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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA

CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA

CYBELE PINHEIRO GUIMARÃES

POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE RODOFÍCEA Hypnea musciformis

COMO ADITIVOS EM APRESUNTADOS DE TILÁPIA DO NILO

(Oreochromis niloticus) E ANÁLISE DE ESTOCAGEM SOB REFRIGERAÇÃO

FORTALEZA

2017


POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE RODOFÍCEA Hypnea musciformis COMO

ADITIVOS EM APRESUNTADOS DE TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) E

ANÁLISE DE ESTOCAGEM SOB REFRIGERAÇÃO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do Título de Mestre em Engenharia de Pesca.

Linha de Pesquisa: Tecnologia e Microbiologia do Pescado.

Orientador: Prof. Dr. Bartolomeu War-lene Silva de Souza.

Co-orientador(a): Prof.ª Dr. Ianna Wi-vianne Fernandes de Araújo.

FORTALEZA

2017

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca UniversitáriaGerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

G977p Guimaraes, Cybele Pinheiro Polissacarídeos sulfatados da alga marinha Hypnea musciformis como aditivos em apresuntados detilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e análise de estocagem sob refrigeração / CYBELE PINHEIROGuimaraes. – 2017. 77 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Programa dePós-Graduação em Engenharia de Pesca, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Bartolomeu Warlene Silva de Souza.. Coorientação: Prof. Dr. Ianna Wivianne Fernandes de Araújo..

1. Rhodophyta. 2. Galactanas. 3. Embutidos. 4. Atividade antioxidante. 5. Vida de prateleira . I. Título. CDD 639.2


Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Engenharia

de Pesca da Universidade Federal do Ceará,

como requisito parcial à obtenção do Título

de Mestre em Engenharia de Pesca.

Linha de Pesquisa: Tecnologia e Microbiologia do Pescado.

Aprovada em: ____/____/______

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________ Professor Dr. Bartolomeu Warlene Silva de Souza (Orientador)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

__________________________________________________________ Professora Dr. Ianna Wivianne Fernandes de Araújo (Co-orientadora)


__________________________________________________________ Professor. Dr. Reynaldo Amorim Marinho


__________________________________________________________ Dr. José Ariévilo Gurgel Rodrigues

http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728912T7

A Deus. E a minha mãe e irmã,

Ana Rita e Julianne.

“Olhe para o alto e agradeça a

Deus, por teu sonho realizar.

Assim tem que ser; assim

deveria ser. Consciência em

momentos críticos visando à

estabilidade futura. O tempo

nos ensina. As dificuldades nos

ensinam. Os tropeços e as

quedas também nos ensinam

(Autor desconhecido).”

AGRADECIMENTOS

Á minha família: minha mãe e minha irmã, que são minha base, a quem devo

grande parte de tudo isso.

Ao Prof. Dr. Bartolomeu Warlene Silva de Souza, pela excelente orientação.

A Prof.ª Dra. Ianna Wivianne Fernandes de Araújo, pela excelente co-orientação.

Aos professores colaboradores, Prof. Dr. Ygor Raphael Gomes Eloy (UNIFOR -

Centro de Ciências da Saúde - CCS); Prof.ª Dra. Norma Maria Barros Benevides (UFC -

Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular) e Prof.ª Dra. Ana

Lúcia Ponte Freitas (UFC - Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular), que disponibilizaram os laboratórios para realização dos experimentos deste

trabalho.

A Dra. Terezinha Feitosa pelo auxilio na realização dos experimentos no

Laboratório de Microbiologia de Alimentos Embrapa Agroindústria Tropical (CNPAT).

Aos colegas da turma de mestrado, pelas reflexões, críticas e sugestões recebidas.

Aos colegas dos laboratórios LATEPE e LAPROP, pelo auxílio na realização do

projeto.

Ao Prof. Dr. Reynaldo Amorim Marinho (UFC - Centro de Ciências, Departamento

de Engenharia de Pesca) e Dr. José Ariévilo Gurgel Rodrigues, por participarem da Banca

examinadora.

Á Embrapa Agroindústria Tropical pela disponibilização de sua estrutura de

laboratórios.

A CAPES, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio.

RESUMO

O objetivo do estudo foi avaliar a aplicação de k-carragenana da alga marinha vermelha

Hypnea musciformis em subprodutos do tipo apresuntados, elaborados a partir de filés de

tilápia do Nilo (Oreochoromis niloticus) durante 90 dias de estocagem sob refrigeração. Os

polissacarídeos sulfatados (PST) foram obtidos por extração aquosa refinada (25 e 80°C) e

caracterizados quanto ao rendimento, carboidratos (CT), sulfato livre (SL), proteínas

contaminantes (PCs), espectroscopia no infravermelho (FT-IR), atividade antioxidante in

vitro e toxicidade in vivo. Sendo o rendimento do PST (36,82 ± 6,56%), CT (77,39 ±

0,012%) e SL (15,66 ± 0,33%). A FT-IR apresentou bandas fortes para galactose-4-sulfato

a 845 a 846 cm -1; 3,6-anidro-d-galactose a 929 a 930 cm -1e éster de sulfato (S) a 1,230 a

1,260, possível característica de k-carragenana. A ação antioxidante foi verificada pelos

métodos de DPPH, quelação do íon ferroso e capacidade antioxidante total cujos resultados

apresentaram respectivamente 57,87%; 67,67% e 59,36% para diluição de 4mg.mL-1 em

relação aos padrões BHT e EDTA. O ensaio toxicológico foi realizado em grupos (n=8) de

ratos machos que receberam PST (100mg.kg-1) e salina (NaCl; 0,15M), durante 14 dias

consecutivos. Os animais mostraram-se tolerantes aos PST, sem alterações significativas

nos parâmetros avaliados dos PST, por via oral. As formulações dos apresuntados foram

divididas em grupos: CONT (2% de amido), APR1 (1% PST), APR2 (3% PST) e APR3

(1% de amido e 1% PST). Na avaliação dos apresuntados foram realizadas analises físico-

químicas e microbiológicas durante 90 dias de estocagem. A composição centesimal dos

grupos apresentou variação para proteínas de 5,29 a 11,94%; umidade 69,02 a 82,77%;

lipídios 1,27 a 2,98% e carboidratos 1,62 a 5,35%. O pH se manteve estável até 30 dias de

estocagem e valores de TBARS foram favoráveis até 60 dias de estocagem CONT (1,72mg

MDA.kg-1), APR1 (1,87mg MDA.kg-1), APR3 (1,50mg MDA.kg-1). A atividade de água

(Aw) foi elevada, na faixa 0,96 a 0,98 e a cor das amostras não apresentou significância

p<0,05, entre os grupos. Os resultados de Coliformes termotolerantes, Staphylococcus sp e

Salmonella apresentaram valores dentro dos limites estabelecidos na legislação vigente. E

as psicrotróficas ficaram no limite até o 60º dia de estocagem, exceto APR2 que apresentou

valor acima do limite aceitável (2,13 x 105 UFC.g-1).

Palavras-chave: Rhodophyta. Galactanas. Embutidos. Atividade antioxidante. Vida

de prateleira.

ABSTRACT

The objective of the study was to evaluate the application of k-carrageenan of the red

seaweed Hypnea musciformis in avocado-type by-products made from Nile tilapia fillets

(Oreochoromis niloticus) during 90 days of refrigerated storage. The sulfate

polysaccharides (PST) were obtained by refining aqueous extraction (25 and 80° C) and

characterized by yield, carbohydrate (CT), free sulfate (SL), contaminating proteins (PCs),

infrared spectroscopy , antioxidant activity in vitro, and in vivo toxicity. The PST yield

was 36.82 ± 6.56%, CT (77.39 ± 0.012%) and SL (15.66 ± 0.33%). FT-IR showed strong

bands for galactose-4-sulfate at 845 to 846 cm -1; 3,6-anhydro-d-galactose at 929 to 930 cm -1 and sulfate ester (S) at 1.230 to 1.260, a possible characteristic of k-carrageenan. The

antioxidant action was verified by the methods of DPPH, ferrous ion chelation and total

antioxidant capacity, whose results presented, respectively, 57.87%; 67.67% and 59.36%

for dilution of 4mg.mL-1 in relation to the BHT and EDTA standards. The toxicological

assay was performed in groups (n = 8) of male rats that received PST (100mg.kg-1) and

saline (NaCl; 0.15M) for 14 consecutive days. The animals were tolerant to PST, without

significant alterations in the parameters evaluated of PST, orally. The starch formulations

were divided into groups: CONT (2% starch), APR1 (1% PST), APR2 (3% PST) and

APR3 (1% starch and 1% PST). In the evaluation of the presented physicochemical and

microbiological analyzes during 90 days of storage. The centesimal composition of the

groups showed variation for proteins from 5.29 to 11.94%; humidity 69.02 to 82.77%;

lipids 1.27 to 2.98% and carbohydrates 1.62 to 5.35%. pH was stable up to 30 days of

storage and TBARS values were favorable up to 60 days of storage CONT (1.72mg

MDA.kg-1), APR1 (1.87mg MDA.kg-1), APR3 (1.50mg MDA.kg-1). The water activity

(Aw) was high, in the range of 0.96 to 0.98 and the color of the samples did not present p

<0.05 significance between the groups. The results of thermotolerant coliforms,

Staphylococcus sp and Salmonella presented values within the limits established in the

current legislation. And the psychrotrophs were on the limit until the 60th day of storage,

except APR2 that presented a value above the acceptable limit (2.13 x 105 CFU.g-1).

Keywords: Rhodophyta. Galactans. Sausages, Antioxidant activity. Shelf life.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – As diferentes estruturas das unidades diméricas repetidas de carragenanas

comerciais e estruturas relacionadas. ...................................................................................... 23 Figura 2 – Fluxograma de processamento dos apresuntados de tilápia do Nilo. ................. 38 Figura 3 – Foto ilustrativa das formulações dos apresuntados finais de filés de tilápia do

Nilo............................................................................................................................................ 39 Figura 4 – Espectros de infravermelho do PST, obtido por FT-IR da macroalga marinha

vermelha Hypnea musciformis. ............................................................................................... 43

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Capacidade dos PST da H. musciformis em sequestrar o radical DPPH. ......... 44 Gráfico 2 – Habilidade dos PST de H. musciformis na quelação do íon ferroso. ................ 46 Gráfico 3 – Capacidade Antioxidante Total dos PST de H. musciformis. ........................... 47 Gráfico 4 – Avaliação do pH das amostras de apresuntado durante 90 dias de estocagem. 53 Gráfico 5 – Valores do índice de TBARs para os apresuntados adicionados amido e PST

elaborados com filés de tilápia do Nilo. ................................................................................. 54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Características físico-químicas de acordo com regulamento técnico de

identidade e qualidade de apresuntado. .................................................................................. 29 Tabela 2 – Formulações dos apresuntados cozidos para 1000 g de massa de tilápia do Nilo.

................................................................................................................................................... 39 Tabela 3 – Rendimento e composição química dos PST, da macroalga marinha Hypnea

musciformis. .............................................................................................................................. 42 Tabela 4 – Avaliação dos PST de H. musciformis sobre a massa corpórea, peso relativo dos

órgãos e parâmetros bioquímicos de ratos wistar, após 14 dias alimentados com doses de

100 mg.kg -1. ............................................................................................................................. 48 Tabela 5 – Composição centesimal (media e desvio padrão) de apresuntados elaborados

com filés de tilápia de Nilo com diferentes concentrações de PST. ..................................... 51 Tabela 6 – Dados do Índice da atividade da água (Aw) do apresuntado de tilápia do Nilo.

................................................................................................................................................... 55 Tabela 7 – Analise de cor das amostras de apresuntado no tempo inicial. ........................... 56 Tabela 8 – Resultados da avaliação microbiológica das amostras de apresuntado

refrigerado de tilápia do Nilo no tempo 0 e 90 dias de estocagem. ...................................... 57 Tabela 9 – Contagem de bactérias Psicrotróficas aeróbias (UFC/g) das amostras de

apresuntado refrigerado de tilápia do Nilo durante 90 dias de estocagem. .......................... 59

LISTA DE ABREVIAÇÕES

APR1 Apresuntado 1

APR2 Apresuntado 2

APR3 Apresuntado 3

Aw Atividade da água

BHA Butil-Hidroxi-Anisol

BHT Butil-Hidroxi-Tolueno

BSA Albumina Sérica Bovina

CONT Controle

CT Carboidratos totais

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

IR Região do infravermelho

k - car Carragenanas do tipo Kappa

PCs Proteínas contaminantes

PG Propilgalato

PST Polissacáridos sulfatados

SL Sulfato livre

TBA Ácido Tiobarbitúrico

TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

TBHQ Terc-Butil-Hidroquinona

TCA Ácido Tricloroacetico

- car Carragenanas do tipo Iota

- car Carragenana do tipo Lambda

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO . ................................................................................................... 15

2 REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 17

1.1 Algas marinhas . ...................................................................................................... 17

1.2 Alga marinha vermelha Hypnea musciformis . ...................................................... 18

1.3 Polissacarídeos sulfatados (PST) e suas aplicações . ............................................. 19

1.4 Carragenanas: propriedades estruturais e biológicas . ........................................... 21

1.5 Tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus (LINNAEUS, 1758) ............................... 25

1.6 Pescado como alimento: subprodutos e aspectos de qualidade . ........................... 26

1.7 Apresuntado............................................................................................................ 29

1.8 Aditivos e ingredientes usados na indústria alimentícia ........................................ 29

1.8.1....................................................................................................Cloreto de sódio (NaCl) . ............................................................................................................................................... 29

1.8.2 Amido.............................................................................................................. 30

1.8.3 Carragenana . ................................................................................................... 30

1.8.4 Condimentos e especiarias .............................................................................. 30

1.8.5 Nitratos e nitritos . ........................................................................................... 30

1.8.6 Polifosfatos . .................................................................................................... 31

1.8.7 Antioxidantes . ................................................................................................. 31

1.8.8 Corantes .......................................................................................................... 31

3 MATERIAL E MÉTODOS . ..................................................................................... 32

1.9 Material . ..................................................................................................................... 32

1.9.1 Coleta .............................................................................................................. 32

1.9.2 Filés de Tilápia . .............................................................................................. 32

1.9.3 Animais ........................................................................................................... 32

1.10 Métodos . .................................................................................................................... 33

1.10.1 Extração aquosa refinada dos PST . ................................................................ 33

1.10.2 Determinação do conteúdo de carboidratos totais (CTs) ............................... 33

1.10.3 Determinação do conteúdo de proteínas contaminantes (PCs) . .................... 33

1.10.4 Determinação do conteúdo de sulfato livre (SL). .......................................... 33

1.10.5 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FT-IR) . ................ 33

1.10.6 Determinação da atividade antioxidante in vitro . .......................................... 34

1.10.7 Avaliação sistêmica na toxicidade por dose repetida em ratos (wistar) . ...... 35

1.10.8 Análise histológica ............................................................................................ 36

1.10.9 Elaboração do apresuntado ............................................................................... 36

1.10.1 Avaliação da composição centesimal dos apresuntados de tilápia do Nilo ... 39

1.10.2 Medição do Potencial Hidrogeniônico (pH) .................................................... 40

1.10.3 Atividade de água (Aw) .................................................................................... 40

1.10.4 Oxidação Lipídica (Avaliação das Substâncias Reativas ao Ácido

Tiobarbitúrico - TBARS) ......................................................................................................... 40

1.10.5 Colorimetria ....................................................................................................... 40

1.10.6 Análises microbiológicas .................................................................................. 41

1.10.7 Análise estatística .............................................................................................. 41

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................... 42

1.11 Rendimento e composição química dos polissacarídeos sulfatados totais ............ 42

1.12 Espectroscopia na região do infravermelho (FT-IR) .............................................. 43

1.13 Atividades antioxidantes in vitro ............................................................................. 44

1.13.1 Capacidade de sequestro do radical DPPH ...................................................... 44

1.13.2 Habilidade de quelação íon ferroso .................................................................. 46

1.13.3 Atividade Antioxidante Total ........................................................................... 47

1.14 Avaliação sistêmica na toxicidade por dose repetida em ratos wistar ................... 48

1.15 Analise histológica .................................................................................................... 50

1.16 Análises do apresuntado ........................................................................................... 50

1.16.1 Composição Centesimal.................................................................................... 50

1.16.2 pH (Potencial Hidrogeniônico)......................................................................... 52

1.16.3 Índice de TBARs (ácido 2-tiobarbitúrico) ....................................................... 53

1.16.4 Atividade de água (Aw) .................................................................................... 54

1.16.1 Colorimetria ....................................................................................................... 55

1.17 Analises Microbiológicas ......................................................................................... 57

1.17.1 Coliformes termotolerantes a 45ºC, Staphylococcus coagulase positiva,

Salmonella sp............................................................................................................................ 57

1.17.2 Contagem de bactérias Psicrotróficas aeróbias ............................................... 59

5 CONCLUSÃO .............................................................................................................. 61

REFERÊNCIA ........................................................................................................62

ANEXO ...................................................................................................................77

15

1 INTRODUÇÃO

O pescado é uma fonte rica em proteínas, lipídios, vitaminas e minerais essenciais à

alimentação humana (MENEGASSI, 2011). Segundo a Organização Mundial da Saúde

(OMS), o consumo anual deve representar, pelo menos, 12 quilos por habitante/ano.

Entretanto, somente no período de 2003 á 2013, o consumo nacional de pescado aumentou

mais de 100%, chegando a uma demanda média de consumo interno de 14,5 kg por habitante

neste último ano (FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations)

(BRASIL, 2014).

Dentre as espécies dulcícolas de maior nicho de mercado no Brasil, destaca-se a tilápia

do Nilo, Oreochromis niloticus (LINNAEUS, 1758). Esse peixe representa um grande

potencial na aquicultura, apresentando aspectos gerais que o tornam propicio à

comercialização, como por exemplo, a carne branca de alta qualidade nutricional e custos

menores de produção. A sua musculatura destituída de espinhas na forma de “Y” favorecem a

industrialização sob a base de filé livre de espinhas, favorecendo a aceitação pelo mercado

consumidor (KUBITZA, 2000; BOSCOLO; FEINDEN, 2007; VICENTE; FONSECA -

ALVES, 2013).

Atualmente, as perspectivas indicam um aumento do consumo de produtos

industrializados, uma vez que a sociedade destina menos tempo para o preparo de suas

refeições (FERREIRA et al., 2002). Geralmente, estes produtos são comercializados

congelados, porém esta técnica não é totalmente eficiente, pois com o passar do tempo de

estocagem os produtos sofrem degradação lentamente, tais como a oxidação lipídica,

conferindo ao produto sabor e odor indesejável (COSTA et al., 2016). Quando sob

refrigeração, os produtos cárneos têm a vida útil reduzida, em comparação aos produtos

congelados (RAMOS; GOMIDE, 2007).

Uma maneira de prevenir a oxidação lipídica é pela adição de antioxidantes que tem a

função de atrasar, controlar ou inibir a oxidação e a deterioração dos alimentos (SHAHIDI,

2015). Os antioxidantes sintéticos mais utilizados pelas indústrias de alimentos são: Butil-

Hidroxi-Anisol (BHA), Butil-Hidroxi-Tolueno (BHT), Propilgalato (PG), e Terc-Butil-

Hidroquinona (TBHQ), que são capazes de controlar essa atividade oxidativa no produto. O

interesse mais recente está concentrado em encontrar fontes alternativas de antioxidantes

naturais com toxicidade mínima em relação aos antioxidantes sintéticos, que podem causar

alguns efeitos cancerígenos (SHAHIDI, 2015).

https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjzlqP30bjUAhUHg5AKHYyJDbsQFggtMAE&url=http%3A%2F%2Fwww.fao.org%2F&usg=AFQjCNFN0FJRtsVrfnxh2u66Un8onLMaSw&sig2=G251-YwCUfT7EHXEyLNptA

16

De acordo com a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, PORTARIA Nº

540-SVS/MS, DE 27/10/1997), qualquer aditivo alimentar é considerado como ingrediente

adicionado intencionalmente aos alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de

modificar as características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, durante a fabricação,

processamento, preparação, tratamento, embalagem, acondicionamento, armazenagem,

transporte ou manipulação de um alimento. Essa definição não inclui os contaminantes ou

substâncias nutritivas que sejam incorporadas ao alimento para manter ou melhorar suas

propriedades nutricionais.

Nas últimas décadas têm sido utilizados os polissacarídeos sulfatados de algas

marinhas como agentes geleificantes, espessantes e emulsificantes em diferentes preparações

na indústria alimentícia. A importância dessas moléculas se faz presente como aditivos

alimentares, entretanto suas diversas aplicações como antivirais, antifúngicos, antibacterianos,

antioxidantes, anti-inflamatórios, hiperlipidêmicos e antineoplásicos, têm sido relatadas

(GUPTA; ABU GHANNAM, 2011; CHOJNACKA et al., 2012).

As algas marinhas vermelhas apresentam galactanas sulfatadas como a classe química

de polissacarídeos sulfatados encontrada nas suas paredes celulares. Dentre essas classes

citam-se as carragenanas e as agaranas, as quais diferem entre si quanto a esterioquímica

molecular e são os hidrocolóides com aplicações amplas na indústria alimentícia (NECAS;

BARTOSIKOVA, 2013; PRAJAPATI et al., 2014; SAHA; BHATTACHARYA, 2010;

SALTMARSH, 2015).

Tendo em vista as propriedades biológicas dos polissacarídeos sulfatados de algas

marinhas, o objetivo do presente estudo é a aplicação de galactanas de algas marinhas

vermelhas (carragenanas) em subprodutos do tipo apresuntados, elaborados a partir de tilápia

do Nilo (Oreochromis niloticus), para verificar a atividade antioxidante dos polissacarídeos e

avaliar a qualidade dos apresuntados armazenados sob refrigeração durante 90 dias de

estocagem.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X15301132#bib18





17

2 REFERENCIAL TEÓRICO

1.1 Algas marinhas

As algas contemplam um grupo variável de organismos autotróficos mais antigos do

planeta, revelando papéis estruturais e de sustentação dos ecossistemas costeiros, servindo de

berçário a diversas formas primárias de vida marinha (CABRAL, 2012; RAVEN et al., 2007).

Estão agrupadas em três divisões ou filos, a saber: Rhodophyta (algas vermelhas), Phaeophyta

(algas marrons ou pardas) e Chlorophyta (algas verdes), cuja classificação, por exemplo,

segue a critérios quanto à fisiologia, composição bioquímica e ciclo de vida desses

organismos (RAVEN et al., 2007).

O grupo das macroalgas vermelhas é predominantemente marinho e compõe 6.200

espécies conhecidas atualmente e divididas em 600 gêneros, exemplares geralmente são

encontrados associados ao substrato até em regiões polares (GUIRY; GUIRY, 2013). Detém

características monofiléticas dentro dos eucariotos e apresenta gerais distinções frente à outros

grupos de algas (RAGAN et al., 1994; FRESHWATER et al., 1994). Apresentam clorofilas a

e d, além dos pigmentos acessórios aloficocianina, ficocianina e ficoeritrina, este último

conferindo a coloração avermelhada às rodofíceas, presentes nos tilacóides não empilhados,

assim como pigmentos fotoprotetores (carotenóides) (FRESHWATER, 2000). Os gêneros

mais importantes desse grupo são: Porphyra, Chondrus, Rhodymenia, Hypnea, Gracilaria,

Laurencia e Iridae (KILINÇ et al., 2013; DHARGALKAR; VERLECAR, 2009; RAVEN et

al., 2007; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).

As diferenças nas características das macroalgas vermelhas estão relacionadas com a

fisiologia e aos compostos presentes, tais como conteúdo mineral e maior teor proteico, além

de algumas espécies apresentarem conteúdo de fibras elevado (VASCONCELOS;

GONÇALVES, 2013). Além disso, esses seres fotossintetizantes se mostram ricos de

vitaminas A, do completo B, C, D e E e minerais, tais como Ca, P, Na e K (SOARES et al.,

2012; DHARGALKAR; VERLECAR, 2009). Sintetizam polissacarídeos sulfatados de matriz

extracelular denominado de galactanas (galactose ou derivados desse monossacarídeo)

compondo sua estrutura, além de apresentarem papéis fisiológicos quanto à regulação iônica e

osmótica, possibilitando as macroalgas vermelhas existirem em condições de estresse

ambiental (O’SULLIVAN et al., 2010; COSTA et al., 2012). O amido das florídeas como

material de reserva encontrado no citoplasma e a celulose presente na camada interna da

18

parede celular se mostram também como constituintes químicos das rodofíceas (MURANO et

al., 1997; CAMPO et al., 2009; SILVA et al., 2010).

Segundo Horta et al. (2001), a biodiversidade brasileira de macroalgas vermelhas

abrange aproximadamente 388 espécies dentro das 643 espécies conhecidas. Estudo posterior

de Fujii et al. (2008) relataram, ainda, que existem 482 táxons infragenéricos de Rhodophyta

dentre os 774 conhecidos no país. A coletividade dessas investigações elenca pilares quanto à

utilização desses organismos marinhos como alimento e na obtenção de ficocoloides de

relevância econômica, despertando, ainda, estudos quanto à biologia e ao cultivo de algas

nativas, no intuito de minimizar a dependência de bancos naturais (RODRIGUES et al.,

2011).

1.2 Alga marinha vermelha Hypnea musciformis

O gênero Hypnea J. V. Lamouroux (1813) (Gigartinales, Rhodophyta) de algas

marinhas vermelhas compreende aproximadamente 67 espécies apresentando tamanho de talo

que varia de 3 a 50 cm dependendo do táxon e está distribuído nas regiões tropicais e

subtropicais (GERALDINO et al., 2009; GUIRY; GUIRY, 2012).

Nas Américas, nove espécies de algas desse gênero são reconhecidas, a saber: H.

cenomyce J. Agardh, H. cervicornis J. Agardh, H. cornuta (Kützing) J. Agardh, H. krugiana

Hauck, H. musciformis (Wulfen in Jacq.) J.V. Lamour., H. nigrescens Grev. ex J. Agardh, H.

spinella (C. Agardh) Kütz, H. valentiae (Turner) Mont. e H. volubilis Searles

(SCHENKMAN, 1986; NUNES, 2005; WYNNE, 2011). No Brasil, apenas H. krugiana não é

referida (CREED et al., 2012).

A macroalga vermelha bentônica Hypnea musciformis (Wulfen) J. V. Lamouroux

pertence à família Hypneaceae. Caracteriza por tamanho, em geral, entre 4 a 30 cm e 0,5 a 1,0

cm de diâmetro, apresentando morfologia dotada de ramos cilíndricos e cartilaginosos,

ramificada variavelmente, com presença de ápices em forma de gavinha ou ganchos de seus

ramos, cuja finalidade é de aderência ao substrato ou epifitando outras algas (JESUS et al.,

2013; NASCIMENTO, 2014).

No Brasil, a distribuição geográfica da referida espécie ocorre em costas, estuários, em

marés calmas e rasas, além de recifes e rochas, percorrendo desde o litoral do Rio Grande do

Sul até o litoral do Estado do Maranhão (NUNES et al., 2013), suportando grandes variações

19

ambientais, como de temperatura (18 a 30ºC) e salinidade (20 a 50 ppt) (YOKOYA;

OLIVEIRA, 1992).

A composição bioquímica de H. musciformis equivale àquela encontrada em fontes

vegetais tradicionais, porém com teores de proteínas (KUMAR et al., 2011), pigmentos

(BAGHEL et al., 2014) e minerais maiores para aplicação em alimentos, produtos

farmacêuticos, cosméticos, entre outros. Além disso, sua composição lipídica expõem

propriedades antioxidantes, anticancerígenas, antidiabéticas e anti-inflamatórias (KUMAR,

2013).

O potencial econômico gerado por esta macroalga no litoral brasileiro é também

justificado pelo seu conteúdo de polissacarídeos sulfatados de parede celular do tipo kappa-

carragenana (VÁZQUEZ-DELFIN; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2013), com utilização

nas indústrias alimentícias (CAMPO et al., 2009). Suas aplicações variadas têm motivado a

maricultura e a caracterização bioquímica e farmacológica do ficocolóide de H. musciformis

(MUÑOZ, 2011).

No Ceará, a produção de H. musciformis vem sendo realizada na praia de Flecheiras,

através da Associação de Produtores de Algas Flecheiras e Guajirú (APAFG), juntamente

com o Instituto Terramar, Universidade Federal do Ceará (UFC), bem como outros órgãos

participantes. O modelo de cultivo é do tipo long - line, o qual é constituído por uma corda

principal com várias secundárias e fixado por poitas ao fundo. O projeto visa minimizar a

exploração desse recurso de áreas naturais para extração de carragenana pelas indústrias

(RODRIGUES et al., 2011), além de gerar oportunidades de renda as comunidades de

pescadores da região.

1.3 Polissacarídeos sulfatados (PSs) e suas aplicações

Os polissacáridos sulfatados compreendem um grupo complexo de macromoléculas

com uma vasta gama de propriedades bioativas importantes, visto que, são aplicados na

indústria de alimentos, em produtos fármacos (COSTA et al., 2010; RHEIN-KNUDSEN et

al., 2015). Estes compostos bioativos isolados possuem atividade antibacteriana

(GONZALEZ DEL VAL et al., 2001), potencial antioxidante (CHANDINI et al., 2008;

BARAHONA et al., 2011), propriedades anti-inflamatórias (KANG et al., 2008; CHAVES et

al., 2012), anticoagulante ( ATHUKORALA et al., 2007; PUSHPAMALI et al., 2008;

ZHANG et al., 2008; CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010), atividade antiviral (SINHA

20

et al., 2010), atividade apoptótica (KWON et al., 2006) e imunoestimulante (LIMA, 2007;

ARAÚJO et al., 2008; ZHA et al., 2015).

Estes polímeros aniônicos são encontrados em organismos vegetais e animais, e

incluindo as algas marinhas (RHEIN-KNUDSEN et al., 2015). As algas marinhas possuem

grandes quantidades de PSs, principalmente, na estrutura da parede celular (matriz

mucilaginosa) (KUMAR et al., 2008), cuja função biológica está relacionada com a proteção

contra desidratação solar das macroalgas em períodos de oscilação entre marés (baixa maré),

além de oferecer flexibilidade as algas nas correntes oceânicas permitindo o seu crescimento,

e uma rigidez satisfatória que possibilita ao organismo estender e assim captar a luz e os

nutrientes com eficiência (PERCIVAL; DOWELL, 1967). Os PSs de algas podem variar na

estrutura e na concentração, pois dependem das espécies de algas e condições ambientais

(COSTA et al., 2010).

Os três grandes de grupos de algas marinhas, que contém concentrações significantes

de PSs são Rhodophyta, Phaeophyta e Chlorophyta. Estes compostos são encontrados em

Rhodophytas (algas vermelhas) na forma de galactanas (carragenanas e ágares) (SILVA et al.,

2010), em Phaeophytas (algas pardas) compreende as fucanas sulfatadas (AZEVEDO et al.,

2009) e em Chlorophytas (algas verdes) são heteropolissacarídeos constituídos por galactose,

manose, xilose, raminose, arabinose e/ou ácidos urônicos (ZHANG et al., 2008;

JAULNEAU et al., 2010; COSTA et al., 2012).

Nos últimos anos, vários PSs isolados de algas marinhas atraíram atenção nos campos

alimentícios, pois PSs contêm fibras dietéticas solúveis e insolúveis, entretanto, estes

compostos possuem maior capacidade de retenção de água do que as fibras celulósicas,

favorecendo assim a sua habilidade de aumentar a viscosidade, formação de géis e / ou atuar

como emulsificantes (ELLEUCH et al., 2011).

As carragenanas, uma família de PSs isolados de algas marinhas vermelhas, são

amplamente utilizadas como aditivos alimentares, como agentes emulsificantes, estabilizantes

ou espessantes (CHEN; YAN et al., 2007; CAMPO; KAWANO et al., 2009; BIXLER;

PORSE, 2011). Sua aplicabilidade, nas indústrias de laticínios (iogurtes, sorvetes,

achocolatados) (NECAS; BARTOSIKOVA, 2013) e embutidos (salsichas, apresuntados,

entre outros) cuja função é retardar a oxidação lipídica (VARELA, 2011), alimentos para pets

(MCHUGH, 2003), e para a fabricação de gelatinas e geleias, e como agente espessante em

21

molhos e sopas (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). São empregados nas indústrias de

cervejeira, vinhos e mel (HOLDT; KRAAN, 2011).

As agaranas são biopolímeros que estão presentes no material intracelular das espécies

de algas vermelhas e são divididos em duas partes: a agarose e a agaropectina, que pode ser

considerada uma mistura de polissacarídeos, entretanto, a agaropectina possui baixo poder de

gelificação e a agarose é um componente gelificante (FERRARIO; SAR, 1996). As agaranas

são utilizadas na fabricação de gelatinas, pois apresentam um tipo de fibra que não é digerido

e que possui propriedades laxativas, além de que, a gelatina com agarana se solidifica rápido

em relação à gelatina de origem animal, por esse motivo, que este composto vem sendo

utilizado em recheios de tortas, coberturas, glacês e produtos cárneos, em função de suas

propriedades coloidais e gelificastes (ORNELLAS, 2006).

O alginato, atualmente é obtido de algas pardas coletadas em regiões costeiras

marinhas, devido a suas propriedades bioativas tornou-se um produto de importância

comercial tanto para indústria de alimentos, indústria têxtil e de papel (MÜLLER et al.,

2011). Na indústria de alimentos, o alginato é aplicado na produção de sorvetes, em produtos

lácteos, misturas para bolos, além disso, é utilizado também na indústria de bebidas com a

finalidade de melhorar as características sensoriais destes produtos (CUNHA et al., 2009).

1.4 Carragenanas: propriedades estruturais e biológicas

As carragenanas são substâncias mucilaginosas presentes na parede das algas

vermelhas pertencentes à ordem das Gigartinales. A denominação “carragenana” é originaria

da “carraigeen”, palavra derivada do nome irlandês coloquial, cujo significado é "rocha

pequena" (STANLEY, 1987). Estes ficocolóides, formadores de géis viscosos, têm grande

importância econômica, devido suas propriedades funcionais. Em forma de pó, suas

características apresentam-se como inodoro e insípido, normalmente, são solúveis em água, e

compatíveis com a maioria dos alimentos, além disso, permitem substituir a gordura em

derivados lácteos, patês e molhos (LIMA et al., 2013).

As carragenanas de algas vermelhas, Rhodophyceae, têm sido amplamente utilizadas

em várias aplicações, tais como alimentos, produtos farmacêuticos, pesquisas, cosméticos e

industriais. Na indústria alimentar são utilizados como agentes gelificantes, espessantes,

estabilizantes e aditivos alimentares (SAHA; BHATTACHARYA, 2010; NECAS;

BARTOSIKOVA, 2013; PRAJAPATI et al., 2014; SALTMARSH, 2015 ).

22

As carragenanas são galactanas sulfatadas lineares hidrofílicas que apresentam como

açúcar majoritário a galactose. É um polissacarídeo com massa molecular acima de 100 kDa e

possui um conteúdo de éster sulfato entre 15% a 40% formado por unidades alternadas de D-

galactose e 3,6-anidro-galactose unidas por ligações α-1,3 e β-1,4-glicosídica (NECAS;

BARTOSIKOVA, 2013).

Sua classificação é representada por vários tipos, tais como: (Lambda), (Kappa),

(Iota), (Mu), (Nu) e (Theta) onde apresentam 22 a 35% de grupos de sulfatos (NECAS;

BARTOSIKOVA, 2013). Estes códigos foram atribuídos aos resíduos correspondendo à

denominação simplificada, de acordo com Knutsen et al. (1994). Esta nomenclatura é

relevante tanto para a sua classificação química como para a produção comercial, uma vez

que os diferentes subtipos de carragenanas são extraídos de fontes distintas (CAMPO et al.,

2009). A carragenanas do tipo Kappa (k - car) tem um teor de sulfato de éster de 25 a 30% e

um teor de 3,6 – anidro - galactose de 28 a 35%, do tipo Iota ( - car) tem um teor de sulfato

de éster de 28 a 30% e um teor de 3,6 - anidro-galactose de 25 a 30%, e a do tipo Lambda ( -

car) tem um éster sulfato de 32 a 39% e nenhum teor de 3,6 - anidro-galactose

(BARBEYRON et al., 2000).

As algas mais usuais para extração de carragenanas são Gigartina, Chondrus crispus,

Eucheuma, Hypnea, E. denticulatum, e Solieria filiformis (STANLEY, 1987; MCHUGH,

2003; COSENZA; NAVARRO; FISSORE et al., 2014). Estes polímeros são normalmente

extraídos em elevadas temperaturas alcalinas para transformar os precursores biológicos e

-carragenanas em - e -carragenanas (CAMPO et al., 2009) (FIGURA 1).

23

Figura 1 – As diferentes estruturas das unidades diméricas repetidas de carragenanas comerciais e estruturas relacionadas.

Fonte: Campo et al. (2009).

A reatividade química das carragenanas é devido aos seus grupos sulfato semi-éster

que são fortemente aniônicos, sendo comparados aos respectivos sulfatos inorgânicos. Os

cátions associados juntamente com as unidades de açúcar na cadeia do polímero determinam

as propriedades físicas das carragenanas (NECAS; BARTOSIKOVA, 2013).

De acordo com Bixler (1994), as carragenanas apresentam longas cadeias lineares de

D-galactose e D-anidrogalactose com sulfatos de éster, sendo, portanto aniônica, estes grupos

sulfatados são usualmente neutralizados por cátions, tais como Na+ (Sódio), K+ (Potássio),

Ca+2 (Cálcio) e Mg +2 (Magnésio), mas é provável que outros íons tenham esta capacidade de

neutralização com menor frequência (PARDONCHE, 1985). Consequentemente, a proporção

de sulfatos e de cátions na solução aquosa determinam a viscosidade das soluções ou a

resistência dos géis formados por carragenanas (CAMPO et al., 2009).

As viscosidades destes géis de carragenanas vão depender da concentração,

temperatura, e da presença de outros solutos, além do tipo de carragenana e do seu peso

molecular (LAI et al., 2000). A viscosidade aumenta exponencialmente com a concentração e

reduz com a temperatura (NECAS; BARTOSIKOVA, 2013). As carragenanas são

despolimerizadas por hidrólise catalisada por ácidos, ou seja, em temperaturas elevadas e pH

baixo, podem levar a perda da sua funcionalidade (STANLEY, 2011). No entanto, o aumento

24

da viscosidade pode ocorrer quanto à interação entre as cadeias lineares, diminuindo o espaço

livre ou aumentando o volume excluído; e a formação de um gel físico é ocasionada por

“reticulação” entre as cadeias. O aumento da viscosidade, principalmente, das frações de

kappa, iota podem gelificar em pequenas concentrações de sal e baixas temperaturas

(ANDERSON, 1968).

A solubilidade da carragenana em água depende dos níveis dos grupamentos de

sulfatos e seus cátions associados, consequentemente, esta proporção vai indicar a viscosidade

da solução como também a resistência dos géis formados e estas variáveis são importantes

para as indústrias alimentares e farmacêuticas (CAMPO et al., 2009).

A formação de géis de carragenanas abrange dois procedimentos, dependendo da

temperatura e dos cátions associados (RHEIN-KNUDSEN et al., 2015). A temperatura acima

de 75ºC propicia à transição da hélice por arrefecimento, ou seja, ocorrendo umas repulsões

eletrostáticas entre cadeias de polímeros adjacentes. Após arrefecimento, as cadeias

poliméricas alteram a conformação da estrutura de hélice (RHEIN-KNUDSEN et al., 2015).

A presença dos cátions associados, principalmente, potássio e cálcio, são uma exigência

característica para a gelificação, porém, para - e - car, é primordial a presença dos íons (Li +, Na +, K +, Rb +, Cs +) que são capazes de induzir a gelificação (RAMAKRISHNAN;

PRUD'HOMME, 2000; FUNAMI et al., 2008).

As carragenanas apresentam alguns efeitos biológicos, tais como antitumoral,

imunomoduladora, anticoagulante, antitrombótico, e atividades antivirais (NECAS;

BARTOSIKOVA, 2013). Além de ser um enorme recurso biológico, representando uma das

fontes mais promissoras para novos produtos e aplicações industriais (PULZ; GROSS, 2004).

No Brasil, houve um aumento pelo o consumo de carragenanas, por conta da sua

importância biológica (FURTADO, 2004). Além das suas aplicações industriais, estudos

científicos realizados anteriormente com kappa-carragenana extraída de H. musciformis

demonstraram que esse polissacarídeo possui potencial farmacológico gastroprotetor

(DAMASCENO et al., 2013) e antioxidante (ALVES et al., 2012; PRAJÂPATI et al., 2014).

Agentes antioxidantes têm a capacidade de reduzir ou evitar a oxidação do substrato

celular, levando a inibição das espécies reativas ao oxigênio (ALVES et al., 2012a). Portanto,

estes polissacarídeos sulfatados são capazes de reduzir os efeitos patológicos como agentes

25

carcinogênicos, arteriosclerose e processos degenerativos relacionados ao envelhecimento

(LIU et al., 1997; MAU et al., 2002).

Nos alimentos, a oxidação ocasiona a deterioração lipídica, consequentemente estes

danos são responsáveis pelos odores e sabores rançosos e ocasionam o decréscimo da

qualidade e segurança nutricionais, pois há formação de compostos secundários tóxicos.

Assim, a adição de antioxidantes é requerida para preservar sabor e odor dos produtos (DE

OLIVEIRA et al., 2009).

Tradicionalmente, os agentes antioxidantes sintéticos, utilizados nas indústrias

alimentícias são BHA (hidroxianisol butilado), BHT (hidroxitolueno butilado) e TBHQ

(butilhidroquinona terciária), porém estes compostos demonstram elevado potencial

carcinogênico (CHENG et al., 2013). No Brasil, o uso destes antioxidantes é controlado pelo

Ministério da Saúde que limita 200 mg/kg para BHA e TBHQ e 100mg/g para BHT como

concentrações máximas permitidas (ANVISA, 2017). Devido às preocupações quanto as

doses de segurança e toxicidade dos antioxidantes sintéticos (BALASUNDRAM et al., 2006),

existe a busca constante de substituintes naturais com propriedades antioxidantes (CHENG et

al., 2013; DORE et al., 2013; YANG et al., 2013).

Vários estudos científicos relatam que aditivos naturais possuem uma ampla ação

antioxidante, cuja finalidade visa aumentar a qualidade e vida de prateleira de produtos

cárneos (SAMPAIO et al., 2012; VEECK et al., 2015). Nos últimos anos, os polissacarídeos

de algas, demonstraram um papel importante como antioxidante natural capaz de eliminar

radicais livres prevenindo o dano oxidativo (WANG et al., 2009). Do mesmo modo, é

importante ressaltar que apesar de suas propriedades biológicas reconhecidas são necessários

maiores avaliações referentes à segurança das carragenanas e suas aplicações.

1.5 Tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus (LINNAEUS, 1758)

A introdução no Brasil da tilápia data de 1950, quando a espécie Tilapia rendalli

(BOULENGER, 1897) foi importada da África (GURGEL, 1998), com a finalidade de

povoamento dos reservatórios hidrelétricos da empresa “light” no Estado de São Paulo

(RAGHIANTE et al., 2017). Somente 20 anos depois o Departamento Nacional de Obras

Contra a Seca (DNOCS) disseminou a referida espécie nos reservatórios da região Nordeste

do país (OLIVEIRA et al., 2007; BARROSO et al., 2015).

26

A origem da tilápia do Nilo, O. niloticus é registrada há mais de quatro mil anos na

África, cuja espécie Cichlidae nativa do vale do rio Nilo era criada como peixes ornamentais

(BOECHAT et al., 2015). Foi introduzida no Brasil para o cultivo pelo cientista francês

Jacques Bard devido à sua biologia conhecida (SILVA, 2009). A fácil adaptação dessa

espécie ao clima do país, além da rusticidade e confinamento intensivo no cultivo frente

outras espécies dulcícolas, tornaram a tilápia do Nilo apreciada no mercado também pela sua

qualidade e rentabilidade ao agronegócio (SILVA; SOARES, 2009). Sua carne saborosa, com

baixo teor de gordura (0,9%), calorias (172 Kcal 100g de carne-1) e rendimento de filé em

torno de 30% a 40% (MESQUITA et al., 2016) tornam a espécie um produto satisfatório aos

olhos do consumidor.

Segundo dados do IBGE no ano de 2015, a produção de tilápia ocorreu em 1.878

municípios brasileiros, configurando seu potencial na aquicultura e equivalendo 41,9% do

total da piscicultura do país. Segundo as projeções, a produção de tilápia será maior que 30%

referente à de outros organismos como molusco, salmão e camarão que terão 10% de

crescimento (FAO, 2014).

Apesar do crescimento da tilapicultura nacional nos últimos anos, a comercialização

do pescado brasileiro em geral enfrenta algumas limitações, em destaque à qualidade do

produto, principalmente pelo baixo grau de frescor à mesa do consumidor, haja vista que o

beneficiamento do pescado é um dos principais impasses da cadeia produtiva, visto que, o

produto pode ser comercializado in natura, sem valor agregado e com qualidade inferior

(SUCASAS, 2011).

1.6 Pescado como alimento: subprodutos e aspectos de qualidade

De acordo com o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de

Origem Animal (RIISPOA), “pescado” é um termo empregado que abrangem peixes,

crustáceos, moluscos, anfíbios, quelônios e mamíferos de água doce ou salgada, cujos

recursos pesqueiros são usados na alimentação humana (BRASIL, 1984).

No Brasil, a produção de pescado no ano de 2011 atingiu quase 1,4 milhões de

toneladas, gerando um PIB nacional de R$ 5 bilhões (PINHEIRO, 2014). Da pesca extrativa

marinha em 2010, a região Nordeste, contribuiu com 195.842,1 toneladas, cujo desse total a

Bahia foi o Estado que apresentou a maior produção de pescado (37,8%) com 74.043,0

27

toneladas ano-1, seguido dos Estados do Maranhão (22,3%) e Ceará (10,8%) com 43.780,1 e

21.254,7 toneladas ano-1, respectivamente (BRASIL, 2012).

Segunda a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Nutrição, a meta para

2030 é de que o Brasil possa produzir 20 milhões de toneladas, melhorando sua posição no

ranking mundial (SOARES et al., 2011).

O valor nutricional do pescado é mundialmente conhecido como fonte na dieta

humana rica em proteínas, lipídios insaturados, vitaminas e minerais (GONÇALVES, 2011),

além de oferecer benefícios diversos à saúde (OGAWA; MAIA, 1999). As proteínas possuem

valor nutritivo elevado em aminoácidos importantes, em especial lisina e metionina. A

composição de lipídios rica em ácidos graxos polinsaturados apresenta efeito redutor sobre os

teores de triglicerídeos e colesterol sanguíneos, favorecendo a redução dos riscos de doenças

cardiovasculares diversas. Além disso, o pescado detém minerais, como Mg, Mn, Zn e Cu, e

vitaminas hidrossolúveis do complexo B e lipossolúveis A e D de desempenhos fisiológicos

regulatórios à saúde humana (OGAWA; MAIA, 1999).

A composição química da carne do pescado depende das condições do seu habitat,

espécie, tamanho, estado fisiológico, gênero, estação do ano, havendo inclusive variações

entre indivíduos da mesma espécie aquática (CORRÊA et al., 2016). No geral, o conteúdo de

proteínas é de aproximadamente 20%; de lipídeos variando entre 0,6 a 36%; de minerais de 1

a 2%; enquanto os carboidratos estão presentes em menor escala variando 0,3 a 1%

(OGAWA; MAIA, 1999). A atividade de água possui maior representatividade no pescado,

podendo variar, dependendo da espécie, entre 53 a 80% da constituição total (GONÇALVES,

2011).

Dentre as proteínas encontradas no músculo do pescado temos: Sarcoplasmáticas, as

quais desempenham funções bioquímicas nas células, são solúveis em água e em soluções

salinas e facilmente diluídas, estando presentes no pescado em aproximadamente 30% do seu

total; Miofibrilares do sistema contrátil que compreendem de 40 a 60% do músculo, sendo

formadas basicamente por miosina e a actina que têm a finalidade de formar a actomiosina

durante o rigor mortis, além de terem a capacidade de reter água, influenciando nas

propriedades sensoriais e capacidade de formar gel; Tecidos conjuntivos, cujos papéis estão

relacionados à integridade do músculo do pescado (OGAWA; MAIA, 1999).

28

Os lipídios são moléculas orgânicas constituídas por grupos de ácidos graxos, ácidos

carboxílicos com cadeias não ramificadas, portanto têm as funcionalidades principais de

fornecimento de energia, proteção mecânica, fornecimento de ácidos graxos essenciais e

manutenção de temperatura corpórea (GONÇALVES, 2011). O pescado possui o conteúdo de

lipídios variável, pois depende da época do ano, da dieta, da temperatura da água, da

salinidade, da espécie, do sexo e da parte do corpo analisada. Por estes motivos, há

necessidade de classificação do teor de gordura: pouca gordura (menos de 5 %), gordura

média (5 a 15%) e elevada gordura (mais de 15%) (ORDOÑEZ et al., 2005).

Os minerais são nutrientes que apresentam funções orgânicas essenciais e que atuam

na forma iônica, regulando o metabolismo enzimático e mantendo o equilíbrio ácido - básico.

O pescado representa uma fonte natural desses nutrientes essenciais e de fundamental

importância para a fisiologia (GONÇALVES, 2011).

O conteúdo de carboidratos nos peixes é considerado baixo, pois o seu teor sofre

modificações antes e durante a captura interferindo na depleção do glicogênio que é

metabolizado, cujo este processo resulta no acido lático durante o post-mortem. Entretanto,

outras espécies de invertebrados podem possui teores elevados de carboidratos (10,2 a 12,5%)

(GONÇALVES, 2011).

O pescado, recém-capturado está fresco, entretanto a perda de qualidade inicial que é

causada principalmente por mudanças autolíticas e não microbianas. Os compostos

nitrogenados não proteicos (aminoácidos livres, creatina, ureia e óxido de trimetilamina) são

formados inicialmente pela ação autolítica de enzimas musculares que hidrolisam proteínas e

lipídios que serão utilizados por bactérias (ORDÓÑEZ et al., 2005). As alterações autolíticas

são as principais responsáveis pela perda da qualidade inicial do pescado fresco,

principalmente devido ao rápido desenvolvimento de odores desagradáveis e ao aparecimento

de manchas devido à ação de enzimas digestivas (GONÇALVES, 2011).

O interessante é que logo após a autólise, as bactérias decompositoras entram em ação

acentuada, cujo resultado é a formação de compostos tóxicos no músculo do pescado. Estes

processos acarretam mudanças na estrutura e na composição química dos tecidos que podem

ser notadas através de análise sensorial (aparência externa, firmeza, consistência da carne e

odor) e juntamente com analises químicas, permite saber se o pescado está apropriado ou não

para consumo (ORDÓÑEZ et al., 2005).

29

1.7 Apresuntado

De acordo com o Ministério da Agricultura e do Abastecimento Secretaria de Defesa

Agropecuária (MAPA), Instrução Normativa Nº 20, de 31 de Julho de 2000, entende-se por

“apresuntado” o produto cárneo industrializado, obtido a partir de recortes e/ou cortes e

recortes de massas musculares, adicionados de ingredientes e submetido ao processo de

cozimento adequado (BRASIL, 2000). Entretanto sua diferença em relação ao presunto está

relacionada pelo fato da carne ser moída, ou seja, o presunto se caracteriza por ter pedaços de

carne inteiros em blocos ou reestruturados (SIQUEIRA-PEREIRA, 2008).

Na sua composição estão incluídos ingredientes obrigatórios: carne de pernil e/ou

paleta de suíno, sal, nitrito e/ou nitrato de sódio e/ou potássio em forma de salmoura;

ingredientes opcionais: proteínas de origem animal e/ou vegetal, açúcares maltodextrina,

condimentos, especiarias e aditivos. Entretanto será permitida a adição de 2,5 % (máx.) de

proteínas não cárnicas na forma agregada e característica física – química apresentada na

tabela 1 (BRASIL, 2000).

Tabela 1 – Características físico-químicas de acordo com regulamento técnico de identidade e qualidade de apresuntado.

COMPOSIÇÃO NO LIMITE FAVORÁVEL

CONCENTRAÇÃO (%)

Amido (max.)* 2,0 Carboidratos Totais (max.)* 5,0

Umidade (max.) 75 Gordura (max.) 12 Proteína (min.) 13

*O somatório de amido e carboidratos totais não deverá ultrapassar a 5% (BRASIL, 2000).

1.8 Aditivos e ingredientes usados na indústria alimentícia

1.8.1 Cloreto de sódio (NaCl)

O sal é um dos aditivos alimentares mais utilizados como conservante, melhorando o

sabor e absorção de água nos alimentos (SILVA; A MORAIS; SILVESTRE, 2003;

LAWRENCE et al., 2004). O sal comum não exibe ação antimicrobiana, entretanto tem

capacidade de reduzir a atividade da água (Aw) nos alimentos que influência na redução dos

processos microbianos nos alimentos (ALBARRACÍN, 2011). A alta concentração de sal

pode gerar mudanças no metabolismo celular devido ao seu efeito osmótico influenciando

microrganismos intolerantes a diferentes concentrações de sal, mais estas concentrações altas

são capazes de reduzir o valor nutricional dos alimentos preservados (LUCK; JAGER, 2000).

30

Para embutidos cozidos (presunto e apresuntado) a utilização de sal está entre 2 e 3%, faixa

que reside a maior aceitabilidade em sabor (MACARI, 2007). A legislação vigente não exige

o limite máximo para sua utilização.

1.8.2 Amido

O amido é o polissacarídeo mais importante e abundante encontrado em alimentos,

apesar de não ser considerado um aditivo (PEDROSO; DEMIATE, 2008). Principal

carboidrato da dieta humana, o amido, fornece de vinte a cinquenta por cento do valor total de

energia consumido diariamente em uma dieta balanceada (CABALLERO, 2009). Geralmente,

é muito utilizado para aumentar o rendimento, a textura do produto, e baixa a capacidade de

emulsificação dos alimentos processados (GONÇALVES et al., 2014). Entretanto, sua função

tecnológica não se restringe apenas as propriedades de textura, mas também como importante

substituto de gordura nos alimentos, melhorando as características de maciez e suculência

(LAGE, 2012).

1.8.3 Carragenana

Carragenana vem sendo amplamente usada em produtos cárneos variados, pois tem a

capacidade de formar gel, reter água e fornecer textura desejada. A função mais importante da

carragenana em produtos cárneos é a sua propriedade de gelatinização térmica reversível em

temperaturas 50 a 60%, pois a carragenana se dissolve totalmente e forma gel quando o

produto resfria, aumentando a retenção de água, textura e a consistência dos produtos cárneos

(PIETRASIK, 2003; PEDROSO; DEMIATE, 2008).

1.8.4 Condimentos e especiarias

São produtos constituídos de uma ou diversas substâncias saborosas, de origem

natural, com ou sem valor nutritivo, empregados nos alimentos para ressaltar ou modificar o

seu sabor e odor, além disso, melhorar a aparência do alimento (PARDI et al., 1994).

1.8.5 Nitratos e nitritos

Sais de nitrato e nitrito são aditivos adicionados frequentemente em alimentos

processados, atuam como conservantes, evitando sua deterioração, também desempenham

função como antioxidantes de lipídeos e realçadores da cor (ALMUDENA et al., 2001).

31

1.8.6 Polifosfatos

Estas substâncias são utilizadas como aditivos alimentares em variados produtos, tais

como no processamento de queijo, carne e pescado (SEAFISH, 2012; EFSA, 2013). Os

fosfatos apresentam inúmeras propriedades físicas e químicas que justificam a sua utilização,

pois têm efeitos emulsionantes, sequestrantes, tampões, entre outros (KIM et al., 2009).

Existem vários tipos de polifosfatos disponíveis para uso em produtos alimentares, porem os

mais utilizados são os tripolifosfato de sódio e o hexametafosfato de sódio que participam de

90% do processamento de carnes (MACARI, 2007).

1.8.7 Antioxidantes

Os compostos antioxidantes mais utilizados na indústria são polifenóis de origem

sintética, com destaque para: butil-hidroxi-anisol (BHA), butil-hidroxi-tolueno (BHT), terc-

butil-hidroxiquinona (TBHQ) e propil galato (PG) (RAMALHO; JORGE, 2006). Os produtos

cárneos se deterioram devido ao crescimento microbiano e a deterioração química

(KARAKAYA et al., 2011). A deterioração oxidativa em carnes apresenta mudanças na

coloração do alimento, sabor e formação de compostos tóxicos, reduzindo a vida de prateleira

com a perda de nutrientes e água (CONTINI et al., 2014). Antioxidantes são doadores de

radicais de hidrogênio para parear com outros radicais livres disponíveis e este efeito retarda a

oxidação, ocasionando um prolongamento maior na manutenção da qualidade e vida de

prateleira dos produtos cárneos (LEÃO et al., 2017).

1.8.8 Corantes

Podem ser classificados como naturais ou sintéticos, e os mais utilizados pelas

indústrias de embutidos são o carmim, urucum, entre outros. Eles têm a funcionalidade de

conferir, intensificar ou restaurar a cor dos alimentos processados (ODERICH, 2007). Em

geral, a importância da aparência do produto para sua aceitabilidade é a maior justificativa

para o emprego de corantes (PRADO; GODOY, 2007).

32

3 MATERIAL E MÉTODOS

1.9 Material

1.9.1 Coleta

A alga marinha, Hypnea musciformis, foi coletada na Praia de Flecheiras, município

de Trairi – CE, em estruturas de cultivo, em seguida, conduzidas ao Laboratório de

Processamento do Pescado (LAPROP), do Departamento de Engenharia de Pesca, Centro de

Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará - UFC, localizado no Campus Universitário

do Pici, Fortaleza, Ceará, em sacos plásticos. No laboratório, o material foi limpo, lavado com

água destilada e secado em papel filtro na temperatura ambiente. Em seguida foi armazenado

em ambiente refrigerado (-20°C) até seu uso.

1.9.2 Filés de Tilápia

Os filés de tilápia congelados foram adquiridos de um supermercado de Fortaleza -

CE. Em seguida, foram transportados em caixas isotérmicas ao Laboratório de Processamento

do Pescado (LAPROP), do Departamento de Engenharia de Pesca, Centro de Ciências

Agrárias, Universidade Federal do Ceará - UFC, localizado no Campus Universitário do Pici,

Fortaleza, Ceará, para o devido processamento.

1.9.3 Animais

Foram utilizados ratos wistar (240 - 260g), totalizando oito animais, quatro animais

por grupo, especificados em grupo CONT (controle) e PST (extração aquosa refinada),

fornecidos pelo biotério central da Universidade de Fortaleza (Unifor), Parecer Nº.010/2015,

aprovado em 16 de Dezembro de 2015, pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA.

Os animais receberam água e alimentação ad libitum. Os ensaios com os animais seguiram os

padrões exigidos de ética, biossegurança e respeito aos princípios dos 3 R’s da

experimentação animal (reduction, replacement and refinement).

33

1.10 Métodos

1.10.1 Extração aquosa refinada dos PST

A alga desidratada e triturada foi submetida à extração aquosa refinada. Foram

pesados 5 g da alga e hidratada em concentração de (1,5 %; m/v) e atribuído á agitação

mecânica em temperatura ambiente por 12 horas. Em seguida, realizou-se a filtração em

tecido de poliamida e submeteu-se aos resíduos da filtração, á extração aquosa (80 ºC por 4

h), adicionando água destilada nas mesmas proporções iniciais. Logo após, realizou-se

novamente a filtração e adicionou-se uma solução de etanol refrigerado (1: 3), deixando a

solução em repouso por 24 h em temperatura de -17 ºC. Em seguida, os polissacarídeos

sultados totais (PST) foram dialisados com água destilada (exaustivamente). Após a diálise,

refrigerou-se os PST em balões para liofilização.

1.10.2 Determinação do conteúdo de carboidratos totais (CTs)

Os carboidratos totais (CTs) dos PST foram determinados pelo método fenol - ácido

sulfúrico (DUBOIS et al., 1956) e monitorados em espectrofotômetro, ajustado à 490 nm. O

açúcar simples D-galactose foi utilizado para a obtenção da curva-padrão.

1.10.3 Determinação do conteúdo de proteínas contaminantes (PCs)

As concentrações de proteínas contaminantes (PCs) dos PST foram realizadas segundo

o método de Bradford (1976), utilizou-se Albumina Sérica Bovina (BSA) como padrão e

realizou-se as leituras em espectrofotômetro à 525 nm.

1.10.4 Determinação do conteúdo de sulfato livre (SL)

O teor de sulfato livre (SL) dos PST foi determinado após hidrólise ácida (HCl, 1M; 5

horas, 105 ºC) pelo método da gelatina - bário (DODGSON; PRICE 1962) e monitorado em

espectrofotômetro à 360 nm. O sulfato de sódio foi empregado como padrão.

1.10.5 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FT-IR)

Os espectros na região de IR dos PST foram registrados em um espectrofotômetro de

Shimadzu IR (modelo 8300) na região 500 e 4000 cm -1 utilizando pastilhas de KBr.

34

1.10.6 Determinação da atividade antioxidante in vitro

1.10.6.1 Método do sequestro de radicais DPPH (1,1-diphenyl-

picrylhydrazyl)

O sequestro do radical livre DPPH foi realizado de acordo com o método descrito por

Blois (1958). Inicialmente, adicionou-se 300 µL da amostra (PST, 0,125 – 4 mg.mL-1)

dissolvida em 200 µL de metanol (MeOH) e submetida a agitação. Posteriormente, foram

adicionados nessa solução 2,5 mL de DPPH (75 µM) e a mesma armazenada em ambiente

escuro por 30 minutos. As leituras de absorbâncias foram realizadas a 517 nm (A517). Todas

as reações foram realizadas em triplicata e o hidroxitolueno butilado (BHT) foi utilizado

como controle. O efeito no sequestro do radical livre DPPH (%) foi calculado através da

seguinte fórmula:

Efeito do sequestro DPPH (%) = [Ao - (A-Ab) /Ao]x100

Onde:

Ao: A517 do DPPH sem amostra;

A: A517 do DPPH com amostra;

Ab: A517 da amostra sem DPPH.

1.10.6.2 Ensaio de quelação do íon ferroso

O ensaio de quelação do íon ferroso foi analisado de acordo com o método descrito

por Chew et al. (2008). Seguindo a ordem, misturou-se 1 mL de Sulfato Ferroso 0,1 mM

(FeSO4), 1 mL das amostra de PST (0,1 - 4,0 mg.mL-1) e 1 mL de Ferrozina 0,25 mM (ácido

3- (2-piridil) 5,6 difenil – 1,2,4 – triazina – p - p’ - disulfônico).

Posteriormente, os tubos foram agitados e mantidos em repouso por 10 minutos. As

leituras foram realizadas a 562 nm de absorbância no espectrofotômetro (A562). O branco foi

realizado substituindo a amostra por água destilada. O EDTA (ácido etilenodiamino tetra-

acético) foi utilizado como material de referência. Todas as amostras foram realizadas em

triplicata. Os resultados foram expressos como habilidade de quelação do íon ferroso (%)

através da seguinte fórmula:

Habilidade de quelação do íon Ferroso (%) = [(Ao-(A-Ab)) /Ao]x100

35

Onde:

Ao: Absorbância (A562) do FeSO4 com Ferrozina sem amostra;

A: Absorbância (A562) da amostra mais FeSO4 e Ferrozina;

Ab: Absorbância (A562) da amostra sem FeSO4 e Ferrozina.

1.10.6.3 Ensaio de capacidade antioxidante total pela formação do

complexo fosfomolibdênio

O ensaio de capacidade antioxidante foi realizado através da formação do complexo

fosfomolibdênio descrito por Prieto, Pineda e Aguilar (1999). Inicialmente, seguindo esta

ordem adicionou-se 300 µL das amostras (PST, 0,125 – 4 mg.mL-1), 3 mL de solução de

molibdato de amônio (4 mM), ácido sulfúrico (0,6 M) e fosfato de sódio (28 mM),

submetidos a homogeneização e em seguida incubados a 95 ºC por 90 minutos. Logo após a

incubação foi realizado o resfriamento para a realização das leituras de absorbância a 695 nm

(A695). O branco foi representado pela substituição da amostra pelo solvente utilizado. Sendo

o BHT utilizado como material de referência. Para efeito de cálculo, o ácido ascórbico (200

µg/mL) foi considerado como 100% de atividade antioxidante. Todas as reações foram

realizadas em triplicata. Os resultados foram expressos em capacidade antioxidante total (%) e

calculados através da seguinte formula:

Capacidade antioxidante total (%) = [((A - Ab)) / ((Ac - Ab) )]x100

Onde:

A: A695 da amostra com a solução de molibdato, ácido sulfúrico e fosfato de sódio;

Ab: A695 do branco;

Ac: A695 do ácido ascórbico.

1.10.7 Avaliação sistêmica na toxicidade por dose repetida em ratos (wistar)

Os animais foram distribuídos em dois grupos de 4 animais denominados “controle”

(CONT) e “experimental” (PST), mantidos em ambiente controlado. O grupo “experimental”

foi tratado com PST via oral pela técnica de gavagem (WAYNFORTH; FLECKNALL,

1992), com dose de 100 mg.Kg-1, por um período de 14 dias (LIU et al., 1988). O grupo

“controle” recebeu da mesma forma solução salina (NaCl 0,15 M). Durante este período,

36

foram observados sinais físicos como coçar nariz, lamber as patas, rodopiar, ereção de pelos,

além de sinais comportamentais, como apatia e/ou agressividade. No décimo quinto dia, os

animais foram anestesiados e amostras de sangue do plexo oftálmico foram coletadas e

centrifugadas para a obtenção do plasma para posteriores dosagens séricas das atividades das

Transaminases Glutâmico Oxalacética e Pirúvica (TGO e TGP), Uréia, Fosfatase Alcalina e

Creatinina. Todos os parâmetros toxicológicos observados foram comparados a de animais

normais que receberam apenas solução salina do grupo CONT, nas mesmas condições que os

animais tratados com PST.

1.10.8 Análise histológica

As amostras (coração, rim direito, estômago, intestino delgado, fígado, baço, timo e

linfonodos) dos grupos CONT e PST foram fixadas em 10% de solução de formalina por 24

horas, seccionadas e embutidas em parafina. Secções de quatro micrometros de espessura

foram desparafinadas, coradas com hematoxilina e eosina, e depois examinadas sob

microscópio por um patologista. As espécimes foram avaliados de acordo com os critérios

descritos por Lima et al. (2014).

1.10.9 Elaboração do apresuntado

1.10.9.1 Elaboração da massa base com filés de tilápia

Os filés de tilápia refrigerados (6 kg) foram cortados em cubos e triturados em moedor

de carne utilizando um disco de 5 mm, obtendo-se uma massa base para elaboração do

apresuntado, em seguida a massa foi lavada duas vezes com água estéril (5 ºC) . Logo após, a

matéria processada foi dividida e embalada em sacos de polietileno de 1,0 kg e mantidas

congeladas (- 18 ºC) até o momento da sua utilização para preparação do apresuntado.

1.10.9.2 Preparação da salmoura

Para a preparação da salmoura foi utilizado água com temperatura aproximadamente

entre 2 – 3 ºC, tripolifosfato de sódio (estabilizante), condimento para peixe, cloreto de sódio

(NaCl), para o grupo controle (CONT) BHT (antioxidante), sal de cura (nitrato e nitrito) e

corante, em seguida, a salmoura foi misturada até a completa dissolução dos ingredientes.

37

1.10.9.3 Processo de cura

Os sais de cura (nitrato e nitrito) foram adicionados nas formulações dos apresuntados

para auxiliar na conservação, além de melhorar o sabor e cor, esses sais têm ação preventiva

na germinação e proliferação de esporos de algumas bactérias, em especial Clostridiuns

sulfitos redutores (ORDOÑEZ, 2005). O uso destes sais tem que ser estabelecidos, pois

alguns estudos relatam que os mesmos podem ocasionar danos tóxicos a humanos. De acordo

com a Legislação o limite máximo estabelecido é de 0,015 g / 100 g (BRASIL, 1998). O

processo de cura do apresuntado foi realizado durante 12 horas sob temperatura de 8 ºC.

1.10.9.4 Adição do amido e carragenana

O Ministério da Agricultura e do Abastecimento Secretaria de Defesa Agropecuária

estabelece o limite máximo de 0,02 g / 100g para adição de amido na elaboração de

apresuntado (BRASIL, 2000). Para a utilização da carragenana é permitida o limite máximo

de 0,1g / 100g (ANVISA, 2006). Estes compostos são utilizados na indústria de alimentos

como agentes espessantes, estabilizadores, gelificantes e de volume, adesivos, retentores de

umidade e texturizantes.

1.10.9.5 Embalagem, enformagem e prensagem

Após as etapas seguintes, a massa in natura foi envolvida em embalagem de

polipropileno (termoencolhível) e lacrada com clipes prendedores para embalagens. Foram

utilizadas fôrmas de aço inoxidável modelos 1 kg, em formato oval e retangular. A massa

devidamente embalada foi colocada na fôrma e fechada com tampa regulável para que o

produto fosse prensado.

1.10.9.6 Cocção

A cocção foi realizada em banho-maria de bancada da marca Quimis, as fôrmas foram

imersas em água com temperatura de 80 ºC. O processo de cocção foi finalizado quando o

produto atingiu uma temperatura interna entorno de 75 - 80 ºC. O tempo da cocção do

apresuntado corresponde à uma hora para cada quilo de massa.

38

1.10.9.7 Resfriamento e estocagem

O processo de resfriamento foi realizado com água estéril refrigerada (5ºC) juntamente

com gelo estéril em cubos durante 5 minutos logo após o processo de cocção para que ocorra

a redução da temperatura rapidamente, em seguida os produtos foram armazenados sob

temperatura de 8ºC e posteriormente foram desenformados. A estocagem das amostras de

apresuntado foi realizada durante 90 dias em refrigerador a temperatura de 8 ºC.

1.10.9.8 Formulações do experimento

O processamento para a elaboração dos apresuntados de tilápia do Nilo estão de

acordo com o fluxograma (FIGURA 2). As três formulações elaboradas são: CONT – 2%

amido (controle); APR1 – 1,0% de carragenana; APR2 – 3,0% de carragenana e APR3 – 1%

de amido com 1% de carragenana (TABELA 2). Os produtos finais estão representados na

figura 3.

Figura 2 – Fluxograma de processamento dos apresuntados de tilápia do Nilo.

Fonte: Autor (a) (2017)

Matéria-prima (filés de tilápia)

Corte e moagem

Pesagem (massa e ingredientes)

Adição da salmoura a massa

Homogeneizar a massa (15 min.)

Processo de cura (12h / 8ºC)

Adição do amido e/ou PST e homogeneizar (10 min.).

Enformagem e prensagem

Cocção (1h30min./ 80ºC)

Resfriamento (10 min.)

Armazenamento (8º)

39

Tabela 2 – Formulações dos apresuntados cozidos para 1000 g de massa de tilápia do Nilo.

INGREDIENTES/ADITIVOS FORMULAÇÕES (%)

CONT APR2 APR3 APR4 Massa 77,44 78,24 76,65 77,45 Água refrigerada 18,59 18,78 18,40 18,59 NaCl 1,45 1,46 1,43 1,45 Amido (Fécula de mandioca) 2,07 - - 1,00 PST - 1,04 3,07 1,02 Condimento para peixe 0,09 0,09 0,08 0,08 Sal de cura 0,02 0,02 0,02 0,02 Tripolifosfato de sódio 0,31 0,31 0,31 0,31 Antioxidante (BHT) 0,01 - - - Corante 0,03 0,03 0,03 0,03 Fonte: Autor (a) (2017).

Figura 3 – Foto ilustrativa das formulações dos apresuntados finais de filés de tilápia do Nilo.

Fonte: Autor (a) (2017).

1.10.1 Avaliação da composição centesimal dos apresuntados de tilápia do Nilo

A composição centesimal (umidade, proteína, lipídeos e cinzas) foi realizada, em

triplicata, no inicio e final do experimento conforme a Association of Official Analytical

Chemists (AOAC, 2005). Os carboidratos foram determinados por diferença da soma dos

nutrientes, de acordo com a fórmula abaixo:

% Carboidrato= [100-(% proteína+% umidade+% cinza+% lipídeo)].

40

1.10.2 Medição do Potencial Hidrogeniônico (pH)

O pH foi mensurado através de um potenciômetro digital. A análise foi realizada a

partir de um filtrado contendo 5g da amostra macerada com 50 mL de água destilada em um

Becker de 50 mL e com auxilio de um bastão para homogeneizar a mistura. Em seguida foi

realizada a leitura em quatro repetições, de acordo com a Association of Official Analytical

Chemists (AOAC, 2005).

1.10.3 Atividade de água (Aw)

Foi utilizado o equipamento Aqualab CX-2, da marca Decagon Devices Inc., com

temperatura da amostra 18ºC (±1) (Decagon Devices, Inc.). As amostras foram analisadas em

quatro repetições.

1.10.4 Oxidação Lipídica (Avaliação das Substâncias Reativas ao Ácido

Tiobarbitúrico - TBARS)

A estabilidade oxidativa do apresuntado foi avaliada pelo desenvolvimento de

Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) conforme Wyncke (1970). Foram

pesados 10 g das amostras de apresuntado em balança analítica e adicionados 50 mL de TCA

7,5 % para homeneização por 5 minutos. Logo após foi realizada a filtração em papel de filtro

qualitativo, recolhendo o extrato filtrado em balão volumétrico de 50 mL. Para cada amostra

foram recolhidos 5 mL do extrato filtrado e 5 mL de TBA 0,02M em tubo de ensaio com

tampa (quatro repetições), sendo homogeneizados com agitação mecânica. O branco foi

representado com 5 mL de TBA e 5 mL de TCA para calibrar o espectrofotômetro. Os tubos

foram aquecidos em banho-maria à temperatura de 90 ºC por 10 minutos e posteriormente foi

realizado o resfriamento em água refrigerada e gelo. A leitura foi realizada em

espectrofotômetro a 532 nm de absorbância.

1.10.5 Colorimetria

A determinação da cor foi realizada no laboratório de pós-colheita da EMBRAPA

Agroindústria Tropical em Colorímetro digital CR400 (Konica Minolta). O método foi o

sistema CIELAb desenvolvido por Hunter (1975) que utiliza uma escala L* a* b*. Onde L*

varia de preto a branco (0 a 100), a* varia do verde ao vermelho (-60 a +60) e b* varia de azul

a amarelo (-60 a +60). As análises das amostras foram realizadas com quatro repetições

totalizando 16 leituras.

41

1.10.6 Análises microbiológicas

As amostras de apresuntados foram submetidas às análises microbiológicas, segundo

Silva et al (2010), sendo elas: Contagem de Coliformes termotolerantes a 45ºC,

Staphylococcus coagulase positiva, Salmonella sp., e Contagem de bactérias Psicrotróficas.

Conforme RDC nº 12 de 02 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(BRASIL, 2001). As amostras foram transportadas em caixas isotérmicas ao Laboratório de

Microbiologia de Alimentos Embrapa Agroindústria Tropical (CNPAT), localizado no

Campus Universitário do Pici, Fortaleza, Ceará, para as devidas análises.

1.10.7 Análise estatística

Os dados obtidos durante o experimento foram tratados estatisticamente pela analise

de variância (ANOVA) e teste de Tuckey ao nível de p < 0,05 de probabilidade. Para a análise

dos dados foi utilizado o software Graphpad Prism 5.0.

42

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

1.11 Rendimento e composição química dos polissacarídeos sulfatados totais

A macroalga marinha vermelha H. musciformis foi sujeita à extração de

polissacarídeos sulfatados totais em meio aquoso refinado (PST; 25 e 80°C) e o rendimento e

composição química estão relatados na tabela 3.

Tabela 3 – Rendimento e composição química dos PST, da macroalga marinha Hypnea musciformis.

Composição Química (%)

Método Rendimento Carboidratos Totais Sulfato Proteínas Contaminantes

PST 36,82 ± 6,56% 77,39 ± 0,012% 15,66 ± 0,33% -

*- ausência.

O emprego de água se confirmou um meio para obtenção de PST presentes em H.

musciformis comparado a outros estudos (ARMANA; QADER, 2012; VÁZQUEZ-DELFIN

et al., 2013) apresentando neste trabalho 36,82% de rendimento obtido pelo método de

extração aquoso refinado, a partir da matéria-prima desidratada e procedimento de

liofilização.

A quantidade significativa de PST foi presumida ao fato da obtenção de precursores e

outros componentes químicos não formadores de gel ocorrentes na parede celular da

macroalga como proposto por Rodrigues et al. (2011), diante a presença desses constituintes

nas primeiras camadas do tecido, empregando-se água como meio extrator em temperatura

ambiente (25°C) (CAMPO et al., 2009).

Somou-se ainda, a composição de carboidratos totais indicada na tabela 3 que

apresentou um teor (77,39%) e o conteúdo de sulfato (15,66%) na amostra de PST analisadas,

como em coerência a um estudo anterior (RODRIGUES et al., 2011).

A análise pelo método Bradford (1976) indicou nas amostras dos extratos de PST a

ausência de proteínas e esse achado poderia ser o resultado do emprego de temperatura

elevada (80°C), promovendo a desnaturação das proteínas complexadas aos carboidratos

presentes na parede celular de H. musciformis. Porém, a presente pesquisa contrastou a de

Rodrigues et al. (2011), na qual PSs obtidos de extrações aquosas mostraram proteínas

contaminantes. Possivelmente, a época de colheita de H. musciformis em maricultura dessa

43

espécie para a realização deste estudo poderia refletir na referida diferença encontrada quanto

ao conteúdo de proteínas (CARDOZO et al., 2007).

1.12 Espectroscopia na região do infravermelho (FT-IR)

A análise apresentou as características estruturais pela técnica espectroscópica de

infravermelho, usando o PST da macroalga marinha vermelha H. musciformis.

O espectro esta ilustrado na figura 4 revelando sinais químicos relativos à presença de

PST na amostra examinada. De acordo com a janela espectral considerada (700 a 1500 cm-1),

perfis estruturais foram encontrados no extrato contendo polímero, cujas bandas em torno de

1259 cm-1, indicam a ocorrência do grupamento éster sulfato (FERNÁNDEZ et al., 2012).

Além disso, o polímero possui bandas de absorção fortes e amplas, que indicam

características de PST, na região 1000 a 1100 cm -1 (TURQUOIS et al., 1996).

Figura 4 – Espectros de infravermelho do PST, obtido por FT-IR da macroalga marinha vermelha Hypnea

musciformis.

A presença de bandas em torno de 926 cm-1 no espectro sugere a presença de 3,6-

anidro-D-galactose (PEREIRA et al., 2003; SILVA et al., 2010). Os sinais principais na

região de 846 cm-1 foi atribuído ao carbono 4 de D-galactose-4-sulfato no espectro da figura 4

para PST como característica de -carragenana (PEREIRA et al., 2003; PEREIRA et al.,

PST

44

2009; RHEIN-KNUDSEN et al., 2017). O estiramento químico em 705 cm-1 presumiu

sulfatação no carbono 4 da galactose (ALVES et al., 2016). No presente estudo, estas

características sugeriram que o principal tipo de hidrocolóide presente na H. musciformis pode

vim a ser k - carragenana.

1.13 Atividades antioxidantes in vitro

1.13.1 Capacidade de sequestro do radical DPPH

DPPH é um composto de radicais livres estáveis que tem sido amplamente utilizado

para determinar a capacidade sequestradora de radicais livres das amostras (WANG et al.,

2009). No estudo presente, mediu-se o efeito de eliminação de radicais livres DPPH de PST

(GRÁFICO 1).

Gráfico 1 – Capacidade dos PST da H. musciformis em sequestrar o radical DPPH.

0,125 0,25 0,5 1 2 4 0,50

20

40

60

80

100PSTBHT

Concentração (mg.mL -1)

% d

e re

duçã

o de

DP

PH

*BHT controle positivo; PST (extração aquosa refinada).

Os resultados demonstraram que o PST teve um efeito significativo sobre a inibição da

formação destes radicais, onde PST apresentou EC50 = 4,7 mg.mL-1. No entanto, nenhuma das

concentrações apresentaram atividades mais forte que o BHT na concentração 0,5 mg.mL-1, o

composto usado como referencial controle obteve valor de EC50 = 1,50 mg.mL-1 , portanto

quanto menor o valor de EC50 maior será a atividade antioxidante das amostras. Na

concentração de 4 mg.mL-1 a PST apresentou uma atividade antioxidante mais forte, cujos

efeitos de eliminação foram de 57,87%.

O resultado indica que a redução do teor de PST de H. musciformis teve um efeito

importante na atividade de eliminação de radicais DPPH. Abad et al. (2013) descobriram que

45

os polissacarídeos influenciaram as atividades antioxidantes, o que pode ser atribuído ao seu

teor de açúcares redutor. Alves et al. (2012b) avaliaram a atividade antioxidante in vitro de

galactanos sulfatados de H. musciformis e verificaram que na sua extração enzimática de 4 mg

mL-1 obtiveram uma redução de 9,88% com EC50 de 37,46 mg mL-1, afirmando seu potencial

como antioxidante. Entretanto, estes resultados diferiram com o nosso estudo, pois os

métodos aplicados de extração foram distintos. Souza et al. (2012), utilizando o método de

extração aquosa a 90ºC para obter PSs da macroalga vermelha G. birdiae apresentaram

resultados de EC50 = 1,62 mg.mL-1 , essa concentração é menor do que nosso referido estudo

para a mesmo tipo de extração (GRÁFICO 1). Zubia e Robledo (2007), verificaram a

capacidade de redução de DPPH de 23 para Rodophytas, dentre estas algas a Chondria

baileyana foi a que apresentou a maior atividade antioxidante com EC50 de 2,84 mg.mL-1. E

de acordo com os mesmos as comparações entre os estudos tornam-se difíceis devido à

utilização de protocolos de extração diferentes, além das variações do ambiente durante as

coletas. Estes resultados sugerem que a inclusão de PST com atividades antioxidantes

possivelmente evitará ou reduzirá a deterioração oxidativa dos alimentos.

46

1.13.2 Habilidade de quelação íon ferroso

A habilidade de quelação do íon ferroso consiste em avaliar a capacidade de capturar

íons metálicos presentes no meio evitando reações com outras substâncias, tais como: lipídios,

proteínas e componentes celulares (WANG et al., 2012). Esses íons metálicos podem atuar

como catalisadores na deterioração oxidativa de macromoléculas biológicas devidas sua alta

reatividade (CHEW et al., 2008; WANG et al., 2012). Os resultados podem ser visto no

gráfico 2.

Gráfico 2 – Habilidade dos PST de H. musciformis na quelação do íon ferroso.

0,125 0,25 0,5 1 2 4 0,50

20

40

60

80

100PSTEDTA


Que

laçã

o do

íon

ferr

oso

(%)

*EDTA controle positivo; PST (extração aquosa refinada).

No gráfico 2, PST demonstrou a capacidade de quelação ferrosa de uma maneira

dependente da concentração, com efeito máximo em 4 mg.mL-1 (67,67%) de quelação. Alves

(2011), em concentrações testadas de galactana sulfatada de H. musciformis exibiu uma

atividade quelante de ferro a baixo de 8% a uma concentração 5 mg.ml -1. O autor atribuiu que

há uma necessidade de mais estudos para esclarecer a relação entre o teor de sulfato e a ação

antioxidante, pois a H. musciformis possui alto teor de sulfato apresentando atividade

antioxidante moderada ou alta, dependendo da metodologia utilizada. Neste ensaio de

determinação da habilidade de quelação do íon ferroso, o EDTA foi utilizado como controle

positivo.

47

O íon ferroso é importante na peroxidação lipídica pré-oxidante, que ocorre de acordo

com a reação de Fenton (Fe 2+ + H 2 O 2 → Fe 3+ + OH - + OH), devido à sua alta reatividade

(CHUN – HUI et al., 2007). Os PST de H. musciformis apresentaram uma quelação de ferro,

como pontecial antioxidante por inibir reações que poderiam modificar o DNA, levando-o à

inativação ou mutação, ocorrendo a lipoperoxidação (HALLIWELL; GUTTERIDGE 1989).

1.13.3 Atividade Antioxidante Total

A atividade antioxidante total é a formação do complexo de fosfomolibdênio pela

redução do molibdênio (Mo 6+ → Mo 5+) por um agente redutor em um meio ácido (formando

o fosfomolibdênio da cor azul) (PRIETO et al., 1999). Os resultados estão expostos no gráfico

3.

Gráfico 3 – Capacidade Antioxidante Total dos PST de H. musciformis.

0,125 0,25 0,5 1 2 4 0,50

20

40

60

80

100PSTBHT


Ati

vida

de A

ntio

xida

nte

Tota

l (%

)

* BHT controle positivo; PST (extração refinada aquosa).

É possível verificar no gráfico 3, que PST só apresentou atividade antioxidante a partir

da concentração de 0,25 mg.mL-1 (1,40 %), sua capacidade foi crescente até a concentração

máxima 4 mg.mL-1 (59,36 %). O BHT, utilizado como controle, promoveu efeitos 100%

antioxidantes na dose de 0,5 mg.mL-1. Sousa et al. (2016) para os polissacarídeos sulfatados

da alga vermelha Solieria filiformes encontraram a capacidade de antioxidante total na

concentração de 4 mg.mL -1 (62,46%), valor acima do presente estudo. Nossos resultados

sugerem que o PST pode servir como um agente redutor do estresse oxidativo ocasionados

pelos agentes radicais livres.

48

1.14 Avaliação sistêmica na toxicidade por dose repetida em ratos wistar

No presente estudo, alguns parâmetros físicos e comportamentais foram analisados

nos animais dos grupos Controle (salinos) e PST, tais como coçar o nariz, lamber as patas,

rodopiar, ereção de pêlos, apatia e/ou agressividade, respectivamente. Segundo as

observações, os animais que receberam os PST, comparados ao controle (salina), mostraram-

se normais. O mesmo efeito comportamental foi verificado por Rodrigues et al. (2011), onde

demonstraram resultados normais para camundongos. Os resultados da avaliação dos

parâmetros corporais e as dosagens estão demonstrados na tabela 4.

Tabela 4 – Avaliação dos PST de H. musciformis sobre a massa corpórea, peso relativo dos órgãos e parâmetros bioquímicos de ratos wistar, após 14 dias alimentados com doses de 100 mg.kg -1.

Tratamento oral (100 mg.kg-1)

Parâmetros Salina PST

Massa corpórea (g) inicial 246,75 ± 9,8 254,75 ± 19,9

Massa corpórea (g) final 239,75 ± 3,9 242,75 ± 19,7

Fígado(g) massa corpórea-1 2,84 ± 0,4 3,27 ± 3,8

Rim(g) massa corpórea-1 0,38 ± 0,04 0,41 ± 3,8

Coração(g) massa corpórea-1 0,36 ± 0,08 0,37 ± 1,5

Timo(g) massa corpórea-1 0,17 ± 0,1 0,17 ± 1,5

Intestino delgado(g) massa corpórea-1 1,40 ± 0,76 1,67 ± 1,4

Linfonodos(g) massa corpórea-1 0,07 ± 0,06 0,06 ± 2,4

Estômago(g) massa corpórea-1 1,14 ± 1,5 1,16 ± 2,3

Baço(g) massa corpórea-1 0,37 ± 0,08 0,37 ± 2,4

TGP/ALT (U L -1) 69,0 ±1,40 35,0 ± 0,7

TGO/AST (U L-1) 195,0 ± 1,67 106,0 ± 0,95*

Fosfatasse 95,0 ± 0,12 64,0 ± 0,10

Ureia (mg dL-1) 80,0 ± 1,62 49,0 ± 0,99

Creatinina 0,55 ± 0,05 0,46 ± 0,04

Os dados são expressos como média ± erro-padrão. *Foi considerado P<0,01 como significantes.

https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwihhuWeiLLUAhXMFJAKHRAwCOEQFggnMAA&url=http%3A%2F%2Fwww.minhavida.com.br%2Fsaude%2Ftudo-sobre%2F18546-fosfatase-alcalina-exame-investiga-doencas-do-figado-e-dos-ossos&usg=AFQjCNESTX0mojHx45xATbSwOqxRvmPZGQ&sig2=OanVMeabQmr7nzjP2YQtyg

49

Verificou-se que os animais alimentados pelo método de gavagem com dosagem de

100 mg kg-1 com os PST de H. musciformis, foram tolerantes às aplicações durante os 14 dias

consecutivos experimentais. Apesar da variação de massa corpórea apresentada pelos animais

no decorrer do período de avaliação, não se constataram diferenças significantes (P<0,01)

entre os dois grupos (salina e PST). No decorrer do experimento os animais apresentaram uma

redução de peso ao final do experimento, em decorrência que ao final da experimentação os

animais passaram doze horas desprovidos de alimentação e água. Os órgãos coletados

apresentaram características normais.

O grupo salina (TABELA 4) apresentou valores significativamente mais elevados do

que os tratamentos PST em relação ALT e AST, mais dentro do padrão referencial. As

dosagens de ALT, AST, fosfatase, ureia e creatinina são usadas como marcadores de funções

renais ou hepáticas, portanto o grupo estudado de PST de H. musciformis não ocasionou dano

hepatocelular ou renal (LIMA et al., 2014). Ao final da experimentação, não foram

observadas alterações significativas nos parâmetros avaliados no teste de toxicidade dos PST,

por via oral, em ratos na dose de 100 mg/kg. Rodrigues et al. (2011), investigando a avaliação

toxicológica in vivo de PSs de H.musciformis através da extração com papaína, constatou que

o tratamento subcrônico, no decorrer de 14 dias consecutivos em camundongos não resultou

em efeitos sistêmicos importantes.

Grupos (machos e fêmeas) de porcos (Landrace dinamarquês) foram alimentados com

0, 50, 200 ou 500 mg.kg -1 de peso corporal por dia com kappa-carragenana de C. crispus

durante 83 dias, os animais não apresentaram mudanças comportamental e hematológicas

(POULSEN, 1973). O que condiz com os dados do presente estudo. Coulston et al. (1976),

obtiveram o mesmo efeito no comportamento de ratos (machos e fêmeas) submetidos a 5% de

kappa e lambda-carragenana de C. crispus durante nove meses.

Entretanto, estudos relatados nos últimos anos mostraram que a administração em

longo prazo de carragenana em vários animais causou danos na mucosa intestinal e promoveu

crescimento tumoral (TOBACMAN, 2001). Liang (2009) contestou que mais estudos

epidemiológicos são essenciais para avaliar a segurança do carragenana como alimento.

50

1.15 Analise histológica

As análises de cortes histológicos dos órgãos dos animais submetidos ao experimento

têm como objetivo avaliar alterações microscópicas nos tecidos provocadas pela

administração do PST de H. musciformis durante os 14 dias de experimento.

A avaliação das laminas dos órgãos (coração, rim direito, estômago, intestino delgado,

fígado, baço, timo e linfonodos) consiste em comparar os cortes histológicos dos animais

tratados com o grupo controle e se há indícios básicos de toxicidade e inflamação dos tecidos

dos órgãos analisados.

Os resultados da avaliação histológica do grupo tratado com PST não apresentaram

anormalidades nos tecidos e nem ausência de reações inflamatórias, portanto, o polissacarídeo

administrado por via oral, dose de 100 mg.K-1 de animal, durante 14 dias não apresentaram

sinais típicos de toxicidade em ratos machos adultos.

CAMPO et al. (2009), demonstraram que modelos animais e aplicação de

carragenatos de baixo peso molecular estão associados à indução de ulcerações intestinais e

efeitos colaterais. No presente estudo não houveram indícios desses efeitos colaterais. As

galactanas possuem grande interesse para as indústrias de alimentos por conter propriedades

funcionais físicas (CAMPO et al., 2009). Embora a carragenana de macroalgas possa ser

degradada pelo organismo, provavelmente a sua importância toxicológica encontra-se

limitada, ou seja, se a carragenana de macroalgas fosse totalmente degradada poderia causar

ulceração ou crescimento tumoral nos organismos, e seria detectado em estudos de

alimentação por via oral (NECAS et al., 2013).

1.16 Análises do apresuntado

1.16.1 Composição Centesimal

A composição centesimal dos apresuntados não apresentou diferença significativa

entre as amostras, exceto na umidade que apresentou diferença em CONT e APR1 para

p<0,05, e CONT e APR3 para p<0,01(TABELA 5).

51

Tabela 5 – Composição centesimal (media e desvio padrão) de apresuntados elaborados com filés de tilápia de Nilo com diferentes concentrações de PST.

Composição centesimal CONT APR1 APR2 APR3 Inicial Inicial Inicial Inicial

Proteína 11,94±1,72 9,19±1,77 9,33±1,11 9,26±1,09 Umidade 77,7±0,55 82,29±0.97 82,77±1,26 71,26±1,40 Cinzas 3,06±0,59 2,12±0,60 3,16±0,20 2,41±1,05 Lipídeos 2,53±0,51 2,98±0,50 1,77±0,75 1,73±0,39 Carboidratos 4,77±1,0 3,42±1,2 2,98±0,89 5,35±1,21

Composição centesimal CONT APR1 APR2 APR3 Final Final Final Final

Proteína 10,23±0,10 5,29±0,89 7,55±0,9 6,19±0.60 Umidade 74,81±0,74 79,0±1,12 77,61±0,70 69,02±0,79 Cinzas 3,27±0,10 3,51±0,05 3,67±0,57 2,9±0,22 Lipídeos 1,27±1,54 2,48±0,65 1,58±1,55 1,61±0,58 Carboidratos 3,59±0,9 2,25±1,01 1,62±0,73 4,71±1,02 *CONT (amostra controle com 2% de amido); APR1 (amostra contendo 1% PST de H. musciformis); APR2 (amostra contendo 3% PST de H. musciformis); APR3 (amostra contendo 1% de amido mais 1% PST de H. musciformis).

Os resultados da composição centesimal dos apresuntados estão descritos na Tabela 5.

Os teores de proteínas variaram de 5,29 a 11,94%; umidade 69,02 a 82,77%; lipídios 1,27 a

2,98% e carboidratos 1,62 a 5,35%, portanto, estes valores de composição centesimal estão

próximos do limite da legislação brasileira para apresuntados, exceto os valores de umidade

que ultrapassaram o limite estabelecido de 75% (BRASIL, 2000). A taxa elevada da umidade

é decorrente da utilização da matéria prima ser o pescado que possui elevada atividade de

água no músculo (GONÇALVES, 2011). O APR3 pode ser destacado por apresentar umidade

abaixo de 72%, pois a condição determinante para a formação de um gel de boa qualidade é a

umidade apresentar valor até 75% que favorece a reestruturação adequada das fibras, uma

condição fundamental para obter melhor textura no produto final (OGAWA; MAIA, 1999).

Os níveis de proteínas encontrados nas amostras abaixo de 12% podem ser decorrentes

de uma maior eficiência na extração das proteínas sarcoplasmáticas, durante as duas lavagens

da massa, favorecendo na proporção das proteínas miofibrilares, principais responsáveis pela

formação de gel (OGAWA; MAIA, 1999), em detrimento das proteínas sarcoplásticas,

podendo ter resultado na diminuição do teor proteico dos apresuntados de nosso estudo. Outro

fator que provavelmente provocou a redução proteica nos apresuntados foi o tempo de cocção

que pode ter ocasionado à desnaturação térmica das proteínas (OGAWA; MAIA, 1999).

PARDI et al. (1996) relataram que temperaturas de cocção na faixa de 70 a 80º C por um

tempo de 15 minutos aproximadamente podem acarretar uma desnaturação proteica. Da

52

mesma forma, pode ter ocorrido desnaturação das proteínas miofibrilares do tecido muscular

da carne, as quais são responsáveis por 50% da retenção de água. O teor de lipídios das

amostras analisadas variou de 1,27 a 2,98%. Como estes valores estão próximos do limite da

legislação para alimento saudáveis (BRASIL,1998). Pedroso; Demiate (2008) obtiveram teor

de lipídios das amostras de presunto cozido sob a influência de amido e carragenana que

variaram de 2,39 a 3,79% indicando um alimento low-fat (pouca gordura) que é de 3 g.100 g -

1 de alimento (BRASIL, 1998).

A amostra APR3 apresentou níveis de carboidratos considerados acima da legislação,

sendo que a lei vigente determina o somatório de amido mais carboidrato até 5% (BRASIL,

2000). O elevado percentual de carboidratos no apresuntado em questão deve-se

principalmente à adição de fécula de mandioca e/ou carragenana durante o processamento,

visto que, o musculo de tilápia apresenta em sua composição um conteúdo baixo de

carboidratos. Os teores elevados de cinzas devem-se à adição de aditivos importantes para a

conservação do apresuntado, tais: sais de cura (nitratos e nitritos), cloreto de sódio e

tripolifosfato de sódio. Estes resultados estão semelhantes com Alfaro et al. (2004).

1.16.2 pH (Potencial Hidrogeniônico)

O pH é um fator de influência na qualidade e segurança dos alimentos, pois sua

determinação pode indicar o grau de deterioração do alimento (RAMOS; GOMIDE, 2007). A

evolução dos valores de pH das amostras durante o período de armazenamento a 8°C de

temperatura, é apresentada no gráfico 4 através de análise de variância verificou-se que não

houveram diferenças significativas (p < 0,05) entre as amostras durante os 90 dias de

armazenamento, estes dados estão de acordo encontrados com Pedroso e Demiate (2008).

Silva et al. 2015, analisaram valores de pH em patês de presunto, em função do tempo de

armazenamento e também não encontraram diferenças significativas nas cinco amostras de

patê analisadas, sendo que quatro amostras apresentaram pH próximo de 6,5.

53

Gráfico 4 – Avaliação do pH das amostras de apresuntado durante 90 dias de estocagem.

0 15 30 45 60 75 906.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0ControleAPR1APR2APR3

Tempo (dia)

pH

*CONT (amostra controle com 2% de amido); APR1 (amostra contendo 1% PST de H. musciformis); APR2 (amostra contendo 3% PST de H. musciformis); APR3 (amostra contendo 1% de amido mais 1% PST de H.

musciformis).

Observando o gráfico 4 verificou-se que o pH das amostras iniciais CONT (6,57),

APR1 (6,63), APR2 (6,53) e APR3 (6,57) foram bem acima do valor quantificado para

embutidos cozidos de suíno, ave e bovino que apresentam faixa de 5,9 - 6,1(BRASIL, 2001).

Isso já era esperado, pois a carne de pescado apresenta menor conteúdo de glicogênio, logo,

seu pH (6,8) é próximo da neutralidade, devido à baixa produção do ácido láctico na etapa de

pré-rigor (GONÇALVES, 2011) portanto contribuindo com o aumento do pH das amostras de

apresuntado. O pH se manteve estável até o 30º dia de estocagem. No 45º dia o valor de

APR3 se sobressai em relação aos demais apresentando pH (6,72), supondo que o produto

ainda apresenta boa qualidade. No 60º dia, o pH de APR1 (8,30) e APR2 (8,42) apresentaram

maior faixa podendo ser explicadas por alterações bioquímicas devido à ação de enzimas

tissulares e microrganismos que podem promover a elevação do pH (OGAWA; MAIA, 1999),

portanto a partir desse período os apresuntados já apresentaram características de degradação.

1.16.3 Índice de TBARs (ácido 2-tiobarbitúrico)

TBARS é um fator importante por ser considerado um parâmetro físico-químico de

qualidade em produtos cárneos maturados, fermentados e curados (TERRA et al., 2006). No

gráfico 5, encontram-se os valores de TBARS expressos em mg de malonaldeído por kg de

amostra.

54

Gráfico 5 – Valores do índice de TBARs para os apresuntados adicionados amido e PST elaborados com filés de tilápia do Nilo.

0 15 30 45 60 75 900.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5CONTAPR1APR2APR3

Tempo (dia)

TBA

Rs

(mg

MA

. kg

-1)


musciformis).

Observa-se que os valores iniciais variaram de 0,89mg a 0,99mg de malonaldeído.Kg–

1, entre as amostras. Os valores de TBARS se apresentaram favoráveis até 60 dias de

estocagem CONT (1,72 mg de malonaldeído.Kg–1), APR1 (1,87 mg de malonaldeído.Kg–1),

APR3 (1,50 mg de malonaldeído.Kg–1), exceto o APR2 que apresentou 2,07 mg de

malonaldeído.Kg–1 . Torres e Okani (2000), indicaram que valores de TBARS até 1,59 mg

malonaldeído.Kg–1 por amostra são considerados baixos para serem percebidos por análise

sensorial e não causam alarme para a saúde do ser humano. Entretanto no presente estudo, nos

60 dias de estocagem os produtos já apresentavam características de deterioração visualmente.

Mathias et al. (2010), avaliando alterações oxidativas (cor e lipídios) em presunto de peru

tratado por alta pressão durante 90 dias de armazenamento a 8 °C, obteve alterações do índice

de TBA com 30 dias de armazenamento em relação aos demais. Os resultados indicam que as

amostras de apresuntados estão viáveis para o consumo até o 45º dia de estocagem.

1.16.4 Atividade de água (Aw)

De acordo com a tabela 6 os valores encontrados para atividade de água (Aw) não

apresentou diferença significativa (p>0,05) para o CONT em relação aos demais tratamentos.

55

Tabela 6 – Dados do Índice da atividade da água (Aw) do apresuntado de tilápia do Nilo.

Amostras Aw

CONT 0,97 ± 0,003

APR1 0,98 ± 0,004

APR2 0,96 ± 0,004

APR3 0,97 ± 0,003


musciformis); ** Letras iguais, os tratamentos não diferem entre si a 5% de probabilidade.

Os resultados ficaram entre a faixa 0,96 a 0,98 conforme apresentaram alguns

trabalhos com apresuntados (LAGE, 2012; PRESTES, 2008). Januzzi (2007), avaliando a

atividade de água em presunto cozido de suíno com adição de fibras obteve resultados entre

0,86 a 0,89. Nosso presente estudo obteve resultado de Aw maior, que já era esperado, pois a

matéria prima, o pescado, apresenta atividade de água elevada (GONÇALVES, 2011). De

acordo com Kotzekidou e Bloukas (1996), o presunto cozido é um produto cárneo altamente

perecível devido sua alta atividade de água de 0,96 a 0,98, favorecendo o crescimento

predominante de bactérias ácido lácticas.

Verificamos que o apresuntado APR2 que possui 3% de carragenana apresentou Aw

de 0,965 menor que os outros tratamentos, isso também já era esperado, pois quanto maior for

a concentração de carragenana aplicada ao produto menor será a Aw. Pedroso; Demiate

(2008) analisando a influência do amido e carragenana nas características do presunto cozido

de peru obtiveram valores menores de Aw nas amostras contendo carragenana.

Estes resultados tem grande importância do ponto de vista microbiológico do produto,

pois a adição da carragenana daria estabilidade reduzindo a atividade de água do alimento,

portanto, consiste em um meio de conservação para subprodutos de pescado.

1.16.1 Colorimetria

Para a determinação de cor das amostras de apresuntado foi utilizado o colorímetro

Hunter (1975), nos parâmetros de L* a* b*, onde foram obtidos os seguintes valores

apresentados abaixo (Tabela 7).

56

Tabela 7 – Analise de cor das amostras de apresuntado no tempo inicial.

AMOSTRAS Variáveis CONT APR1 APR2 APR3

L* 71,26 71,85 72,29 73,27 a* 12,37 9,35 10,35 10,85 b* 12,97 12,17 13,12 13,55


musciformis).

As amostras de apresuntado apresentaram uma boa luminosidade, pois a cor encontra-

se próxima ao branco. Onde L* varia do preto ao branco (0 a 100), a* do verde ao vermelho (-

60 a 60) e b* do azul ao amarelo (-60 a 60). As avaliações de cor das amostras foram

realizadas a fim de averiguar a influencia do PST nestas características físicas em relação ao

controle (amido). Nota-se que não houve diferenças significativas para P<0,05 para os índices

L*a*b*, estes resultados condiz com os estudos realizados por Pedroso e Demiate (2008)

onde observaram que a adição de carragenana e amido em presunto de peru não afeta

significativamente (P<0,05) os índices de cor dos mesmos.

Pode-se verificar que a luminosidade (L*) e o índice de vermelho (a*) diferiram nas

quatro formulações de apresuntado. A formulação controle, a* (12,37), foi superior aos

demais apresuntados analisados, isso significa que o apresuntado CONT foi à amostra mais

vermelha, em relação aos apresuntados com carragenana, entretanto o APR1 com 9,35 foi

considerado o mais escuro, características essas que podem a influenciar na sua aceitação.

Huidobro et al. (2005) relataram que a principal característica da aparência desses produtos

curados é a cor, ou seja, parâmetro que pode influenciar na escolha do consumidor quando o

presunto é comercializado fatiado.

Observa-se que APR3 obteve a característica menos clara (L* 73,27) e aumento da

tonalidade da cor amarela (b* 13,55) e em relação às amostras APR1 e APR2, isso nos

permite afirmar que a adição conjunta do amido e carragenana podem vir a modificar os

paramentos de cor. Entretendo, a tonalidade amarela b* expressa à intensidade dessa cor na

amostra, que, para carnes e produtos derivados, se relaciona com a coloração marrom

(BARRETO, 2007).

Válková et al. (2007) observaram que os consumidores de uma região europeia

preferiram produtos com maior valor de luminosidade e menor participação da tonalidade

vermelha. García-Esteban et al. (2003) relataram que a luminosidade pode ser considerada o

57

parâmetro de cor que governa a qualidade da carne e de produtos cárneos, sendo, portanto, o

atributo de cor que pode ter maior influência na aceitação do produto.

1.17 Analises Microbiológicas

1.17.1 Coliformes termotolerantes a 45ºC, Staphylococcus coagulase positiva,

Salmonella sp.

Todas as amostras avaliadas apresentaram contagens dentro dos padrões legais

vigentes, de acordo com a RDC n.º 12 (BRASIL, 2001), estando assim apropriadas para

consumo humano (tabela 8). Os resultados mostram as boas condições de higiene e de

processamento do produto final.

Tabela 8 – Resultados da avaliação microbiológica das amostras de apresuntado refrigerado de tilápia do Nilo no tempo 0 e 90 dias de estocagem.

TRATAMENTO TEMPO

(dias) CT (NMP/g) ECP (NMP/g) SALM (AUS/PRE)

CONT T0 <10 AUS AUS

T90 <10 AUS AUS

APR1 T0 <10 AUS AUS

T90 <10 AUS AUS

APR2 T0 <10 AUS AUS

T90 <10 AUS AUS

APR3 T0 <10 AUS AUS

T90 <10 AUS AUS

Padrões de RDC n.º 12 <103NMP/g <3,0x103 UFC/g AUS. 25 g


musciformis);** CT (Coliformes termotolerantes a 45ºC – NMP/g: Número Mais Provável para 25g de apresuntado); ECP (Staphylococcus coagulase positiva - UFC/g: Unidade Formadora de Colônia em 25g de apresuntado; ***Para Salmonella foi usado critério de ausência e presença (AUS. 25 g: ausência em 25 g).

Resultados similares foram reportados por Januzzi (2007), onde o mesmo desenvolveu

um produto tipo presunto cozido com adição de fibras solúveis e insolúveis, os resultados

refletiram as boas condições de higiene e de processamento da indústria onde foram

realizados os ensaios para elaboração do produto. Portanto, no estudo foi possível indicar as

boas condições de higiene na cadeia de processamento do apresuntado de tilápia do Nilo.

A presença de microrganismos coliformes termotolerantes (CT) em alimentos

processados indica um tratamento inadequado, ou contaminação posterior ao tratamento,

provavelmente a partir de manipuladores, ou de instrumentos e máquinas em condições

precárias de higiene (SILVA et al., 2010). A tabela 8, demonstra que a contagem de CT está

de acordo com a legislação vigente durante os 90 dias de estocagem. Geitenes et al (2013),

58

avaliaram apresuntado e presunto cozidos fatiados e embalados a vácuo de duas marcas no

período de 45 dias de estocagem e obtiveram resultados para coliformes termotolerantes a

45ºC, semelhante ao estudo em questão. Macari (2007) apresentou contagens para CT entre

<0,3 a 1,5 x 101 para formulações variadas de embutido cozido á base de tilápia do Nilo,

resultados acima do presente estudo, entretendo o autor indica a utilização de boas condições

de higiene durante o processamento dos produtos.

Observando a tabela 8, em nenhuma das amostras foi verificada a presença de

Salmonella e Staphylococcus coagulase positiva durante os 90 dias de estocagem.

Salmonella é o principal agente de doenças de origem alimentar, pertencentes da

família Enterobacteriaceae, são bastonetes Gram negativos não esporogênicos (SILVA et al.,

2010). A Salmonella é recorrente primordialmente em alimentos com alto teor de umidade e

alta porcentagem de proteína, podendo ser encontrada em alimentos cárneos crus, se por

ventura ocorrer uma ampla contaminação cruzada nas linhas de processamentos industriais

contaminando o produto, apesar de que os órgãos competentes realizam a inspeção, os surtos

de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA), incluindo a doença salmonelose estão

crescendo mundialmente (VIEIRA et al.,2004; NEITZKE et al., 2017).

Em relação à Salmonella sua ausência no presente estudo, pode ser justificada, pois

são bactérias relativamente termossensíveis, podendo ser destruídas à temperatura de 60 ºC

por 15 a 20 minutos, além disso, as condições adequadas de manipulação e higiene

contribuíram para o resultado (SILVA et al., 2010). Os produtos cárneos, como no caso do

apresuntado e presunto, geralmente, são submetidos a um processo de cocção com

temperaturas mínima de 70 a 80 ºC no ponto central do produto e consequentemente a

eliminação de possíveis patógenos, inclusive do gênero Salmonella. Geitenes et al (2013),

averiguando o crescimento de bactérias durante a 45 dias de estocagem em apresuntados e

presuntos cozidos fatiados e embalados a vácuo obtidos em pontos de vendas na Região Oeste

do Paraná, obtiveram ausência para Salmonella para uma das amostras analisadas, o autores

atribuíram que os produtos foram submetidos a um processo de cozimento onde atingiram a

temperatura mínima de 71ºC no interior do produto, garantindo a eliminação de patógenos

como o gênero Salmonella, entretanto durante sua comercialização houve contaminação

cruzada fazendo com que uma das suas amostras analisadas apresentassem presença de

Salmonella.

59

A detecção de Staphylococcus coagulase positiva está relacionado com a

contaminação cruzada e práticas de higiene inadequadas, em virtude de estar presente nas

mãos e garganta de manipuladores de alimentos (VIERA et al., 2004). Este grupo de

microrganismos pode provocar doença através da ingestão de toxinas encontradas no alimento

(SILVA et al., 2010). Contudo, pode-se afirmar que a manipulação durante o processamento

e pós-processamento dos apresuntados foram aplicadas corretamente, tendo em vista

(TABELA 8) a ausência para ECP, já que as mesmas não são resistentes ao calor, porém, as

suas toxinas são altamente resistentes a tratamentos términos (SILVA et al., 2010).

1.17.2 Contagem de bactérias Psicrotróficas aeróbias

A Resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância

Sanitária – ANVISA (BRASIL, 2001), não estabelece parâmetros máximos para a contagem

padrão em placas de microrganismos psicrotróficos. Na tabela 9 estão expostos os resultados

para contagem de bactérias psicrotróficas.

Tabela 9 – Contagem de bactérias Psicrotróficas aeróbias (UFC/g) das amostras de apresuntado refrigerado de tilápia do Nilo durante 90 dias de estocagem.

TRATAMENTOS TEMPO (DIA)

0 30 60 90

CONT <10 1,0 x 104 1,38 x 104 1,35 x 104

APR1 <10 2,1 x 104 2,04 x 104 2,65 x 105

APR2 <10 1,07 x 102 2,13 x 105 2,08 x 105

APR3 <10 1,0 x 104 1,6 x 104 1,15 x104 *CONT (amostra controle com 2% de amido); APR1 (amostra contendo 1% PST de H. musciformis); APR2 (amostra contendo 3% PST de H. musciformis); APR3 (amostra contendo 1% de amido mais 1% PST de H.

musciformis); ** Psicrotróficas – Unidade Formadora de Colônia / 25 g de apresuntado.

Observando na tabela 9, inicialmente, todos os tratamentos demostraram contagens de

< 10 UFC.g-1 no tempo inicial de estocagem. Até os 30 dias de estocagem não houve

diferença entre os tratamentos, no entanto o APR2, com contagem 10 2 UFC.g-1, demostrou

uma contagem menor do que os demais, isso pode ter ocorrido por causa da concentração

maior de carragenana (3%). Alguns estudos apontam que polissacarídeos sulfatados de

macroalgas tenham potencial para atividade antimicrobiana. Rhimou et al. (2010) obteve

resultados satisfatórios na atividade antimicrobiana para macroalgas, Rhodophyceae, durante

a avaliação dos extratos aquosos.

Os tratamentos se mantiveram estáveis até os 60 dias de estocagem, entretanto o APR2

apresentou uma contagem de 2,13 x 105 UFC.g-1 e visualmente este produto já apresentava

60

alterações organoléticas. Durante os 90 dias de estocagem as amostras CONT e APR3

obtiveram melhores resultados em relação aos demais (APR1 e APR2) que possuem apenas

concentrações diferentes de carragenana (1% e 3%, respectivamente). Nota-se que as

amostras CONT e APR3 tiveram adição de amido sem/com carragenana. Coma (2013) relatou

que seria uma alternativa interessante o desenvolvimento de soluções a base de amido

associado com polímeros com função antimicrobiana, tais como amido e polissacarídeos.

Alguns autores veem estudando a interação do amido com alguns compostos, e dentre

estas analises eles observaram pontos positivos durante os experimentos. Vásconez et al.

(2009) analisaram o revestimento antimicrobiano comestível em soluções baseadas em

misturas de amido (mandioca) juntamente com a quitosana com ou sem adição de sorbato de

potássio. Os resultados revelaram que o músculo de pescado revestido com a solução de

amido e quitosana desenvolveu uma menor população dos microrganismos psicrotróficos

durante o armazenamento em comparação com as amostras do controle.

Pyla et al. (2010), usaram filmes à base de amido, impregnados por ácido tânico para a

inibição de Escherichia coli e Listeria monocytogenes, emergentes patógenos transmitidos

pelos alimentos. Os filmes tiveram uma atividade antimicrobiana acentuada ocasionando uma

diminuição das células de L. monocytogenes em 48 horas e para E. coli células foram mortas

durante o mesmo período.

Flores et al. (2007), verificaram o desempenho antimicrobiano do sorbato de potássio

em filmes comestíveis de amido (mandioca) preparado por varias técnicas de gelatinização e

relataram que há uma eficácia do filme como uma barreira à contaminação microbiana.

Entretanto, as pesquisas que podem comprovar a ação antimicrobiana do amido ainda são

escassas. Nota-se que o estudo aqui realizado se torna uma pesquisa pioneira com relação à

interação do amido juntamente com o polissacarídeo sulfatado (k - carragenana) extraído da

macroalga H. musciformis.

61

5 CONCLUSÃO

Portanto, conclui-se que a extração aquosa refinada (PST), apresentou um rendimento

e composição química do PSs excelente, onde esse método utilizando água é viável para fins

alimentares, pois preserva a composição do hidrocolóide.

O FTIR do hidrocolóide presente na Hypnea musciformis sugere k-carragenana,

composto que apresenta várias características naturais como agente espessante e geleificante

que podem ser aplicados em alimentos.

Além disso, este polissacarídeo apresentou efeitos antioxidantes in vitro excelentes, ou

seja, o mesmo pode servir como um agente redutor do estresse oxidativo ocasionado pelos

agentes radicais livres.

Uso oral de PST não manifestou efeito sistêmico importante, durante 14 dias

consecutivos de tratamento subcrônico em ratos machos, garantindo o seu bem estar, podendo

assim viabilizar a sua utilização como alimento ou como aditivo alimentar em produtos

processados.

A adição do polissacarídeo sulfatado ao apresuntado resultou num produto cárneo com

excelentes características organoléticas. As diferentes concentrações do hidrocolóide em

comparação ao amido de mandioca, quanto às características físicas, químicas e físico-

químicas avaliadas, não apresentaram diferenças. A utilização do amido de mandioca e k-

carragenana não alterou a composição centesimal dos apresuntados, pH, atividade de água e

índice de TBARs, sendo mantidos os parâmetros de identidade e qualidade dos apresuntados,

definidos pela legislação brasileira vigente. Entretanto, a adição conjunta do amido e

carragenana podem modificar os paramentos de cor do produto final, escurecendo a sua

coloração.

As análises de Salmonella sp., Staphylococcus coagulase positiva e Coliformes a 45ºC

demonstraram que foram atendidos os critérios da legislação brasileira vigente para as

amostras de apresuntados, indicando boa qualidade microbiológica durante seu

processamento e estocagem. E as contagens totais de psicrotróficas ficaram no limite até o dia

60º de estocagem, garantindo maior tempo de prateleira do produto.

62

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ANEXO

universidade federal do cearÁ centro de ciÊncias … · cybele pinheiro guimarÃes...

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