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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE NUTRIÇÃO
EFEITOS DO CONSUMO DE ÓLEO DE COCO EM RATOS
NA FASE DE CRESCIMENTO SOBRE O PERFIL
NUTRICIONAL E METABÓLICO NA VIDA ADULTA
CAROLINE CORRÊA MENEZES
Cuiabá-MT, setembro de 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE NUTRIÇÃO
EFEITOS DO CONSUMO DE ÓLEO DE COCO EM RATOS
NA FASE DE CRESCIMENTO SOBRE O PERFIL
NUTRICIONAL E METABÓLICO NA VIDA ADULTA
CAROLINE CORRÊA MENEZES
Trabalho de Graduação apresentado ao Curso de Nutrição da Universidade Federal de Mato Grosso como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Bacharel em Nutrição, sob orientação da Profª. Dra.Márcia Queiroz Latorraca.
Cuiabá-MT, setembro de 2016
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AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar а Deus que iluminou о meu caminho durante esta
caminhada.
À minha família, por sua capacidade de acreditar e investir em mim. Agradeço
também ao meu namorado Felipe Lago, que de forma especial е carinhosa me deu força е
coragem, me apoiando nos momentos de dificuldades.
As minhas colegas de turma Chaiane Aline e Luana Resende por terem sido minhas
parceiras durante toda a vida acadêmica e me auxiliado durante os experimentos realizados.
Ao técnico de laboratório Celso Afonso por sempre ter sido prestativo quando
precisei.
A Profª. Msc. Silvia Reis que me incentivou e me apoiou na escolha do tema escolhido
durante a elaboração do projeto deste estudo.
Por fim, agradeço a Profª. Dra. e orientadora Márcia Latorraca pelo convívio, apoio,
compreensão e amizade durante toda a produção deste estudo, o qual foi determinante para
que houvesse um clima de harmonia e descontração durante as nossas reuniões, e que me
possibilitou realizar este trabalho com maior tranquilidade.
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RESUMO
Em humanos, o uso do óleo de coco no preparo dos alimentos vem sendo estudado comocoadjuvante no
tratamento da obesidade devido ao seu possível efeito termogênico, o qual poderia influenciar na perda de peso
corporal. Foram avaliados os efeitos do consumo de óleo de coco em ratos na fase de crescimento sobre o perfil
nutricional e metabólico na vida adulta. Os animais foram divididos em dois grupos conforme o tipo de dieta
recebida: Grupo Controle (GC) e Grupo Teste (GT). Ratos GT apresentaram aumento dos depósitos de gordura
epididimal, apesar do ganho de peso similar entre os grupos e consumo alimentar menor em relação aos ratos do
GC. O RNA mensageiro da UCP-1 no tecido adiposo marrom e o Kitt foram menores no GT em relação ao GC.
As concentrações séricas do colesterol HDL, albumina e corpos cetônicos, e a razão ureia/creatinina foram
maiores no grupo GT em relação ao grupo GC. Portanto, o consumo do óleo de coco em quantidades normais na
dieta promoveu balanço energético positivo, deposição de gordura visceral, resistência à insulina, cetonemia e
sinais de desidratação celular.
PALAVRAS-CHAVE: Óleo de coco; Resistência à insulina; Gordura visceral; UCP-1
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ABSTRACT
In humans, the use of coconut oil in food preparation has been studied as an adjunct in the treatment of obesity
due to its possible thermogenic effect, which could influence the weight loss. The effects of coconut oil
consumption in rats in the growth phase on the nutritional and metabolic profile in adulthood. The animals were
divided into two groups according to the type of received diet: Control Group (CG) and Test Group (WG). GT
mice showed an increase in deposits of epididymal fat, despite similar weight gain between the groups and lower
energy consumption compared to GC rats. The messenger RNA of UCP-1 in brown adipose tissue and KITT
were lower in GT compared to the CG. Serum concentrations of HDL cholesterol, albumin and ketone bodies,
and the ratio urea / creatinine were higher in GT group compared to the control group. Therefore, consumption
of coconut oil in normal amounts in the diet caused a positive energy balance, visceral fat deposition, insulin
resistance, ketonemia and cellular dehydration signals.
KEY WORDS:
Coconut oil; Insulin resistance; Visceral fat; UCP-1
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LISTA DE ABREVIATURAS
Acetil-CoA
Acetilcoenzima A
ADP
Adenosina Difosfato
AGCL
Ácidos Graxos de Cadeia Longa
AGCM
Ácidos Graxos de Cadeia Média
AIN-93G
American Institute of Nutrition
ATP
Adenosina Trifosfato
cDNA
Ácido Desoxirribonucleico Complementar
CO2
Dióxido de Carbono
CPT-1
Carnitina Palmitoiltransferase-1
DM2
Diabetes Mellitus tipo 2
EPI
Tecido Adiposo Epididimal
GAPDH
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GC
Grupo Controle
GT
Grupo Teste
GTT
Teste de Tolerância a Glicose
HDL
High Density Lipoprotein(Lipoproteína de alta densidade)
ICLA
International Committee on Laboratory Animals
IMC
Índice de Massa Corporal
ITT
Teste de Tolerância a Insulina
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Kitt
Constante de Decaimento da Glicose no Plasma
LDL
Low Density Lipoprotein (Lipoproteína de baixa densidade)
PCR
Reação da Polimerase em Cadeia
pH
Potencial Hidrogeniônico
PYY
Hormônio Peptídeo YY
RBD
Refinamento, Branqueamento e Desodorização
RET
Tecido Adiposo Retroperitoneal
RNA
Ácido Ribonucleico
TAB
Tecido Adiposo Branco
TAM
Tecido Adiposo Marrom
TAV
Tecido Adiposo Visceral
TCM
Triglicerídeos de Cadeia Média
TCL
Triglicerídeos de Cadeia Longa
TFG
Taxa de Filtração Glomerular
TGO
Transaminase Glutâmico Oxalacética
TGP
Transaminase Glutâmico Pirúvica
UCP-1
Uncoupling Protein-1 (Proteína Desacopladora-1)
VLDL
Very low density lipoprotein (lipoproteína de muito baixa densidade)
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SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................. 7 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 10 2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 12
2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 12 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 12
3. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 13 4. MATERIAS E MÉTODOS ............................................................................................ 16
4.1 ANIMAIS ....................................................................................................................... 16 4.2 COMPOSIÇÃO DAS DIETAS ...................................................................................... 16 4.3PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ....................................................................... 19 4.3.1 Avaliação de Ingestão Alimentar ........................................................................... 19 4.3.2 Avaliação do Peso Corporal ................................................................................... 19 4.3.3 Índice de Lee .......................................................................................................... 19 4.3.4 Teste de Tolerância Intraperitoneal a Insulina ....................................................... 19 4.3.5 Teste de Tolerância Intraperitoneal à Glicose ........................................................ 20 4.3.6 Dosagem de Corpos Cetônicos .............................................................................. 20 4.3.7 Coleta de amostra de sangue e tecidos ................................................................... 20 4.3.8 Quantificação de Gordura Hepática Total .............................................................. 21 4.3.9 Determinação do RNAm da UCP-1 por Real time – Reação da Polimerase em Cadeia (PRC) ........................................................................................................................ 22 4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................................... 22
5. RESULTADOS ............................................................................................................... 23 6. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 31 7. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 34 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 35
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1. INTRODUÇÃO
A obesidade é uma doença crônica complexa, caracterizada por excesso de gordura
corporal.É um dos principais problemas de saúde pública no mundo e afeta não apenas países
industrializados, mas também países em desenvolvimento, tornando-se fator de risco para
doenças cardíacas e diabetes (QUEIROZ, 2009).
O crescimento expressivo na prevalência da obesidade pode ser explicado
principalmente pelo desequilíbrio energético decorrente do aumento na ingestão calórica
somado à inatividade física e ao declínio concomitante do gasto energético (OGLESBY,
2006).
O quadro clínico de obesidade está fortemente associado às dislipidemias, e o controle
do peso corporal parece ser uma medida eficaz no controle destas, relacionando-se à
diminuição das Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL, do inglês Low Density Lipoprotein)
e ao aumento das Lipoproteínas de Alta Densidade (HDL, do inglês, High Density
Lipoprotein) (MARQUES, 2011). Com isso, devido a fatores de risco relacionados à
obesidade, há uma crescente preocupação da população mundial com a alimentação, o que
incentiva a indústria de alimentos a investir em novos produtos (GIULIANO, 2005).
Atualmente, existe uma nova categoria de alimentos e suplementos denominados
funcionais, que promovem benefícios bioquímicos e fisiológicos pelos compostos bioativos
que fazem parte de sua composição (LAMARÃO, 2007). Um alimento funcional deve
produzir benefícios à saúde além de seu valor nutricional normal. Portanto, deve ser
consumido dentro dos padrões dietéticos diários da mesma forma que os alimentos comuns,
pois manter seu valor nutricional normal é a característica para diferenciá-lo de suplementos
dietéticos ou alimentares (CAMPOS, 2010).
Os alimentos e suplementos funcionais vêm sendo estudados de forma constante e
exaustiva, principalmente por suas ações na redução de gordura corporal, o que os tornam
coadjuvantes no controle da obesidade (SANTOS, 2008).
Ultimamente,um dos alimentos funcionais utilizados no combate à obesidade é o óleo
de coco, que tem substituído o uso do óleo de soja (ST-ONGE, 2003). O consumo do óleo de
coco parece ter efeito hepatoprotetor, favorece a perda de peso, melhorao sistema
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imunológico, e tem se mostrado benéfico no tratamento de doenças crônicas, tais como
hepatopatias, cardiopatias e câncer (GOPALA, 2010).
No entanto, estudos experimentais trazem resultados negativos que são preocupantes.
Em um estudo realizado em hamsters alimentados com dietas contendo óleo de coco, foi
observado depósito de colesterol livre na aorta e o acúmulo de lipídeos no fígado, o que
ocasionou uma elevação no processo de aterosclerose (OLIVEIRA, 2010).
Portanto, as informações disponíveis a respeito das possíveis relações benéficas da sua
ingestão com a redução de peso corporal e melhora do perfil lipídico são contraditórias. Além
disso, nos estudos disponíveis tem-se avaliado os efeitos do consumo deste óleo em modelos
de obesidade, que utilizam dietas hiperlipídicas. Pouco se sabe sobre o efeito do consumo do
óleo de coco em quantidades normais em substituição ao óleo de soja em animais em fase de
crescimento após o desmame.
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2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos do consumo de óleo de coco em ratos na fase de crescimento sobre
o perfil nutricional e metabólico na vida adulta.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Verificar o consumo alimentar dos animais em dieta contendo óleo de coco.
• Determinar o perfil somático no modelo experimental.
• Determinar o perfil de proteínas viscerais.
• Verificar a massa dos depósitos de tecido adiposo branco e marrom.
• Determinar a transcrição do gene da UCP-1 em tecido adiposo marrom.
• Determinar o perfil sérico de lipídios.
• Verificar a sensibilidade periférica à insulina.
• Investigar a função hepática.
• Verificar a função renal.
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3. REVISÃO DE LITERATURA
O óleo de coco é um derivado da massa de coco, que pertence à família dos lipídeos,
do qual faz parte o grupo dos triglicerídeos. A função básica dos triglicerídeos no organismo é
o armazenamento de energia, porém, também compõem tecidos e membranas celulares, entre
outras funções (BONTEMPO, 2008).
Os triglicerídeos apresentam em sua cadeia molecular uma combinação de duas
substâncias: glicerol e ácidos graxos (CURI, 2002). A existência ou não de duplas ligações na
cadeia de molécula determina o grau de saturação do ácido graxo, sendo ele saturado, quando
não há dupla ligação; insaturado, quando há uma ou mais duplas ligações; monoinsaturado,
com apenas uma dupla ligação ou poli-insaturado, com duas ou mais duplas ligações
(BONTEMPO, 2008)
O óleo de coco possui em sua constituição ácidos graxos monoinsaturados e
poliinsaturados, como o oléico e o linoleico, respectivamente (GOPALA, 2010). O
ácidooléico promove redução dos triglicerídeos plasmáticos por diminuir a síntese hepática de
Lipoproteínas de Muito Baixa Densidade (VLDL, do inglês, Very Low Density Lipoprotein),
podendo ainda exercer outros efeitos cardiovasculares, como redução da viscosidade do
sangue, maior relaxamento do endotélio e também efeitos antiarrítmicos sem diminuir o HDL,
e provocar oxidação lipídica (SPOSITO, 2007).
Porém, ainda que o óleo de coco seja de origem vegetal, é considerado saturado por
conter em sua composição mais de 90% de gorduras saturadas, sendo em sua maioria, os
Triglicerídeos de Cadeia Média (TCM), os quais são moléculas apolares formadas por três
ácidos graxos saturados com um comprimento de cadeia entre 6 a 12 carbonos que estão
esterificados ao glicerol (BONTEMPO, 2008).
Basicamente, os TCM podem ser encontrados naturalmente na gordura do leite, no
óleo de coco e no óleo de palmeira, ou produzidos comercialmente (óleo TCM) como um
subproduto da produção de margarina. Os óleos de TCM puro fornecem 8,25 kcal/g e os
ácidos graxos saturados que os compõem são: ácidos caprílico (C8:0; 50-80%), cáprico
(C10:0; 20-50%) e com uma proporção menor dos ácidos capróico (C6:0; 1-2%) e láurico
(C12:0; 1-2%). Diferente do óleo de TCM puro, o óleo de coco contém cerca de metade do
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seu conteúdo lipídico composto por ácido láurico (44 a 52%), tornando-se, portanto, seu
principal ácido graxo de cadeia média(KRAUSE, 2013).
Os TCM, ricos em AGCM, são hidrolisados por ação da lipase pancreática, sendo
absorvidos no duodeno mais rapidamente do que os AGCL. Os AGCM constituem uma fonte
rápida de energia, pois, ao contrário dos AGCL, não são significativamente incorporados em
lipoproteínas (quilomícrons e VLDL), sendo absorvidos diretamente na corrente sanguínea,
onde a velocidade de absorção no intestino é similar à da glicose. Após passar pelos
enterócitos, atingem a circulação portal, sendo transportados ao fígado ligados à albumina
(FERREIRA, 2003).
Em se tratando da oxidação mitocondrial, estes ácidos graxos seriam favorecidos por
não dependerem de Carnitina Palmitoiltransferase-1 (CPT-1), enzima-chave que facilita a
entrada do ácido graxo na mitocôndria para sua posterior oxidação, ao converter o acil-CoA à
acilcarnitina(GAO, 2013).
Em virtude da sua composição predominantemente de ácidos graxos saturados, há uma
preocupação em relação a alterações no perfil bioquímico que este óleo poderia promover,
potencialmente elevando o risco de doença cardiovascular. Os achados obtidos em estudos
iniciais com o óleo de coco corroboravam esta ideia. Entretanto, críticas surgiram em relação
à metodologia adotada. Dentre elas o uso de gordura hidrogenada de coco, que apresenta
maior estabilidade para o uso culinário, porém contém elevadas quantidades de ácidos graxos
trans. Estes últimos favorecem o desenvolvimento de dislipidemias e doenças
cardiovasculares. Entretanto, a adoçãodo uso de ácidos graxos poli-insaturados como fonte de
gordura na dieta controle poderia favorecer a redução do colesterol sanguíneo (FERANIL,
2011).
Além disso, na composição do óleo de coco extra virgem são encontrados fitosteróis
(NEVIN, 2004), que são esteróis de fonte vegetal que constituem uma classe de lipídios
derivados de um anel saturado de quatro membros, com um grupo hidroxil na terceira posição
(MARTINS, 2004). No organismo, atuam na diminuição da absorção de colesterol no
intestino delgado por um mecanismo de competição, com consequente aumento na excreção
fecal. Isso ocorre porque a estrutura química dos fitoesteróis é semelhante à do colesterol,
diferindo apenas no tamanho da cadeia (LOTTENBERG, 2009).
Existem vários processos para extração do óleo de coco, sendo o método a seco o mais
utilizado. Neste processo, se prensa a copra (polpa seca) do coco a fim de obter o óleo que
passará pelo processo de Refinamento, Branqueamento e Desodorização (RBD). Durante o
processo de desodorização, a temperatura aumenta, podendo chegar a 245ºC. Porém, o óleo
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de coco virgem não passa pelo processo de RBD, e, portanto, não tem alteração sua forma
natural, o que faz com que se qualifique como virgem (MARINA, 2009).
De acordo com Vérmen (2008), o óleo de coco virgem é processado no dia da
colheita, sob boas práticas de manufaturamento, que incluem o impedimento de calor, luz e ar
durante o processo de armazenamento. Porém, Marina et al. (2009) citam que não há regras
bem estabelecidas para a produção de óleo de coco virgem. No entanto, o óleo de coco extra
virgem é prensado a frio, e a temperatura durante a prensagem não deve exceder 39ºC
(VÉRMEN, 2008).
Portanto, o modo de extração e armazenamento do óleo de coco utilizado nos estudos
deve ser considerado, uma vez que a composição diferenciada pode interferir nos resultados
obtidos. Estudos epidemiológicos demonstraram melhora no nível sérico de triglicerídeos
com oconsumo de óleo de coco virgem em comparação com o consumo de óleo de coco
refinado extraído pelo processo de RBD (MARINA, 2009).
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4. MATERIAS E MÉTODOS
O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório de Avaliação Biológica de
Alimentos do Departamento de Alimentos e Nutrição da Faculdade de Nutrição da
Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). Todos os experimentos foram dirigidos por
princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos, seguindo o guia prático
do manual de biotério do International Committee on Laboratory Animals (ICLA), e
submetidos à aprovação do Comitê de Ética da UFMT.
4.1ANIMAIS
Ratos Wistar recém-desmamados (28 dias de idade), provenientes do Biotério Central
da UFMT, foram separados ao acaso em dois grupos e alimentados por 60 dias com dieta
controle (17% de proteína) correspondendo ao Grupo Controle (GC) ou dieta teste
correspondendo ao Grupo Teste (GT). Em todas as etapas do estudo os animais receberam
água e as respectivas dietas ad libitum e foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno
(medindo 37,0 x 31,0 x 16,0 cm) com tampa de material galvanizado. Além disso, foram
mantidos sob condição padronizada de iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas) e
temperatura de 22 ± 2°C.
4.2 COMPOSIÇÃO DAS DIETAS
A dieta controle foi elaborada de acordo com as recomendações da AIN-93G
(American Institute of Nutrition) para roedores em fase de crescimento, prenhez e lactação,
sendo composta por 17% de caseína (REEVES, 1993).Na dieta teste, por sua vez, houve uma
substituição do óleo de soja pelo óleo de coco extra virgem, em quantidades proporcionais ao
da dieta controle. Os demais nutrientes tiveram as concentrações mantidas. Todas as dietas
eram isocalóricas conforme oquadro 1.
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Quadro 1 - Dietas Experimentais Ingredientes Dieta Controle* Dieta Teste Amido 397,0 397,0 Caseína 200,0 200,0 Amido de Milho dextrinizado 132,0 132,0 Sacarose 100,0 100,0 Óleo de soja 70,0 - Óleo de coco - 70,0 Celulose microfibra (fibra) 50,0 50,0 Mistura de minerais AIN-93G* 35,0 35,0 Mistura de vitaminas AIN-93G* 10,0 10,0 L-cistina 3,0 3,0 Bitartarato de colina 2,5 2,5 Total 1000,0 1000,0 *AIN 93 G (Reeves, 1993)
A composição nutricional (Quadro 2) e dos ácidos graxos (Quadro 3) do óleo de coco
foram obtidas das informações contidas na embalagem.
Quadro 2- Composição Nutricional do Óleo de Coco Extra Virgem
Componentes Quantidade por porção 100g Valor energético 847 Kcal=533 KJ
Carboidratos 0 g
Proteínas 0 g Gorduras Totais 93,4g
Gorduras Saturadas 86,7 g Gorduras Trans 0 g
Gorduras Monoinsaturadas 5,34 g Gorduras Poliinsaturadas 1,34 mg
Colesterol 0 mg Fibra Alimentar 0 mg
Sódio 0 mg
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Quadro 3- Composição em Ácidos Graxos do Óleo de Coco Extra Virgem
Componentes (%/100g) C 6:0 Capróico 0,38 C 8:0 Caprílico 5,56
C 10:0 Cáprico 4,99 C 12:0 Láurico 45,78
C 14:0 Mirístico 18,56 C 16:0 Palmítico 8,85
C 18:0 Esteárico 3,39 C 18:1 Ômega 9 Oléico 5,65
C 18:2 Ômega 6 Linoléico 0,94
A composição nutricional (Quadro 4) do óleo de soja foi obtida das informações
contidas na Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2011).
Quadro 4- Composição Nutricional do Óleo de Soja
Componentes Quantidade por porção 100g
Valor energético 884 Kcal=3699 KJ Carboidratos 0 g
Proteínas 0 g
Gordura Total 100g Gorduras Saturadas 15,2g
Gorduras Monoinsaturadas 23,3g Gorduras Poliinsaturadas 60,0g
Colesterol 0 mg Fibra Alimentar 0 mg
Sódio 0 mg Fonte: Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO), 2011.
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4.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
4.3.1 Avaliação de Ingestão Alimentar
A ingestão alimentar foi registrada três vezes por semana pelo método de resto-
ingesta, e os dados expressos em valores absolutos. O peso do resto foi descontado do peso
ofertado durante o período experimental.
4.3.2 Avaliação do Peso Corporal
O peso corporal dos animais foi mensurado semanalmente por pesagem em balança
digital e os resultados expressos em ganho de peso total. O peso corporal inicial (28 dias de
vida) foi descontado do peso corporal final (88 dias de vida).
4.3.3 Índice de Lee
Aos 88 dias de vida, os animais foram anestesiados, avaliados biometricamente com a
mensuração da massa corpórea e do comprimento naso-anal. Posteriormente, os dados foram
utilizados para o cálculo do índice de Lee de cada animal, que é a razão da raizcúbica da
massa corporal (g) pelo comprimento naso-anal (cm) (NOVELLI, 2007).
4.3.4 Teste Intraperitonealde Tolerância à Insulina
Após 12 horas de jejum, os animais tiveram a extremidade da cauda seccionada para
determinar a glicemia através de um glicosímetro (Accu-chek Active) no tempo 0. Em seguida,
foi administrada insulina (regular) por via intraperitoneal numa dose de 1,5U/kg de peso
corporal. As amostras de sangue foram obtidas a partir de um corte na cauda dos ratos, 5, 10,
15 e 30 minutos após a administração da insulina para a determinação de concentração de
glicose no sangue usando um glicosímetro portátil (Accu-Chek).
A constante de desaparecimento da glicose no sangue durante o ITT (Kitt) foi estimada
pela inclinação da linha de regressão do logarítmo da glicemia contra o tempo (entre 5 e 15
20
minutos após a administração da insulina intraperitoneal), quando a concentração de glicose
sanguínea caiu linearmente.
Esta queda da glicose é determinada por dois fatores: supressão da produção hepática
de glicose e pelo estímulo à captação de glicose pelos tecidos insulino-sensíveis. A
interpretação do Kitt se baseia em quanto mais rápida e intensa for a queda da glicose, mais
sensível o indivíduo é à insulina. O índice corresponde à queda da glicose expressa em
%/minuto (ASENSIO, 2005).
4.3.5 Teste Intraperitonealde Tolerânciaà Glicose
Após permanecer em jejum por 6 horas, com água ad libitum os animais tiveram a
extremidade da cauda seccionada para determinar a glicemia através de um glicosímetro
(Accu-Chek, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) no tempo 0. Em seguida, foi
administrada por via intraperitoneal uma dose de 2g de glicose/kg peso corporal, na
concentração de 50%. Posteriormente, a glicemia, foi medida aos 30, 60, 90 e 120 minutos. A
resposta da glicose durante o GTT foi calculada pela estimativa da área total sob a curva,
usando o método trapezoidal(ASENSIO, 2005).
4.3.6 Dosagem de Corpos Cetônicos
Para a determinação da concentração de corpos cetônicos (hidroxibutirato), amostras
de sangue foram coletadas aos 85 dias de vida, após 24 horas de jejum. As amostras de
sangue foram obtidas a partir de um corte na cauda dos ratos e as determinações foram feitas
utilizando um aparelho glicosímetro (Freestyle Optium Neo) e tiras específicas para dosagem
de corpos cetônicos (Freestyle Optium B-Ketone).
4.3.7 Coleta de amostra de sangue e tecidos
Todos os procedimentos foram realizados pela manhã. As coletas de sangue para as
determinações bioquímicas e hormonal, bem como a coleta de tecidos para as análises foram
realizadas com os animais no estado de jejum de 12 horas, aos 88 dias de vida. Os animais
foram mantidos em câmaras de CO2até desacordarem, em seguida decapitados para coleta de
sangue. O soro foi separado em alíquotas e armazenado a -80°C para posteriores
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determinações bioquímicas usando kits comercialmente disponíveis: glicose, albumina,
proteinas totais, triglicérides, colesterol total, TGO, TGP, uréia e creatinina(LABTEST), HDL
(BIOCLIN), insulina (MILLIPORE). O valor de globulina foi obtido pela subtração de
albumina das proteínas totais. Os valores de VLDL e LDL foram calculados segundo a
equação de Friedewald:
Colesterol VLDL= Triglicerídeos/5
Colesterol LDL= Colesterol total – (HDL + VLDL)
Após laparotomia mediana foram retirados os tecidos adiposo branco retroperitoneal
(RET) e epididimal (EPI), e tecido adiposo marrom (TAM). Esses tecidos foram pesados
imediatamente para a obtenção do peso fresco em valor absoluto (g) e relativo (g/100g de
massa corporal), sendo armazenados em freezer a -80°C para análises posteriores.
4.3.8 Quantificação de Gordura Hepática Total
Para determinação e quantificação da gordura hepática total foi utilizado o método
proposto por Folch, Less e Stanley (1957).
Aproximadamente 1 g de tecido hepático foi homogeneizado com 3 mLde
clorofórmio: metanol (2:1) com a ajuda de um sonicador. Emseguida, completou-se o volume
para 20 mL de clorofórmio: metanol(2:1). A mistura foi filtrada em papel filtro fino e para
cada 10 mL do filtradofoi adicionado 2 mL de solução salina (0,9 %). Os tubos foram
agitados suavemente, sendo invertidos três vezes. Em seguida, foram levados para centrifuga
por 5 minutos a 2500 rpm para separação dasfases. A fase superior (fase aquosa) foi
desprezada. Um volume de 3 mL da fase inferior (fase clorofórmica) foi transferido para
umrecipiente previamente pesado, o qual foi levado à estufa (60 °C) paraevaporação. Após a
secagem, o recipiente foi pesado novamente para ocálculo da diferença de peso (FOLCH,
1957).
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4.3.9 Determinação do RNAm da UCP-1 por Real time – Reação da Polimerase em
Cadeia (PRC)
As amostras contendo aproximadamente 0,5g de TAM foram homogeneizadas em
reagente de TRIzol (InVitrogen, São Paulo, Brasil) com o auxílio de um sonicador na
velocidade máxima. Em seguida, o conteúdo total de ácido ribonucleico (RNA) foi
quantificado por espectrofotometria. Oácido ribonucleico total foi extraído e após, foi
quantificado por espectrofotometria através de NanoDrop.
Posteriormente, alíquotas contendo 3µg de RNA foram submetidas à transcrição
reversa utilizando-se primers hexaméricos randômicos. O ácido desoxirribonucleico
complementar (cDNA) resultante foi amplificado utilizando os oligonucleotídeos
complementares a sequências no gene da Proteína Desacopladora 1 (UCP-1, do inglês
Uncoupling Protein-1). Como controle endógeno foi utilizado o gene da gliceraldeído-3-
fosfato dehidrogenase (GAPDH).
Para as reações de Real Time PCR foi utilizado o sistema TaqManTM (Applied
Biosystems), e os valores da expressão gênica foram obtidos pela análise dos resultados no
programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão do número de animais ou
experimentos. Foi aplicado o teste de Levene para verificar a homogeneidade das variâncias.
Para comparar os grupos GC e GT foi utilizado o Teste T de Student. O nível de significância
foi estabelecido em P< 0,05. Os resultados foram analisados utilizando o software Statistic
(Stat-soft).
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5. RESULTADOS
Ao analisar o ganho de peso corporal (Figura 1A) entre os animais do GC e GT, não
foi encontrada diferença significativa entre os grupos. Porém, ao analisar o consumo
alimentar (Figura 1B), os animais do GT apresentaram consumo significativamente menor em
relação aos animais do GT (P<0,001). O índice de Lee (Figura 1C) foi similar entre os
grupos. Em relação à concentração sérica de albumina (Figura 1D), foi encontrado valor
aumentado nos animais do grupo GT em relação aos do grupo GC (P<0,0001). A
concentração sérica de globulina (Figura 1E), razão albumina/globulina (Figura 1F) e
concentração de proteínas totais (Figura 1G) não diferiram entre os grupos.
24
Figura 1. Ganho de peso corporal (A), consumo alimentar total (B), índice de Lee (C), concentrações séricas de albumina (D) e globulina (E), razão albumina/globulina (F), concentração sérica de proteínas totais (G) de ratos dos Grupos Controle(GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão 5-10 ratos por grupo. *Indica diferença significativa (Teste t de Student, P<0,05).
Em relação ao peso dos tecidos adiposos brancos, o GT apresentou maior acúmulo de
EPI em valor absoluto (Figura 2A) e relativo (Figura 2B) quando comparado ao GC (p<0,02 e
Controle Teste0
100
200
300
400
Grupo
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D
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G
25
0,03). O peso do RET em valor absoluto (Figura 2C) e relativo (Figura 2D) não diferiu entre
os grupos.
Figura 2. Peso absoluto (A) e relativo (B) do tecido adiposo epididimal (EPI), peso absoluto (C) e relativo (D) do tecido adiposo retroperitoneal (RET) de ratos dos Grupos Controle(GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão de 10 ratos por grupo.*Indica diferença significativa(Teste t de Student, P<0,05). Quando avaliado o peso absoluto (Figura 3A) e relativo (Figura 3B) do TAM, não foi
observada diferença entre os grupos. Porém, o GT apresentou a expressão do RNA
mensageiro da UCP-1 deste tecido (Figura 3C), significativamente menor quando comparado
ao GC (P<0,05)
Controle Teste0
5
10
15
Grupo
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corp
oral
)
D
26
Figura 3. Peso absoluto (A) e relativo (B) do Tecido Adiposo Marrom (TAM), expressão do RNAmensageiroda proteína desacopladora 1 (UCP-1) (C), de ratos dos Grupos Controle(GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão de no mínimo 5 e no máximo 10 ratos por grupo. *Indica diferença significativa(Teste t de Student, P<0,05).
A concentração sérica de insulina de jejum (Figura 4A), a glicemia de jejum (Figura
4C) e a área sob a curva da glicose (Figura 4D) não diferiram significativamente entre os
grupos. A cetonemia de jejum (Figura 4B) dos animais GT foi maior quando comparados ao
GC (p<0,05). A constante de decaimento da glicoseno sangue durante o teste de tolerância à
insulina (Kitt)(Figura 4E) foi menor nos animais GTem comparação ao GC (P<0,01).
Controle Teste0.0
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0.2
0.3
Grupo
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C
27
Figura 4. Concentração sérica de insulina de jejum (A), cetonemia de jejum (B), glicemia de jejum (C), área sob a curva da glicose durante teste de tolerância à glicose (D) e constante de decaimento da glicose no plasma durante o teste de tolerância à insulina (Kitt) (E) de ratos dos Grupos Controle(GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão de 5-10 ratos por grupo.*Indica diferença significativa (Teste t de Student, P<0,05).
As concentrações séricas de triglicerídeos (Figura 5A), colesterol total (Figura 5B),
VLDL (Figura 5C) e LDL (Figura 5D) não diferiram entre os grupos A concentração sérica
de HDL (Figura 5E) foi maior em GT quando comparado com GC (P<0,05).
Controle Teste0
1
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28
Figura 5. Concentração sérica de triglicerídeos (A), colesterol total (B), VLDL (C), LDL (D) e HDL (E) de ratos dos Grupos Controle (GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão de 5 ratos por grupo. *Indica diferença significativa (Teste t de Student, P<0,05).
O conteúdo de lipídio hepático (Figura 6A), as concentrações de TGP (Figura 6B) e
TGO (Figura 6C) e a razão TGP/TGO (Figura 6D) foram similares entre os grupos.
Controle Teste0
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Grupo
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29
Figura 6. Conteúdo de lipídeo hepático (A), concentração sérica de Transaminase Glutâmico Pirúvica (TGP) (B), concentração sérica de Transaminase Glutâmico Oxalacética (TGO) (C) e razão de TGP/TGO (D), de ratos dos Grupos Controle (GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão de 5-10 ratos por grupo. *Indica diferença significativa (Teste t de Student, P<0,05).
Por fim, as concentrações séricas de uréia (Figura 7A) e creatinina (Figura 7B) foram
significativamente menores no GT comparado ao GC (P<0,05 e P<0,01, respectivamente).
Porém, quando calculada a razão uréia/creatinina (Figura 7C), o mesmo, apresentou-se maior
no GT em relação ao GC (P<0,001).
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Figura 7. Concentração sérica de uréia (A) e creatinina (B), razão uréia/creatinina (C) de ratos dos Grupos Controle (GC) e Grupo Teste (GT). Valores expressos em média e desvio padrão de 5 ratos por grupo. *Indica diferença significativa (Teste t de Student, P<0,05).
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C
31
6. DISCUSSÃO
No presente estudo, o óleo de coco extra virgem e o óleo de soja foram usados
como única fonte de lipídios em dietas isocalóricas e normolipídicas. Foi observado que os
animais que ingeriram óleo de coco tiveram consumo alimentar menor que aqueles mantidos
com dieta à base de óleo de soja. Estudos têm sugerido que devido à diferença de
viscosidade, a palatabilidade dos TCM é menor do que a do TCL (GREENBERG, 1969), o
que propiciaria uma menor ingestão alimentar. O aumento de mediadores pós-absortivos que
modulam a saciedade (corpos cetônicos e glicose, por exemplo) também contribuem para a
redução da ingestão alimentar (VAN ITALLIE, 1985). Neste estudo foi observado o aumento
significativo apenas de corpos cetônicos nos animais alimentados com óleo de coco, que
podem ter determinado a hipofagia. O aumento dos corpos cetônicos era esperado, sendo o
caráter cetogênico do TCM atribuído ao direcionamento preferencial do acetil-CoA produzido
durante a oxidação dos AGCM para a produção de corpos cetônicos (FERREIRA, 2003).
Apesar do consumo alimentar reduzido, os ratos mantidos com dieta à base de óleo de
coco apresentaram ganho de peso similar, mas aumento do peso absoluto e relativo da gordura
epididimal em comparação àqueles alimentados com óleo de soja. Segundo FAIN (2010), o
aumento do tecido adiposo visceral tem mais correlação com indicadores de resistência à
insulina do que o tecido adiposo subcutâneo abdominal, ou seja, indivíduos com obesidade
abdominal, que possuem acúmulo de tecido adiposo visceral, têm risco aumentado de
desenvolvimento de resistência à insulina. Essa associação foi observada nos animais que
consumiram óleo de coco, a julgar pelos valores reduzidos do Kitt
Curiosamente, o óleo de coco causou redução da expressão do RNA mensageiro da
UCP-1 no TAM, sinalizando para uma possível redução da termogênese, que pode ter
contribuído para o balanço energético positivo e aumento de gordura visceral. Em roedores, o
TAM é o principal efetor da termogênese induzida pela dieta e pelo frio, tendo uma função
importante na modulação das flutuações do gasto energético em resposta a mudanças na
ingestão dietética (ROTHWELL, 1986; TRAYHURN, 1986; HIMMS-HAGEN, 1986).
Também foi observada, neste estudo, uma correlação inversa entre transcrição do gene de
32
UCP-1 no TAM e resistência à insulina. Sabe-se que a expressão do gene da UCP-1 é
reduzida na resistência à insulina (STORLIEN, 1986).
Embora resistentes à insulina, os animais que ingeriram óleo de coco não
apresentaram esteatose hepática ou comprometimento da função do fígado, considerando os
valores inalterados das transaminases hepáticas. A esteatose hepática tem sido observada em
animais mantidos com dieta hiperlipídica contendo óleo de coco hidrogenado. Esse efeito
parece estar associado à resistência hepática à insulina, ao excesso e tipo de gordura da dieta
(óleo de coco hidrogenado) (TURNER, 2009). A resistência à insulina aumenta a
concentração de ácidos graxos livres derivados da lipólise de triglicerídeos do tecido
adiposobranco (DONELLI, 2005). Esses ácidos graxos se dirigem para o fígado e são usados
para a produção de triglicerídeos (LEWIS, 2002). Além disso, a hiperinsulinemia crônica
resultante da resistência à insulina promove a lipogênese hepática de novo devido a regulação
positiva de genes lipogênicos. O aumento da expressão dos genes lipogênicos também é
estimulado pela glicose (BROWNING, 2004). Uma explicação plausível para a inexistência
de fígado gorduroso na vigência da resistência à insulina é a euglicemia e normoinsulinemia
apresentada neste estudo por animais que receberam dieta à base de óleo de coco extra
virgem.
O óleo de coco aumentou a concentração sérica de HDL, a exemplo do que foi
observado previamente por Nevin e Rajamohan (2004). O aumento do HDL tem sido
atribuído à saturação dos ácidos graxos que aumenta a enzima lecitina colesterol acil
transferase (MENSINK, 1992). Esse efeito é principalmente atribuído à sua função medidora
do transporte reverso do colesterol dos tecidos periféricos para a reutilização pelo fígado
(ECKARSTEIN, 2002). Considerando que no presente estudo, o óleo de coco aumentou o
HDL e não alterou as concentrações de triglicerídeos, colesterol total, VLDL e LDL, esse
componente dietético mostrou-se benéfico para o perfil lipídico.
Interessante ressaltar que neste estudo os animais mantidos com dieta à base de óleo
de coco apresentaram diminuição das concentrações séricas de uréia e creatinina, aumento da
concentração sérica de albumina e da razão uréia/creatinina (valor médio de 127).
Considerando a predominância dos AGCM na composição do óleo de coco e tendo em
vista que esses ácidos graxos são rapidamente absorvidos e transportados ao fígado ligados à
albumina (ASHBROOK, 1972), é razoável supor que as necessidades aumentadas dessa
proteína sejam supridas pelo aumento da sua síntese pelo fígado.
Os TCMs são rapidamente hidrolisados tendo pequena participação pancreática. Os
seus ácidos graxos são absorvidos diretamente para a circulação portal e transportados pela
33
albumina. São oferecidos para as células e não necessitam de carnitina para adentrarem na
mitocôndria
A coexistência de hiperalbuminemia e o aumento da razão uréia/creatinina são
sugestivas de desidratação celular causada pelo aumento da albumina plasmática. Em
condições normais, a relação uréia/creatinina é em média 30, e valores maiores do que 40-50
são observados quando ocorre contração do volume extracelular (SBN, 2011).
A dieta contendo óleo de coco promoveu balanço energético positivo, possivelmente
devido à redução da termogênese, que resultou em aumento da deposição de gordura visceral
e resistência à insulina.
Essas alterações foram acompanhadas de aumento da cetogênese e da albumina, a qual
possivelmente contribuiu para desidratação celular. No entanto, os animais que consumiram a
dieta com óleo de coco apresentaram aumento da fração colesterol-HDL, considerado
cardioprotetor por sua ação antioxidante. Portanto, esses últimos resultados devem ser
analisados com cautela, considerando que a dieta desencadeou vários fatores de riscos
cardiovasculares anteriores.
34
7. CONCLUSÃO
A dieta contendo óleo de coco promoveu balanço energético positivo, possivelmente
devido à redução da termogênese, que resultou em aumento da deposição de gordura visceral
e resistência à insulina. Essas alterações foram acompanhadas de aumento da cetogênese e da
albumina sérica, a qual possivelmente contribuiu para desidratação celular. Ressalta-se que os
animais que consumiram a dieta com óleo de coco apresentaram aumento da fração
colesterol-HDL, considerada cardioprotetor por sua ação antioxidante. Entretanto, esses
últimos resultados devem ser analisados com cautela, considerando que a dieta desencadeou
vários fatores de riscos cardiovasculares anteriores.
35
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Anexo 1: Documento de aprovação no Comitê de Ética no Uso de Animais