universidad de chile facultad de ciencias físicas y ... · 1.1. antecedentes generales ... como se...
TRANSCRIPT
DESARROLLO DE COMPÓSITOS DE ÁCIDO POLILÁCTICO Y DERIVADOS DEL
GRAFITO PARA SU USO EN SCAFFOLDS PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS
INFORME FINAL INTRODUCCIÓN AL TRABAJO DE TÍTULO
PAULO ANDRÉS ARRIAGADA GONZÁLEZ
PROFESOR GUÍA:
HUMBERTO PALZA CORDERO
PROFESOR CO-GUÍA:
RAÚL QUIJADA ABARCA
MIEMBROS DE LA COMISIÓN:
JUAN ZAGAL
SANTIAGO DE CHILE
NOVIEMBRE 2014
Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas
Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología
IQ6908-1 Introducción al Trabajo de Título
i
RESUMEN EJECUTIVO INFORME FINAL INTRODUCCIÓN AL TRABAJO DE TÍTULO
AUTOR: PAULO ARRIAGADA SANTIAGO, 24 NOVIEMBRE 2014
PROF. GUIA: HUMBERTO PALZA CORDERO
“DESARROLLO DE COMPÓSITOS DE ÁCIDO POLILÁCTICO Y DERIVADOS DEL
GRAFITO PARA SU USO EN SCAFFOLDS PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS”
El trasplante de órganos y tejidos en Chile es un problema en aumento, debido a la falta
de donantes o incompatibilidades entre donador y receptor. De esta forma se hace
necesario encontrar una solución que ayude a mejorar la calidad de vida de la personas.
La ingeniería tisular trata de enfrentar este problema, otorgando desde un punto de vista
interdisiplinario materiales que sirven para el cultivo celular o de tejidos para implantes,
llamados scaffolds, o liberadores de drogas para tratamientos terapéuticos.
El desarrollo de estas estructuras involucra una optimización de las propiedades deseadas,
entre ellas biocompatibilidad, nula toxicidad, propiedades mecánicas como resistencia a
la tracción y dureza, y últimamente conductividad eléctrica.
Esta última propiedad ha sido estudiada pues se ha demostrado que aumenta la
proliferación y la diferenciación celular, gestionando de mejor forma los tejidos para
implantes.
La presente investigación se hace cargo del estudio y la fabricación de scaffolds basados
en compósitos de ácido poliláctico con grafeno, analizando su comportamiento conductor
para determinar el efecto sobre la proliferación celular, con tal de evaluar su
biocompatibilidad y uso antimicrobiano.
El plan de trabajo está definido, y se espera tener una semana de holgura en caso de
cualquier inconveniente.
ii
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................... iii
LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................................................... iv
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 1
1.1. ANTECEDENTES GENERALES ............................................................................................... 1
1.2. OBJETIVOS .................................................................................................................................. 2
1.3. ALCANCES ................................................................................................................................... 3
2. DISCUSIÓN BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................... 3
2.1. INGENIERÍA DE TEJIDOS ....................................................................................................... 4
2.2. FABRICACIÓN DE SCAFFOLDS .............................................................................................. 4
2.3. PLA EN LA INGENIERÍA DE TEJIDOS .................................................................................. 5
2.4. CONDUCCIÓN ELÉCTRICA EN LA INGENIERÍA TISULAR ............................................. 6
2.5. COMPÓSITOS DE ÁCIDO POLILÁCTICO Y GRAFENO ...................................................... 7
2.6. TOXICIDAD ................................................................................................................................. 9
2.7. USO ANTIMICROBIANO ........................................................................................................10
3. METODOLOGÍA ................................................................................................................................12
4. TRABAJO ADELANTADO ...............................................................................................................12
5. PLAN DE TRABAJO .........................................................................................................................13
6. RECURSOS Y REQUERIMIENTOS ...............................................................................................13
6.1. NO FINANCIEROS ...................................................................................................................14
6.2. FINANCIEROS ..........................................................................................................................14
7. RESULTADOS ESPERADOS ...........................................................................................................14
8. TEMARIO ESPERADO DOCUMENTO FINAL IQ6909 ..............................................................14
9. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................15
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Molécula de ácido láctico (izquierda arriba) y las dos posibles vías de
polimerización: apertura de anillos (derecha arriba) y policondensación (en diagonal
hacia la derecha)...................................................................................................................2
Figura 2: Grafeno (superior) y las posibles estructuras del carbono a las que da origen
(abajo): fulereno (izquierda), nanotubos de carbono (centro) y grafito y/o diamante
(derecha). [7]………………………………………………………………………………………………………….3
Figura 3: Conductividad v/s concentración en volumen (%) de compósitos de PLA y
óxidos de grafeno:GO (óxidos de grafeno), rGO-g (óxidos de grafeno reducidos con
glucosa), rGO-p (óxidos de grafeno reducidos con polivinilpirrolidona (PVP)). [26]….…7
Figura 4: Resistividad eléctrica v/s contenido en peso de grafito para compósitos de PLA
con grafito no exfoliado (NG) y grafito exfoliado (EG). [27]…………………………………………8
Figura 5: Módulo de Yong v/s contenido de grafito en peso para compósitos de PLA/EG
y PLA/NG. [27]………………………………………………………………………………………………………9
Figura 6: Proliferación y viabilidad celular para el polímero puro y los compósitos con
GO en concentraciones de 1% y 2% en peso. [28]……………………………………………….……..10
Figura 7: Índice de inhibición (%) para el material puro y los compósitos de PLA con GO
y GNP a distintos tiempos.[29]…………………………………….…………..…………………………….10
Figura 8: Cultivo de 24 horas para (a) S. Aureus y (b) E. Coli para distintas
concentraciones en peso de GO en una matriz de PLA/PU [30].......................................11
Figura 9: Diagrama de flujo de la metodología de la investigación...................................12
Figura 10: Carta Gantt de la investigación.........................................................................13
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
GO: óxido de grafeno.
PDLA: ácido poli-D-láctico.
PDLLA: ácido poli-D-L-láctico.
PLA: ácido poliláctico.
PLLA: ácido poli-L-láctico.
PU: poliuretano.
rGO: óxido de grafeno reducido.
TRGO: óxido de grafeno térmicamente reducido.
1
1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años el trasplante de órganos se ha transformado en un tema controversial.
Con la entrada en vigencia de la nueva Ley de Trasplantes 20.413 en el año 2010, que
establece en su Artículo 2 que “toda persona mayor de 18 años será considerada por ley
como donante, a menos que exprese su voluntad de no serlo” 1], la opinión pública se ha
dividido a favor y en contra. Aparte de esa discusión, se destaca el hecho de que el
trasplante de órganos está limitado por la cantidad de donantes y por el dinero que
cuestan los procedimientos, dejando miles de personas esperando algún trasplante. Según
cifras de la Corporación del Trasplante 2] en Chile se han realizado más de 300 trasplantes
o implantes de tejido en el período enero-octubre de 2014, que vienen de
aproximadamente 100 donantes. Además, la lista de espera actualmente es de más de
1.300 pacientes para trasplante, y más de 1.000 para implantes.
1.1. ANTECEDENTES GENERALES
Por ello surge la necesidad de crear nuevas fuentes de tejidos, como una respuesta a las
crecientes listas de espera que inundan el sistema de salud nacional. Sin embargo, para
ello es necesario un medio, ya sea para cultivar células o tejidos, o para generar implantes
funcionales. Es aquí donde nace la llamada ingeniería de tejidos, una tecnología
interdiciplinaria que combina principios de Ingeniería, Ciencia de los Materiales,
Química, Biología y Medicina. El objetivo de esta práctica es el desarrollo de reemplazos
funcionales para los tejidos y órganos que necesitan ser trasplantados. Estos tejidos son
incubados en biomateriales antes de su trasplante, los que sirven como medios temporales
donde se promueve la reorganización de las células para generar un tejido funcional [3].
Estos materiales se configuran en forma de scaffolds, que son estructuras
tridimensionales porosas. El factor importante de utilizar estos arreglos es que se fomenta
el crecimiento celular es todo el material, y no solo superficialmente como se hace en
cultivos en dos dimensiones. De esta forma se aprovecha todo el espacio disponible y se
regula de mejor manera la diferenciación, morfogénesis y la proliferación celular [4].
Un biomaterial se define como un material hecho para interaccionar con sistemas
biológicos, para evaluar, tratar, aumentar o reemplazar cualquier tejido, órgano o función
del cuerpo [5]. Dentro de este grupo se encuentran los biopolímeros, y dentro de éste, está
el ácido poliláctico (PLA). Este material es un poliéster alifático derivado de fuentes 100%
renovables, tales como remolachas de azúcar o de maíz. Es un material altamente versátil
y biodegradable, es un polímero termoestable, con un punto de fusión de 150°C y una
temperatura máxima de trabajo de 55°C. Sus propiedades son similares a las poliolefinas,
en particular al polietileno tereftalato. Se sintetiza a partir del ácido láctico mediante dos
vías: policondensación y apertura de anillos. En la Figura 1 se muestra la molécula de ácido
láctico y las dos posibles vías de polimerización. Puede presentarse en tres formas
estereoquímicas: ácido poli-L-láctico (PLLA), ácido poli-D-láctico (PDLA) y ácido poli-D-
L-láctico (PDLLA). El primero es usado extensamente en el campo biomédico debido a su
biodegradabilidad y biocompatibilidad [6], mientras que los otros dos son utilizados como
2
material en el rubro de empaques, debido a sus propiedades de barrera al paso de gases
(en envases como botellas) o su biodegradabilidad (en bolsas biodegradables).
Sin embargo, este material no será utilizado puro, sino más bien como un compósito con
grafeno. Los compósitos son materiales fabricados a partir de dos o más constituyentes
cuyo objetivo es mejorar las propiedades según el uso que se requiera. Un ejemplo es la
“fibra de vidrio”, un compósito entre una resina polimérica reforzada con fibra de vidrio,
que es ligero y tiene alta resistencia.
Figura 1: Molécula de ácido láctico (izquierda arriba) y las dos posibles vías de polimerización: apertura de anillos (derecha arriba) y policondensación (en diagonal hacia la derecha).
El grafeno es una monocapa de átomos de carbono empacados en un entramado
bidimensional en forma de panal, que es la configuración base para las demás posibles
estructuras del carbono. La Figura 2 muestra al grafeno y las posibles configuraciones a
las que da origen.
1.2. OBJETIVOS
General
Estudiar el efecto de agregar derivados del grafito en una matriz de ácido
poliláctico densa y como scaffold sobre las propiedades eléctricas y su
relación con aplicaciones biomédicas.
Específicos
3
Desarrollar compósitos de ácido poliláctico y derivados del grafito y analizar
sus propiedades eléctricas.
Estudiar el efecto de la presencia de poros en las propiedades del material.
Investigar viabilidad celular, citocompatibilidad y propiedad
antimicrobiana del material denso y scaffold.
Figura 2: Grafeno (superior) y las posibles estructuras del carbono a las que da origen (abajo): fulereno (izquierda), nanotubos de carbono (centro) y grafito y/o diamante (derecha). [7]
1.3. ALCANCES
Los estudios de conductividad y biológicos serán realizados a nivel de laboratorio, por lo
que no se espera realizar la investigación en un nivel industrial. El estudio comienza en la
preparación de TRGO a partir de grafito, pasando por la fabricación de compósitos de
PLA/TRGO, fabricación de scaffolds de los compósitos, hasta estudios de conductividad y
análisis biológicos.
2. DISCUSIÓN BIBLIOGRÁFICA
4
2.1. INGENIERÍA DE TEJIDOS
Como se explicó anteriormente, la ingeniería de tejidos es un área interdisciplinaria que
se encarga de generar reemplazos funcionales para tejidos y órganos. Los poros en la
estructura del scaffold simulan el medio extracelular, sirviendo como soporte para las
células [3].
Un aspecto a considerar en la fabricación de scaffolds es que los requerimientos son
complejos. En otras palabras, que la razón de degradación, las propiedades mecánicas, la
porosidad, el tamaño de poro, la química de la superficie y la topografía deben ser
cuidadosamente controladas en la fabricación y diseños de los scaffolds. Por ejemplo, la
porosidad y forma de los poros es un factor que afecta la proliferación celular debido a la
distribución de nutrientes dentro de la estructura. Papenburg et al [8] proponen un
scaffold hecho a partir de láminas multicapas porosas apiladas una sobre otra,
encontrando que en un medio estático la difusión de los nutrientes no era la suficiente, lo
cual produjo una inhibición en la proliferación de las células. Sin embargo, la difusión en
condiciones dinámicas mejoró notablemente debido al flujo a través de los canales que
distribuía los nutrientes a gran parte del scaffold, aumentando la proliferación de las
células en todas las capas.
2.2. FABRICACIÓN DE SCAFFOLDS
Debido a lo anterior, existen numerosas técnicas para la fabricación de scaffolds, las cuales
incluyen disolución por solvente, separación de fases, espuma por gas, secado por
congelación, electrospinning, radiación laser y UV, lixiviación con sales y diseño 3D
(desarrollo por CAD/CAM). A continuación se detallan los métodos más importantes.
La disolución por solvente es el método mayormente usado para preparar scaffolds. Esta
técnica involucra la disolución del polímero en un solvente orgánico seguido de un
mezclado con gránulos cerámicos, que luego son lixiviados por disolución selectiva para
crear una matriz polimérica porosa. La ventaja es que es un método simple, y se pueden
incorporar drogas y químicos en la estructura. Sin embargo, sus limitaciones son muchas:
se pueden hacer formas simples de poros, tiene baja interconectividad entre los poros y
los solventes usados son tóxicos, lo que impide que puedan ser usados de forma segura en
ingeniería tisular [9].
Por otro lado, la separación de fases inducida térmicamente (TIPS) disminuye
rápidamente la temeperatura de una solución de polímero homogénea para solidificar el
solvente e inducir una separación sólido líquido. El solvente solidificado fuerza al
polímero a entrar en los espacios intersticiales. Usando un secador-congelador, la mezcla
es liofilizada para remover el solvente y crear la estructura porosa [9]. Se pueden producir
scaffolds de PLA y Bioglass® altamente porosos con morfología tubular y alta
interconectividad entre poros con esta técnica [10,11]. Sin embargo, la sensibilidad
respecto a estos parámetros, el uso de solventes tóxicos, la baja estabilidad mecánica y que
el tamaño de poro esté en un rango de 10-100 micrómetros son las más importantes
desventajas [12].
5
El método de electrospinning usa un campo eléctrico de alto voltaje, para formar fibras
ultra finas desde una gota de polímero fundido o de una solución a través de una boquilla.
El proceso involucra la aplicación del campo eléctrico en el extremo de un tubo capilar,
obteniéndose un polímero con carga eléctrica que se solidifica y se recoge en una superficie
con conexión a tierra. La principal desventaja de este método radica en su dificultad de
aplicación del campo eléctrico, y en el poco control de los poros, generando scaffolds
azarosos [9].
La fabricación por formación sólida libre (SFF) incluye las técnicas de sinterizado laser,
impresión 3D y modelado por deposición fundida (FDM), las cuales se basan en diseño y
manufactura por computador (CAD/CAM). Taboas et al [13] produjeron scaffolds de PLA
con poros diseñados computacionalmente en un rango de 500 a 800 micrómetros. La
principal ventaja, entonces, es el mayor control en la porosidad de la estructura, que
genera un uso mucho más específico del material. Sin embargo, las principales
desventajas radican en el hecho de que es necesario equipamiento complejo y los tiempos
de fabricación son más extensos que de las técnicas directas. En particular, la impresión
3D genera scaffolds con bajas propiedades mecánicas debido al apilamiento de varias
capas de polvo en la estructura [14].
2.3. PLA EN LA INGENIERÍA DE TEJIDOS
Por las propiedades expuestas anteriormente el PLA se utiliza en el área de la ingeniería
de tejidos, y ha sido estudiado de forma extensa en aplicaciones para la piel, nervios,
hígado, cardiovascular, cartílagos y regeneración de hueso. Por ejemplo, se han formulado
nanopartículas para la administración de fármacos de forma sostenible y constante, que
han demostrado ser efectivas para objetivos intracelulares. Asimismo, poseen un buen
control fármaco-cinético, lo que las hace útiles para la administración de un amplio rango
de agentes terapéuticos [15].
El PLA puro ha sido estudiado mayormente en aplicaciones en scaffolds biodegradables.
Sin embargo, para mejorar sus propiedades como capacidad de carga, bioactividad y
respuesta biológica se han hecho nanocompósitos de PLA. Por ejemplo, la incorporación
de Bioglass® [16] o hidroxiapatita (HA) [17] ha demostrado mejorar las propiedades
mecánicas del scaffold, además de inducir funciones bioactivas, como el enlazamiento al
hueso por la formación de capas superficiales de HA [18]. Por otra parte, Zhang et al [19]
han estudiado un compósito multifuncional usando PLLA y nanodiamantes
funcionalizados con octadecilamina (ND-ODA), obteniendo un material 800% más duro
y con un aumento de 3 veces en el módulo de Young (lo que se acerca las propiedades
mecánicas del hueso natural humano), con solo agregar un 10% en peso de ND-ODA, y sin
afectar la proliferación celular. Este último resultado es muy importante, pues es
necesario conservar la compatibilidad biológica que tiene el PLA, mejorando sus
propiedades.
Aplicaciones para la piel también han sido documentadas. Santos et al [20] han
investigado sobre membranas de PLLA densas y porosas con diferentes tamaños de poro
para potenciales aplicaciones como substratos para regeneración de piel. Se encontró que
6
los fibroblastos adjuntos a las membranas de PLLA proliferaron, produciendo moléculas
de la matriz extracelular como colágeno IV y fibronectina, lo que sugiere que estas
membranas pueden tener el potencial para ser usadas como substratos en heridas de la
piel.
Las enfermedades cardiovasculares son la mayor causa de mortalidad en Chile, con un
30% del total de fallecidos, y significa la tercera causa de invalidez. En mujeres la cifra se
incrementa, donde 1 de cada 3 fallece por este tipo de enfermedades [21]. Por ello parece
importante crear alternativas a los tratamientos actuales, de tal forma de generar
instancias y salvar más vidas, disminuyendo las cifras de muertes en el país. La ingeniería
tisular se enfoca a usar estructuras tubulares porosas, que sean biocompatibles, flexibles,
elásticas y biodegradables. Están estructuras son alimentadas por células vasculares que
son cultivadas in vitro o inmediatamente implantadas. Carfi et al. [22] han desarrollado y
caracterizado scaffolds tubulares de mezcla de PLLA y PLA para aplicaciones en ingeniería
de tejidos vasculares (VTE). Estos scaffolds exhibieron una estructura de poro abierto, con
interconectividad a lo largo de la pared, y un estudio preliminar usando células
endoteliales mostró un buen nivel de adhesión y proliferación con un desarrollo de una
monocapa vascular. Este resultado muestra una aplicación promisoria de scaffolds de PLA
en VTE.
2.4. CONDUCCIÓN ELÉCTRICA EN LA INGENIERÍA TISULAR
Las propiedades eléctricas son un importante asunto en la interacción celular, ya que la
conducción permite el intercambio de señales eléctricas entre las células en muchos tipos
de tejidos. Por ejemplo, la conducción eléctrica en el sistema cardiaco es esencial para
mantener los latidos sincronizados que bombean sangre de forma ordenada. O en el
sistema nervioso, que posee un bien conocido sistema de señales electroquímicas. En la
fabricación de scaffolds, los biomateriales conductores han sido estudiados para entender
de qué forma afectan a los campos bioeléctricos en células y tejidos para replicar la
electrofisiología natural.
Supronowicz et al [23] estudiaron el efecto de la estimulación eléctrica en nanocompósitos
de PLA y nanotubos de carbono. Cultivaron osteoblastos en la superficie del material, y lo
sometieron a una estimulación de 10 μA a 10 Hz por 6 horas al día por varios días. Los
resultados arrojaron un incremento de casi un 50% de proliferación celular después de
dos días, y más de 4 veces de aumento de la concentración de calcio extra celular después
de 21 días. Estos resultados muestran que una estimulación eléctrica en matrices
conductoras fomentan las funciones de los osteoblastos que son responsables de la
composición orgánica e inorgánica del hueso. Por otro lado, Hu et al [24] estudiaron la
estimulación eléctrica en películas conductoras de polipirrol. Obtuvieron que la
mineralización se fomentaba sin necesidad de aplicar la estimulación. Cuando se aplicó el
tratamiento eléctrico, se obtuvo una mayor promoción, encontrando un óptimo de 0.35
V/cm por 4 horas. Este resultado muestra que el material por sí mismo puede promover
la proliferación celular, y al aplicar una estimulación eléctrica, ésta se aumenta. Sin
embargo, también indica que existe un óptimo en este valor, por lo que es necesario
realizar estudios variando el voltaje y la intensidad de la estimulación.
7
Por otro lado, también se ha estudiado el efecto de campos eléctricos y la respuesta como
contracciones sincronizadas de cardiomiocitos cultivados en scaffolds de colágeno. Se
obtuvo que en solo 8 días se expresó la diferenciación cardiaca y una contracción
sincronizada a la estimulación eléctrica [25]. Este resultado demuestra la importancia del
tratamiento eléctrico del cultivo en el scaffold, permitiendo la diferenciación de las células
cardiacas y el fomento a las contracciones que se producen en el corazón.
Finalmente, es posible decir que la estimulación eléctrica juega un rol importante en la
ingeniería de tejidos, pues fomenta e incrementa la proliferación y diferenciación celular,
de tal forma que resulta interesante enfocar el estudio en esta característica.
2.5. COMPÓSITOS DE ÁCIDO POLILÁCTICO Y GRAFENO
Los biopolímeros conductores tienen extensas aplicaciones, tales como biosensores,
herramientas de microcirugía, como músculos artificiales o en conductores para la
reparación de nervios. De esta forma, es deseable impartir conductividad eléctrica a
polímeros biocompatibles y biodegradables, como el PLA. El rol de la conductividad
eléctrica dentro de la ingeniería tisular es muy importante, tal como se discutió
anteriormente, por lo que es necesario analizar la factibilidad de dotar al PLA de esa
propiedad.
Figura 3: Conductividad v/s concentración en volumen (%) de compósitos de PLA y óxidos de grafeno:GO (óxidos de grafeno), rGO-g (óxidos de grafeno reducidos con glucosa), rGO-p (óxidos de grafeno reducidos con
polivinilpirrolidona (PVP)). [26]
Los estudios realizados por Shen et al [26] se realizan sobre compósitos de PLA con óxidos
de grafeno y óxidos de grafeno reducidos con distintas sustancias. El principal resultado
8
se muestra en la Figura 3, donde se observa que los óxidos de grafeno reducidos (rGO)
aumentan casi 10 órdenes de magnitud la conductividad eléctrica a bajas concentraciones
de relleno, encontrándose el punto de percolación entre 0.5% y 1% en volumen. Además,
los autores indican que una concentración de 1.25% de rGO-g muestra una conductividad
de 2.2 S/m, lo que equivale a un semiconductor.
Por otro lado Kim y Jeong [27] muestran resultados similares para óxidos de grafeno
térmicamente reducidos (EG o TRGO). La Figura 4 muestra la resistividad eléctrica (que
es el inverso de la conductividad) v/s el contenido de relleno en peso. Se observa que el
compósito de PLA con EG a bajas concentraciones disminuye casi 10 órdenes de magnitud
la resistividad, es decir, aumenta considerablemente la conductividad eléctrica. El grafito
no exfoliado (NG) presenta también una disminución, pero a mayor concentración. El
punto de percolación se ubica entre un 3% y 5% en peso para el PLA/EG. Además, se
muestra un aumento del módulo de Young para ambos compósitos, pero es mucho más
elevado en el PLA/EG, tal como se observa en la Figura 5.
Estos resultados resultan ser bastante notorios, pues indican que es posible dotar al PLA
de conductividad eléctrica a bajas concentraciones de relleno, e incluso cambiar las
propiedades mecánicas del material.
Figura 4: Resistividad eléctrica v/s contenido en peso de grafito para compósitos de PLA con grafito no exfoliado
(NG) y grafito exfoliado (EG). [27]
9
Figura 5: Módulo de Yong v/s contenido de grafito en peso para compósitos de PLA/EG y PLA/NG. [27]
2.6. TOXICIDAD
La incorporación de relleno dentro de la matriz polimérica de PLA para hacer los
compósitos puede cambiar las propiedades del polímero, en particular su
biocompatibilidad. Esto se puede deber a que el agregado genera toxicidad en el material,
por lo que la interacción con sistemas biológicos ya no es posible. De esta forma, resulta
importante estudiar el efecto de la incorporación de grafeno en la matriz de PLA.
Joon et al [28] estudiaron este efecto al incorporar nanocapas de GO a una matriz de ácido
poli(D-L-láctico-co-glicólico) (PLGA). La Figura 6 muestra la proliferación y viabilidad de
las células respecto al material puro. Se observa que un agregado de 2% en peso de GO
aumenta en un 10% la proliferación de células, lo que se debe al cambio en las propiedades
superficiales del material.
Además, Pinto et al [29] incorporaron GO y nanoplaquetas de grafeno (GNP) para
estudiar la biocompatbilidad del material compósito. La Figura 7 muestra que el índice de
inhibición CPII es menor para el compósito de PLA/GO comparado con el polímero puro
y el compósito de PLA/GNP, es decir, la proliferación celular es mayor en PLA/GO. Esto
se debe a que la incorporación de GO a la matriz aumenta el comportamiento hidrofílico,
lo que crea una morfología superficial más adecuada para la adhesión celular.
10
Figura 6: Proliferación y viabilidad celular para el polímero puro y los compósitos con GO en concentraciones de 1%
y 2% en peso. [28]
Figura 7: Índice de inhibición (%) para el material puro y los compósitos de PLA con GO y GNP a distintos
tiempos.[29]
Estos dos resultados muestran que es posible dotar de la deseada conductividad eléctrica
al PLA, sin disminuir su biocompatibilidad, pues la toxicidad del material no se ve
afectada. Es más, se observa que la proliferación celular aumenta cuando se tiene una
concentración baja de agregado en la matriz, lo cual es un resultado destacable.
2.7. USO ANTIMICROBIANO
Los estudios de An et al [30] muestran un comportamiento antimicrobiano de compósitos
de ácido poliláctico (PLA) con poliuretano (PU) con agregados de GO. La Figura 8 muestra
que para dos tipos de bacterias el comportamiento es similar: con solo agregar un 3% en
peso de GO a la matriz polimérica se obtiene una eliminación prácticamente completa de
11
las bacterias después de 24 horas. Además, con solo 4 horas de cultivo la mitad de las
bacterias es eliminada, lo que es un resultado notable, pues la eliminación es rápida.
Por otro lado, los autores investigan la proliferación celular, obteniendo un resultado
positivo. Esto se debe a la biocompatibilidad y la propiedad hidrofílica de los óxidos de
grafeno, que promueven la interacción entre las células y el material.
Los resultados obtenidos son importantes, pues la incorporación de grafeno contiene una
doble acción: por un lado promueve la proliferación celular, y por otro reduce la acción de
bacterias en el material. Esta propiedad es la base para la utilización de estos materiales
en sistemas biológicos, pues fomenta la formación de tejido mientras que impide el ataque
de bacterias que puedan dañar tanto a los mismos tejidos como al material.
Figura 8: Cultivo de 24 horas para (a) S. Aureus y (b) E. Coli para distintas concentraciones en peso de GO en una matriz de PLA/PU [30].
12
3. METODOLOGÍA
i. La primera parte de la investigación radica en la recopilación y estudio
bibliográfico.
ii. Posteriormente viene una primera parte experimental de fabricación y análisis de
óxidos de grafeno térmicamente reducido (TRGO).
iii. La segunda parte experimental consta de la preparación de películas de compósitos
de PLA/TRGO en solución con diferentes concentraciones en peso: 0.2%, 0.5%, 1%,
2%, 3%, 4% y 5%. Además se deja un octavo compósito con concentración a
determinar dependiendo de los resultados de conductividad.
iv. Luego se realiza la medición de la conductividad eléctrica de las películas.
v. La siguiente parte experimental es la fabricación de scaffolds de los compósitos
anteriormente hechos por los métodos de liofilización e impresión 3D.
vi. Luego se mide la conductividad eléctrica de los scaffolds.
vii. Una cuarta parte experimental se relaciona con los ensayos de biocompatibilidad,
viabilidad celular y propiedad antimicrobiana a realizar sobre los scaffolds.
La Figura 9 resume la metodología a seguir en la investigación.
Figura 9: Diagrama de flujo de la metodología de la investigación.
4. TRABAJO ADELANTADO
La búsqueda bibliográfica ha sido extensa, recolectando una multitud de documentos
relacionados con el tema. Se han analizado todos para determinar la relevancia para la
investigación. El proceso ha durado 4 meses hasta la actualidad.
Actualmente la primera parte experimental está realizada, pues se han fabricado 7.5
gramos de TRGO a partir de 14 gramos de GO. Este proceso se realizó en el Laboratorio
13
de Polímeros de la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad de Chile,
durante 3 semanas.
5. PLAN DE TRABAJO
La Figura 10 muestra la carta Gantt de la investigación, indicando el trabajo realizado el
semestre primavera 2014 en el ramo IQ6908-Introducción al trabajo de Título y las
semanas del semestre otoño 2015 enmarcadas en el ramo IQ6909-Trabajo de Título.
Figura 10: Carta Gantt de la investigación.
Se observa que la búsqueda bibliográfica continúa hasta la semana 4, lo cual es una
aproximación. Esto se debe a que siempre se debe estar pendiente de buscar nueva
información que sea relevante al estudio. Además se planea realizar la fabricación y
análisis de TRGO y la fabricación y estudio de los compósitos en el marco del ramo de
Introducción al Trabajo de Título, de tal forma de adelantar trabajo y dejar más holgura
en el próximo semestre.
Por otro lado, la redacción del informe para el Trabajo de Título se hará a medida que se
realicen los trabajos experimentales y se obtengan resultados, de tal forma de disminuir
la carga de escribir todo de forma consecutiva. Además, esto deja un semana de holgura
en caso de que se necesite más tiempo para realizar alguna actividad.
6. RECURSOS Y REQUERIMIENTOS
Actividad/Semana IQ-6908 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Búsqueda bibliográfica
Fabricación TRGO
Análisis de muestras TRGO
Fabricación compósitos
Análisis de compósitos
Montaje Scaffolds
Análisis de muestras Scaffolds
Estudio biológico
Análisis de resultados
Redacción de informes
Entrega de informes
Número de Semana Trabajo de Título
14
6.1. NO FINANCIEROS
- Implementos de seguridad: delantal, gafas, mascarilla, guantes de látex.
- Reactivos: grafito, ácido sulfúrico, nitrato de sodio, permanganato de potasio y
ácido poliláctico.
- Materiales: contenedores de teflón, contenedores de vidrio.
- Equipos: estirrer, bomba de vacío, filtro, estufa, secador de vacío, horno, equipo de
liofilización, impresora 3D.
6.2. FINANCIEROS
Los implementos necesarios se encuentran en el laboratorio, y no se espera incurrir en
gastos extras para comprar materiales. Sin embargo, para ensayos iniciales se espera
ocupar PLA de baja pureza, por lo que se podría incurrir en ese gasto en el futuro.
7. RESULTADOS ESPERADOS
Debido al análisis efectuado en secciones anteriores, se espera que el compósito entre PLA
y TRGO le otorgue conductividad eléctrica al polímero sin disminuir la biocompatibilidad
de la matriz, y que el punto de percolación se encuentre alrededor del 3% en peso de
TRGO. Además, se espera que los métodos a ocupar para la fabricación del scaffold
resulten en estructuras altamente porosas y con una buena distribución de poros, más
controlables en la impresión 3D que en la liofilización.
Debido a lo expuesto, se espera que los scaffolds fabricados tengan la capacidad de
aumentar la proliferación y la viabilidad celular, por lo que puedan ser utilizados para
potenciales aplicaciones en la ingeniería tisular.
8. TEMARIO ESPERADO DOCUMENTO FINAL IQ6909
1. Portada
2. Resumen
3. Dedicatoria
4. Agradecimientos
5. Índice general
6. Índice de figuras
7. Índice de tablas
8. Lista de abreviaturas
15
9. Introducción y Objetivos
a. Introducción
b. Objetivos
10. Antecedentes generales
11. Parte experimental
12. Resultados y discusiones
13. Conclusiones
14. Bibliografía
15. Anexos
9. BIBLIOGRAFÍA
1.- Biblioteca del Congreso Nacional. Ley 20.413 [en línea] < http://www.leychile .cl/Navegar?idNorma=1010132> [consulta: 20 de noviembre de 2014].
2.- Corporacióndel Trasplante. Resúmenes anuales. <http://www.trasplante.cl/ 16 de noviembre de 2014> [consulta:20 noviembre de 2014].
3.- Tal Dvir. Brian P. timko, Daniel S. Kohane and robert langer. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. 2011:6;13-22.
4.- Tsang, K. Y., Cheung, M. C., Chan, D. & Cheah, K. S. The developmental roles of the extracellular matrix: beyond structure to regulation. Cell Tissue Res. 2010:339;93–110.
5.- Lakshmi S. Naira, Cato T. Laurencina. Biodegradable polymers as biomaterials. Prog. Polym. Sci. 2007:32;762–798.
6.- M. Savioli Lopesa, A. L. Jardinib, R. Maciel Filho. Poly (lactic acid) production for tissue engineering applications. Procedia Engineering. 2012:42;1402 – 1413.
7.- A. K. Geim and K. S. Novoselov. The Rise of Graphene. nature materials. 2007:6.
8.- Bernke J. Papenburg. Development and analysis of multi-layer scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 2009:30;6228–6239.
16
9.- I. Armentanoa, N. Bitinis, E. Fortunati, S. Mattioli, N. Rescignano, R. Verdejo, M.A. Lopez-Manchad , J.M. Kennya. Multifunctional nanostructured PLA materials for packaging and tissue engineering. Progress in Polymer Science. 2013:38;1720–1747.
10.- Boccaccini AR and Maquet V (2003). Bioresorbable and bioactive polymer/Bioglass (R) composites with tailored pore structure for tissue engineeringapplications. Compos Sci Technol. 2003:63 (16);2417–2429.
11.- Chen Q, Roether JA and Boccaccini AR. Tissue engineering scaffolds from bioactive glass and composite materials. In: N Ashammakhi, R Reis and F Chiellini (eds.) Topics in Tissue Engineering. 2008;4.
12.- Yang SF, Leong KF, Du ZH and Chua CK. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part 1. Traditional factors. Tissue Eng. 2001:7 (6);679–689.
13.- Taboas JM, Maddox RD, Krebsbach PH and Hollister SJ. Indirect solid free form fabrication of local and global porous, biomimetic and composite 3D polymer-ceramic scaffolds. Biomaterials. 2003:24 (1);181–94.
14.- Leong KF, Cheah CM and Chua CK. Solid freeform fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs. Biomaterials. 2003:24(13);2363–78.
15.- FarajiAH, Wipf P. Nanoparticles incellulardrugdelivery. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2009:17;2950–62.
16.- Caridade SG, Merino EG, Martins GV, Luz GM, Alves NM and Mano JF. Membranes of poly(DL-lactic acid)/Bioglass (R) with asymmetric bioactivity for biomedical applications. J Bioact Compat Pol. [Article]. 2012:27 (5);429–40.
17.- Georgiou G, Mathieu L, Pioletti DP, Bourban PE, Manson JAE, Knowles JC and Nazhat SN. Polylactic acid-phosphate glass composite foams as scaffolds for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res B. 2007:80B (2);322–31.
17
18.- Hench LL, Splinter RJ, Allen WC and Greenlee TK (Bonding mechanisms at the interface of ceramic prosthetic materials. J Biomed Mater Res. 1972. 5 (6);117–41.
19.- Qingwei Zhang, Vadym N. Mochalin. Fluorescent PLLA-nanodiamond composites for bone tissue engineering. Biomaterials. 2011:32;87-94
20.- Santos AR, Barbanti SH, Duek EAR, Dolder H, Wada RS and Wada MLF. Vero cell growth and differentiation on poly(L-lactic acid) membranes of different pore diameters. Artif Organs. 2001:25 (1);7–13.
21.- Sociedad Chilena de Cardiología. Biblioteca Sochicar. [en línea] http://portal.sochi car.cl/ [consulta: 21 de noviembre 2014].
22.- Carfi Pavia F, Rigogliuso S, La Carrubba V, Mannella GA, Ghersi G and Brucato V. Poly lactic acid based scaffolds for vascular tissue engineering. Chem Eng Trans. 2012:27;409–14.
23.- Supronowicz PR, Ajayan PM, Ullmann KR, et al. Novel current-conducting composite substrates for exposing osteoblasts to alternating current stimulation. J Biomed Mater Res. 2002:59;499–506.
24.- Wei-Wen Hu, Yi-Ting Hsu , Yu-Che Cheng, Chuan Li, Ruoh-Chyu Ruaan, Chih-Cheng Chien . Electrical stimulation to promote osteogenesis using conductive polypyrrole films. Materials Science and Engineering C. 2014:37;28–36
25.- Gerecht-Nir S, Radisic M, Park H, Cannizzaro C, Boublik J, Langer R, et al. Biophysical regulation during cardiac development and application to tissue engineering. Int J Dev Biol 2006;50(2-3):233-43.
26.- Yuxia Shen, Tao Jing, Weijie Ren, Jiewei Zhang, Zhi-Guo Jiang, Zhong-Zhen Yu, Aravind Dasari. Chemical and thermal reduction of graphene oxide and its electrically conductive polylactic acid nanocomposites. Composites Science and Technology. 2012:72;1430–1435.
27.- Kim, I. Polylactide/Exfoliated Graphite Nanocomposites with Enhanced Thermal Stability, Mechanical Modulus, and Electrical Conductivity. Journal of Polymer Science: Part B: Polymer Physics. 2010:48;850–858.
18
28.- Joon, O. et al. Nanocomposite nanofibers of poly(D, L-lactic-co-glycolic acid) and graphene oxide. Nanosheets. Composites: Part A. 2011:42;1978–1984.
29.- Pinto, M. et al. Biocompatibility of poly(lactic acid) with incorporated graphene-based materials. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013:104;229– 238
30.- An X, HaibinMa, Bin Liu, and JizengWang. Graphene Oxide Reinforced Polylactic Acid/Polyurethane Antibacterial Composites. Journal of Nanomaterials 2013;1-7.