UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE VEGETAL

ELIENAI CANDIDA E SILVA

Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (BROMELIACEAE) CULTIVADA IN VITRO E EX

VITRO: MORFOLOGIA, ANATOMIA E ULTRAESTRUTURA

Goiânia, GO - Brasil

Junho de 2016

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZARAS TESES E

DISSERTAÇÕESELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a

disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº9610/98, o documento conforme permissões assinaladas

abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a

partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor(a): Elienai Candida e Silva

E-mail: elienaibio@gmail.com

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Vínculo empregatício do autor

Agência de fomento: Sigla:

País: Brasil UF: GO CNPJ:

Título: Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada in vitro e ex vitro: morfologia,

anatomia e ultraestrutura

Palavras-chave: Aclimatização; Crescimento in situ; Sistema mixotrófico; Vedação do recipiente.

Título em outra língua: Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivated in vitro and ex

vitro: morphology, anatomy and ultrastructure

Palavras-chave em outra língua: Acclimatization. Flasks sealing. In situ development. Mixotrophic system

Área de concentração: Botânica

Data defesa: 31/03/2016

Programa de Pós-Graduação: Biodiversidade Vegetal

Orientador(a): Dra. Dalva Graciano Ribeiro

E-mail: dalvagraciano@gmail.com

Co-orientador(a):* Dra. Letícia de Almeida Gonçalves

E-mail: leticia.icb.ufg@gmail.com *Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento:

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________________________________________ Data: ____ / ____ / _____

Assinatura do(a) autor(a)

1Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita

justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de

embargo.

ELIENAI CANDIDA E SILVA

Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (BROMELIACEAE) CULTIVADA IN VITRO E EX

VITRO: MORFOLOGIA, ANATOMIA E ULTRAESTRUTURA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Biodiversidade Vegetal do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como

requisito para a obtenção do título de Mestre em

Biodiversidade Vegetal

Orientadora: Profª Drª Dalva Graciano Ribeiro

Co-orientadora: Profª Drª Letícia de Almeida

Gonçalves

Goiânia, GO - Brasil

Junho de 2016

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.

CDU 581

Silva, Elienai Candida e Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada invitro e ex vitro: morfologia, anatomia e ultraestrutura [manuscrito] /Elienai Candida e Silva. - 2016. 122 f.

Orientador: Profa. Dra. Dalva Graciano Ribeiro; co-orientadoraDra. Letícia de Almeida Gonçalves. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Institutode Ciências Biológicas (ICB), Programa de Pós-Graduação emBiodiversidade Vegetal, Goiânia, 2016. Bibliografia. Inclui siglas, fotografias, gráfico, tabelas, lista de figuras, lista detabelas.

1. Aclimatização. 2. Crescimento in situ. 3. Sistema mixotrófico. 4.Vedação do recipiente. I. Ribeiro, Dalva Graciano, orient. II. Título.

Aos meus pais, José Luiz da Silva e Aparecida Cândida da Silva pelo cuidado e apoio

incondicional.

Aos amigos, pela cumplicidade.

À Profª. Drª Letícia de Almeida Gonçalves, cuja dedicação e profissionalismo são exemplos “O

professor [...], nenhum desses passa pelos alunos sem deixar sua marca.” (Paulo Freire)

AGRADECIMENTOS

Ao meu Deus acima de tudo, Amigo, Pai e único Senhor. Obrigada por estar comigo em

todos os momentos.

À Universidade Federal de Goiás (UFG), ao Departamento de Botânica e ao Programa de

Pós-graduação em Biodiversidade Vegetal (PPGBV) pela oportunidade de realização deste

mestrado.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de estudos; e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás

(FAPEG) pelo auxílio financeiro.

À Drª. Letícia de Almeida Gonçalves, exímia Professora e pesquisadora. Obrigada pelos

conselhos e ensinamentos que foram para além da construção deste trabalho. Obrigada pela

paciência, motivação, amizade, ajuda e por todas as vezes que me tranquilizou quando foi

preciso. Obrigada por me receber, formar e pela oportunidade de grandes aprendizados. A

senhora é meu exemplo! Muito obrigada por tudo!

Ao Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV)

da UFG pelo auxílio técnico e pelas valiosas contribuições na construção deste trabalho.

Agradeço em especial à Msc. Fernanda Fernandes por todo auxílio, você é 10! Obrigada pela

paciência, ensinamentos e por ter me recebido tão bem no LCTV.

À Empresa de Assistência Técnica, Extensão Rural e Pesquisa Agropecuária do Estado

de Goiás (EMATER-GO) e à Profª. Drª. Maurízia de Fátima Carneiro pelo fornecimento das

sementes da espécie em estudo.

Ao Laboratório de Microscopia de Alta Resolução (LabMic/UFG) e ao Centro Regional

para o Desenvolvimento Tecnológico e Inovação (Crti/UFG) pelo auxílio técnico. Aos

Professores Dr. Pedro Vale de Azevedo Brito e Drª. Fernanda Cristina Alcantara dos Santos pelo

auxílio na preparação das amostras para análise em microscopia eletrônica de transmissão.

Ao amigo Thársis Gabryel pela disponibilidade e paciência ao me ensinar a realizar as

análises estatísticas. E ao Prof. Dr. Robson Maia Geraldine pelo auxílio nas mesmas.

À Drª. Divina Vilhalva pela amizade e ensinamentos no laboratório de Anatomia Vegetal.

Ao grande amigo Msc. Rodolph Delfino Sartin pelo incentivo, discussões e ensinamentos

que somaram para a construção deste trabalho.

Aos Profs. Dr. Hyrandir Cabral de Melo e Dr. Renê Gonçalves da Silva Carneiro pelas

valiosas contribuições na redação final do trabalho.

Aos companheiros de turma do PPGBV, em especial ao Alex Cunha pelo auxílio,

amizade e parceria na Anatomia Vegetal; a Alline França e a amiga Francielle Karla por serem

exemplos de força, coragem e determinação.

À turma do Laboratório de Anatomia Vegetal: Denise, Paulo Antônio, Maria Eunice,

Fernanda Alves, Emily e Isabella. Obrigada pela paciência, ensinamentos e pelos momentos de

descontração. Em especial à Nauany Sales, pela amizade, companheirismo e ajuda no laboratório

e no campo. E a Priscila Silva pelos momentos de troca de experiência.

Aos professores Dr. Tomás de Aquino Portes por ceder à imagem do telado presente

neste trabalho; Drª. Maria Helena Rezende e Drª. Moemy Gomes de Morais pelo apoio e

incentivo e; Drª. Dalva Graciano Ribeiro por sua colaboração.

Aos amigos, Msc. Marina Alves; Camila Borges; Marco Antônio; Brucce e Rogério

Coutinho pelo auxílio.

Aos meus pais José Luiz da Silva e Aparecida Cândida da Silva, meus alicerces.

Obrigada pelo apoio em todos os momentos e por me ensinarem os valores da vida e o respeito

ao próximo. E às minhas irmãs Raquel e Sulamita. Família muito amada, minha base e meu

exemplo.

A todos que de alguma maneira contribuíram com este trabalho, muito obrigada!

RESUMO

Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada in vitro e ex vitro:

morfologia, anatomia e ultraestrutura - Plantas desenvolvidas in vitro possuem características

que dificultam sua sobrevivência quando transferidas diretamente da condição in vitro para o

ambiente natural, evidenciando a necessidade de aclimatização. A caracterização estrutural e

fiosiológica de plantas desenvolvidas in vitro e ex vitro são importantes para o aprimoramento

das técnicas e, contribuem com informações sobre a plasticidade fenotípica de plantas

submetidas a diferentes condições ambientais. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os

aspectos morfológicos, anatômicos e ultraestruturais de Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker

cultivada in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio, e aclimatizada. A.

bromeliifolia é de interesse ornamental e, por isso, o Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais

da Universidade Federal de Goiás tem realizado trabalhos visando sua propagação in vitro.

Foram analisadas plantas cultivadas in vitro em tubos de ensaio sob três tipos de vedação: tampa

rígida de polipropileno (TP), filme de policloreto de vinila (FPVC) e tampa rígida de

polipropileno coberta com membrana microporosa (TM). Para efeito de comparação, plantas de

sementes germinadas em telado também foram avaliadas. As plantas aclimatizadas foram

mantidas em casa de vegetação em condições controladas e foram avaliadas após 11 meses.

Plantas coletadas in situ foram utilizadas para efeito de comparação. Entre as plantas

desenvolvidas in vitro, as desenvolvidas em tubos vedados com TM se assemelharam mais

àquelas cultivadas em telado, principalmente quanto à abertura dos estômatos e a ultraestrutura

dos cloroplastos. Nas folhas das plantas aclimatizadas algumas características morfológicas e

anatômicas são diferentes das que ocorrem nas plantas desenvolvidas in situ: as fibras associadas

aos feixes possuem paredes menos espessas e as fibras hipodérmicas, se organizam em menor

número de camadas, além de terem também paredes menos espessas. Além disso, os estômatos

ocorrem menos aprofundados na epiderme nas folhas desenvolvidas na casa de vegetação.

Considerando, contudo, que a maioria das características morfológicas, anatômicas e

ultraestruturais das folhas das plantas aclimatizadas são semelhantes àquelas que ocorrem nas

folhas das plantas desenvolvidas in situ, é possível concluir que o processo de aclimatização e o

ambiente de casa de vegetação não restringiram seu desenvolvimento, resultado que favorece o

estabelecimento destas plantas em condições de ambiente natural.

Palavras-chave: Aclimatização. Crescimento in situ. Sistema mixotrófico. Vedação do

recipiente.

ABSTRACT

Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivated in vitro and ex vitro:

morphology, anatomy and ultrastructure – In vitro-grown plants have functional

characteristics that difficult their survival when transferred directly from in vitro conditions to

the natural environment, thus needing of acclimatization. Structural and phyisiological

characteristic of the plants grown in vitro and ex vitro are important for technical adjustments

and contribute to further information about the phenotypic plasticity of the plants exposed to

different environmental conditions. Therefore, the aim of this study was to evaluate the

morphology, anatomy and ultrastructure of Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker grown in vitro

under different sealing lids of test tubes, and acclimatized. A. bromeliifolia is on ornamental

species and therefore, the Plant Tissue Culture Laboratory of Universidade Federal de Goiás

(UFG) has accomplished studies aiming to propagation in vitro. Plants cultured in vitro in test

tubes with three sealing lids were analyzed: polypropylene rigid closure (PC), polyvinyl chloride

film (PVC) and PC covered with a microporous membrane (PM). For comparison, plants

germinated from seeds in a screen house were also analyzed. The acclimatized plants were

maintained in a greenhouse under controlled conditions and were evaluated after 11 months. The

in situ-grown plants were used for comparison. Among the in vitro-grown plants, those grown in

tubes sealed with PM are more similar to those grown in screen house, mainly on opening of the

stomata and chloroplasts ultrastructural. In the leaves of acclimatized plants some morphological

and anatomical characteristics are different from those that occur in the leaves of in situ-grown

plants: fibers associated to the vascular bundles have less wall thickness and the hypodermic

fibers are organized into least number of layers in addition, they also less wall thickness.

Moreover, the stomata occurs less depth in the epidermis in the leaves developed in the

greenhouse. However, considering that most morphological, anatomical and ultrastructural

characteristics of the leaves of the acclimatized plants are similar to those that occur in the leaves

of in situ-grown plants, is possible concluded that the acclimatization process and the greenhouse

environmental did not restrict its development, result that favoring the establishment of these

plants in natural environmental.

Keywords: Acclimatization. Flasks sealing. In situ development. Mixotrophic system.

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1 - Aechmea bromeliifolia no Parque Estadual da Serra Dourada, Goiás, Brasil ............ 23

CAPÍTULO I

Figura 1 - Tipos de vedações dos tubos de ensaio utilizados no cultivo in vitro de Aechmea

bromeliifolia .................................................................................................................................. 51

Figura 2 - Cultivo de Aechmea bromeliifolia sob condições de telado ......................................... 52

Figura 3 - Raízes das plantas jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas in vitro em tubos

de ensaio vedados com tampa rígida de polipropileno com membrana microporosa (A-B, D) e

em telado (C) ................................................................................................................................ 56

Figura 4 - Secções transversais da região proximal das raízes jovens de Aechmea bromeliifolia

desenvolvidas em telado (A) e in vitro (B-D) evidenciando semelhanças anatômicas ................. 58

Figura 5 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais da região

proximal das raízes jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas in vitro .............................. 59

Figura 6 - Média do comprimento da parte aérea (CPA) em centímetros (A) e média do número

de folhas (B) das plantas jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em telado e in vitro,

sob diferentes condições de cultivo ............................................................................................... 61

Figura 7 - Aspecto geral das plantas jovens de Aechmea bromeliifolia cultivadas em telado (A)

com menor crescimento da parte aérea e menor número de folhas, e in vitro (B-D) com maior

crescimento da parte aérea ............................................................................................................. 61

Figura 8 - Secções transversais da região mediana das folhas jovens de Aechmea bromeliifolia

desenvolvidas em telado (A) e in vitro (B-F), mostrando a organização anatômica básica.......... 63

Figura 9 - Vista frontal (A-D, F) e secção transversal (E) da região mediana das folhas jovens de

Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em telado (A) e in vitro (B-F) .......................................... 64

Figura 10 - Aechmea bromeliifolia desenvolvidas in vitro, evidenciando tricomas de aspecto

glandular distribuídos em fileiras na margem da folha ................................................................. 65

Figura 11 - Secções transversais de folhas jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em

telado (A, E) e in vitro (B-D, F-H) evidenciando feixes vasculares colaterais ............................. 66

Figura 12 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais das folhas

jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em telado (A, E, H, O) e in vitro (B-D, F-G, I-N,

P) .................................................................................................................................................... 68

Figura 13 - Electromicrografia de transmissão das secções transversais do parênquima

clorofiliano de Aechmea bromeliifolia desenvolvida em telado (A-B) e in vitro (C-H),

evidenciando estruturas e organelas típicas das células vegetais .................................................. 72

Figura 14 - Electromicrografia de transmissão das secções transversais do parênquima

clorofiliano de Aechmea bromeliifolia desenvolvida em telado (A-B) e in vitro (C-H),

evidenciando os cloroplastos ......................................................................................................... 74

CAPÍTULO II

Figura 1 - Aclimatização de Aechmea bromeliifolia ..................................................................... 96

Figura 2 – Local de coleta e aspecto das plantas de Aechmea bromeliifolia crescidas no Parque

Estadual da Serra Dourada, Goiás, Brasil ..................................................................................... 97

Figura 3 - Aechmea bromeliifolia aclimatizada (A) e desenvolvida in situ (B) .......................... 100

Figura 4 – Imagens em eletromicrografia de varredura da superfície foliar de Aechmea

bromeliifolia desenvolvidas in situ (A-B) e aclimatizadas (C-D) ............................................... 101

Figura 5 – Secção paradérmica (A) e transversais (B-F) das folhas de Aechmea bromeliifolia

aclimatizadas (A-C, E) e desenvolvidas in situ (D, F) ................................................................ 102

Figura 6 - Superfície foliar da face abaxial de Aechmea bromeliifolia aclimatizada (A, D-E) e

desenvolvida in situ (B-C, F) ....................................................................................................... 103

Figura 7 – Superfície (A-D) e secções transversais (E-F) das folhas de Aechmea bromeliifolia

desenvolvida in situ (A-B, F) e aclimatizada (C-D, E) evidenciando tricomas peltados ............ 105

Figura 8 - Secções longitudinais (A, E) e transversais (B-D) das folhas de Aechmea bromeliifolia

desenvolvidas in situ (A, C-E) e aclimatizada (B) ...................................................................... 107

Figura 9 - Secções transversais das folhas de Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A, C-D) e

desenvolvidas in situ (B, E-F) ..................................................................................................... 108

Figura 10 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais das folhas de

Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A, C, F, H) e desenvolvidas in situ (B, D-E, G, I) ......... 110

Figura 11 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais das folhas de

Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A, C, E, G) e desenvolvidas in situ (B, D, F, H) ............ 111

Figura 12 - Eletromicrografia de transmissão das secções transversais do parênquima clorofiliano

das folhas de Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A-D) e desenvolvidas in situ (E-I),

evidenciando cloroplastos de folhas fixadas no período da manhã (A-C, E-F) e da tarde (D, G-I)

..................................................................................................................................................... 113

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1 - Testes histoquímicos realizados em amostras foliares e radiculares de Aechmea

bromeliifolia cultivada in vitro e em telado. ................................................................................. 53

Tabela 2 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas raízes de Aechmea bromeliifolia

jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio . 59

Tabela 3 – Diâmetro médio e espessura (µm) das raízes de Aechmea bromeliifolia jovem, bem

como de suas principais regiões, desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de

vedação dos tubos de ensaio .......................................................................................................... 60

Tabela 4 – Número de pólos do protoxilema e metaxilema das raízes de Aechmea bromeliifolia

jovem, desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio 60

Tabela 5 – Resultado dos testes histoquímicos das folhas de Aechmea bromeliifolia jovem

desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio ............ 67

Tabela 6 – Médias do diâmetro polar (DP), diâmetro equatorial (DE) e relação entre DP e DE

dos estômatos da face abaxial folhas de Aechmea bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e

in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio ....................................................... 69

Tabela 7 – Médias do número de estômatos/mm² e índice estomático das folhas de Aechmea

bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos

de ensaio ........................................................................................................................................ 70

Tabela 8 – Espessura média das folhas, do mesofilo, parênquima aquífero (PA) e parênquima

clorofiliano (PC) das folhas de Aechmea bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e in vitro,

sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio ..................................................................... 70

Tabela 9 – Média da altura das células epidérmicas (µm) das folhas de Aechmea bromeliifolia

jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio . 71

Tabela 10 – Área (µm2) dos cloroplastos presentes no parênquima clorofiliano de Aechmea

bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos

de ensaio ........................................................................................................................................ 71

CAPÍTULO II

Tabela 1 – Testes histoquímicos realizados em amostras foliares de Aechmea bromeliifolia

aclimatizadas e desenvolvidas in situ ............................................................................................ 98

Tabela 2 – Resultado dos testes histoquímicos realizados nas folhas de Aechmea bromeliifolia

aclimatizadas e desenvolvidas in situ .......................................................................................... 109

Tabela 3 – Área (µm2) dos cloroplastos presentes no parênquima clorofiliano das folhas de

Aechmea bromeliifolia aclimatizadas desenvolvidas in situ ....................................................... 114

LISTA DE SIGLAS

ABA – Ácido abscísico (do inglês abscisic acid)

CAM - Metabolismo ácido das Crassulaceae (do inglês crassulacean acid metabolism)

Crti - Centro Regional para o Desenvolvimento Tecnológico e Inovação

DE – Diâmetro equatorial dos estômatos

DP – Diâmetro polar dos estômatos

E – Número de células epidérmicas por unidade de área (do inglês epidermis)

EMATER-GO - Empresa de Assistência Técnica, Extensão Rural e Pesquisa Agropecuária do

Estado de Goiás

FAA – Formaldeído, ácido acético glacial, álcool

FPVC – Filme de policloreto de vinila

ICB – Instituto de Ciências Biológicas

LabMic – Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução

LCTV – Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais

MS – Meio de cultura básico criado por Murashige e Skoog

MET – Microscópio eletrônico de transmissão

MEV – Microscópio eletrônico de varredura

PAR – Radiação fotossinteticamente ativa (do inglês photosynthetically active radiation)

PESD – Parque Estadual da Serra Dourada

PET – Politereftalato de etileno transparente

PPFD – Densidade de fluxo de fótons fotossinteticos (do inglês photosynthetic photon flux

density)

PTFE – Politetrafluoroetileno

S – Número de estômatos por unidade de área (do inglês stomata)

SI – Índice estomático (do inglês stomata index)

TM – Tampa rígida de polipropileno com membrana microporosa

TP – Tampa rígida de polipropileno

UFG – Universidade Federal de Goiás

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 19

2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................... 21

3 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 21

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................ 21

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 21

4 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 22

4.1 BROMELIACEAE .............................................................................................................. 22

4.1.1 Aechemea bromeliifolia (Rudge) Baker ..................................................................... 22

4.2 O AMBIENTE IN VITRO NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS ............................ 24

4.3 MORFOLOGIA E ANATOMIA DE PLANTAS DESENVOLVIDAS IN VITRO ............ 26

4.3.1 Influência do sistema de vedação dos recipientes ..................................................... 31

4.4 CARACTERÍSTICAS ULTRAESTRUTURAIS DAS PLANTAS DESENVOLVIDAS IN

VITRO ........................................................................................................................................ 34

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 36

CAPÍTULO 1: MORFOLOGIA E ANATOMIA DE Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker

(BROMELIACEAE) E ULTRAESTRUTURA DO SEU PARÊNQUIMA

CLOROFILIANO EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO IN VITRO ............... 45

RESUMO ...................................................................................................................................... 46

ABSTRACT ................................................................................................................................. 47

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 48

2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 50

2.1 PLANTA MATRIZ ............................................................................................................. 50

2.2 GERMINAÇÃO .................................................................................................................. 50

2.2.1 Descontaminação das sementes .................................................................................. 50

2.2.2 Germinação in vitro ..................................................................................................... 50

2.2.3 Germinação em telado ................................................................................................ 52

2.2.4 Análises anatômicas e ultraestruturais ...................................................................... 52

2.2.5 Análises quantitativas ................................................................................................. 54

3 RESULTADOS ......................................................................................................................... 56

3.1 MORFOLOGIA E ANATOMIA RADICULAR ................................................................ 56

3.2 MORFOLOGIA E ANATOMIA FOLIAR ......................................................................... 60

3.3 ULTRAESTRUTURA DAS CÉLULAS DO PARÊNQUIMA CLOROFILIANO ............ 71

4 DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 75

4.1 MORFOLOGIA FOLIAR E RADICULAR ........................................................................ 75

4.2 ANATOMIA RADICULAR ............................................................................................... 76

4.3 ANATOMIA FOLIAR ........................................................................................................ 77

4.4 ULTRAESTRUTURA DAS CÉLULAS DO PARÊNQUIMA CLOROFILIANO ............ 79

5 CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 82

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFRICAS ................................................................................ 83

CAPÍTULO 2: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E ANATÔMICA DAS FOLHAS

E ULTRAESTRUTURA DOS CLOROPLASTOS DE Aechmea bromeliifolia (Rudge)

Baker (BROMELIACEAE) APÓS PROCESSO DE ACLIMATIZAÇÃO ........................... 90

RESUMO . .................................................................................................................................... 91

ABSTRACT ................................................................................................................................. 92

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 93

2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 95

2.1 OBTENÇÃO DAS PLANTAS ACLIMATIZADAS .......................................................... 95

2.2 OBTENÇÃO DAS PLANTAS DESENVOLVIDAS IN SITU ........................................... 96

2.3 ANÁLISES MORFOLÓGICAS, ANATÔMICAS E ULTRAESTRUTURAIS ................ 97

3 RESULTADOS ....................................................................................................................... 100

3.1 MORFOLOGIA FOLIAR ................................................................................................. 100

3.2 ANATOMIA FOLIAR ...................................................................................................... 101

3.3 ULTRAESTRUTURA DOS CLOROPLASTOS .............................................................. 112

4 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 115

5 CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 118

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 119

19

1 INTRODUÇÃO GERAL

Bromeliaceae inclui cerca de 60 gêneros e 3.000 espécies (SOUZA & LORENZI, 2012)

distribuídas nas regiões tropicais e temperadas das Américas, com exceção de uma espécie de

Ptcairnia que ocorre na África tropical (JACQUES-FÉLIX, 2000). A família representa um

grupo fortemente sustentado como monofilético dentro do clado de Poales, ordem que constitui

um grupo irmão do restante das monocotiledôneas (APG III, 2009). É tradicionalmente dividida

em três subfamílias: Pitcairnioideae, Bromelioideae e Tillandsioideae. Entretanto, estudos em

sistemática filogenética suportam Tillandsioideae e Bromelioideae como subfamílias

monofiléticas e Pitcairnioideae como um agrupamento parafilético (GIVINISH et al., 2007).

Reúne plantas herbáceas, onde grande parte é epífita, mas também podem ser terrestres ou

rupículas, ocorrendo em ambientes xéricos e mésicos (BENZING et al., 1976). Muitas espécies

apresentam folhas organizadas em espiral, formando uma roseta que acumula água.

Anatomicamente, possuem tecidos aquíferos, células epidérmicas com corpos silicosos e

superfície foliar coberta por tricomas peltados capazes de absorver água (JUDD et al., 2009;

SOUZA & LORENZI, 2012).

As bromélias contribuem como mantenedoras da biodiversidade. O acúmulo de água e

nutrientes nas folhas distribuídas em roseta possibilita, por exemplo, o abrigo e o

desenvolvimento de animais, especialmente invertebrados (BENZING, 2000; FAVRETTO et al.,

2011). Segundo Aoyama et al. (2012), manter as espécies de bromélias em seu ambiente natural

significa não somente preservá-las, como também conservar a diversidade local. Além disso, são

utilizadas comercialmente, como plantas ornamentais, fonte de alimentos e como produtoras de

fibras (JUDD et al., 2009; SILVEIRA et al., 2009; NEGRELLE et al., 2012; LEONEL et al.,

2014).

Considerando a importância para os projetos paisagísticos, as bromélias são muito

cultivadas e utilizadas em decorações de interiores. Por possuírem inflorescências, em geral

muito vistosas pelo colorido das flores, seu extrativismo vem se intensificado nos últimos anos, o

que coloca em risco algumas espécies com maior grau de ameaça (RODRIGUES et al., 2007;

NEGRELLE et al., 2012). Neste contexto, a técnica de cultivo in vitro tem sido utilizada na

produção de várias bromélias ornamentais, sendo considerada estratégia importante na

preservação das espécies nativas. Essa técnica possibilita o fornecimento de maior quantidade de

plantas ao mercado, diminuindo a procura por exemplares de ambientes naturais (TAMAKI et

al., 2011).

20

O sistema de propagação in vitro apresenta vantagens se comparado aos métodos

tradicionais, tais como redução dos espaços requeridos na multiplicação de mudas; as plantas se

desenvolvem em um ambiente asséptico; possibilidade de ajustar fatores que influenciam o

desenvolvimento das plantas (nutrientes, reguladores de crescimento, luz e temperatura) e

produção contínua de plantas ao longo do ano, independente das mudanças de estações

(GEORGE & DEBERGH, 2008). Nos últimos anos, essa técnica tem sido amplamente utilizada

para várias espécies vegetais, como em bromélias, muitas das quais são nativas do Brasil, de

valor ornamental e consideradas como vulneráveis a ameaçadas de extinção por diversos autores

(ARRABAL et al., 2002; RECH FILHO et al., 2005; ALVES et al., 2006; SILVEIRA et al.,

2009; AOYAMA et al., 2012; SANTA-ROSA et al., 2013; DAL VESCO et al., 2014).

Plantas crescidas in vitro desenvolvem-se em um ambiente asséptico, sob baixa

intensidade luminosa, em condições nutricionais que permitem crescimento heterotrófico e alto

nível de umidade (HAZARIKA, 2003). Esses fatores contribuem, geralmente, para induzir

características fenotípicas que dificultam a sobrevivência da planta, quando transferida

diretamente da condição in vitro para o campo ou casa de vegetação, evidenciando a necessidade

de aclimatização para a condição ex vitro na maioria das vezes (HAZARIKA, 2003, 2006;

CHANDRA et al., 2010). No processo de aclimatização, as plantas desenvolvidas in vitro são

transferidas, de forma gradual, para um ambiente com as condições climáticas próximas às

naturais. Desse modo, busca-se minimizar o estresse que pode danificar as plantas ou levá-las à

morte (SILVA et al., 1995).

Alterações anatômicas e fisiológicas são as principais causas da baixa taxa de

sobrevivência de plantas desenvolvidas in vitro após transferência para condição ex vitro.

Alterações na forma, no funcionamento e na frequência dos estômatos e a ocorrência de cutícula

delgadas nas plantas in vitro conferem, por exemplo, alta condutância estomática e alta taxa de

transpiração (SÁEZ et al., 2012a). Além disso, a ultraestrutura celular também pode ser alterada

durante o desenvolvimento das plantas na condição in vitro (SALLANON et al., 1993; SÁEZ et

al., 2012a; MOYO et al., 2012; KAPCHINA-TOTEVA et al., 2014). Por esse motivo, estudos

que buscam identificar as alterações estruturais e funcionais de plantas cultivadas in vitro

possibilitam a compreensão dos processos celulares envolvidos no desenvolvimento das mesmas

e, consequentemente, fornecem subsídios para o aprimoramento da técnica.

21

2 JUSTIFICATIVA

Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker possui potencial ornamental e, por isso, o

Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Goiás (ICB/UFG) tem realizado trabalhos visando sua propagação in vitro.

Entretanto, os tipos de recipientes utilizados nos processos da cultura de tecidos vegetais, bem

como a forma de vedação dos mesmos, criam ambientes que influenciam o crescimento e

desenvolvimento das plantas e, consequentemente, o processo de aclimatização. Visando

contribuir com informações sobre o desenvolvimento das plantas na cultura de tecidos, o

presente trabalho avaliou características relacionadas ao desenvolvimento de plantas jovens de A.

bromeliifolia sob diferentes condições in vitro, bem como de plantas aclimatizadas. Além disso,

os resultados ampliam a compreensão da plasticidade fenotípica de plantas submetidas a

diferentes condições ambientais e fornecem informações que podem subsidiar o processo de

reintrodução em ambiente natural.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar aspectos morfológicos, anatômicos e ultraestruturais de Aechmea bromeliifolia

(Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de

ensaio, bem como de plantas aclimatizadas.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar a morfologia e anatomia da raiz e das folhas de plantas jovens desenvolvidas in

vitro se comapradas às desenvolvidas em telado;

Avaliar a influencia de diferentes materiais utilizados para vedação de tubos de ensaio sobre

características morfológicas e anatômicas da folha e da raiz das plantas desenvolvidas in vitro;

bem como sobre a ultraestrutura do parênquima clorofiliano, com ênfase nos cloroplastos;

Avaliar a morfologia e anatomia foliar das plantas aclimatizadas, se comparadas às

desenvolvidas in situ;

22

Caracterizar a ultraestrutura dos cloroplastos presentes nas folhas das plantas aclimatizadas e

das plantas desenvolvidas in situ.

4 REVISÃO DE LITERATURA

4.1 BROMELIACEAE

A família compreende aproximadamente 60 gêneros e 3.000 espécies (SOUZA &

LORENZI, 2012), sendo que no Brasil ocorrem 44 gêneros e 1343 espécies (FORZZA et al.,

2016). Bromeliaceae é diversamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais, estendendo-

se da Virgínia na América do Norte à Patagônia na América do Sul (SMITH & TILL, 1998),

com exceção de Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms & Mildbraed que ocorre no oeste da

África tropical (JACQUES-FÉLIX, 2000). A família representa um grupo fortemente sustentado

como monofilético dentro do clado de Poales, ordem que constitui um grupo irmão do restante

das monocotiledôneas (APG III, 2009). É tradicionalmente dividida em três subfamílias:

Pitcairnioideae, Bromelioideae e Tillandsioideae. Estudos em sistemática filogenética suportam

Tillandsioideae e Bromelioideae como subfamílias monofiléticas e Pitcairnioideae como um

agrupamento parafilético (GIVINISH et al., 2007). Givinish et al. (2007) propõem as seguintes

subfamílias para Bromeliaceae: Tillandsioideae, Bromelioideae, Brocchinioideae,

Lindmanioideae, Hechtioideae, Puyoideae, Navioideae e Pitcairnioideae.

Bromélias são plantas herbáceas com folhas espiraladas formando uma roseta, com

bainha na base da lâmina foliar. A coloração verde nas folhas pode ser ornamentada por

antocianinas e tricomas peltados. O caule geralmente é ereto e curto. Em Pitcairnioideae

terrestres não ocorre rosetas formando tanques, com exceção de uma espécie de Brocchinia, em

Tillandsioideae e Bromelioideae a formação de tanques de vários tipos são comuns (SMITH &

TILL, 1998). Estes tanques possibilitam o desenvolvimento de animais que podem ser de

restritos a ocasional a esses microhabitats, como o Crustaceae Elpidium bromeliarum Müller e o

Anuro Syncope antenori Walker (SMITH & TILL, 1998).

4.1.1 Aechemea bromeliifolia (Rudge) Baker

Pertencente a Bromelioideae (Bromeliaceae), Aechmea bromeliifolia (Figura 1A-D) se

distribui em praticamente todos os estados brasileiros. Ocorre em diferentes tipos de vegetação,

como campo rupestre, cerrado latu sensu, floresta ciliar ou de galeria, floresta estacional

23

semidecidual e floresta ombrófila (FORZZA et al., 2016). São terrestres, epífitas ou rupícolas e

atingem aproximadamente 44-85 cm de altura (LUIZ-SANTOS & WANDERLEY, 2012).

Possui folhas coriáceas, lepidotas, alternas espiraladas, formando roseta tubular com lâminas

lanceoladas e serreadas. A lâmina é esverdeada em ambas as faces e a margem é espinescente

(Figura 1A). A inflorescência, em espiga estrobiliforme (Figura 1B), é vistosa. O escapo é ereto

ou semi-ereto, branco lanoso, com brácteas alternas, lanceoladas, vistosas e róseas (Figura 1C).

As flores são sésseis, sépalas e pétalas verdes ou amarelo-esverdeadas (LUIZ-SANTOS &

WANDERLEY, 2012; KOCH et al., 2013).

Figura 1 - Aechmea bromeliifolia no Parque Estadual da Serra Dourada, Goiás, Brasil. A - Aspecto geral das

plantas crescidas em afloramentos rochosos e em forófitos; B - Detalhe da inflorescência estrobiliforme; C - Detalhe

do escapo com brácteas róseas; D - Folhas espiraladas promovendo o acúmulo de água. Fonte: própria autora.

24

Aechmea bromeliifolia é distribuída em diversos países da América Central, no noroeste

da América do Sul e de Norte a Sul do Brasil. Foi observada floração em março, agosto e

setembro no estado de Minas Gerais, Brasil (LUIZ-SANTOS & WANDERLEY 2012). Koch et

al. (2013), relataram floração e frutificação nos meses de agosto e novembro em uma área de

conservação da Amazônia brasileira. Assim como a maioria das espécies de Bromelioideae

(CRYAN et al., 2004), A. bromeliifolia possui metabolismo ácido das Crassulaceae (CAM, do

inglês crassulacean acid metabolism) (GRIFFITHS & SMITH, 1983; SCARANO et al., 2002).

Aechmea bromeliifolia pode ser utilizada como espécie de valor ornamental e cultivada

em decorações de interiores. Além disso, pode ser inserida em forófitos em florestas no processo

de restauração, promovendo o enriquecimento de matas com essa forma de vida (DUARTE &

GANDOLFI, 2013). Devido a sua estrutura foliar organizada em espiral, verdadeiros tanques são

formados, capazes de acumular água (Figura 1D) e abrigar diversos organismos, como

Turbellaria spp., Nematoda spp., Oligochaeta spp., Crustracea (incluindo Elpidium sp.), Insecta,

Arachnida (LOPEZ et al., 1998) e uma espécie de anura (OLIVEIRA & ROCHA, 2015).

Aechmea bromeliifolia é polinizada principalmente por beija-flores e ocasionalmente por abelhas

(SANTANA & MACHADO, 2010). Segundo esses autores, bromélias ornitófilas são

importantes para a manutenção da fauna de beija-flores, o que beneficia diretamente outras

espécies de plantas que utilizam essas aves como vetores de pólen.

4.2 O AMBIENTE IN VITRO NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

O termo in vitro é derivado do latim “em vidro” e, na cultura de tecidos vegetais, se

refere ao explante que se desenvolve no interior de um recipiente fechado, em meio nutritivo

artificial, asséptico, sob condições controladas de temperatura e luz artificial (AITKEN-

CHRISTIE et al., 1995). Usualmente os recipientes utilizados são de vidro ou plásticos claros,

suscetíveis à entrada de luz (KOZAI & KUBOTA, 2005a).

O ambiente in vitro refere-se ao microclima, atmosfera, rizosfera que envolve o explante

no interior do recipiente de cultivo. O termo microambiente também é empregado como

sinônimo de ambiente in vitro, entretanto com ênfase na dimensão física (KOZAI & SMITH,

1995). O crescimento e desenvolvimento de plantas cultivadas in vitro estão intimamente

acoplados a esse microambiente. O potencial máximo na taxa de crescimento e desenvolvimento

do vegetal é determinado geneticamente, contudo, essas taxas são limitadas pelo microambiente

que o envolve (FUJIWARA & KOZAI, 1995).

25

Na cultura de tecidos vegetais as plantas podem desenvolver-se em sistemas

heterotróficos, fotomixotróficos ou autotróficos (KOZAI, 1991a). No sistema heterotrófico, a

fonte de carbono pode ser proveniente unicamente da sacarose (fonte exógena), o explante se

desenvolve no interior de um recipiente hermeticamente fechado e em baixa densidade de fluxo

de fótons fotossintéticos (PPFD, do inglês photosynthetic photon flux density). No sistema

fotomixotrófico a sacarose também está presente no meio de cultura, contudo as plantas também

utilizam os carboidratos obtidos por meio da fotossíntese (fonte endógena) podendo ser

promovida pelo aumento da PPFD e da concentração de CO2 no ambiente in vitro. No sistema

fotoautotrófico, embora continue ocorrendo aumento da PPFD e da concentração de CO2 no

interior do recipiente, não se adiciona sacarose ou outro carboidrato ao meio de cultura. Sendo

assim, a única fonte de carbono é proveniente da fotossíntese (KOZAI & KUBOTA, 2005a). O

sistema mixotrófico difere do fotoautotrófico pela utilização de baixa PPFD.

O ambiente in vitro, no sistema heterotrófico (conhecido também como sistema de

cultivo in vitro convencional) a PPFD é baxa; a umidade relativa é alta; a temperatura é amena e

constante; a concentração de CO2 no período luminoso é baixa e no escuro é alta; e a

concentração de etileno é alta. Além disso, a sacarose está presente no meio de cultura, além de

micro e macronutrientes (KOZAI & SMITH, 1995).

A radiação compreendida entre 400 e 700 nm é chamada radiação fotossinteticamente

ativa (PAR, do inglês photosynthetically active radiation). Em pesquisas sobre fotossíntese,

quando PAR é expressa sobre uma base quântica, é adotada a denominação PPFD (KOZAI,

1991a). A luz é responsável pelas reações fotoquímicas nas plantas, como fotossíntese e

fotomorfogênese (germinação, enraizamento, iniciação de gemas, alongamento de caules, etc.).

A micropropagação convencional é feita em baixo PPFD, aproximadamente 30-80 µmol m-2 s-1,

quando comparada a outras formas de micropropagação, como a fotoautotrófica ou no ambiente

ex vitro (AFREEN, 2005).

A temperatura do ar na sala de crescimento é, relativamente, constante, em torno de 20-

25 ºC durante o dia (FUJIWARA & KOZAI, 1995), podendo variar de 1-2 ºC no interior do

recipiente. No período noturno, a temperatura do ar no interior do recipiente é quase a mesma

que na sala de crescimento (KOZAI & KUBOTA, 2005b).

Com o desenvolvimento da planta, substâncias gasosas como etileno e vapor de água

podem ser acumulados na atmosfera do recipiente. Os principais fatores que estão relacionados à

acumulação dos gases são a quantidade do material vegetal, o tipo de vedação do recipiente, os

componentes do meio de cultura e o clima da sala de crescimento (temperatura, ventilação e

intensidade luminosa) (BUDDENDORF-JOOSTEN & WOLTERING, 1994). Na

26

micropropagação convencional, utilizando recipientes como tubos de ensaio, o movimento de ar

no seu interior é restrito e pode provocar difusão limitada de CO2, diminuindo seu fluxo para o

interior da planta e, consequentemente, a taxa fotossintética líquida. Durante o fotoperíodo

ocorre baixa concentração de CO2 no interior do recipiente de cultura, já no período noturno, há

uma alta taxa de respiração vegetal, causando aumento na concentração de CO2 (KOZAI &

KUBOTA, 2005b).

O etileno (C2H4) é um fitormônio produzido pelos vegetais e pode acumular em

recipientes totalmente vedados utilizados na cultura de tecidos convencional (KOZAI &

KUBOTA, 2005b). Segundo Buddendorf-Joosten & Woltering (1994) baixas concentrações de

etileno no sistema in vitro, podem ser necessárias para o processo de organogênense. Em altas

concentrações esse gás pode, entretanto, ter um efeito negativo no crescimento e

desenvolvimento da planta e induzir a senescência foliar. De Proft et al. (1985) observaram, por

exemplo, crescimento reduzido e baixo conteúdo de clorofila a em resposta ao acúmulo de

etileno em recipientes, hermeticamente fechados, durante o crescimento in vitro de Magnolia

soulangeana Soul. (Magnoliaceae).

Como o meio de cultura utilizado no cultivo in vitro possui água, a umidade relativa no

interior dos recipientes é muito alta (CHEN, 2004). Somado a isso, a vedação utilizada dificulta

as trocas gasosas com o meio externo, contribuindo para a sua elevação. Esse alto nível de vapor

de água ou umidade (aproximadamente 100%) pode causar anormalidades nos tecidos vegetais,

como baixo desenvolvimento da cutícula e mau funcionamento dos estômatos (JOHANSSON et

al., 1992). Além disso, a taxa de transpiração da planta nessas condições é geralmente baixa,

podendo afetar negativamente o processo de absorção de água e translocação de nutrientes

(KOZAI, 1991b). Segundo Jeong et al. (1995) a baixa taxa de transpiração in vitro é resultado do

pequeno gradiente de umidade entre os espaços intercelulares da folha e a atmosfera saturada do

recipiente de cultivo.

4.3 MORFOLOGIA E ANATOMIA DE PLANTAS DESENVOLVIDAS IN VITRO

O crescimento e o desenvolvimento vegetal não são influenciados apenas pelo seu

material genético, mas também pelas condições biológicas e pelos fatores externos as quais estão

expostos (TING & GIACOMELLI, 1992). Neste contexto, características morfológicas,

anatômicas e fisiológicas de plantas cultivadas in vitro podem ser consideravelmente afetadas,

podendo apresentar características como: reduzida formação de cera epicuticular, tecidos com

menor complexidade estrutural (parênquima paliçádico e esponjoso, e sistema vascular), mau

27

funcionamento dos estômatos, baixo conteúdo de clorofilas, baixa taxa fotossintética e baixa

porcentagem de matéria seca (plantas mais suculentas) (KOZAI & SMITH, 1995).

Plantas em crescimento in vitro são, geralmente, muito delicadas, com ausência, ou

desenvolvimento reduzido, de estruturas que as tornam vulneráveis quando expostas ao ambiente

natural (HAZARIKA, 2006). Entretanto, suas raízes e sua parte área podem ficar mais

alongadas. Aoyama et al. (2012) observaram, por exemplo, ao compararem as plantas de

Alcantarea imperialis (Carrière) Harms (Bromeliaceae) desenvolvida in vitro e ex vitro, maior

crescimento tanto da parte aérea como das raízes nas plantas in vitro, mesmo com a germinação

das sementes ocorrendo simultaneamente. Segundo esses autores, isso ocorre, provavelmente,

em função da presença de sacarose no meio de cultura da planta em desenvolvimento in vitro.

Em estudo sobre a morfologia de Murraya paniculata (Jack) Linn. (Rutaceae) desenvolvida in

vitro e in vivo, Taha & Haron (2008) observaram diferenças na textura foliar. Na condição in

vitro as folhas apresentaram-se membranosas e na condição in vivo apresentaram-se coriáceas.

Johansson et al. (1992) verificaram consistência flácida das folhas de Rosa sp. (Rosaceae)

cultivada in vitro.

A epiderme está presente nos órgãos em estrutura primária e possui vários tipos celulares,

constituindo-se um tecido complexo. Segundo Dickison (2000), o aumento na espessura das

paredes das células epidérmicas pode participar na proteção dos tecidos contra a radiação solar

intensa, e também pode contribuir para a redução da perda excessiva de água. Células

epidérmicas com paredes menos espessas foram observadas nas plantas de Rosa sp.

desenvolvidas in vitro (JOHANSSON et al., 1992) e Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Sm.

(Bromeliaceae) (TAVARES et al., 2015). A cutícula, que reveste a parede externa das células

epidérmicas, protege contra a transpiração excessiva das plantas e forma uma barreira física

contra a ação de patógenos (RIEDERER, 2006; YEATS & ROSE, 2013). Plantas provenientes

do cultivo in vitro possuem, geralmente, cutícula pouco desenvolvida. Essa característica está

relacionada, provavelmente, ao alto nível de umidade no recipiente de cultivo e pode resultar em

plantas que, quando transferidas para o ambiente ex vitro, perdem mais água para a atmosfera

(JOHANSSON et al., 1992). Johansson et al. (1992) observaram cutícula delgada (0,04 µm) nas

superfícies adaxial e abaxial da lâmina foliar de Rosa sp. cultivada in vitro, enquanto nos

indivíduos aclimatizados, e na planta matriz, a cutícula (em ambas as superfícies) foi mais

espessa (aproximadamente 0,3 µm e 0,4 µm respectivamente). Abbade et al. (2009) observaram

ausência de cutícula nas faces adaxial e abaxial da epiderme foliar de Tabebuia roseoalba (Ridl.)

Sandwith (Bignoniaceae) cultivada in vitro e Sáez et al. (2012a) praticamente não observaram

deposição de cera epicuticular em Castanea sativa Mill. (Fagaceae) desenvolvida in vitro.

28

Resultados similares foram observados em Dianthus caryophyllus L. (Caryophyllaceae)

(MAJADA et al., 2001), Fragaria x ananassa Duch. (morangueiro cv. Vila Nova) (Rosaceae)

(CALVETE et al., 2002), Ananas comosus (L.) Merr. cv. Pérola (Bromeliaceae) (BARBOSA et

al., 2006), Cymbidium sp. (Orchidaceae) (MAYER et al., 2008) e Musa sp. (bananeira cv.

Preciosa) (Musaceae) (COSTA et al., 2009b).

Os estômatos nas plantas cultivadas in vitro podem se alterar, quando comparados aos

que ocorrem nas plantas crescidas em campo ou casa de vegetação. Estas variações incluem o

formato das células-guarda, os diâmetros polar e equatorial, a abertura do ostíolo, a densidade

(número de estômatos por unidade de área foliar) e o índice estomático. O formato dos estômatos

é um indicativo da sua funcionalidade. Estômatos com aspectos elípticos são capazes de

responder aos estímulos, enquanto estômatos circulares podem ser incapazes de se fechar

completamente, mantendo a porcentagem de perda de água, em alto nível (SHA VALLI KHAN

et al., 1999). A abertura estomática pode ser controlada por diversos mecanismos que operam

para manter um equilíbrio entre a entrada de CO2 e a restrição à perda excessiva de água na

forma de vapor (SCHULZE & HALL, 1982). Nas folhas de Rosa sp. cultivada in vitro os

estômatos possuem formato esférico, enquanto nas plantas crescidas em ambiente natural, eles

possuem formato elipsóide (JOHANSSON et al., 1992). Resultados similares foram observados

em Malus pumila Mill. (Rosaceae) (BLANKE & BELCHER, 1989) Tectona grandis L.

(Lamiaceae) (JUNIOR & SCHERWINSKI-PEREIRA, 2009), Castanea sativa (SÁEZ et al.,

2012a) e Ficus carica L. cv. “Roxo de Valinhos” (Moraceae) (CHIRINÉA et al., 2012).

A anormalidade mais importante observada em muitas pesquisas relacionadas à

micropropagação convencional é a não funcionalidade dos estômatos (AFREEN, 2005),

Estômatos de folhas de plantas desenvolvidas in vitro não se fecharam imediatamente quando

expostas a baixa umidade relativa, à presença de ácido abcísico (ABA, do inglês abscisic acid)

(WARDLE & SHORT, 1983) e quando expostas ao escuro (WARDLE & SHORT, 1983;

SALLANON et al. 1993). Os estômatos, de formato circular, das folhas de Prunus cerasus L.

(Rosaceae) desenvolvidas in vitro e expostas a baixa umidade relativa (45%), por exemplo,

levaram cerca de 20 min para se fecharem, enquanto os estômatos de folhas crescidas durante

aclimatização e expostas à mesma umidade relativa ficaram com aspecto elíptico e se fecharam

instantaneamente. Esse resultado demonstra uma adaptação de plantas desenvolvidas in vitro

para novas condições ambientais (MARÍN et al., 1988).

Os ostíolos dos estômatos de plantas desenvolvidas in vitro apresentam frequentemente,

maiores aberturas quando comparados às plantas desenvolvidas em campo ou casa de vegetação

(BLANKE & BELCHER, 1989; JOHANSSON et al., 1992; SÁEZ et al., 2012a). De acordo

29

com Johansson et al. (1992), a elevada umidade relativa no interior do recipiente de cultivo

induz a abertura estomática. Estômatos com ostíolo visualmente maior em plantas in vitro foi

relatado em folhas de Cymbidium sp. (MAYER et al., 2008) e em Tectona grandis (JUNIOR &

SCHERWINSKI-PEREIRA, 2009). Além disso, plantas in vitro são deficientes em ABA

(CHANDRA et al., 2010), fitormônio que induz o fechamento dos estômatos inibindo a

transpiração excessiva foliar (MITTELHEUSER & VAN STEVENINCK, 1969).

A densidade estomática entre plantas desenvolvidas in vitro, comparadas às plantas

desenvolvidas em casa de vegetação ou no campo, pode variar. Abbade et al. (2009) observaram

que o número de estômatos por área, nas folhas de Tabebuia roseoalba in vitro foi

significativamente maior que nas plantas provenientes do campo. Maior densidade estomática

em plantas desenvolvidas in vitro também foi observada em Rosa sp. em detrimento à planta

matriz (JOHANSSON et al., 1992), em Musa sp. (bananeira cv. Preciosa) comparada a

diferentes estágios de aclimatização (COSTA et al., 2009b) e em Castanea sativa comparada à

planta desenvolvida em viveiro (SÁEZ et al., 2012a). O aumento na densidade estomática em

plantas cultivadas in vitro é provocado, provavelmente, pela alta umidade e temperatura amena

(ABBADE et al., 2009). Segundo Fráguas (2003) os numerosos estômatos abertos podem

facilitar as trocas gasosas e aumentar a eficiência fotossintética no ambiente in vitro. Costa et al.

(2009a) observaram que a redução na densidade estomática em resposta a aclimatização pode

ocorrer, provavelmente, em decorrência do aumento do crescimento das células epidérmicas e

demais tecidos foliares.

Menor densidade estomática em plantas cultivadas in vitro foi observada em Ananas

comosus (L.) Merr. cv. IAC “Gomo-de-mel” (Bromeliaceae) comparado à planta aclimatizada

em pleno sol (BATAGIN et al., 2009) e Ficus carica comparado a espécie crescida no campo

(CHIRINÉA et al., 2012). Batagin et al. (2009) atribuíram esse resultado, à condição

heterotrófica, de umidade e luz controlada do recipiente de cultivo in vitro.

Outra característica que deve ser considerada é a formação, in vitro, de estômatos

proporcionalmente maiores. As plantas de Tabebuia roseoalba cultivadas in vitro possuem

estômatos com maiores dimensões em comparação com estômatos da planta desenvolvida no

campo (ABBADE et al., 2009). O mesmo foi encontrado em Tectona grandis, segundo Junior &

Scherwinski-Pereira (2009), isso ocorre devido à falta de controle no mecanismo de abertura e

fechamento estomático, pois na planta desenvolvida em casa de vegetação, os estômatos

possuíram menores dimensões, controlando a perda de água.

Estômatos levemente projetados acima das demais células epidérmicas foram observados

em folhas de Cymbidium sp. desenvolvidas in vitro. Na planta matriz, entretanto, os estômatos

30

ocorrem abaixo do nível das demais células epidérmicas (MAYER et al., 2008). Resultado

semelhante foi observado nas folhas de Liquidambar styraciflua L. (atualmente, Altingiaceae)

desenvolvida in vitro, quando comparadas às folhas das plantas aclimatizadas e desenvolvidas no

campo. Nestas últimas condiçõesos os estômatos encontram-se no mesmo nível das demais

células epidérmicas (WETZSTEIN & SOMMER, 1982). Segundo Mayer et al. (2008), esses

resultados estão relacionados, provavelmente, à alta umidade relativa do ambiente in vitro.

As plantas desenvolvidas in vitro possuem, geralmente, folhas com pouca diferenciação.

Fidelis et al. (2000) não observaram, por exemplo, distinção dos parênquimas paliçádico e

esponjoso na lâmina foliar de Brosimum gaudichaudii Trécul (mama-cadela) (Moraceae)

proveniente do cultivo in vitro. Nas plantas crescidas em casa de vegetação o mesofilo possuiu,

entretanto, uma camada de células do parênquima paliçádico, e duas camadas de células do

parênquima lacunoso. Taha & Haron (2008) observaram apenas uma camada de células do

parênquima paliçádico nas folhas de Murraya paniculata desenvolvidas in vitro, ao invés de

duas encontradas na espécie in vivo. Dentre outras espécies cultivadas in vitro em que o

parênquima paliçádico apresentou menos camadas de células estão Ficus carica (CHIRINÉA et

al., 2012) e Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae) (RODRIGUES et al., 2014). Em Tabebuia

serratifolia (Vahl) G. Nicholson (Bignoniaceae) desenvolvida in vitro e em viveiro, Dousseau et

al. (2008) observaram apenas uma camada de células paliçádicas nas folhas. Entretanto, nas

plantas provenientes do cultivo in vitro essas células apresentaram formato cônico com espaços

intercelulares maiores, ao invés de apresentarem formato alongado com células justapostas,

como no crescimento em viveiro. Não se observou alteração no número de camadas de células

do parênquima paliçádico em Cocos nucifera L. (Arecaceae) cultivada in vitro e em condição

autotrófica (casa de vegetação). Entretanto, enquanto na condição in vitro as células do

parênquima paliçádico apresentaram formato irregular e com diferentes tamanhos, na condição

autotrófica essas foram bem organizadas (SANTANA et al., 2010).

Plantas cultivadas in vitro possuem o mesofilo com, geralmente, alta proporção de

espaços intercelulares (WETZSTEIN & SOMMER, 1982; JOHANSSON et al., 1992;

APÓSTOLO et al., 2005; CHIRINÉA et al., 2012) e redução dos parênquimas paliçádico e

esponjoso (CALVETE et al., 2002; CHIRINÉA et al., 2012). Além disso, possuem redução na

espessura da lâmina foliar (WETZSTEIN & SOMMER, 1982; JOHANSSON et al., 1992;

FIDELIS et al., 2000; JUNIOR & SCHERWINSKI-PEREIRA, 2009; ABBADE et al., 2009;

CHIRINÉA et al., 2012). O fator que está relacionado com essas modificações é, provavelmente,

a luminosidade. Trabalhos evidenciam a influência da maior intensidade luminosa sobre a

expansão das células do mesofilo (VOLTAN et al., 1992; HANBA et al., 2002), da lâmina foliar

31

e redução dos espaços intercelulares (FERNANDES et al., 2014). Sendo assim, plantas

desenvolvidas in vitro podem apresentar mesofilo pouco desenvolvido se comparado ao das

plantas que se desenvolvem no campo ou casa de vegetação, pois no ambiente in vitro, a

intensidade luminosa é baixa. Em Castanea sativa cultivada in vitro foi observada interação

significativa entre as plantas expostas a maior luminosidade e recipientes com vedação que

permitem maior aeração. Indivíduos que cresceram em recipientes ventilados e expostos a PPFD

de 150 µmol m-2 s-1, obtiveram maior produção de biomassa, maior capacidade fotossintética e

maior capacidade de controle na perda de água, comparado a indivíduos que cresceram em

recipientes com menor ventilação sob PPFD de 50 µmol m-2 s-1 (SÁEZ et al., 2012b).

O conjunto xilema-floema forma um sistema vascular contínuo através dos órgãos

vegetativos e reprodutivos das plantas vasculares (ESAU, 1974). O xilema é responsável pelo

transporte de água e solutos, armazenamento de nutrientes e suporte mecânico, enquanto o

floema é o principal tecido de condução de matérias orgânicas e inorgânicas em solução

(COSTA et al., 2012; MACHADO & CARMELLO-GUERREIRO, 2012). Feixes vasculares em

folhas de Cynara scolymus L. (Asteraceae) cultivada in vitro apresentaram desenvolvimento

limitado, evidenciando poucos elementos condutores e ausência de fibras. Nos estágios

avançados de aclimatização, esses se mostraram bem desenvolvidos, com numerosos elementos

condutores e presença de fibras (APÓSTOLO et al., 2005). A lâmina foliar de Musa sp.

(bananeira cv. Japira) possuiu menor espessura da nervura central no desenvolvimento in vitro,

tornando-se maior e mais diferenciada em resposta à aclimatização (COSTA et al., 2009a).

Cattleya jenmanii Rolfe Y. e Cattleya lueddemanniana Rchb.F. (Orchidaceae) desenvolvidas in

vitro, apresentaram feixes vasculares com bainha esclerenquimática constituída por fibras com

paredes pouco espessas, enquanto as plantas dessas mesmas espécies cultivadas em orquidário,

possuíram fibras com paredes mais espessadas (TORRES & SANABRIA, 2011).

4.3.1 Influência do sistema de vedação dos recipientes

O tipo de vedação dos recipientes para o cultivo in vitro pode influenciar no crescimento

das plantas (PRAKASH et al. 2004). No cultivo in vitro convencional, além da presença de

sacarose no meio de cultura, os recipientes utilizados são bem vedados para que possa prevenir a

entrada de microrganismos (KOZAI & KUBOTA, 2005b). Os recipientes, quando

completamente vedados, fazem com que o ar no interior do frasco fique saturado com vapor de

água, além de favorecerem o aumento da concentração interna de etileno e CO2 (JEONG et al.,

1995). Além disso, segundo Biddington (1992), a acumulação de etileno na cultura de tecidos

32

vegetais é consequência do método (recipientes totalmente vedados) e pode constituir um

contaminante indesejável. De forma contrária, vedações que permitem maiores trocas gasosas

favorecem o desenvolvimento das plantas (DE PROFT et al., 1985).

Diferentes tipos de vedações para os recipientes podem ser utilizados. Estes incluem

tampões de algodão não absorvente, tampões de espuma de poliuretano, papel de alumínio,

tampa de aço inoxidável, tampa de polipropileno, filme PVC (policloreto de vinil) e goma de

silicone (PRAKASH et al., 2004). Neste contexto, têm-se avaliado a influencia do tipo de

vedação dos recipientes utilizados no cultivo in vitro sobre características relacionadas ao

desenvolvimento e metabolismo das plantas. Estudos recentes evidenciam que vedações que

permitem melhores trocas gasosas proporcionam melhores resultados. Saldanha et al. (2012)

estudaram, por exemplo, a utilização de tampa rígida de polipropileno sem e com furos de 10

mm de diâmetro cobertos com fita microporosa e fita veda-rosca (PTFE). Segundos esses

autores, o crescimento de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen (Amaranthaceae) foi favorecido

na condição em que houve maiores trocas gasosas. O comprimento foliar de Annona glabra L.

(Annonaceae) cultivada in vitro também foi significativamente influenciado pelo tipo de vedação

dos recipientes. Santana et al. (2011) observaram maior comprimento foliar nas plantas crescidas

em tubo de ensaio vedado com tampão de algodão e tampa plástica sem película de PVC, em

detrimento da tampa plástica envolvida com película de PVC. Nessa última condição de cultivo

foi observada significativa perda foliar. Resultados similares foram observados em

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan var. cebil (Griseb) Altschul (Fabaceae), onde os

tratamentos com tampa plástica sem filme de PVC e o tratamento com tampão de algodão

obtiveram aumento da massa seca das folhas e raízes em comparação com o fechamento com

filme de PVC. A vedação com tampa plástica sem filme de PVC proporcionou maior número de

folhas por microplanta, e na vedação com tampão de algodão as plantas ficaram com folhas

maiores e mais expandidas. Além disso, a taxa de abscisão das folhas, desta última vedação, foi

menor e houve aumento do comprimento e da quantidade das raízes (NEPOMUCENO et al.,

2009).

A vedação que permite melhores trocas gasosas entre o meio externo e o interior dos

recipientes diminui o acúmulo de gases e aumenta o fluxo transpiratório, aumentando a

probabilidade de as plantas sobreviverem quando transferidas para o ambiente ex vitro, uma vez

que nessas condições elas apresentam melhor controle transpiratório (NEPOMUCENO et al.,

2009). Em Herreria salsaparrilha Mart. (Herreriaceae), Gonçalves et al. (2008) observaram uma

elevação do filme de PVC sobre os recipientes, resultado da acumulação de O2 (oxigênio) no

interior dos recipientes. Já em amostras vedadas com tampa rígida de polipropileno (com e sem

33

filtro), a concentração de O2 não diferiu da concentração do ambiente externo ao recipiente de

cultivo. Segundo esses mesmos autores, os recipientes vedados com tampa rígida não ficam

hermeticamente vedados, facilitando as trocas gasosas.

Características anatômicas e fisiológicas também podem ser influenciadas pelo tipo de

vedação dos recipientes. Majada et al. (2001) estudaram o efeito da taxa de ventilação (VR, do

inglês ventilation rates) dos recipientes de cultivo vedados com folha de alumínio, sem e com

filtro, e plástico transparente com filtro sobre a densidade estomática em Dianthus caryophyllus.

Segundo os mesmos autores, o aumento da taxa de ventilação promoveu maior deposição de cera

cuticular e diminuição da densidade estomática. Além disso, o grau de fechamento estomático

foi menor nas plantas crescidas em recipientes hermeticamente fechados, após serem expostas a

baixa humidade relativa. Nas plantas crescidas em recipientes mais ventilados ocorreu o

contrário. É importante ressaltar que segundo Majada et al. (1997) a taxa de ventilação no

interior dos frascos vedados com folha de alumínio, sem e com filtro menor, plástico

transparente com filtro e com folha de alumínio com filtro maior é respectivamente, 0,11; 0,21;

0,68 e 0,86 h-1 (air changes per h) (Tabela 1), e que a PPFD no interior dos recipientes vedados

com plástico transparente com filtro é significativamente maior (Tabela 1).

Tabela 1 – Tipo de vedação e características do interior dos frascos de cultivo (PPFD – densidade de fluxo de fótons

fotossintéticos 2 e 5 cm a partir da base do recipiente). Fonte: Majada et al. (1997, modificado).

Tipo de vedação Taxa de

ventilação (h-1)

PPFD (2 cm) PPFD (5 cm)

Alúminio sem filtro 0,11 17 a 9,5 a

Alumínio com filtro menor 0,21 12 a 6 b

Plástico com filtro 0,68 29 b 33 c

Alumínio com filtro maior 0,86 10 a 5,5 b

Nota: Letras diferentes na coluna indicam diferenças significativas para α = ≤ 0,05.

Em Castanea sativa, a densidade estomática não diferiu significativamente nas plantas

cultivadas in vitro em recipientes vedados com e sem membrana porosa, mas em recipientes

mais ventilados exibiram estômatos com menor abertura e com formato elíptico. O interior dos

recipientes exibiu a mesma PPFD (50 µmol m-2 S-1) (SÁEZ et al., 2012b). Já em Solanum

tuberosum L. cv. Sandy (Solanaceae), a densidade estomática foi menor nas folhas

desenvolvidas em recipientes com mais ventilação (tampa de polipropileno com membrana

microporosa). Além disso, os estômatos ficaram elípticos, com ostíolos apresentando menor

abertura. Nas folhas desenvolvidas em recipientes não ventilados (tampa de polipropileno sem

34

membrana microporosa) a densidade estomática foi maior e os estômatos ficaram mais esféricos

e com maior abertura do poro. A lâmina foliar exibiu ainda mesofilo formado por células de

formatos irregulares, grandes espaços intercelulares e sistema vascular pouco desenvolvido.

Comparativamente, em recipientes com mais ventilação, a lâmina foliar ficou mais espessa, com

mesofilo diferenciado e poucos espaços intercelulares (MOHAMED & ALSADON, 2010).

4.4 CARACTERÍSTICAS ULTRAESTRUTURAIS DAS PLANTAS DESENVOLVIDAS IN

VITRO

A ultraestrutura de algumas organelas pode ser influenciada pela condição in vitro,

quando comparada a de plantas crescidas em casa de vegetação ou em ambiente natural.

Segundo Wetzstein & Sommer (1982) mudanças no metabolismo celular ocorrem,

provavelmente, associadas às alterações no citoplasma e no desenvolvimento de organelas,

durante transição do desenvolvimento heterotrófico paro o autotrófico.

Em Liquidambar styraciflua as folhas das plantas desenvolvidas no campo e as folhas das

plantas aclimatizadas possuem as células do mesofilo com ampla área citoplasmática, contendo

mitocôndria, dictiossomos, cloroplastos, pequenos vacúolos e considerável quantidade de

retículo endoplasmático e ribossomos. Nas folhas desenvolvidas in vitro, também foram

observadas essas organelas, contudo, menos numerosas. O vacúolo apresentou-se proeminente

com citoplasma reduzido e restrito a área parietal da célula (WETZSTEIN & SOMMER, 1982).

Os cloroplastos de Lamium album L. (Lamiaceae) desenvolvida in situ (habitat natural)

possuem tilacóides e grana bem estruturados, enquanto nas folhas das plantas desenvolvidas in

vitro, os cloroplastos são arredondados, com sistema interno de membranas de aspecto ondulado.

Esses cloroplastos possuem também estroma com grandes áreas sem tilacóides, lamelas do

estroma parcialmente fragmentadas e ausência de grãos de amido (KAPCHINA-TOTEVA et al.,

2014), o que pode estar associado à baixa taxa fotossintética. De acordo com Hazarika (2006)

plantas cultivadas in vitro possuem baixo desenvolvimento do aparato fotossintético. Outros

autores, entretanto, relataram a presença de grãos de amido nos cloroplastos de Rosa multiflora

L. cv. Montse (Rosaceae) cultivada in vitro, observando aumento em número e tamanho dos

grãos de amido com o aumento do nível de sacarose em 1%, 3% e 5% no meio de cultura

(CAPELLADES et al., 1991). Na ultraestrutura foliar de Liquidambar styraciflua desenvolvida

in vitro os cloroplastos apresentaram formato achatado e ausência de grãos de amido (LEE et al.,

1985).

35

Os cloroplastos de Castanea sativa propagada em viveiro possuem o dobro do tamanho

dos cloroplastos das plantas cultivadas in vitro. Não foi possível distinguir claramente a

delimitação do grana nos cloroplastos desenvolvidos in vitro, enquanto em folhas de viveiro os

cloroplastos possuem grana facilmente delimitado (SÁEZ et al., 2012a). Foram observados

resultados similares para o tamanho dos cloroplastos em Jatropha curcas cultivada in vitro, onde

a menor área dos cloroplastos pode indicar senescência precoce das folhas. O vacúolo, o núcleo e

mitocôndrias ficaram ultraestrutualmente semelhantes (RODRIGUES et al., 2014).

Plastoglóbulos são corpos lipídicos encontrados em diferentes frequências e tamanhos em

todos os plastídios (AUSTIN et al., 2006; LICHTENTHALER, 2013). Nos cloroplastos são

acoplados aos tilacóides e constituem um subcompartimento que contém enzimas envolvidas na

biossíntese e metabolismo de lipídios. Podem conter clorofilas, carotenóides, plastoquinonas e

vitamina E, que atuam na proteção do aparato fotossintético contra radicais livres. O seu

aumento em número tem sido relatado em resposta ao estresse oxidativo e durante a senescência

(AUSTIN et al., 2006). Os plastoglóbulos são frequentemente observados na microscopia

eletrônica de transmissão como corpúsculos elétron densos, mas também podem ser observados

como corpúsculos elétron translúcidos. Esse último sendo mais comum em folhas de plantas

expostas a alta radiação luminosa (LICHTENTHALER, 2013). Em Castanea sativa na condição

in vitro houve baixa ocorrência de plastoglóbulos nos cloroplastos e, segundo Sáez et al.

(2012a), esse fato está associado, provavelmente, à baixa capacidade dessas plantas, de prevenir

danos oxidativos na membrana dos cloroplastos. Entretanto, Capellades et al. (1991)

encontraram grande quantidade de plastoglóbulos em Rosa multiflora cv. Montse desenvolvida

in vitro e estes foram associados à presença de clorose nas plantas.

36

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