo um mapa de imagem da
distribuição de um elemento em uma amostra não homogênea (DEDAVID, GOMES E
MACHADO, 2007).
A EDS usa um material semicondutor, para detectar os raios-X, e um analisador
multicanal e converte a energia de raios-X em uma contagem eletrônica. A partir do valor
acumulado destas contagens é criado um espectro que representa a análise química da amostra.
Para a análise quantitativa dos elementos, deve-se utilizar padrões com concentrações
conhecidas dos elementos a serem analisados (DEDAVID, GOMES E MACHADO, 2007).
Apesar de sua maior utilização ser na quantificação de elementos químicos de uma
amostra (SILVA et al., 2015; NOURMOHAMMADI, GHAEE E LIAVALI, 2016), a EDS
também pode ser utilizada para avaliar a distribuição dos elementos na superfície da amostra.
59
Nesse caso, os elementos químicos que compõem determinada amostra são mostrados na forma
de mapas cuja concentração é representada por cores, tal como apresentado na Figura 14. Nesta
aplicação, um determinado elemento é inicialmente selecionado para ser detectado e ter sua
posição identificada. Após várias passagens do feixe de elétrons sobre a área, é gerado um mapa
de regiões brilhantes que representa a distribuição relativa do elemento previamente selecionado.
Figura 14 - Imagem da seção de uma esfera de quitosana carregada com prata obtida por MEV
(a) e mapeamento por EDS quantitativo (b) e qualitativo dos elementos carbono (c), oxigênio (d)
e prata (e).
(a) (b)
(c) (d) (e)
Fonte: (YANG et al., 2016).
Yang e colaboradores (2016) utilizaram a técnica para caracterizar nanopartículas de
quitosana com prata para fim de aplicação farmacêutica devido à sua atividade antibacteriana.
Essa técnica também já está sendo aplicada para filmes finos. Ciszewski e Stepniak (2013)
demonstraram que filmes finos de hidróxido de níquel incorporados em uma membrana de
quitosana e depositado sobre um eletrodo de carbono vítreo apresentam dispersão uniforme
utilizando a técnica de EDS e MEV.
60
A seguir serão apresentados as metodologias e procedimentos utilizados neste trabalho.
61
Parte experimental
62
4 PARTE EXPERIMENTAL
Na presente seção, são apresentados os principais materiais e a descrição dos procedimentos
utilizados durante o desenvolvimento desse trabalho.
4.1. PURIFICAÇÃO DA QUITOSANA
A quitosana obtida da Polymar foi purificada por três diferentes formas. As
metodologias foram propostas por Signini e Campana Filho (2001) com modificações e estão
descritas a seguir:
a) Forma neutra (QtNeutra): Aproximadamente 1,0 g de quitosana bruta foi
disperso em 300 mL de ácido acético diluído (1%) e a suspensão foi mantida sob agitação
constante durante 24h. A solução resultante foi filtrada em papel de filtro seguido de
filtração com funil de placa porosa G4. À solução filtrada foi adicionado hidróxido de
amônio concentrado até a ocorrência de precipitação. Em seguida, o precipitado foi
filtrado em funil de placa porosa G4, lavado com água destilada até pH 7 e com metanol
absoluto. O precipitado foi então transferido para um almofariz, onde foi mascerado e
submetido a aquecimento até 90 °C. Ao final deste processo tem-se a quitosana
purificada na forma de pó, a mesma foi armazenado em frasco de acrílico e mantido em
dessecador.
b) Acetato de quitosana (QtAcetato): Aproximadamente 1,0 g de quitosana bruta
foi disperso em 150 mL de ácido acético diluído (1%) e a suspensão foi mantida sob
agitação constante durante 24h. À solução resultante foram adicionados 150 mL de uma
solução de acetato de sódio 0,2 M e deixado sob agitação por mais 15 min. Em seguida, a
mistura foi filtrada em papel de filtro seguido de filtração com funil de placa porosa G4.
A seguir a solução foi precipitada em etanol absoluto, armazenada na geladeira por 15
min e filtrada em funil de placa porosa G4. O precipitado foi lavado três vezes com etanol
P.A. e, na última etapa, com metanol absoluto. O precipitado foi então transferido para
um almofariz, onde foi mascerado e submetido a aquecimento até 90 °C. Ao final deste
processo tem-se a quitosana purificada na forma de pó, a mesma foi armazenada em
frasco de acrílico e mantido em dessecador.
63
c) Cloridrato de quitosana (QtCloridrato): Aproximadamente 1,0 g de quitosana
bruta foi disperso em 150 mL de ácido clorídrico 0,05 M e a suspensão foi mantida sob
agitação constante durante 24h. À solução resultante foram adicionados 150 mL de
cloreto de sódio 0,02 M e deixado sob agitação por mais 15 min. Em seguida, a mistura
foi filtrada em papel de filtro seguido de filtração com funil de placa porosa G4. A seguir
a solução foi precipitada em etanol absoluto, armazenada na geladeira por 15 min e
filtrada em funil de placa porosa G4. O precipitado foi lavado três vezes com etanol P.A.
e, na última etapa, metanol absoluto foi empregado. O precipitado foi então transferido
para um almofariz, onde foi mascerado e submetido a aquecimento até 90 °C. Ao final
deste processo tem-se a quitosana purificada na forma de pó, a mesma foi armazenado em
frasco de acrílico e mantido em dessecador.
4.2 CONSTRUÇÃO DOS FILMES AUTOMONTADOS
A fim de permitir a deposição do primeiro material (quitosana) e limpeza do substrato,
este foi previamente funcionalizado em solução piranha. Assim, o substrato foi mergulhado em
solução H2SO4/H2O2 (7:3 v/v) por 15 minutos, seguido de limpeza no ultrassom por 1 h.
Posteriormente, foram lavadas com água destilada, imersas em solução H2O/NH4OH/H2O2
(5:1:1) por 15 min e lavada novamente com água.
Os filmes foram preparados usando uma solução da quitosana purificada (0,031 mol/L)
solubilizada em ácido acético 1% por 24 horas, ao final o pH da solução era de 3,0. As soluções
dos complexos NPS (PROQUÍMIOS) e RubpyNO (disponibilizado pelo Prof. Dr. Francisco
Ordelei Nascimento da Silva – IQ/UFRN) e foram preparadas na concentração 23 g/L (77,2
mmol/L para o NPS e 35,3 mmol/L, para o RubpyNO) em metanol (determinada após diversos
testes), apresentando pH igual a 5,1 e 4,9, respectivamente, sem que houvesse purificação prévia.
A deposição de cada camada foi realizada através da imersão do substrato em cada
solução por 10 minutos, após cada mergulho o substrato foi lavado com água destilada e a
secagem com ar. Os filmes foram preparados com (Qt/NPS)n e (Qt/RubpyNO)n, sendo “n” o
número de camadas, variando de n = 1 a 20 bicamadas. Os filmes foram obtidos em substrato de
quartzo ou óxido de titânio (ITO), dependendo da técnica de caracterização. Assim foram
obtidos os seguintes filmes para o complexo de NPS e RubpyNO:
64
QtNeutra/NPS QtNeutra/RubpyNO
QtAcetato/NPS QtAcetato/RubpyNO
QtCloridrato/NPS QtCloridrato/RubpyNO
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS MATERIAIS
4.3.1 Determinação do Grau de Desacetilação (GD) das Quitosanas Purificadas
A determinação do grau de desacetilação da quitosana purificada foi determinada
através da titulação condutimétrica adaptado do trabalho de Raymond e colaboradores (1993).
Neste procedimento, 200 mg da amostra de quitosana foi agitada em 40 mL de solução de HCl
0,05 mol/L por 18 h. As amostras foram tituladas com solução de NaOH 0,189 mol/L à
temperatura de 25 °C ± 0,1 °C. As variações de condutância durante a titulação foram medidas
por um condutivímetro mcA 150 MS TECNOPON Instrumentação, equipado com célula
condutimétrica. As análises foram realizadas em triplicata.
4.3.2 Determinação da viscosidade intrínseca e massa molar viscosimétrica (Mv)
As medidas viscosimétricas das amostras de quitosana foram realizadas em um
viscosímetro Ubbeload, a uma temperatura de 25,0 ± 0,1°C. Para estas análises, foram
preparadas soluções diluídas dos polissacarídeos, utilizando como solvente um tampão formado
por ácido acético 0,3 mol/L e acetato de sódio 0,2 mol/L. As soluções foram filtradas antes da
determinação de viscosidade, cujo procedimento foi realizado em triplicata. A viscosidade
intrínseca, [], foi determinada pela extrapolação dos dados de viscosidade à diluição infinita, de
acordo com a Equação de Huggins (Huggins, 1942). A massa molar viscosimétrica média, Mv,
foi determinada através da Equação de Mark-Houwink.
Durante os experimentos, a temperatura deve permanecer constante, certificando-se que
a sua variação seja no máximo de 0,01 °C e deve-se ter atenção quanto à presença de impurezas
no equipamento que podem alterar o fluxo do fluído, caso estejam incrustadas na parede do
capilar.
65
4.3.3 Análise por Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho
Os espectros de infravermelho da quitosana purificada nas 3 formas e dos complexos
foram obtidos em um espectrofotômetro Shimadzu, modelo FTIR-8400S, série IRAFFINITY-1,
software IRSOLUTION, versão 1.60, com número de varredura igual a 30, resolução 4 e
unidade expressa na forma de cm-1
. Todas as amostras foram preparadas em estado sólido, na
forma de pastilhas. Para tal, as amostras sólidas foram diluídas com brometo de potássio
espectroscópico (KBr), maceradas em um almofariz e prensadas para a obtenção da pastilha.
4.3.4 Análise por Espectroscopia Eletrônica na Região do Ultravioleta e Visível
Os espectros eletrônicos foram obtidos através da preparação de soluções dos
complexos em metanol absoluto P.A. (VETEC), utilizando o espectrofotômetro modelo Agilent
8453 UV-visible Spectroscopy System fazendo uso de uma cubeta de quartzo com 1 cm de
caminho óptico.
O acompanhamento do crescimento dos filmes foi realizado através da técnica de
espectroscopia de absorbância no Uv-Vis (Agilent, modelo 8453) sobre uma placa de quartzo. A
medida da absorbância de cada uma das bicamadas formadas no processo de construção dos
filmes foi determinada pela incidência direta do feixe luminoso sobre o substrato.
4.3.5 Análise Termogravimétrica (TG)
A análise termogravimétrica das amostras de quitosana e dos filmes foi realizada em um
aparelho analisador termogravimétrico e calorímetro simultâneo, modelo SDTQ600 do
fabricante TA Instruments. Cerca de 3,00 mg de amostra foi analisada em cadinho de alumina e
aquecido a partir de 25°C até 900°C a uma taxa de 2,5 ºC/min sob atmosfera de nitrogênio, com
fluxo de 50 mL/min.
66
4.3.6 Voltametria Cíclica
As medidas eletroquímicas dos complexos e dos filmes foram obtidas por voltametria
cíclica usando um potenciostato/galvanostato AUTOLAB AUT 85282. Foi utilizada uma cela
eletroquímica com volume total de 50 mL e tampa com encaixe para três eletrodos. Como
eletrodo de referência foi utilizado o eletrodo de prata/cloreto de prata, um eletrodo de platina foi
utilizado como contra-eletrodo, e o eletrodo de trabalho foi o de carbono vítreo. Os experimentos
foram realizados diluindo-se 20 mL da solução de cada um dos complexos (mesma concentração
utilizada na construção dos filmes) em 10 mL de uma solução de cloreto de potássio (KCl) 0,1
mol/L, em sala climatizada à temperatura de 17 °C. As soluções finais de NPS e RubpyNO
apresentaram pH igual a 6,7 e 5,8, respectivamente. No caso dos filmes, o crescimento dos
filmes para a caracterização eletroquímica por voltametria cíclica foi realizado no substrato ITO.
4.3.7 Caracterização morfológica
As micrografias eletrônicas de varredura (MEV) foram obtidas em um equipamento
Hitachi (modelo Hitachi Tabletop Microscope TM-3000) com detector semicondutor de elétrons
retroespalhados de alta sensibilidade, operando com feixe de elétrons de 15 kV. Cada
micrografia foi obtida com as seguintes ampliações: 100, 500, 1.000, 2.000, 3.000 e 4.000 vezes.
A obtenção das imagens foi feita em diferentes regiões que poderiam fornecer informações que
ajudassem na interpretação da amostra.
Já as análises de espectrometria de energia dispersiva de raios-x (EDS) foi realizada no
equipamento da Oxford Instruments, modelo SwiftED3000.
4.4 APLICAÇÃO COMO BIOSENSOR
A fim de investigar a capacidade dos filmes de atuarem como biosensor para as
moléculas de ácido ascórbico (AA) e cisteína foram realizados experimentos de voltametria
cíclica em soluções dessas substâncias, cuja concentração variou entre os teores mínimos e
máximos encontrados no plasma sanguíneo (8, 15, 20, 25 e 30 mmol/L) para o AA e, para a
cisteína, foram feitas em soluções 0,01 e 0,1 M, ambos os reagentes são da marca VETEC. Tais
67
soluções foram preparadas utilizando-se como solvente uma solução salina de KCl 0,1 mol/L, e a
cela eletroquímica foi composta pelo eletrodo de prata/cloreto de prata (eletrodo de referência),
eletrodo de platina (contra-eletrodo) e cada um dos filmes automontados atuando como eletrodo
de trabalho. Os voltamogramas foram obtidos usando um potenciostato/galvanostato AUTOLAB
AUT 85282, sendo operado em sala climatizada à temperatura de 17 °C.
68
Resultados e discussão
69
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA
A quitosana é um polieletrólito catiônico e com baixa solubilidade em água. Sua
solubilização ocorre em meio ácido em decorrência da protonação dos grupos aminos (-NH2)
livres presentes na sua estrutura, por isso é comum encontrar na literatura o ácido acético como
solvente. Assim nas etapas de purificação este foi o solvente utilizado para solubilização dos
mesmos, independente da metodologia de purificação.
Com relação ao estabelecimento de correlações entre as estruturas e as propriedades
observadas em polieletrólitos é extremamente importante que o polissacarídeo seja purificado
de forma a conter apenas um contra-ion presente. Assim, seu comportamento em relação a
determinados parâmetros como acidez e força iônica, por exemplo, podem ser melhor
estudados e compreendidos. Tendo em mente este fato, foram utilizadas três metodologias de
purificação, conforme descritos no item 4.1.1. Assim, para assegurar que apenas um contra íon
estava presente após o processo de purificação, foi adicionado um excesso de sal em relação a
quantidade de sítios iônicos do polieletrólitos e durante a etapa de precititação, esse excesso foi
eliminado pela extensiva lavagem do precipitado em água. Já a quitosana purificada na forma
neutra foi obtida através de uma simples dissolução e precipitação em meio básico.
Os valores de rendimentos obtidos na purificação da quitosana foram 82,5% ± 0,54,
64,1% ± 0,25 e 85,6% ± 0,22 para as amostras na forma neutra, acetato e cloridrato,
respectivamente. Esses valores de rendimento devem-se à perda por manipulação e,
principalmente, à presença de materiais insolúveis e agregados presentes na quitosana e que
foram eliminados durante as etapas de filtração, além de resíduos com grau de acetilação
superior a 60% e/ou massas molares elevadas. A presença de materiais insolúveis em produtos
comerciais é relatada na literatura (OTTOY et al., 1996). Segundo Goy, Assis e Campana Filho
(2004) o processo de purificação disponibiliza mais grupos polares, o que aumenta a
capacidade de interação com outros compostos. As diferenças nas metodologias de purificação
também resultaram em materiais com aspectos visuais distintos, apresentados na Figura 15.
70
Figura 15 - Aspecto das amostras de quitosana purificadas nas formas: neutra (a), acetato (b) e
cloridrato (c).
(a) (b) (c)
Todas as amostras purificadas apresentaram-se bastante solúveis em ácido acético
diluído, e o polissacarídeo purificado nas formas de acetato e cloridrato foram parcialmente
solúveis em água. A solubilidade partical das quitosanas purificadas nas formas salinas em
água é relatado na literatura, entretanto essa solubilidade não é maior devido a presença de
resíduos de grupamento acetil no polissacarídeo. A Figura 16 apresenta a proposta das estuturas
da quitosana nas suas diferentes formas.
Figura 16 - Proposta de estrutura das quitosanas purificadas nas formas: neutra (a), acetato (b) e
cloridrato (c).
(a) (b)
(c)
71
O número de grupos aminos presentes na cadeia polimérica da quitosana é um parâmetro
importante e está relacionado com grau de desacetilação (GD), que por sua vez exerce influência
sobre propriedades como hidrofobia, capacidade de reticulação na presença de determinados
agentes de entrecruzamento, solubilidade e viscosidade de suas soluções (GONSALVES et al.,
2011). Existem várias técnicas para a determinação do GD, uma das técnicas mais simples e
amplamente utilizada é a titulação condutométrica.
A Figura 17 apresenta as curvas condutométricas obtidas na titulação das amostras de
quitosana purificadas nas formas: neutra, acetato e cloridrato. De acordo com a figura, a primeira
reta da curva corresponde à neutralização do HCl em excesso, solvente utilizado para
solubilização das amostras, o segundo, à neutralização do grupo amino presente na quitosana e o
terceiro corresponde aos íons OH- em excesso presentes na solução, após o ponto de
equivalência. Essas três retas originam, por extrapolação, dois pontos de inflexão que
correspondem ao volume de base necessário para neutralizar os grupos amino protonados.
Figura 17 - Curvas condutométricas das amostras de quitosana neutra ( ), acetato ( ) e
cloridrato ( ) solubilizadas em HCl 0,05 mol/L para determinação do grau de desacetilação.
0 5 10 15 20
4
8
12
16
20
24
28
Co
nd
utâ
ncia
/mS
Volume de NaOH 0,189 mol/L (mL)
72
O número de grupos amino da cadeia polimérica foi calculado empregando-se a seguinte
Equação (SANTOS, CIRILO E NUNES, 2011):
%GD = 161. [base].(V2-V1).100 (3)
M
onde: 161 é a massa equivalente a um monômero de quitosana; [base] é a concentração de NaOH
utilizado; V1 é volume de base consumido para a neutralização de HCl em excesso, expresso em
mL; V2 é o volume de NaOH correspondente à neutralização dos grupos amino presentes no
polímero, expresso em mL; e, m é a massa de quitosana utilizada na determinação, expresso em
mg. Os dados obtidos para as diferentes amostras de quitosana são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6 - Valores relativos ao Grau de Desacetilação (GD) da quitosana.
Amostra %GD
QtNeutra 68,47 ± 2,17
QtAcetato 68,64 ± 4,58
QtCloridrato 60,83 ± 4,40
A viscosimetria é um dos processos mais utilizados para a determinação da massa molar
de polímeros. As medidas foram feitas com base no tempo de escoamento do solvente e das
soluções diluídas do polímero, utilizando-se um viscosímetro. A Figura 18 mostra as curvas de
viscosidade específica (esp) versus a concentração das soluções de quitosana. Vale salientar que
todas as medidas foram realizadas em triplicata e a média destes valores foi usada para a
construção do gráfico e na determinação dos valores de viscosidade intrínseca.
Pode-se observar que, para todas as amostras, obteve-se um bom índice de correlação
entre as medidas experimentais com R > 0,99 e que a metodologia utilizada na purificação da
quitosana afeta diretamente a viscosidade do polissacarídeo, indicando diferenças em suas
propriedades.
73
Figura 18 - Curva de viscosidade específica versus concentração da QtNeutra ( ), QtAcetato ( ) e
QtCloridrato ( ), em tampão ácido acético/acetato a 25 °C ± 0,1.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4
0
50
100
150
200
250
300
350
400
R = 0,99739
R = 0,99778
R = 0,99943
V
iscosid
ad
e e
sp
ecíf
ica
(m
L/g
)
Concentração (x10-3 g/mL)
Para determinação da massa molar viscosimétrica fez-se uso da equação de Mark-
Houwink (4).
[] = K x Mvα
(4)
onde [] é a viscosidade intrínseca da solução, K é uma constante característica do polímero e
depende da temperatura e do solvente, α é a constante característica da interação
polímero/solvente e Mv é a massa molar viscosimétrica. Os valores da constante de Huggins (K)
e α utilizados foram, respectivamente, 76,0 x 10-3
(mL/g) e 0,76 (CANELLA E GARCIA, 2001).
A tabela abaixo apresenta os valores de viscosidade intrínseca e massa molar
viscosimétrica para todas as amostras estudadas.
74
Tabela 7 - Dados da viscosidade intrínseca () e massa molar viscosimétrica (Mv) para
as amostras purificadas de quitosana comparados com dados da literatura.
Amostra (mL/g) Mv (x 104 g/mol) Mv (x 10
4 g/mol) Literatura*
QtNeutra 273,72 ± 3,80 4,79 ± 0,094 16,7
QtAcetato 136,18 ± 19,47 1,14 ± 0,009 17,2
QtCloridrato 44,72 ± 19,43 0,454 ± 0,002 16,1
*(SIGNINI E CAMPANA-FILHO, 2001).
Os espectros na região do Infravermelho para as amostras de quitosana purificadas são
mostrados na Figura 19, onde se observa bastante semelhança entre os espectros obtidos para as
três metodologias de purificação.
Figura 19 - Espectros vibracionais na região do infravermelho das amostras de QtNeutra (___
),
QtAcetato (___
) e QtCloridrato (___
) em pastilha de KBr.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
120
%T
Número de onda (cm-1)
Independente do tipo de purificação utilizada as bandas observadas são semelhantes
aquelas descritas na literatura (BRUGNEROTTO et al., 2001; SANTOS et al., 2003). É possível
observar uma banda bem larga característica do estiramento axial de OH em 3502-3450 cm-1
.
75
Na Figura 20 é possível observar algumas bandas importantes no espectro de
infravermelho na região entre 1400 a 1700 cm-1
, como a carbonila entre 1664 - 1643 cm-1
(C=O-
NHR) e amida (NH2), como também a presença de grupos amina protonados (NH3+).
Segundo Lee (2001), a presença de grupos amina protonados é observada na região
próxima de 1520 cm-1
.
Figura 20 - Espectros vibracionais na região do infravermelho das amostras de QtNeutra (___
),
QtAcetato (___
) e QtCloridrato (___
) em pastilha de KBr na região de 2000 a 500 cm-1
.
2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
1201
55
51
56
6 1318
QtNeutra (preta), QtAcetato (vermelha) e QtCloridrato (Verde)
14
58
1414
1379
15
26
16
45
%T
Número de onda (cm-1)
As deformações axiais C-N das amidas é observadas em 1423-1321 cm-1
. As principais
bandas observadas no espectro estão identificadas na Tabela 8.
76
Tabela 8 - Atribuições das bandas de infravermelho para as amostras de quitosana purificadas (δ
= deformação; ν = estiramento).
Amostra
ATRIBUIÇÕES DAS BANDAS IV (cm-1
)
C=O
(amida I)
N-H
(amida II)
C-N
(amida III) CH COC β-(1-4) CO OH C-H
QtNeutra 1664 1556 1381 1423 1156 1078 3467 2878
QtAcetato 1658 1566 1321 1415 1157 1074 3471 2879
QtCloridrato 1643 1525 1381 1323 1155 1082 3502 2885
Ref.* 1655 1600 1423 - 1153 1031 3450 2904
*(SIGNINI E CAMPANA-FILHO, 2001)
O estudo sobre a estabilidade térmica foi realizado a fim de se determinar o teor de
umidade, cinzas e avaliar a influência da metodologia de purificação na estabilidade térmica.
De acordo com a literatura, o primeiro evento de decomposição térmica de uma amostra
de quitosana, ocorre em torno de 100 °C e refere-se à perda de água da mesma (água de
hidratação). Segundo Neto e colaboradores (2005) a mais importante região de perda de massa
para quitosana ocorre entre 200 – 400 °C e está relacionado à decomposição do biopolímero pela
quebra das cadeias glicosídicas. Assim, através do decréscimo da massa nesse evento (calculado
pelo próprio equipamento) provocado pelo aumento da temperatura, pode-se determinar o teor de
umidade do material. Já o teor de cinzas (massa residual), pode ser calculado pela subtração das
perdas de massa principal e de água de hidratação, em relação à massa total da amostra utilizada
na análise.
As perdas de massa para as amostras de quitosana em suas diferentes formas purificadas
são mostradas na Figura 21, onde a primeira perda de massa das amostras refere-se à perda de
umidade do material. A segunda perda de massa tem início em torno de 150 °C e está associada à
quebra das ligações do polímero, gerando uma perda de massa de 52,20 % para a amostra de
quitosana neutra, 57,78 %, para a quitosana purificada na forma de acetato e 46,65 %, para a
forma de cloridrato. Observando os gráficos da derivada da curva termogravimétrica (DTG) de
cada uma das amostras, é possível identificar a temperatura onde ocorre o máximo de
degradação do material. Para as amostras de QtNeutra, QtAcetato e QtCloridrato, os percentuais de perda
de massa são respectivamente associados a picos de temperatura de degradação de 273,8 °C,
260,3 °C e 185,6 °C, respectivamente. Uma vez que a forma neutra da quitosana requer maior
77
temperatura para promover a degradação do material, podemos inferir que este biopolímero
apresenta maior estabilidade térmica em relação aos demais.
Ainda segundo Neto e colaboradores (2005), as perdas de massa que ocorrem a partir de
500 °C são relacionadas ao teor de cinzas das amostras, para o nosso trabalho os valores foram
de 35,19 %, 28,73 % e 36,51 %, para as quitosanas neutra, acetato e cloridrato, respectivamente.
Figura 21 – Analise termogravimétrica da Quitosana purificada nas formas neutra (a), acetato
(b) e cloridrato (c) (___
) e suas respectivas derivadas (- - - -).
0 200 400 600 800
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
TG
(%
mg
)
Temperatura (°C)
(a)
35 °C
273,8 °C
DT
G (
%/°
C)
78
0 200 400 600 800
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
TG
(%
mg
)
Temperatura (°C)
(b)
35,4 °C260,3 °C
DT
G (
%/°
C)
0 200 400 600 800 1000
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
TG
(%
mg
)
Temperatura (°C)
(C)
35,8 °C
185,6 °C
DT
G (
%/°
C)
O teor de umidade para as amostras de quitosana purificadas nas três metodologias
foram inferiores ao observado na literatura (23,8% + 0,4) (SIGNINI & CAMPANA FILHO,
2001) para mesma metodologia de purificação. A diferença pode está relacionada à etapa de
secagem, no caso da literatura foi realizada à temperatura ambiente, enquanto que neste trabalho,
o processo de secagem foi utilizado um leve aquecimento (com máximo de 90 °C).
79
Os elevados teores de cinzas observados podem estar relacionados à presença do sal que
foi adicionado durante os processos de purificação da quitosana e que continuou presente,
mesmo após o processo de dissolução e precipitação.
Ao analisar as propriedades da quitosana obtida após os três processos de purificação
(Tabela 9), pode-se concluir que em função da metodologia empregada, obtêm-se materiais com
características e propriedades distintas.
Tabela 9 - Propriedades das quitosanas em suas diferentes formas purificadas.
Amostra %GD (mL/g) Mv (g/mol) Teor de
umidade (%)
Teor de
cinzas (%)
Temperatura de
decomposição (oC)
QtNeutra 68,47 ± 2,17 273,72 ± 3,80 4,79 ± 0,094 12,16 35,19 273,8
QtAcetato 68,64 ± 4,58 136,18 ± 19,47 1,14 ± 0,009 13,49 28,73 260,3
QtCloridrato 60,83 ± 4,40 44,72 ± 19,43 0,454 ± 0,002 16,84 36,51 185,6
Das três metodologias, a quitosana purificada na forma de cloridrato foi a que
apresentou menores valores de viscosidade, massa molar e temperatura de decomposição.
Entretanto apresenta um maior teor de umidade, cinzas e parcialmente solúvel em água. Segundo
Signini e Campana Filho (2001) a presença de cargas em quitosana purificada na forma de
cloridrato deve alterar as interações inter e intracadeia, conferindo maior hidrofilicidade e, por
consequência, maior solubilidade em água quando comparada a quitosana purificada na forma
neutra. Já para a quitosana purificada na forma acetato, o tamanho do contra íon parece
influenciar nas suas características.
5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS
O espectro eletrônico em metanol dos complexos NPS e RubpyNO, é apresentado na
Figura 22.
A utilização de solventes diferentes dos que foram utilizados na literatura (geralmente
água) e as baixas absortividades dos picos de absorção podem provocar um deslocamento para
comprimentos de onda menores para cada uma dessas transições, em relação aos apresentados na
literatura. A medida da absorbância de soluções concentradas é um artifício utilizado para
verificar a existência de bandas em regiões do espectro onde, inicialmente não se observa
80
nenhum indicativo de bandas de transição. Este é o caso do NPS, uma vez que a banda relativa à
transição dxy → π*NO é de baixa intensidade, foi necessário realizar uma concentração extrema
da solução desse complexo, de forma que a banda se tornasse visível. Assim, essa transição que
geralmente ocorre na literatura em torno de 480 nm, sofreu um deslocamento para a região de
comprimento de onda em torno de 540 nm. As demais atribuições das bandas identificadas nos
espectros eletrônicos dos complexos estão apresentadas na Tabela 10.
Figura 22 - (a) Espectro eletrônico dos complexos NPS (___
) e RubpyNO (___
) obtidos em
metanol; (b) Destaque das bandas de absorção na região entre 300 e 600 nm do espectro
eletrônico do NPS
200 300 400 500 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
403 nm317 nm
282 nm
248 nm
202 nm
270 nm
208 nm
Ab
so
rbâ
ncia
(u
. a
.)
Comprimento de onda (nm)
(a)
A baixa concentração e absortividade da solução do complexo RubpyNO utilizada,
também deve explicar os deslocamentos para regiões de menor comprimento de onda verificados
para esse composto, cujas transições associadas também encontram-se especificadas na tabela a
seguir. Ainda para o RubpyNO, a banda em 202 nm não foi atribuída à transição eletrônica do
complexo, pois esta região de absorção é comum para diversas substâncias. Quanto à banda em
248 nm, apesar de não estar discutida na literatura, está relacionada à bandas intraligantes da
300 350 400 450 500 550 600 650
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
540 nm
335 nm
399 nm
Absorb
ância
(u.
a.)
Comprimento de onda (nm)
(b)
81
bipiridina. Já banda observada em 403 nm é atribuída à transição dπRuII
→ π*(bpy), pois as
bandas relacionadas às transições com o NO+ apresentam baixa absortividade molar, podendo ser
encobertas pela transição MLCT da bipiridina.
Tabela 10 - Atribuições das bandas de Uv-Vis presente nos complexos.
NPS RubpyNO
Comprimento de onda
(nm) Atribuição
Comprimento de onda
(nm) Atribuição
Observado Lit* Observado Lit.**
208 200 dxy → π*CN 202 Nd
270 264 dxz, dyz → dz2 248 Nd π → π*(bpy)
335 330 dxy → dx2
-y2 282 296 π → π*(bpy)
399 394 dxz, dyz → π*NO 317 325 dπRuII
→ π*(bpy)
540 480 dxy → π*NO 403 ≈420 dπRuII
→ π*(bpy)
Fonte: *(SWINEHART, 1967); **(SILVA et al., 2006); Nd = Não discute.
Os espectros de infravermelho dos complexos são apresentados na Figura 23. A
caracterização do estado de oxidação do NO coordenado apenas em função da sua banda de
estiramento é difícil, devido à grande superposição que pode ocorrer entre as regiões do
estiramento da ligação do NO coordenado em seus diferentes estados de oxidação, embora
freqüências acima de 1900 cm-1
sejam indicadoras da forma NO+ (NAKAMOTO, 1978). Para os
complexos NPS e RubpyNO analisados são observados picos em 1942 cm-1
e 1945 cm-1
,
confirmando que as duas espécies contém a espécie NO+ ligado ao metal.
Para o complexo NPS, a região entre 2040 e 2180 cm-1
são associados às vibrações de
estiramento do ligante cianeto. Uma ampliação do espectro nessa faixa de número de onda foi
realizada a fim de poder visualizar melhor cada um dos picos, pois, as vibrações a elas
associadas, compreendem picos estreitos ou de baixa intensidade. Assim, foi possível identificar
as bandas de estiramento axial –CN (2173 cm-1
) e estiramento equatorial –CN (2161, 2158 e
2144 cm-1
). Apesar das bandas em 2109 e 2097 cm-1
também estarem relacionadas ao ligante
cianeto não são consideradas como bandas características do NPS uma vez que já foi discutido
na literatura que elas seriam dependentes da temperatura em que o equipamento seja operado
(KHANNA, BROWN E JONES, 1969). Outra banda característica deste complexo é o
estiramento NO observado em 1942 cm-1
. A literatura (SWINEHART, 1967; PALIANI,
POLETTI E SANTUCCI, 1970; RUCKI, 1977; CHACÓN VILLALBA, VARETTI, E
82
AYMONINO, 1999) associa os picos da região deformação abaixo de 700 cm-1
principalmente
às tensões de deformação e estiramento sofridas pelo ligante cianeto e átomo de carbono ligados
ao metal. Assim, tem-se que a deformação Fe–C≡N está associada aos picos localizados em 495
e 423 cm-1
e estiramento Fe–C em 466 cm-1
. No entanto, nessa região também se encontra
deformação linear Fe–N→O (número de onda = 661 cm-1
). As bandas de estiramento assimétrico
e simétrico de OH em 3636 e 3547 cm-1
, respectivamente, e de deformação de OH (em 1618 cm-
1) são observadas devido ao complexo apresentar-se na forma di-hidratada.
Figura 23 - Espectro de absorção na região do infravermelho obtido em pastilha KBr para (a)
NPS e RubpyNO (b)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
42
34
6649
5
66
1
16
18
19
42
21
73
35
47
36
26
21
44
Tra
nsm
itâ
ncia
(%
)
N° de onda (cm-1)
(a)
21
10
21
60
21
56
21
73
20
98
83
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
763
550
842
14521607
1945
3140
3409
Tra
nsm
itâ
ncia
(%
)
N° de onda (cm-1)
(b)
Quanto ao RubpyNO, complexos bipiridínicos de rutênio-nitrosil apresentam νNO+
variando entre 1800 - 2000 cm-1
e as intensidades de pico variam de médias a fortes. Apesar de
poder sofrer influência de fatores estruturais como, por exemplo, a tensão dos anéis, o efeito de
retrodoação envolvendo os orbitais dπ(Ru) → π*(NO+) apresenta maior efeito no deslocamento
para regiões de menor número de onda desses compostos.
O espectro vibracional na região do infravermelho desse complexo, apresentado na
Figura 23b, confirmaram os dados disponíveis na literatura para identificação desse composto.
Nele observamos as bandas de estiramento e deformação CH da bipiridina em 3140 e 763 cm-1
,
respectivamente; Os demais ligantes podem ser identificados pelos picos observados em 1945
cm-1
(estiramento do NO), 1452 cm-1
(estiramento do CN) e em 842 e 550 cm-1
(tem-se os picos
relacionados às vibrações do íon PF6). Da mesma forma que o complexo anterior, as vibrações
de estiramento assimétrico do OH da água (3409 cm-1
) e deformação OH da água (1607 cm-1
)
observadas no espectro estão relacionados ao fato do RupbyNO apresentar-se hidratado ou
devido à umidade presente no KBr.
Antes de ser iniciada a caracterização eletroquímica dos filmes obtidos pela técnica da
automontagem, foi realizada a voltametria cíclica (VC) do ferricianeto de potássio (Figura 24) a
uma taxa de varredura de 50 mV.s-1
. Devido o par Fe3+
/Fe2+
ser um sistema eletroquímico padrão
84
na literatura (com um pico de redução e um de oxidação bem definido), é considerado modelo
para os experimentos de VC por ser um sistema reversível, apresentando nos dois sentidos
(direto e inverso) o pico anódico e catódico, cujos valores de referência são 0,266 e 0,168 V,
respectivamente. Uma vez que os dados obtidos foram consistentes com as referências
encontradas na literatura, é possível garantir a confiabilidade da medida realizada pelo
equipamento.
Figura 24 – Voltamograma cíclico da solução de ferricianeto de potássio 0,1 mol/L obtido em
solução de KCl 0,1 mol/L, pH = 6,7 e eletrodo de referência de Ag/AgCl.
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
-1000
-500
0
500
1000
0,07 V
0, 28 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
Os compostos de coordenação foram analisados eletroquimicamente a fim de identificar
os potenciais relacionados aos picos de oxidação e redução.
O VC obtido em meio salino para o NPS 77,2 mmol/L em pH 6,8 e velocidade de
varredura de 50 mV.s-1
é mostrado na Figura 25a. Como observado, na faixa de potencial
estudado, o voltamograma apresenta um pico catódico em -0,72 V e um pico anódico em -0,11
V, referentes ao processo redox do ferro, levando ao pentacoordenado [Fe(CN)4(NO)]2-
, a qual é
a espécie libertadora do NO. Através do voltamograma e da razão entre os picos catódicos e
anódicos (ipc/ipa) = 0,37, Tabela 11, observa-se uma não reversibilidade do processo. Tais
potencais apresentam-se um pouco deslocados em relação ao que se encontra na literatura, Isso
85
pode ser ocasionado devido este esperimento ter sido realizado com a retirada de oxigênio da
amostra, o que não foi realizado nas análises desse trabalho (CARAPUCA, SIMÃO E FOGG,
1996).
Tabela 11 - Dados eletroquímicos dos complexos NPS e RubpyNO.
Epa (V) Epc (V) ∆Ep (V) ipc/ipa
NPS -0,72 -0,11 0,61 0,37
RubpyNO 0,20 0,27 0,07 0,86
Para o complexo RubpyNO, o VC apresentou um caráter reversível, como pode ser
observado na Tabela 11, caracterizado em potenciais positivos em velocidade de varredura de 50
mV.s-1
. A varredura para o complexo apresentou picos de redução e oxidação iguais a 0,20 e
0,27 V, respectivamente, num processo redox que envolve um elétron e que pode ser atribuído
ao processo de redução do NO+/NO
0 ligado ao metal (SILVA et al., 2006).
Figura 25 - Voltamogramas cíclicos dos complexos (a) NPS e (b) RubpyNO, obtido em solução
de KCl 0,1 mol/L utilizando o eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho.
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
-0,11 V
-0,72 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(a)
86
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6
-4
-2
0
2
4
6
8
0,27 V
0,20 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(b)
Após o processo de caracterização da quitosana nas suas três formas de purificação e
dos complexos (NPS e RubpyNO), iniciou-se a etapa de caracterização dos filmes produzidos
pela técnica de automontagem com estes materiais que será apresentado a seguir.
5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES AUTOMONTADOS
A deposição das camadas dos materiais foi investigada pelo monitoramento do aumento
da absorbância dos filmes após a deposição de cada bicamada na região do comprimento de onda
de 200 a 1100 nm. Este procedimento permite avaliar se os materiais são depositados em
quantidades semelhantes a cada bicamada formada.
A Figura 26 mostra os espectros de Uv-Vis obtidos através de monitoramento do
crescimento dos filmes automontados de QtNeutra/NPS e QtNeutra/RubpyNO, suportados em placa
de quartzo. Os espectros eletrônicos obtidos para QtAcetato/NPS e QtCloridrato/NPS exibem
comportamentos semelhantes a QtNeutra/NPS. O mesmo acontece com os filmes de
87
QtAcetato/RubpyNO e QtCloridrato/RubpyNO, semelhantes a QtNeutra/RubpyNO. Por isso optou-se
por apresentar apenas os gráficos de crescimento dos filmes QtNeutra/NPS e QtNeutra/RubpyNO.
Os espectros mostram uma banda de absorção em 270 nm e 293 nm, correspondentes à
transição eletrônica característica do NPS e RubpyNO, respectivamente, uma vez que a
quitosana não absorve nessa região. O espectro de Uv-Vis observado é característico dos
complexos de origem, com pequenas alterações resultantes da interação do grupamento amino da
quitosana com os complexos.
Figura 26 - Acompanhamento do crescimento do filme de QtNeutra com NPS (a) e RubpyNO (b),
ambos com 20 bicamadas (bcm).
250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
270 nm
Ab
so
rbâ
ncia
(u
. a
.)
Comprimento de onda (nm)
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
250 300 350 400 450 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
293 nm
Ab
so
rbâ
ncia
(u
. a
.)
Comprimento de onda (nm)
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
(a) (b)
Pode-se perceber que a absorbância das bandas monitoradas aumenta com o número de
bicamadas. A fim de verificar se esse incremento ocorria de forma linear foi plotado o gráfico de
absorbância versus o número de bicamadas, Figura 27. Através deste gráfico pode-se perceber
que o crescimento dos filmes ocorre de forma linear, ou seja, a quantidade de complexo
adsorvido nos filmes é a mesma a cada bicamada depositada para os filmes: QtNeutra/NPS;
QtNeutra/RubpyNO; QtAcetato/NPS e Qtacetato/RubpyNO (ZUCOLOTTO et al., 2003, 2006). Já para
os filmes de quitosana purificada na forma de cloridrato percebe-se um comportamento não
linear, com menores valores dos índices de correlação, como se pode observar na Figura 27b e
Tabela 12, por este motivo, esses filmes foram formados até o número de 8 bicamadas somente.
88
Figura 27 – Acompanhamento do crescimento dos filmes de QtNeutra/NPS
( ),QtAcetato/NPS ( ) e QtCloridrato/NPS ( ) a 270 nm (a) e dos filmes de QtNeutra/RubpyNO
( ),QtAcetato/RubpyNO ( ) e QtCloridrato/RubpyNO ( ) a 293 nm (b).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
R = 0,99816
R = 0,94249Ab
so
rbâ
ncia
/u.a
.
N° de bicamadas
(a)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
R = 0,98333
R = 0,98811
Ab
so
rbâ
ncia
/u.a
.
N° de bicamadas
(b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
R = 0,86477
Absorb
ância
/u.a
.
N° de bicamadas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
R = 0,92797
Absorb
ância
/u.a
.
N° de bicamadas
89
Picart e colaboradores (2002) afirmam que o crescimento de filmes pode ocorrer
linearmente ou exponencialmente, esse comportamento vai depender da capacidade de pelo
menos um dos eletrólitos utilizados, difundir-se entre as diversas camadas do filme, ou seja,
migrar das camadas mais internas até as mais externas. Estudos sobre a formação de filmes
utilizando a goma do cajueiro/PAH/ ftalocianinas de ferro também mostraram um crescimento
exponencial, enquanto os filmes formados com a goma do cajueiro/PAH/ftalocianinas de níquel
apresentaram um crescimento linear (ARAÚJO et al., 2002). Esse comportamento de
crescimento exponencial foi observado para QtNeutra/NPS e QtAcetato/RubpyNO.
As inclinações obtidas na Figura 27 podem estar relacionadas a diferenças nas
afinidades entre as espécies envolvidas na formação das camadas. Quanto maior a inclinação,
maior a interação entre as substâncias no filme formado (EIRAS et al., 2007). Assim, conforme
os dados apresentados na Tabela 12, percebe-se que o filme formado pelo complexo
QtAcetato/RubpyNO é o que apresenta maior interação, seguido do QtAcetato/NPS. Assim, o método
de purificação da quitosana que teoricamente poderia gerar uma maior interação eletrostática foi
a que apresentou piores resultados, tanto para o crescimento dos filmes (aleatório) quanto para
interação, descaracterizando a forma cloridrato como bom policátion para a formação deste tipo
de filme automontado.
Tabela 12 - Dados da inclinação e índices de correlação dos filmes de quitosana neutra, acetato e
cloridrato com complexos nitrosil.
Filme Inclinação Índice de correlação
QtAcetato/NPS 0,04042 0,99816
QtAcetato/RubpyNO 0,00744 0,98333
QtNeutra/NPS -7,46x10-4
0,94249
QtNeutra/RubpyNO 0,01051 0,99811
QtCloridrato/NPS 0,00974 0,92797
QtCloridrato/RubpyNO 0,00131 0,86477
A incorporação dos complexos aos filmes automontados de quitosana também foi
monitorada pela técnica de Espectroscopia na região do infravermelho. Assim, a Figura 28
mostra os espectros obtidos para os filmes com 20 bicamadas, pode-se perceber a sobreposição
de algumas bandas presentes nos complexos e na quitosana.
90
Figura 28 - Espectros de IV dos filmes de QtNeutra/NPS (___
) e QtNeutra/RubpyNO (___
)
depositados em placa de quartzo.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
100
110
13
42
15
56
1
55
6
19
31
1
93
0
48
2
11
22
11
22
22
04
2
14
1
28
87
29
24
34
06
33
94
%T
Número de onda (cm-1)
(a)
Os espectros para os filmes automontados apresentaram deslocamentos, de forma geral,
para regiões de número de onda mais baixo, provavelmente ocasionado pela interação entre os
materiais. Esses deslocamentos variaram tanto em função do tipo de purificação quanto do
complexo utilizado. A Tabela 13 apresenta os deslocamentos de algumas bandas características
das quitosanas e dos complexos. A banda de N-H (característica da quitosana) sofreu
deslocamentos da ordem +10 e +100 cm-1
para os filmes de quitosana neutra e acetato,
respectivamente, com ambos os complexos. Estes dados contribuem no sentido de afirmar que
ocorre uma interação entre a quitosana e os complexos na formação das camadas.
Tabela 13 - Atribuições das bandas observadas no espectro de IV dos filmes de quitosana com
os complexos nitrosil depositados sobre lâmina de quartzo.
Filmes
Atribuição (cm-1
)
OH
C-H
C≡N
δN-H COC β-(1-4)
NO+ Ru-bpy δFe-C≡N
QtNeutra/NPS 3394 2924 2141 1566 1122 1931 - 482
QtNeutra/RubpyNO 3406 2887 2204 1566 1122 1930 483 -
91
Os filmes também foram submetidos a análises termogravimétricas, com o objetivo de
avaliar sua estabilidade térmica. A Figura 29 apresenta os termogramas obtidos para os filmes de
QtNeutra e QtAcetato com os complexos nitrosil. Os filmes com QtCloridrato não foram analisados pois,
por não não apresentarem boa interação com os complexos, comprovando pelo crescimento
aleatório dos filmes por Uv-Vis.
A primeira perda de massa (Tinicial a partir de 29 °C) está associado com a perda de água
e material volátil presente no filme. Neste aspecto, o filme de QtNeutra/RubpyNO apresentou
maior umidade, em relação à quitosana de origem. A segunda perda de massa, corresponde à
degradação da quitosana: decomposição de unidades amino, despolimerização e a decomposição
pirolítica do polissacarídeo (MARTINEZ-CAMACHO et al., 2010; MARTINS, CERQUEIRA E
VICENTE, 2012). Osiri e colaboradores (2015) relatam que, durante a decomposição térmica de
cianetos de metais de transição, a perda de massa que ocorre a temperaturas próximas a 190 °C
estão associadas à degradação das moléculas dos ligantes nitrosil e cianeto. Podemos concluir
que nos filmes de QtNeutra e QtAcetato com NPS as perdas de massa observadas a temperatuda de
174 e 181 °C, correspondem a saída desses ligantes e que a degradação da quitosana ocorre
somente a temperaturas de maiores que 259 0C (Tabela 14) . É possível comparar as perdas de
massa e temperatura de decomposição para todos os filmes de Qt e complexos na Tabela 15.
Tabela 14 – Temperatura de degradação dos filmes de quitosanas purificadas com complexo e
suas respectivas perdas de massa.
QtNeutra/NPS QtNeutra/RubpyNO QtAcetato/NPS QtAcetato/RubpyNO
Temperatura
de pico (°C)
Perda de
massa (%)
Temperatura
de pico (°C)
Perda de
massa (%)
Temperatura
de pico (°C)
Perda de
massa (%)
Temperatura
de pico (°C)
Perda de
massa (%)
37,6 13,94 62 75,14 32 16,92 37 14,61
174 4,666 268 15,32 181 5,396 243 34,93
259 46,69 267 39,26 440,6 16,92
886 8,596 821 16,99
Percebe-se que a estabilidade térmica da quitosana foi diminuída com a incorporação dos
complexos. Comparando entre uma mesma metodologia de purificação e diferentes complexos,
observa-se que incorporação do NPS diminui ainda mais a estabilidade da quitosana, conforme
explicado anteriormente.
92
Figura 29 – Curvas termogravimétricas (___
) e suas respectivas derivadas (- - - -) dos filmes de
QtNeutra/NPS (a), Qtneutra/RubpyNO (b) QtAcetato/NPS (c) e QtAcetato/RubpyNO (d).
0 200 400 600 800 1000
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6259 °C
37,6 °C
DT
G (
%m
)
Temperatura (°C)
(a)
886 °C
174 °C DT
G (
%/°
C)
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
268 °C
62 °C
DT
G (
mg
/°C
)
TG
(%
mg
)
Temperatura (°C)
(b)
93
0 200 400 600 800 1000
20
40
60
80
100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
821 °C
267 °C
181 °C DT
G (
%/°
C)
TG
(%
m)
Temperatura (°C)
(c)
32 °C
0 200 400 600 800 1000
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
TG
(%m
)
Temperatura (°C)
(d)
440,6 °C
37 °C
243 °C
DT
G(%
/°C
)
Conforme descrito no procedimento experimental, para análise por voltametria cíclica
os filmes foram construídos utilizando como suporte o ITO. Com o objetivo de identificar
qualquer possível interferência neste suporte nos resultados obtidos, foi realizado uma análise
utilizando-o como eletrodo de trabalho e em solução salina ( KCl 0,1 mol/L), cujo voltamograma
94
é observado na Figura 30, onde se observa somente o processo redox do oxigênio dissolvido em
solução.
Figura 30 – Voltamograma cíclico do ITO em solução salina de KCl 0,1 mol/L, velocidade de
varredura de 50 mV.s-1
.
1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
Antes de iniciar a caracterização eletroquímica dos filmes atomontados, realizou-se
também o estudo eletroquímico da quitosana e dos complexos na forma de filmes depositados
em ITO. A Figura 31 mostra o voltamograma para 1 camada de NPS 77,2 mmol/L. Ocorre uma
pequena diferença nos potenciais do voltamograma quando comparado a análise em solução
devido à diferença de mobilidade das transferências de carga no complexo agora na forma de
filme. Tomando como base essas mudanças em seus potenciais, pode-se avaliar melhor o
comportamento eletroquímico dos filmes automontados.
95
Figura 31 – Voltamograma cíclico do filme de NPS 77,2 mmol/L (a), do filme de RubpyNO
35,3 mmol/L (b) com 1 bicamada obtido em solução salina de KCl 0,1 mol/L e eletrodo de
trabalho de Ag/AgCl.
1,5 1,0 0,5 0,0
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0,32 V0,50 V
0,63 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(a)
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(b)
96
A caracterização eletroquímica foi obtida pela técnica de voltametria cíclica (VC) que
está entre as mais utilizadas na caracterização deste tipo de material, bem como na sua possível
aplicação como biosensor.
Alguns artigos realizam a caracterização eletroquímica dos filmes automontados com
polissacarídeos fazendo uso do HCl como solução eletrolítica. A justificativa está na melhora da
estabilidade dessses filmes automontados (Eiras, 2007). Já em nosso estudos, a utilização do
ácido provocou a solubilização dos filmes, inviabilizando sua utilização. Foram testados várias
soluções eletrolíticas, entretanto o que apresentou melhores resultados foi o KCl 0,1 mol/L.
Filmes com 20 bicamadas e mesma área de substrato foram analisados por voltametria
cíclica em meio salino (KCl 0,1 mol/L; pH = 6,7) com os filmes depositados sobre ITO, como
eletrodo de trabalho, a fim de avaliar a variação da corrente em função da velocidade de
varredura aplicada.
Tomando como base os resultados de monitoramento do crescimento dos filmes pela
técnica de Uv-Vis, somente os filmes com quitosana purificada na forma neutra e acetato foram
utilizados nesta etapa do trabalho.
O filme de QtNeutra/NPS foi analisado para diferentes taxas de varredura pré-determinada
(5, 10, 25, 50, 75 e 100 mV.s-1
) a fim de se determinar as condições ideais para as análises. Pode-
se perceber que à medida que a velocidade de varredura aumenta, há um incremento no valor das
correntes de pico anódica e catódica (Figura 32a) e o valor dos potenciais onde se dá a
transferência eletrônica também varia para as diferentes velocidades de varredura aplicadas
(Figura 32b) e não existe um afastamento significativo dos picos de corrente anódica e catódica.
Obsevou-se também que a 50 mV.s-1
o voltamograma eletroquímico teve maior resolução e os
potenciais puderam ser determinados com maior exatidão, sendo esta velocidade adotada como
referencial para todas as análises a seguir.
O valor do pico catódico do filme automontado sofreu deslocamento de 0,5 V, já o
pico anódico foi para regiões mais negativas quando comparado aos valores observados para o
filme de NPS. Essa alteração nos valores pode ser indicativo da interação entre a quitosana e o
NPS.
Em filmes automontados formados por ITO-quitosana/NiTsPC e ITO-
quitosana/FeTsPc, o mescanismo proposto de transferência de carga que ocorre entre as
interfaces do filme é conhecida como “electron hopping”. Nesses sistemas, o elétrons “saltam”
entre os orbitais presentes no complexo e no polissacerídeo. Essa interligação entre as camadas
ocorre devido a interação que existe entre os grupamentos aminos da quitosana e o grupamento
sulfônico das ftalocianinas (CRESPILHO et al., 2006). Semelhante mecanismo de transferência
97
de carga deve ocorrer entre os filmes obtidos com quitosana e NPS, uma vez que a interação que
ocorrer entre as camadas é também de natureza eletrostática.
Figura 32 – (a) Análise eletroquímica do filme de QtNeutra/NPS em solução de KCl 0,1 mol/L a
diferentes taxas de varredura: 5 mV.s-1
(___
), 10 mV.s-1
(___
), 25 mV.s-1
(___
), 50 mV.s-1
(___
), 75
mV.s-1
(___
) e 100 mV.s-1
(___
). (b) crescimento do pico de oxidação com a velocidade de
varredura. Dados obtidos em solução eletrolítica de KCl 0,1 mol/L e eletrodo de referência de
Ag/AgCl.
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
-0,12 V
0,67 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(a)
A Figura 33 mostra o voltamograma cíclico para os filmes de quitosana neutra e acetato
com os complexos NPS e RubpyNO. Pode-se observar que para o mesmo complexo e quitosana
purificadas de diferentes formas existem diferenças significativas dos potenciais obtidos (Tabela
15).
0 20 40 60 80 100
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
R = 0,9812
i/A
Velocidade de varredura (mV.s-1)
(b)
98
Figura 33 - Voltamograma cíclico do filme de (a) QtNeutra/NPS, (b) QtAcetato/NPS, (c)
QtNeutra/RubpyNO e (d) QtAcetato/RubpyNO em KCl 0,1 mol/L.
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6
-20
-10
0
10
20 0,67 V
-0,12 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(a)
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
0,19 V
-0,14 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(b)
99
0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2 -1,4
-800
-600
-400
-200
0
200
-1,24 V
-0,68 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(c)
1,0 0,5 0,0 -0,5
-40
-30
-20
-10
0
10
-0,17 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(d)
100
Tabela 15 – Dados eletroquímicos para os filmes de quitosana com os complexos nitrosil e paa o
filme de NPS com 1 bcm em KCl 0,1 mol/L.
Amostra Epa (V) Epc (V) ∆Ep (mV) |ipc/ipa|
QtNeutra/NPS 0,67 -0,12 790 0,97
QtAcetato/NPS -0,14 0,19 330 6,00
QtNeutra/RubpyNO -0,68 -1,24 560 0,17
QtAcetato/RubpyNO -0,17 - - -
NPS (filme) 0,63 0,50 e 0,32 - -
Observa-se um grande aumento na intensidade da corrente para o filme
QtNeutra/RubpyNO, indicando que para esse sistema a quitosana purificada na forma neutra
propricia uma melhor resposta química quando combinado ao complexo RubpyNO.
A QtAcetato/NPS apresenta potencial de pico anódico mais negativo que QtNeutra/NPS,
esse efeito deve ser provocado pelo aumento da carga gerado pela metodologia de purificação,
além da interação eletrostática entre os materiais que formam o filme. Já para o filmes obtidos de
quitosana com RubpyNO o efeito da metodologia de purificação parece ser bem menor. Esse
efeito pode ser explicado através do tipo de interação que existe entre a quitosana e o complexo,
por se tratar de dois materiais carregados positivamente, a interação que deve ocorrer é por
ligações de hidrogênio.
Após a varredura dos potenciais no intervalo de -1,4 a 1,2 V, o filme de
QtAcetato/RubpyNO apresentou resposta oxidativa irreversível, pois, ao efetuar a varreduras em
diferentes velocidades, os potenciais deslocaram-se sempre no sentido anódico (Epa), não sendo
observado o pico correspondente inverso - características essas que configuram um processo
redox com baixa velocidade de transferência de carga quando comparada com a velocidade de
varredura. Os demais filmes apresentaram elevados valores de ∆Ep, se observarmos a relação
desta variação de potencial versus a velocidade de varredura (Figura 34) concluímos que apenas
os filmes de QtNeutra podem ser classificados como semi-reversíveis, pois os valores de potencial
aumentaram com o aumento da velocidade de varredura. Pela inclinação das curvas obtidas no
gráfico, temos que os valores de ∆Ep aumentam de maneira mais pronunciada para o filme de
QtNeutra com NPS do que com o de RubpyNO, essa observação pode inferir que o processo redox
sofrido pelo filme QtNeutra/NPS possui uma velocidade de transferência de carga maior que a do
QtNeutra/RubpyNO, embora esta velocidade não seja tão elevada quando comparada às das
reações reversíveis.
101
Figura 34 – Relação da variação de potencial versus velocidade de varredura para o filmes de
QtNeutra/NPS ( ), QtNeutra/RubpyNO (
), QtAcetato/NPS (
)
0 20 40 60 80 100
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Epa-E
pc/V
Velocidade de varredura (mV.s-1)
Comparando-se os dados apresentados na Tabela 15 dos filmes de quitosana neutra com
NPS e RubpyNO temos que a forma da interação com os complexos, alteram drasticamente os
potenciais redox originais destes. Deslocamentos de, aproximadamente, 1,2 V (em módulo) são
observados para ambos os filmes porém, enquanto que para o filme com NPS o deslocamento
ocorre para regiões de potencial mais positivo, no filme com o RubpyNO, ocorre exatamente o
contrário, o deslocamento se dá para regiões de potencial negativo. Sabendo-se que, quanto mais
positivo for o valor do potencial de redução de uma espécie, maior a tendência desta para
adquirir elétrons e sofrer redução, podemos dizer que o filme QtNeutra/NPS apresenta uma maior
tendência a sofrer redução que o filme de QtNeutra/RubpyNO. Interpretação análoga não pode ser
realizada para filme de QtAcetato com os complexos. Apesar do filme com o complexo de rutênio-
nitrosil não apresentar pico de oxidação, os potenciais em que ambos os filmes sofrem redução
são bem semelhantes, indicando que este tipo de purificação pouco influencia no potencial redox
desses.
Comparando-se os potenciais dos filmes de QtNeutra/NPS e QtAcetato/NPS também
observa-se deslocamento nos valores dos potenciais, em relação ao do complexo de origem,
102
principalmente para os potenciais de oxidação. Ambos deslocaram para regiões de potencal mais
positivo por um incremento de potencial de 1,39 V e 0,58 V, em módulo, para a forma neutra e
acetato, respectivamente. Essas observações podem estar fundamentadas no tipo de interação que
as formas purificadas apresentam com os complexos. O fato da quitosana acetato apresentar
contra-íons positivos e o RubpyNO ser um íon de carga também positiva, faz com que suas
interações não sejam bastante efetivas na formação do filme automontado com este complexo,
mas promove deslocamentos ao interagir com o NPS, que possui carga negativa. Já a quitosana
neutra, por não apresentar cargas adicionais aos dos grupos aminos, quando em solução, irá
interagir mais fortemente com o NPS (por ser um contra-íon negativo) do que com o RubpyNO.
A fim de verificar qualquer modificação dos filmes provocada pela análise
eletroquímica foram realizados alguns testes, o primeiro foi a análise das soluções eletrolíticas
após o estudo de VC pela técnica de espectroscopia na região do Uv-Vis e o segundo foi a
análise dos filmes após a VC pela técnica de espectroscopia na região do Infravermelho e análise
térmica.
Figura 35 – Estiramento dos filmes de QtNeutra/NPS (___
), QtNeutra/RubpyNO (___
), QtAcetato/NPS
(___
) e QtAcetato/RubpyNO (___
) em pastilha de KBr após a análise por voltametria cíclica.
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
1201021-1
079
895-9
00
630-6
39
1315-1
318
1379-1
384
1646-1
656
2959-2
083
2340-2
360
2559-2
563
2681-2
880
3483-3
556
%T
Número de onda (cm-1)
1930
103
No estudo de Uv-Vis não foi observado picos de absorção relacionados aos complexos,
confirmando que não ocorre migração destes materiais para a solução eletrolítica. Já o estudo de
espectroscopia na região do Infravermelho para os filmes obtidos em KBr é mostrado na Figura
35. O fato dos picos da figura a seguir apresentarem maior intensidade, deve-se ao fato de que a
leitura foi realizada através de pastilha de KBr, o que permite a concentração da amostra, em
relação à leitura realizada diretamente sobre o filme depositado sobre a placa de quartzo. Pode-se
observar que os deslocamentos foram mínimos para todos os modos vibracionais, confirmando
assim a presença tanto da quitosana quanto dos complexos nos filmes após as análises de
voltametria cíclica.
A análise térmica dos filmes automontados de QtNeutra e QtAcetato com NPS são
mostrados na 36, com perfis e temperaturas de decomposição muito semelhantes àqueles
observados antes do experimento de voltametria cíclica.
Figura 36 - Comportamento térmico dos filmes após estes serem submetidos a VC em KCl 0,1
mol/L para QtNeutra/NPS (a) e QtAcetato/NPS (b).
0 200 400 600 800 1000
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
887,9 °C
257,8 °C
179 °C
40 °C
TG
(%
m)
Temperatura (°C)
(a)
D
TG
(%
/°C
)
0 200 400 600 800 1000
20
40
60
80
100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
TG
(%
m)
Temperatura (°C)
(b)
DT
G (
%/°
C)
820 °C
263,1 °C
183,1 °C
31,69 °C
Assim, após a análise destes resultados podemos concluir que durante a eletroquímica
não ocorre migração significativa dos complexos para a solução eletrolítica. Também não é
observado nenhuma alteração dos filmes pela espectroscopia de IV e análise térmica, o que é um
indicativo de uma possível integridade dos filmes após os ensaios de VC. Sugerindo então que os
filmes são estavéis e podem ser reutilizandos.
A microscopia eletrônica (MEV) e a espectroscopia de energia dispersiva (EDS) foram
as técnicas utilizadas na caracterização das superfícies dos filmes automontados. Os resultados
do MEV para os filmes de QtNeutra e QtAcetato com NPS são apresentadas na Figura 37.
104
Figura 37 - Imagens de MEV dos filmes de QtNeutra/NPS (a) e QtAcetato/NPS (b)
(a) (b)
Esses resultados mostram que os filmes de quitosana apresentam poucas falhas
(macroporos), que podem ter sido provocadas durante o processo de secagem dos filmes, já que
um jato de vapor era direcionado. A segunda etapa de análise morfológica foi realizada por meio
do uso da técnica de EDS, que tem a finalidade de avaliar a disposição dos elementos químicos
no filme após o seu processo de formação. A Figura 38 mostram os resultados da distribuição
dos elementos de carbono, nitrogênio, oxigênio e ferro na superfície do filme de QtNeutra/NPS,
comprovando uma certa homogeneidade do material. Tais resultados são similares ao de Kang et
al. (2015) que relataram a disposição homogênea dos elementos em filmes automontados pela
combinação do polissacarídeo goma de gelano com óxido de grafeno.
Figura 38 - Análise de EDS do Filme de QtNeutra/NPS. Distribuição dos elementos: (a) carbono,
(b) oxigênio, (c) nitrogênio e (d) ferro.
(a) (b)
105
(c) (d)
Através dos resultados apresentados até aqui é possivel afirmar que ocorreu a deposição
de camadas alternadas de quitosana e complexos, exceto para a quitosana purificada na forma de
cloridrato, uma vez que essa deposição ocorreu de forma bem aleatória como observado pela
técnica de Uv-Vis. A Figura 39, mostra uma representação da interação entre a Qt e os
complexos.
Figura 39 – Representação da interação entre a QtNeutra e o (a) NPS e (b) RubpyNO.
(a) (b)
Percebe-se também a estabilidade dos filmes, uma vez que podem ser reutilizados e
apresentam poucas falhas na sua superfície. Diante deste resultados deu-se início a um teste
preliminar quanto a sensibilidade dos filmes a determinadas substâncias, como veremos a seguir.
106
5.4 UTILIZAÇÃO DO FILME COMO BIOSENSOR
A utilização de polissacarídeos naturais na produção de filmes automontados apresenta a
vantagem em se obter eletrodos modificados biodegradáveis e muitas vezes com uma maior
sensibilidade e reprodutibilidade. Estudos com filmes automontados tem sido reportados:
PAH/Chichá/PAH/NiTsPC na detecção de dopamina (ZAMPA et al., 2007),
PANI/CuTsPc e PANI/FeTsPc na determinação de dopamina e ácido ascórico (ZUCOLOTTO et
al., 2006), quitosana com lipossomos na detecção de (GUAN et al., 2012) de algumas classes de
pesticidas.
Os filmes automontados que apresentaram bons resultados no monitoramento do
crescimento (QtNeutra/NPS, QtNeutra/RubpyNO, QtAcetato/NPS e QtAcetato/RubpyNO) foram testados
quanto à sua capacidade como biosensor, na detecção de ácido ascórbico (AA) e cisteína pela
técnica de voltametria cíclica. Assim, foram preparadas soluções de AA variando entre os teores
mínimos e máximos dessa substância no corpo humano (8, 15, 20, 25 e 30 mmol/L) e analisadas
utilizando como eletrodo de trabalho os filmes. Quanto à cisteína, foram utilizadas soluções 0,01
e 0,1 M dessa substância, as quais compreendem a concentração em que a cisteína se encontra no
plasma sanguíneo.
A Figura 40 apresenta a voltametria ciclica para a QtNeutra/NPS a várias concentração de
AA, observa-se que para concentração de 30 mM deste reagente há um aumento não linear
quando comparado as outras concentrações que parecem ter um crescimento linear com o
aumento da concentração.
A análise do filme de QtAcetato/NPS além de não identificar pico redox na concentração
de 8 mmol/L (valor abaixo do limite de detecção do filme), apresentou crescimento de ipa
aleatório com o aumento da concentração das solução de AA. Já o filme de QtAcetato/RubpyNO,
apesar de conseguir identificar as ipa (exceto para as concentrações de 15 e 30 mmol/L do AA),
os picos são de baixa intensidade, não sendo perceptíveis, exceto quando observados
individualmente.
Já o estudo para o filme de QtNeutra/RubyNO apresentou resultado bastante interessante,
pois observou-se uma variação da intensidade da corrente em função da concentração de AA,
Figura 41. Para todos os filmes não foi observado nenhum processo reversível.
107
Figura 40 - Comportamento voltamétrico da solução de AA nas concentrações 8 mmol/L (___
),
15 mmol/L (___
), 20 mmol/L (___
), 25 mmol/L (___
) e 30 mmol/L (___
) em KCl 0,1 mol/L quando
analisados pelo filme de QtNeutra/NPS.
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
-400
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
Figura 41 - Comportamento voltamétrico da solução de AA nas concentrações 8 mmol/L (___
),
15 mmol/L (___
), 20 mmol/L (___
), 25 mmol/L (___
) e 30 mmol/L (___
) em KCl 0,1 mol/L quando
analisados pelo filme de QtNeutra/RubpyNO.
1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5
-1500
-1000
-500
0
500
1000
1500
2000
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
108
Tabela 16 – Potenciais de pico anódico da análise das diferentes concentrações de AA pelo
filme de QtAcetato/RubpyNO.
Concentração Epa (V)
8 -0,63
15 -0,62
20 -0,65
25 -0,41
30 -0,22
Uma vez que os valores de potencial não sofrem grandes deslocamentos com o aumento
da concetração de AA, construindo-se o gráfico do crescimento da corrente de pico anódica
observada em cada um dos filmes versus a concentração de AA (Figura 42), tem-se que o filme
de QtNeutra/RubpyNO apresentou o melhor coeficiente de correlação (R = 0,95779),
demonstrando que para o caso de uma determinação quantitativa do AA, este filme é a melhor
opção. Assim sendo, a equação da reta pelo qual a determinção de AA pode ser realizada é: ipa =
2,25•10-5
x[AA] -1,77•10-4
, com um desvio padrão de 6,68x10-5
.
Figura 42 - Crescimento da ipa com a concentração de AA para os filmes de QtNeutra/NPS ( ),
QtNeutra/RubpyNO ( ), QtAcetato/NPS ( ) e QtAcetato/RubpyNO ( ).
5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
500
R = -0.11094
R = -0.11094
R = 0.95779
R = 0.86752
[AA]/mM
i pa/
V
109
Quanto à análise de cisteína, novamente somente o filme QtNeutra/RubpyNO apresentou
um comportamento linear em função da concentração. Os outros filmes apresentaram
comportamento aleatório. A Figura 43 apresenta a eletroquímica de amostras de cisteína 0,01 e
0,1 M utilizando o filme de QtNeutra/RubpyNO como eletrodo de trabalho. Observou-se um
deslocamento dos picos anódicos e catódicos para regiões de potencial mais baixo e maior valor
de corrente, com o aumento da concentração do analito, de forma semelhante ao que ocorre com
a análise do AA.
Figura 43 – Análise por VC da solução de cisteína 0,01 M (___
) e 0,1 M (___
) em KCl 0,1 mol/L
pelo (a) eletrodo de carbono vítreo e (b) filme de QtNeutra/RubpyNO.
0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2
-2
-1
0
1
2
3
4
5 -0,76 V-0,62 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(a)
110
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0,63 V
0,22 V
i/
A
E/V vs Ag/AgCl
(b)
Um estudo mais detalhado é necessário para proposição de uma possível equação que
possibilite a determinação da concentração de cisteína, em função da corrente obtida no
voltamograma de análise da substância.
111
Conclusão
112
6 CONCLUSÃO
Observando as características das quitosana purificadas através do procedimento adotado
neste trabalho, pode-se concluir que em função da metodologia empregada no processo de
purificação, obtém-se materiais com características distintas. A quitosana purificada na forma de
cloridrato apresenta uma menor viscosidade e massa molar. Entretanto com maior umidade,
podendo ser explicado pela presença de cargas na sua estrutura que deve alterar as interações
inter e intracadeia, conferindo maior hidrofilicidade e, por conseqüência, maior solubilidade em
água. Comportamento contrário é observado para a quitosana purificado na forma de acetato,
essa alteração no comportamento pode estar relacionada a utilização de um ácido fraco (ácido
acético) na sua purificação.
Os filmes automontados construídos utilizando-se quitosanas purificadas nas formas
neutra, acetato e cloridrato com NPS e RubpyNO apresentaram absorção no Uv-Vis na região de
270 e 293 nm, respectivamente. A espectroscopia de absorção da região do infravermelho para
os filmes é observada bandas relativas tanto ao polímero, quanto aos complexos, caracterizando
uma boa interação entre os dois reagentes. O estudo sobre o monitoramento do crescimento dos
filmes pela técnica de Uv-Vis mostrou um crescimento não linear nos filmes automontados em
que foi utilizado a quitosana purificada na forma cloridrato, desta forma o estudo eletroquímico
de biosensor não foi realizado.
O estudo eletroquímico mostra que, o filme formado com QtAcetato/RubpyNO, apresentou
um processo redox irreversível. Os demais filmes apresentaram comportamento como um
processo redox semi-reversível. Os potenciais de picos catódicos e anódicos para os filmes de
QtNeutra/NPS, QtAcetato/NPS exibiram uma maior variação, provavelmente provocado pela carga
existente neste polímero que parece afetar drasticamente nos potenciais, além do tipo de
interação eletrostática que existe entre a quitosana e os complexos. No caso dos filmes com
RubpyNO observou-se menor deslocamento dos picos catódicos e anódicos, essa diferença pode
ser explicada pela interação que existe entre o polímero é o complexo, que neste caso são as
ligações de hidrogênio.
Foram realizados após o experimento de eletroquímica, alguns testes com a solução
eletrolítica (Uv-Vis) e com os filmes (análise térmica e IV) com o objetivo de identificar
qualquer diferença após sua utilização. A análise por Uv-Vis confirmou que não ocorre liberação
dos complexos para a solução eletrolítica, além disso, o infravermelho apresenta os mesmos
deslocamentos químicos, com pequenas variações que podem estar relacionadas a modificação
113
do substrato utilizado (vidro e KBr). A análise termogravimética também apresentou resultados
semelhantes àqueles observados no filme antes do ensaio de eletroquímica. Estudos
eletroquímicos com o mesmo eletrodo utilizados em datas alternadas mostraram-se
reprodutíveis, confirmando assim a estabilidade destes filmes.
Análises por MEV e EDS mostraram que os filmes formados são homogêneos e
apresentam os elementos químicos distribuídos por toda a superfície do filme.
Uma possível aplicação dos filmes na detecção AA e cisteína foram realizadas. Todos os
filmes apresentaram comportamento eletroquímico de processos semi-reversíveis. Somente o
filme de QtNeutra/RubpyNO apresentou melhor coeficiente linear, com baixo valor de desvio
padrão e pequenos deslocamentos nos valores de potencial, sendo assim um potencial eletrodo
para identificação tanto da cisteína quanto do AA.
Tendo como base esses resultados, pode-se concluir que a metodologia utilizana na
purificação da quitosana inferfere diretamente no comportamento eletroquímico dos filmes
automontados e na sua capacidade de detecção. Outro fator que afeta é o tipo de interação, em
nosso estudo tivemos dois tipos de interação: quitosana/NPS, interação eletrostática; quitosana/
RubpyNO ligação entre os átomos de hidrogênio presentes nas duas moléculas.
Esses resultados são promissores e indicam que o eletrodo de ITO modificado com
QtNeutra/RubpyNO têm uma possível aplicação como biosensor de AA e cisteína. Estudos mais
detalhados quanto ao mecanismo e limite de detecção são necessários.
114
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