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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
TEMA: DETERMINACIÓN DE LA FRACCIÓN ACTIVA RESPONSABLE
DEL EFECTO HERBICIDA DEL EXTRACTO DE LAS INFLORESCENCIAS DE
Calliandra carbonaria SOBRE MALEZAS DE CULTIVOS DE QUINUA
Trabajo de investigación previo a la obtención del título de QUÍMICA DE
ALIMENTOS
Autora: Ingrid Guadalupe Toscano Cartagena
E-mail: [email protected]
Tutora: MSc. Dayana Paulina Borja Espín
E-mail: [email protected]
DMQ, mayo 2017
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AGRADECIMIENTOS
A mi tutora, MSc. Dayana Borja, por haberme impartido sus conocimientos y ser mi
guía en la realización de esta investigación y por su gran calidad humana que la hace
merecedora de mi estima y consideración.
A los distinguidos miembros del tribunal: Ing. Milene Díaz y MSc. David Chúquer,
por su invaluable soporte en las últimas etapas de este trabajo.
A mis queridos padres, por creer en mí y ser mi apoyo en cada momento de mi vida,
reiterando mi profundo amor y admiración hacia ellos por ser un ejemplo de infinita
paciencia y por tener siempre las palabras justas para levantarme los ánimos.
Al personal docente que ha sido partícipe de mi formación universitaria,
especialmente a la MSc. Lorena Goestchel, a quien considero una excelente profesional y
persona, y por quien siento una gran admiración.
Al coordinador general de los laboratorios de Agrocalidad, PhD. Luis Ramos, por
brindarme las facilidades para el desarrollo de mi tesis en la institución.
Al personal técnico de Agrocalidad: Paulette Andrade, Betty Hernández, Jorge
Irazábal, por su inestimable aporte en la consecución de los objetivos de esta investigación.
A mis compañeros/colegas de mi carrera: Gaby, Estefanía, Anita, Germania, Jenny,
Gina, Cristian, Jessica, José Luis, Richy; y a mis entrañables amigas: Mireya, Lisbeth,
Dayana, Katty, Mary, por los valiosos momentos compartidos y por hacer de su amistad
una de mis fortalezas. Ahora son una parte imprescindible en mi vida.
Y finalmente, a mi pequeña Bu, por iluminar mis días con su cariño e inocencia y por
siempre brindarme su apoyo incondicional y desinteresado.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1
CAPÍTULO 1: EL PROBLEMA ........................................................................................................ 2
1.1 Planteamiento del problema ..................................................................................................... 2
1.2 Formulación del problema ........................................................................................................ 5
1.2.1 Preguntas directrices. ......................................................................................................... 5
1.3 Objetivos de la investigación .................................................................................................... 5
1.3.1 General. .............................................................................................................................. 5
1.3.2 Específicos. ........................................................................................................................ 5
1.4 Importancia y justificación de la investigación ........................................................................ 6
CAPÍTULO 2: MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 8
2.1 Antecedentes ............................................................................................................................. 8
2.2 Fundamento teórico ................................................................................................................ 10
2.2.1 Manejo de malezas. ......................................................................................................... 10
2.2.2 Productos naturales para el manejo de malezas. .................................................................. 21
2.2.3 Uso de leguminosas como cubiertas vegetales. ............................................................... 26
2.2.4 Fraccionamiento de extractos naturales. .......................................................................... 28
2.2.5 Descripción botánica y fisicoquímica de Calliandra carbonaria. ................................... 46
2.2.6 Descripción general de Chenopodium quinoa Willd., Chenopodium album L. y Holcus
lanatus L. .................................................................................................................................. 50
2.3 Marco legal ............................................................................................................................. 54
2.4 Hipótesis ................................................................................................................................. 54
2.4.1 Hipótesis de trabajo (Hi). ................................................................................................. 54
2.4.2 Hipótesis nula (Ho). ......................................................................................................... 54
2.5 Conceptualización de variables .............................................................................................. 55
2.5.1 Variables independientes. ................................................................................................ 55
2.5.2 Variable dependiente. ...................................................................................................... 55
2.5.3 Variables de interés. ......................................................................................................... 55
CAPÍTULO 3: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ....................................................... 56
3.1 Diseño de la investigación ...................................................................................................... 56
3.2 Población y muestra ................................................................................................................ 57
3.3 Métodos y materiales .............................................................................................................. 57
vii
3.3.1 Extracción. ....................................................................................................................... 57
3.3.2 Fraccionamiento. ............................................................................................................. 58
3.3.3 Ensayos de inhibición de germinación y crecimiento radicular. ..................................... 60
3.3.4 Pruebas cualitativas de las fracciones. ............................................................................. 61
3.3.5 Cuantificación de flavonoides totales. ............................................................................. 63
3.4 Diseño experimental ............................................................................................................... 64
3.4.1 Hipótesis nulas. ................................................................................................................ 65
3.4.2 Hipótesis alternativas. ...................................................................................................... 65
3.5 Operacionalización de las variables ........................................................................................ 66
3.6 Técnicas e instrumentos de recolección de datos ................................................................... 66
3.7 Técnicas de análisis e interpretación de resultados ................................................................ 67
CAPÍTULO 4: ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ....................................... 69
4.1 Análisis estadístico del efecto de los factores de estudio sobre el indicador germinación ..... 69
4.1.1 Comparaciones de medias de los niveles del primer factor (fracción del extracto) sobre el
indicador germinación. ............................................................................................................. 70
4.1.2 Comparaciones de medias de los niveles del tercer factor (tipo de semilla) sobre el
indicador germinación. ............................................................................................................. 71
4.1.3 Efecto de las interacciones entre los factores sobre el indicador germinación. ............... 72
4.2 Análisis estadístico del efecto de los factores de estudio sobre el indicador crecimiento
radicular ........................................................................................................................................ 74
4.2.1 Comparaciones de medias de los niveles del primer factor (fracción del extracto) sobre el
indicador crecimiento radicular. ............................................................................................... 74
4.2.2 Comparaciones de medias de los niveles del segundo factor (método de extracción)
sobre el indicador crecimiento radicular. .................................................................................. 75
4.2.3 Comparaciones de medias de los niveles del tercer factor (tipo de semilla) sobre el
indicador crecimiento radicular. ............................................................................................... 77
4.2.4 Efecto de las interacciones entre los factores sobre el indicador crecimiento radicular. . 78
4.3 Resultados de las pruebas cualitativas de las fracciones ........................................................ 80
4.4 Cuantificación de flavonoides ................................................................................................ 84
CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES....................................................... 86
5.1 Conclusiones ........................................................................................................................... 86
5.2 Recomendaciones ................................................................................................................... 87
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 88
ANEXOS .......................................................................................................................................... 96
A. Diagrama de Ishikawa (espina de pescado) ............................................................................. 96
B. Diagrama de flujo..................................................................................................................... 97
C. Instrumentos de recolección de datos ...................................................................................... 98
viii
C1. Guía de observación (porcentaje de germinación). ............................................................ 98
C2. Guía de observación (crecimiento radicular). .................................................................... 99
D. Tabla de medias por mínimos cuadrados para germinación con intervalos de confianza del
95,0% .......................................................................................................................................... 100
E. Tabla de medias por mínimos cuadrados para crecimiento radicular con intervalos de
confianza del 95,0%.................................................................................................................... 101
F. Fotografías del proceso realizado y de los resultados obtenidos ............................................ 102
F1. Acondicionamiento de la muestra. ................................................................................... 102
F2. Obtención de los extractos crudos. ................................................................................... 102
F3. Análisis de alcaloides (fracción 1). ................................................................................... 103
F4. Análisis de esteroles, flavonoides, antraquinonas, taninos y saponinas (fracciones 2, 3 y 4).
................................................................................................................................................ 104
F5. Análisis de sesquiterpenolactonas, coumarinas, heterósidos cardiotónicos (fracción 5). . 105
F6. Concentración en el rotavapor. ......................................................................................... 105
F7. Dosificación de las fracciones. ......................................................................................... 106
F8. Ensayos cualitativos de las fracciones. ............................................................................. 106
F9. Ensayos de inhibición (fracciones del extracto crudo etanólico). .................................... 108
F10. Ensayos de inhibición (fracciones del extracto obtenido con nitrógeno líquido). .......... 112
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Principales grupos de herbicidas y funciones de las malezas a las que afectan. .............. 14 Tabla 2: Mecanismos y modos de acción de los principales grupos de herbicidas. ........................ 15 Tabla 3: Valores de DL50 de algunos herbicidas. ............................................................................. 18 Tabla 4: Usos y mecanismos/modos de acción de productos usados como herbicidas en la
agricultura orgánica. ........................................................................................................................ 22 Tabla 5: Compuestos químicos identificados en diferentes especies de leguminosas. ..................... 27 Tabla 6: Polaridad y estructura molecular de los principales solventes orgánicos. ....................... 30 Tabla 7: Sistemas de solventes utilizados comúnmente para TLC. .................................................. 32 Tabla 8: Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos. ........................................ 33 Tabla 9: Caracterización taxonómica de Calliandra carbonaria. ..................................................... 47 Tabla 10: Caracterización taxonómica de Chenopodium quinoa Willd. ......................................... 50 Tabla 11: Caracterización taxonómica de Chenopodium album L. ................................................. 51 Tabla 12: Caracterización taxonómica de Holcus lanatus L............................................................ 53 Tabla 13: Fases móviles y reveladores que se utilizaron en la TLC de cada fracción obtenida. .... 61 Tabla 14: Ensayos fitoquímicos que se realizaron en cada fracción. .............................................. 62 Tabla 15: Factores de estudio y niveles. .......................................................................................... 64 Tabla 16: Matriz de operacionalización de variables. ..................................................................... 66 Tabla 17: Análisis de varianza para la evaluación de la germinación de las semillas de quinua,
falsa quinua y holco aplicando siete fracciones de los extractos de C. carbonaria obtenidos por dos
métodos de extracción. ..................................................................................................................... 69 Tabla 18: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para porcentaje de germinación por fracción del
extracto aplicada sobre las semillas. ................................................................................................ 70 Tabla 19: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para porcentaje de germinación por tipo de
semilla. .............................................................................................................................................. 71 Tabla 20: Análisis de varianza para la evaluación del crecimiento radicular de las semillas de
quinua, falsa quinua y holco aplicando siete fracciones de los extractos de C. carbonaria obtenidos
por dos métodos de extracción. ........................................................................................................ 74 Tabla 21: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para crecimiento radicular por fracción del
extracto aplicada sobre las semillas. ................................................................................................ 75 Tabla 22: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para crecimiento radicular por método de
obtención del extracto....................................................................................................................... 76 Tabla 23: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para crecimiento radicular por tipo de semilla.
.......................................................................................................................................................... 77 Tabla 24: Lista de cotejo con los resultados de los ensayos fitoquímicos para las fracciones
correspondientes al extracto obtenido mediante maceración etanólica. ......................................... 80 Tabla 25: Lista de cotejo con los resultados de los ensayos fitoquímicos para las fracciones
correspondientes al extracto obtenido con nitrógeno líquido. ......................................................... 81 Tabla 26: Lista de cotejo con los resultados de la cromatografía en capa fina para las fracciones
de los dos extractos. .......................................................................................................................... 82 Tabla 27: Características de las manchas identificadas en la cromatografía de capa fina de la
fracción 3 proveniente del extracto obtenido por maceración etanólica. ........................................ 83 Tabla 28: Características de las manchas identificadas en la cromatografía de capa fina de la
fracción 3 proveniente del extracto obtenido con nitrógeno líquido. ............................................... 83
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Tabla 29: Datos bibliográficos de las características de algunos flavonoides en cromatografía de
capa fina (fase móvil: butanol-ácido acético-agua 4:1:5). .............................................................. 83 Tabla 30: Valores de absorbancia obtenidos de la lectura de absorbancia de 6 soluciones
etanólicas estándar de quercetina de concentraciones: 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,0625 mg/mL.
.......................................................................................................................................................... 84 Tabla 31: Valores para el cálculo de la densidad de la fracción 3 del extracto obtenido con
nitrógeno líquido. ............................................................................................................................. 85
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Estructuras químicas del glifosato y paraquat. .................................................................. 3 Figura 2: Estructuras químicas del alachlor y linuron (ingrediente activo del afalon). ................... 7 Figura 3: Estructura química del DNOC. .......................................................................................... 8 Figura 4: Estructura química del amino triazol. .............................................................................. 11 Figura 5: Estructuras químicas del 2,4,5 T, amitrole y dinoseb. ..................................................... 17 Figura 6: Estructuras químicas de algunos ácidos grasos usados en preparaciones de herbicidas
orgánicos. ......................................................................................................................................... 21 Figura 7: Estructuras químicas de aleloquímicos que han demostrado efecto herbicida. .............. 24 Figura 8: Estructuras químicas de la tentoxina y el sorgoleone. ..................................................... 26 Figura 9: Estructuras químicas de algunos compuestos identificados en leguminosas. .................. 28 Figura 10: Estructura química del reactivo Sudán III. .................................................................... 34 Figura 11: Estructuras generales de las aminas primarias, secundarias y terciarias. .................... 34 Figura 12: Estructuras químicas de algunos alcaloides presentes en productos naturales. ........... 35 Figura 13: Reacción de Draggendorf. ............................................................................................. 35 Figura 14: Reacción de Mayer. ........................................................................................................ 36 Figura 15: Reacción de Wagner. ...................................................................................................... 36 Figura 16: Estructuras químicas de algunas sesquiterpenolactonas. .............................................. 37 Figura 17: Reacción de Baljet. ......................................................................................................... 37 Figura 18: Estructuras químicas del hopano y del colesterol. ......................................................... 38 Figura 19: Reacción de Liebermann-Burchard. .............................................................................. 38 Figura 20: Estructuras químicas de la coumarina y algunos derivados de origen natural. ............ 39 Figura 21: Estructuras químicas de la antraquinona y la α-naftoquinona. ..................................... 39 Figura 22: Reacción de Bornträger. ................................................................................................ 40 Figura 23: Reacción del ensayo de Fehling para azúcares reductores. .......................................... 40 Figura 24: Estructura básica de las saponinas. ............................................................................... 41 Figura 25: Reacción de las saponinas con agua. ............................................................................. 41 Figura 26: Monómeros de los tres tipos de taninos. ........................................................................ 42 Figura 27: Reacción de la gelatina. ................................................................................................. 42 Figura 28: Mecanismo de reacción de condensación de la ninhidrina con una amina primaria.... 43 Figura 29: Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración. .................................... 43 Figura 30: Estructura química del ion flavilio. ................................................................................ 44 Figura 31: Clasificación de los flavonoides. .................................................................................... 44 Figura 32: Reacción de Shinoda. ..................................................................................................... 45 Figura 33: Estructura general de los cardiotónicos (R=H, aglicona; R=H, glucósido). ................ 45 Figura 34: Reacción de Kedde. ........................................................................................................ 45 Figura 35: Estructura general de los glucósidos cianogenéticos. ................................................... 46
xi
Figura 36: Hidrólisis de los glucósidos cianogenéticos. ................................................................. 46 Figura 37: Inflorescencia de Calliandra carbonaria. ........................................................................ 47 Figura 38: Estructura química del ácido hexadecanoico. ............................................................... 48 Figura 39: Estructuras químicas de algunos compuestos identificados en Calliandra
haematocephala. ............................................................................................................................... 49 Figura 40: Semillas de quinua (Chenopodium quinoa Willd.), variedad Tulcanaza. ...................... 50 Figura 41: Semillas de falsa quinua (Chenopodium album L.). ...................................................... 51 Figura 42: Semillas de holco (Holcus lanatus L.). ........................................................................... 52
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Gráfico de medias para porcentaje de germinación por fracción del extracto aplicada
sobre las semillas. ............................................................................................................................. 70 Gráfico 2: Gráfico de medias para porcentaje de germinación por tipo de semilla. ....................... 71 Gráfico 3: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del extracto y
método de extracción para el porcentaje de germinación................................................................ 72 Gráfico 4: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del extracto y tipo
de semilla para el porcentaje de germinación. ................................................................................. 73 Gráfico 5: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a método de extracción y tipo
de semilla para el porcentaje de germinación. ................................................................................. 73 Gráfico 6: Gráfico de medias para crecimiento radicular por fracción del extracto aplicada sobre
las semillas. ...................................................................................................................................... 75 Gráfico 7: Gráfico de medias para crecimiento radicular por método de obtención del extracto
crudo. ................................................................................................................................................ 76 Gráfico 8: Gráfico de medias para crecimiento radicular por tipo de semilla. ............................... 77 Gráfico 9: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del extracto y
método de extracción para el crecimiento radicular. ....................................................................... 78 Gráfico 10: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del extracto y tipo
de semilla para el crecimiento radicular. ......................................................................................... 79 Gráfico 11: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del extracto y
método de extracción para el crecimiento radicular. ....................................................................... 79 Gráfico 12: Curva de calibración. ................................................................................................... 84
xii
TEMA: Determinación de la fracción activa responsable del efecto herbicida del extracto
de las inflorescencias de Calliandra carbonaria sobre malezas de cultivos de quinua.
AUTORA: Ingrid Toscano
TUTORA: MSc. Dayana Borja
RESUMEN
Este trabajo de investigación tuvo como propósito determinar la fracción del extracto de las
inflorescencias de Calliandra carbonaria de mayor actividad herbicida. Las fracciones se
obtuvieron realizando particiones líquido-líquido con diferentes solventes a partir de los
extractos crudos de la planta, que se obtuvieron por dos métodos: trituración y maceración
con nitrógeno líquido, y extracción con etanol al 70%. El efecto herbicida de las fracciones
se determinó realizando pruebas de inhibición, tomando como parámetros de medición al
porcentaje de germinación y crecimiento radicular de semillas de quinua (Chenopodium
quinoa Willd.) y de dos malezas típicas del cultivo de quinua (Chenopodium album L. y
Holcus lanatus L.). El diseño experimental con el que se trabajó corresponde a un diseño
completamente al azar con tres factores de estudio: método de extracción, tipo de semilla y
fracción utilizada. Las fracciones también fueron analizadas cualitativamente para la
detección de grupos fitoquímicos mediante ensayos de reacciones específicas y por
cromatografía de capa fina (TLC). De acuerdo a los resultados obtenidos, la fracción que
demostró tener mayor actividad fue aquella en la que se confirmó la presencia de
flavonoides, taninos y azúcares reductores. En esta fracción se cuantificó la cantidad de
flavonoides totales, que resultó ser 2,7mg de quercetina por g de fracción, o 12,8mg de
quercetina por g de inflorescencias de C. carbonaria.
PALABRAS CLAVES: CALLIANDRA CARBONARIA, CULTIVO DE QUINUA,
FRACCIONAMIENTO, HERBICIDA, GRUPOS FITOQUÍMICOS, FLAVONOIDES.
xiii
SUBJECT: Determination of the active fraction responsible for the herbicidal effect of the
extract of the inflorescences of Calliandra carbonaria on weeds from quinoa crops.
AUTHOR: Ingrid Toscano
ADVISOR: MSc. Dayana Borja
ABSTRACT
This research aimed to determine the fraction of the extract of Calliandra carbonaria
inflorescences of higher herbicidal activity. The fractions were obtained by performing
liquid-liquid partitions with different solvents from the crude extracts of the plant, which
were obtained by two methods: trituration and maceration with liquid nitrogen, and
extraction with ethanol 70%. The herbicidal effect of the fractions was determined by
performing inhibition tests, taking as measurement parameters the percentage of
germination and root growth of quinoa seeds (Chenopodium quinoa Willd.) and two weeds
typical of quinoa crops (Chenopodium album L. y Holcus lanatus L.). The experimental
design that was applied corresponds to a completely randomized design with three study
factors: extraction method, seed type and fraction used. The fractions were also
qualitatively analyzed for the detection of phytochemical groups by specific reaction
assays and thin layer chromatography (TLC). According to the obtained results, the
fraction that demonstrated to have higher activity was the one in which the presence of
flavonoids, tannins and reducing sugars was confirmed. In this fraction, the concentration
of total flavonoids was quantified, which resulted to be 2,7 mg of quercetin per g of
fraction, or 12,8 mg of quercetin per g of C. carbonaria inflorescences.
KEY WORDS: CALLIANDRA CARBONARIA, QUINOA CROPS, FRACTIONATION,
HERBICIDE, PHYTOCHEMICAL GROUPS, FLAVONOIDS.
1
INTRODUCCIÓN
El tema que se desarrolló en esta investigación corresponde a la determinación de la
fracción activa responsable del efecto herbicida del extracto de las inflorescencias de
Calliandra carbonaria sobre malezas de cultivos de quinua.
En el capítulo 1 “El Problema”, se desarrolla el planteamiento y la formulación del
problema, en donde se establece la descripción, el análisis y la delimitación del problema.
También se señala el objetivo general, los objetivos específicos y la importancia y
justificación de esta investigación.
En el capítulo 2 “Marco teórico”, se describen los antecedentes de la investigación, en
donde se reportan algunos trabajos relacionados y se menciona el trabajo precedente que
constituyó el punto de partida para esta investigación. Se desarrolla el fundamento teórico
a manera de una recopilación bibliográfica acerca de los conceptos que se desprenden del
tema de este estudio. En el marco legal se recogen algunas políticas que amparan el
desarrollo de este tema. Se realiza además, la conceptualización de las variables de la
investigación y las hipótesis de trabajo y nula.
El capítulo 3 “Marco metodológico”, ofrece una descripción del diseño de la
investigación y se define el paradigma, nivel y tipo de la misma. Se señalan los métodos,
procedimientos y materiales que se utilizaron para la ejecución de este estudio y se
presenta la matriz de operacionalización de variables. También se mencionan las técnicas e
instrumentos tanto para la recolección de datos como para el análisis e interpretación de los
resultados que se obtuvieron.
En el capítulo 4 “Análisis e interpretación de resultados”, se exponen los resultados
obtenidos del análisis estadístico, así como de los ensayos cualitativos aplicados a las
fracciones correspondientes a los dos extractos con los que se trabajó y la concentración de
flavonoides determinada en la fracción de mayor actividad.
Finalmente, en el capítulo 5 “Conclusiones y recomendaciones”, se resumen las
conclusiones de esta investigación en base a los objetivos planteados inicialmente y las
recomendaciones para análisis futuros referentes al tema.
2
CAPÍTULO 1: EL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
La utilización de productos agroquímicos; incluyendo plaguicidas como: fungicidas,
rodenticidas y antibióticos; se considera necesaria como medio de protección de los
cultivos, de plagas que podrían constituir un riesgo para la eficiencia de los mismos.
Incluso en la agricultura “orgánica”, cuando prácticas culturales para el manejo de
plagas, como la selección y rotación del cultivo y la utilización de barreras físicas, no
muestran efectividad, los agricultores están autorizados a utilizar plaguicidas que incluyen
algunos compuestos formulados sintéticamente (Hollyer et al., 2013).
La OMS (2015) considera que los plaguicidas son potencialmente tóxicos para los
seres humanos con efectos perjudiciales para la salud, como “provocar cáncer o acarrear
consecuencias para los sistemas reproductivo, inmunitario o nervioso”. El nivel de
toxicidad que pueden desarrollar depende de varios factores (como la dosis de exposición y
la vía por la cual se produce la exposición).
Hasta el 2005, la OMS reportaba que el uso de plaguicidas provoca unas 70 000
muertes por envenenamiento cada año, y al menos siete millones de casos de enfermedades
agudas y de larga duración (OMS, 2005). En algunos países los plaguicidas llegaron a
causar el 14% de las enfermedades ocupacionales en la agricultura y el 10% de los decesos
(Madeley, 2002).
Dentro del grupo de plaguicidas se encuentran los herbicidas, cuya función es impedir
el crecimiento de malezas indeseables en cultivos de interés. En la actualidad, su uso se
prefiere para el control de malezas, sobreponiéndose a métodos manuales o mecánicos de
deshierba. Se estima que en los países industrializados los herbicidas constituyen entre el
60-70% de pesticidas usados en la agricultura (Cutler & Cutler, 1999) y se aplican sobre el
85-100% de los cultivos principales; mientras que en países en vías de desarrollo se busca
estimular el uso de herbicidas por sus precios reducidos y la producción local, aunque por
la falta de conocimiento de los agricultores el control químico de malezas presenta varias
limitaciones a nivel técnico y cultural (Labrada et al., 1996).
El mercado mundial de herbicidas alcanzó los 2061,94 millones de dólares en el año
2016 (QY Research, 2017).
3
Dependiendo de su modo de acción (pre-emergente, emergente o post-emergente), los
herbicidas pueden aplicarse antes, durante o después de la siembra. Esto conlleva a un
considerable riesgo de contaminación tanto ambiental como del ser humano, al ser
susceptibles a acumularse sus residuos tóxicos en el agua y en el suelo y ser potenciales
contaminantes químicos en los alimentos productos de los cultivos.
Si bien, al uso de herbicidas de origen sintético se le atribuye beneficios tales como:
acción inmediata y efecto residual (por ser de degradación lenta), poca sensibilidad a
factores ambientales (pH, temperatura, radiación UV, humedad), amplia producción a nivel
mundial, etc. (Macías, 2012), su utilización podría derivar en desventajas a mediano y
largo plazo.
Los herbicidas sintéticos más utilizados son el 2,4-D, la atrazina, el glifosato, el
glufosinato de amonio, el paraquat, la pendimetalina, la dicamba, el fluroxypyr y el
metalochlor (QY Research, 2017). Estos herbicidas se consideran efectivos en el control de
malezas pero poco generosos con el medio ambiente y la salud humana.
Glifosato
Paraquat (diclorado e hidratado)
Figura 1: Estructuras químicas del glifosato y paraquat.
Fuente: Sigma-Aldrich
Se han reportado efectos negativos como consecuencia de la acción residual de
algunos herbicidas de origen sintético. Entre estos efectos se encuentran la contaminación
de aguas y suelo, bioacumulación en órganos y tejidos de peces, moluscos y otros animales
(Gunkel & Streit, 1980), además de provocar desequilibrios en la biodiversidad al ser poco
selectivos y ejercer su acción tanto sobre las malezas indeseables como en los cultivos de
interés (fitotoxicidad al cultivo) o cultivos subsiguientes (Hollyer et al., 2013). Su poca
selectividad ha conducido al desarrollo de cultivos transgénicos, como la soja resistente al
glifosato (Labrada, 2004), cuyas consecuencias en la salud humana continúan siendo
inciertas. Por su acción residual también presentan un mayor riesgo de dejar residuos en los
productos de agricultura.
4
El uso de herbicidas de origen sintético incrementa el riesgo de generación de
resistencia en las malezas, lo que con el tiempo conlleva a utilizar dosis mayores del
herbicida para „mejorar‟ la efectividad y, en el peor de los casos, a su uso indiscriminado
sobre los cultivos.
Los herbicidas de origen natural constituyen una alternativa que apantalla algunas de
las desventajas de los herbicidas de origen sintético. Debido a su degradación rápida y
biodegradabilidad se les atribuye un menor riesgo de dejar residuos en alimentos, menor
riesgo de generar resistencia y fitotoxicidad, ser menos agresivos con enemigos naturales y
no dejar residuos tóxicos (Macías, 2012). Aunque se han reportado casos (por ejemplo, el
sorgoleone) en los que principios activos que actúan como herbicidas naturales pueden
provocar alergias, como la dermatitis (Inderjit & Mallik, 2002). Es por esto que dentro de
los estudios referentes a la producción de herbicidas naturales se deben incluir aspectos
como determinación de los componentes activos, mecanismos de defensa, toxicidad,
alternativas de síntesis, semisíntesis, etc.
La acción de los herbicidas naturales se atribuye principalmente a la producción de
agentes alelopáticos (metabolitos producidos por plantas, algas, bacterias y hongos que
tienen influencia sobre el crecimiento y desarrollo de sistemas biológicos y de agricultura)
de las plantas (Cutler & Cutler, 1999) como mecanismos de defensa ante situaciones de
estrés. La identificación de estos metabolitos constituye una fuente potencial para el
desarrollo de herbicidas de origen natural que podrían llegar a reemplazar a algunos de los
que hoy en día son de uso común en las prácticas agroquímicas.
Algunas plantas pertenecientes a la familia de las leguminosas se usan como cubiertas
vegetales en prácticas culturales de manejo de malezas, debido a que se ha observado que
muchas de ellas producen metabolitos secundarios que ejercen un efecto inhibitorio sobre
el crecimiento radicular de otras plantas consideradas como malezas (Kelton et al., 2012).
En la actualidad se hace énfasis en la proyección de la agricultura como potenciador
social y económico, por lo que es imperativo realizar investigaciones que se ajusten a los
requerimientos para la implementación de alternativas ecológicas y sostenibles, tanto para
productores como para trabajadores y consumidores, en procesos agroquímicos como el
control y manejo de plagas. Sin estas investigaciones se limita el marco de alternativas al
uso y/o mantenimiento de prácticas que se consideran riesgosas a nivel de salud pública y
de equilibrio ambiental.
5
1.2 Formulación del problema
¿Cuál es la fracción activa responsable del efecto herbicida del extracto de las
inflorescencias de Calliandra carbonaria y cuáles son los grupos fitoquímicos presentes en
ella?
1.2.1 Preguntas directrices.
¿Cómo acondicionar la muestra para su extracción?
¿Qué método debe seguirse para obtener el extracto crudo?
¿Cómo fraccionar el extracto crudo?
¿Cómo identificar los grupos fitoquímicos presentes en el extracto y sus
fracciones?
¿Cómo evaluar la actividad herbicida del extracto y sus fracciones?
¿Qué tratamiento previo debe aplicarse al material vegetal y de laboratorio para las
pruebas de actividad?
¿Cómo determinar la fracción más activa del extracto?
1.3 Objetivos de la investigación
1.3.1 General. Determinar la fracción activa responsable del efecto herbicida del
extracto de las inflorescencias de Calliandra carbonaria sobre malezas del cultivo de
quinua e identificar los grupos fitoquímicos presentes en ella.
1.3.2 Específicos.
Evaluar dos métodos de extracción para la obtención de los extractos crudos y las
fracciones de los mismos obtenidas mediante particiones líquido-líquido con
solventes de distinta polaridad.
Identificar los grupos fitoquímicos presentes en las fracciones mediante
cromatografía en capa fina y ensayos con reacciones específicas.
Valorar la actividad herbicida de los extractos y sus fracciones mediante pruebas de
inhibición de germinación y de crecimiento radicular en semillas del cultivo
principal (quinua) y de dos malezas del cultivo (falsa quinua y holco).
6
1.4 Importancia y justificación de la investigación
La OMS (2015) estima que “los alimentos insalubres que contienen bacterias, virus,
parásitos o sustancias químicas nocivas causan más de 200 enfermedades, que van desde la
diarrea hasta el cáncer”. Es por esto que dicho organismo recomienda adoptar prácticas a lo
largo de toda la cadena agroalimentaria que reduzcan el riesgo de contaminación de los
alimentos, cuya inocuidad debería ser asignada dentro del rango de prioridad de salud
pública. Los estudios acerca de productos agroquímicos ecológicos y sostenibles se
vislumbran como un paso importante para la adopción de las prácticas aludidas. Es
imperativo fomentar este tipo de estudios para reducir gradualmente la producción y
utilización de plaguicidas potencialmente riesgosos.
Cutler & Cutler (1999) señalan que los agentes alelopáticos aislados de plantas o
microorganismos “son una fuente potencial para modelos de nuevos tipos estructurales de
herbicidas”. En los últimos años el número de investigaciones acerca de posibles fuentes
de plaguicidas naturales ha ido en aumento, así como estudios complementarios más
detallados en los que se identifican los ingredientes activos mediante diversos métodos. La
identificación de dichos ingredientes activos supone un punto de partida para estudios
posteriores que definan uno de los factores que, según Dayan et al. (2011), constituyen una
limitación para la amplificación del uso de herbicidas naturales: “sus mecanismos de
acción sin especificar”.
Esta investigación pretende servir de punto de partida para los estudios mencionados y
se presenta como una continuación de la investigación realizada por Hernández (2015),
quien demostró el efecto herbicida del extracto de las inflorescencias de Calliandra
carbonaria en dos malezas típicas del cultivo de quinua (Chenopodium quinoa Willd).
Además de exhibir los beneficios de un herbicida natural, dicho extracto ha mostrado
tener actividad selectiva contra las malezas del cultivo de quinua, lo que ofrece una
alternativa para el desarrollo de un herbicida adecuado para estos cultivos, ya que los
métodos químicos de control de malezas recomendados para la quinua son muy limitados.
Galwey (1989) referido por Jacobsen & Risi (2001) señala que en el Ecuador se ha
utilizado el herbicida alachlor en plantaciones comerciales de quinua. El uso de este
herbicida es restringido en Estados Unidos (Delaware Health and Social Services, 2015) y
prohibido en la Unión Europea tras haberse encontrado concentraciones de sus metabolitos
superiores al límite aceptable en aguas subterráneas (Quevauviller et al., 2009). Peralta
(2009) recomienda el uso de afalon y alachlor (figura 2) como control químico de malezas
en los cultivos de quinua. Afalon se considera tóxico para peces, crustáceos, aves y abejas
(Adama Essentials) y al ser de acción residual se ha reportado que su persistencia en los
suelos de varios cultivos perjudica a los microorganismos presentes en los mismos. En uno
de estos reportes se señala la reducción de la biomasa y de la actividad enzimática de
microorganismos del suelo del cultivo de soya (Nowak et al., 2008).
7
Alachlor
Linuron
Figura 2: Estructuras químicas del alachlor y linuron (ingrediente activo del afalon).
Fuente: Feigenbrugel et al. (2005)
Hernández (2015) recomienda “identificar y caracterizar los compuestos e
ingredientes activos de las inflorescencias de Calliandra carbonaria que producen efectos
alelopáticos”. En base a los resultados que esta investigación arroje, posteriormente
podrían estudiarse formas de formular un herbicida a partir del extracto de las
inflorescencias de Calliandra carbonaria.
8
CAPÍTULO 2: MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes
La síntesis de los primeros herbicidas se remonta al año 1932 en Francia, con la
patente del DNOC (4-6-dinitro-o-cresol; figura 3), y con la aparición de otros
dinitrocresoles y dinitrofenoles cuya selectividad demostró ser muy variable al afectar
tanto a animales como a plantas (Cobb & Reade, 2011).
Figura 3: Estructura química del DNOC.
Fuente: Sigma-Aldrich
A partir de que en el año 1941 se sintetizó el ácido 2,4-diclorofenoxiacético, nuevos
herbicidas comenzaron a sintetizarse hasta que en 1949 se desarrollaron los primeros
aceites minerales herbicidas. Desde el año 1950 el uso de herbicidas sintéticos se
intensificó y se ha mantenido hasta la actualidad (Macías, 2012).
Bhadoria (2011) señala que “la resistencia a específicos herbicidas sintéticos se ha
incrementado dramáticamente en las últimas dos décadas”. Esta es una de las razones por
las que se han intensificado los estudios acerca del aprovechamiento de las propiedades
9
alelopáticas de las plantas como alternativa para la introducción de herbicidas naturales en
procesos agrícolas.
La alelopatía fue definida en 1984 por Rice como “la ciencia que estudia procesos, en
los que están involucrados metabolitos secundarios de plantas y microorganismos,
afectando el crecimiento y el desarrollo de sistemas biológicos”. Qasem & Foy (2001)
referidos por Macías et al. (2004) indican que existen cerca de 240 especies de plantas con
propiedades alelopáticas que interfieren con el crecimiento y producción de cultivos.
Bhadoria (2011) reportó las propiedades alelopáticas del arroz (Oryza sativa L.), trigo
(Triticum aestivum L.), pepino (Cucumis sativus L.), mostaza negra (Brassica nigra L.),
alforfón (Fagopyrium esculentum L.), trébol (Trifolium spp.), trébol de olor (Melilotus
spp.), avena (Avena sativa L.) y sorgo (Sorghum bicolor L.); que se ha demostrado que
ejercen acción herbicida contra ciertas especies de hierbas. El autor ofrece este reporte
como una compilación de diversos estudios realizados desde el año 1986.
Tworkoski (2002), de la Estación de Investigación de frutas de los Apalaches (USDA-
ARS), estudió el efecto herbicida de los aceites esenciales de canela (Cinnamomum
zeylanicum L.), clavo de olor (Syzgium aromaticum), tomillo rojo (Thymus vulgaris) y
ajedrea de jardín (Satureja hortensis). En el estudio también se determinó el principio
activo del aceite esencial de la canela mediante cromatografía de gases y espectrometría de
masas.
En la India, Yadav & Yadava (2012), de la Universidad de Sagar, demostraron el
efecto alelopático negativo de extractos de Phaseolus trilobus Ait. y Albizzia
Odoratissima Benth., y positivo de Tephrosia purpurea Linn. y Prosopis spicigera Linn.,
especies pertenecientes a la familia de las leguminosas. Los autores concluyen que estas
especies pueden usarse como herbicidas naturales y que sus “(agentes) químicos
responsables pueden aislarse y refinarse para usos comerciales”.
En Ecuador, Hernández (2015), de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la
Calidad del Agro (AGROCALIDAD), demostró la actividad herbicida de los extractos de
Calliandra carbonaria y Vicia faba L. sobre malezas típicas de cultivos de quinua
(Chenopodium quinoa Willd): falsa quinua (Chenopodium album L.) y holco (Holcus
lanatus L.). En el estudio se concluyó que los extractos de flores de Calliandra carbonaria
10
demostraron los efectos más representativos, inhibiendo las malezas mencionadas sin
afectar la germinación y el crecimiento radicular de las semillas de quinua.
2.2 Fundamento teórico
2.2.1 Manejo de malezas.
Las malezas pueden definirse como plantas que crecen de forma indeseable (en
presencia cantidad, lugar) en los cultivos y que pueden interferir en su manejo y
operatividad. La presencia de malezas en los cultivos dificulta el uso de la maquinaria y
por tanto hace que sus costos se eleven.
La competición entre el cultivo y las malezas puede provocar una reducción en la
calidad del cultivo al alterar características en la fisiología de las plantas de interés que las
hacen menos deseables para el consumidor.
Además, las malezas pueden servir como reservorios de pestes y agentes patógenos en
los cultivos, causando problemas por contaminación (Cobb & Reade, 2011).
En los sistemas agrícolas se opta por un manejo integrado de plagas, que Labrada et
al. (1996) definen como el sistema que, “en el contexto de la asociación del medio y la
dinámica poblacional de las plagas, utiliza todas las técnicas y métodos adecuados de
forma compatible, manteniendo las poblaciones nocivas a niveles por debajo de aquellos
causantes de daño económico”.
Dentro de estas técnicas y métodos se encuentra el manejo de malezas, que incluye
métodos preventivos, físicos y culturales, así como control químico (a través del uso de
herbicidas), control biológico y otros métodos no convencionales (Labrada et al., 1996).
La elección de los métodos adecuados para el control y manejo de malezas toma en
cuenta factores como: las especies de malezas predominantes en el cultivo, el área y
localización de la invasión, el estado de desarrollo de las malezas y su interacción con el
cultivo, el equipo disponible para el control y las condiciones ambientales en las que se
desarrolla el control (Gómez, 1995).
Con respecto a la distribución global de las malezas, Cobb & Reade (2011) señalan
que:
En una base global cerca de 250 especies son lo suficientemente problemáticas como para
ser consideradas malezas, representando aproximadamente el 0,1% de la flora mundial.
De estas, el 70% se encuentran en 12 familias, el 40% son miembros de Gramineae y
Compositae. Interesantemente, 12 cultivos de 5 familias proveen el 75% de los alimentos
en el mundo y las mismas 5 familias proveen muchas de las peores malezas.
11
Por la persistencia de las malezas en los cultivos más importantes, los sistemas
agrícolas deben incluir en sus prácticas un plan de manejo de malezas. En la actualidad, el
éxito de estas prácticas se debe en gran parte al uso de métodos químicos para su control
(Dayan et al., 2009).
2.2.1.1 Control químico para el manejo de malezas.
Carballo & Guharay (2004) señalan que: “el primer método de control químico de
malezas ocurrió en 1896, cuando el sulfato de hierro fue utilizado para matar una maleza
de hoja ancha en cultivos de cereales”. Los autores también manifiestan que en esos años
el uso de métodos químicos no tuvo mayor repercusión en la agricultura debido a que la
mano de obra era barata.
Los métodos químicos empezaron a reemplazar considerablemente a otros métodos
para el manejo de malezas desde la década de 1940, cuando empezaron a desarrollarse
herbicidas sintéticos (Singh et al., 2006).
El uso de estos herbicidas en cierta forma compensa los problemas que se generan por
la diseminación de semillas de malezas por los métodos de transporte y otros métodos
agrícolas, brindando una opción más efectiva para su control (Crafts, 1975). Sin embargo,
aspectos que en los primeros años de uso de herbicidas sintéticos no se consideraban, como
su repercusión en el ambiente y en la salud humana, en la actualidad se refuerzan en busca
de alternativas a su uso.
Los herbicidas constituyen herramientas importantes para los sistemas de producción,
a pesar de que su uso se relaciona con problemas de contaminación de suelos y aguas y
toxicidad a los productos alimenticios (Singh et al., 2006).
Crafts (1975) señala que la aprehensión por los efectos del uso de herbicidas se
reforzó cuando inspectores de la FAO encontraron residuos de amino triazol (figura 4) en
arándanos en altas cantidades en el año 1959.
Figura 4: Estructura química del amino triazol.
Fuente: Sigma-Aldrich
12
Mecanismos de acción.
Los mecanismos de acción de los herbicidas se refieren a las interferencias
bioquímicas y/o fisiológicas causadas por un herbicida, que determinan el daño final a la
planta y tienen lugar en un determinado sitio de acción. El mecanismo de acción se incluye
dentro del modo de acción del herbicida, que es la secuencia de eventos que culmina con
algún daño en la planta (Papa, 2007).
Se distinguen herbicidas de acción sistémica y de contacto. Los primeros ejercen su
acción generalmente en lugares de la planta distintos a donde ingresaron (traslocación),
mientras que los últimos afectan la superficie en la que fueron aplicados.
En los herbicidas de acción sistémica, el ingrediente activo se absorbe por los tejidos
vegetales, transportándose a la savia a una velocidad de 10 a 100 cm/h (Macías, 2012).
La intercepción de los herbicidas por las plantas puede ocurrir mediante las partes
aéreas, como sucede con el glifosato y el paraquat (figura 1), y también a través de las
raíces, como en algunos herbicidas de acción post-emergente.
En las partes aéreas, la principal barrera para los herbicidas es la cutícula, de
naturaleza hidrófoba. Agentes tensoactivos presentes en las formulaciones de los
herbicidas facilitan su retención y penetración a través de estas barreras. Los lugares
preferenciales de entrada de los herbicidas son las células de protección de los estomas, los
pelos y los nervios foliares en las especies de hoja ancha. En el caso de los herbicidas
solubles en aceite, el problema de absorción es menor al ser capaces de penetrar fácilmente
la cutícula mediante sus componentes lipofílicos.
Los herbicidas que se aplican en el suelo pasan por procesos de adsorción a las
partículas de los componentes del suelo antes de ser absorbidos por la planta. En el suelo,
estos herbicidas se fraccionan a fase sólida, líquida y gaseosa, de las cuales las dos
primeras son aptas para su absorción.
Después de su absorción, muchos herbicidas se traslocan o distribuyen hacia otras
partes de la planta por el apoplasto (red interconectada de tejido no vivo) y el simplasto
(sistema vivo de la planta). Un herbicida que se absorbe por las raíces y se transporta por el
apoplasto, llegará a las partes aéreas de la planta; patrón que se considera ideal para los
inhibidores de la fotosíntesis (Labrada et al., 1996).
Según Labrada et al. (1996), “los herbicidas destruyen las malezas interfiriendo los
procesos bioquímicos, como la fotosíntesis, que tiene lugar en el simplasto” y que
constituye el mecanismo de acción de alrededor del 35% de los herbicidas comerciales.
Los autores clasifican a los herbicidas según los siguientes “puntos de acción”:
13
Herbicidas que interfieren con la fotosíntesis
Inhibidores de la biosíntesis de pigmentos
Inhibidores de la síntesis de lípidos
Inhibidores de la división celular
Herbicidas que imitan al ácido indolacético (AIA)
Inhibidores de la biosíntesis de aminoácidos
o Inhibidores de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos
o Inhibidores de la síntesis de glutamato
o Inhibidores de la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada
Cobb & Reade (2011) concuerdan con esta clasificación, con una modificación:
refiriéndose a los “herbicidas que imitan al ácido indolacético” de manera más general
como “herbicidas tipo auxina”; e introduciendo a la clasificación a los herbicidas que
inhiben la biosíntesis de celulosa. En la tabla 1 se recogen algunos grupos de herbicidas
cuya acción probable recae sobre los puntos de acción mencionados.
Rosales (2006) expone la clasificación que se enlista a continuación y de la que se
resumen los mecanismos de acción en la tabla 2.
Reguladores de crecimiento
Inhibidores del crecimiento de plántulas
o Inhibidores de radículas
o Inhibidores de brotes
Inhibidores de la fotosíntesis
Inhibidores de síntesis de pigmentos
Inhibidores de la síntesis de lípidos
Inhibidores de la síntesis de aminoácidos
o Inhibidores de aminoácidos ramificados
o Inhibidores de aminoácidos aromáticos
o Glufosinato
Destructores de membranas celulares
o Aceptores de electrones
o Inhibidores de la enzima PPO oxidasa
o Arsenicales orgánicos
Muchos autores coinciden en que la mayoría de herbicidas ejerce su acción sobre
algún proceso bioquímico importante para el desarrollo de la planta provocando
interferencias en la fotosíntesis, la división celular y el crecimiento. Labrada et al. (1996)
señalan que “algunos herbicidas parecen afectar más de un punto”.
14
Tabla 1: Principales grupos de herbicidas y funciones de las malezas a las que afectan.
Grupos Ejemplo Acción principal probable Función
afectada
Bipiridilos. Paraquat.
Transporte fotosintético de
electrones desviado en el
fotosistema II.
Fotosíntesis.
Anilidas, nitrilos,
triazinas, triazinonas,
ureas, uracilos.
Propanil,
bromoxynil,
atrazina,
metribuzin,
diuron,
lenacil.
Transporte fotosintético de
electrones inhibido en el
fotosistema II.
Difenil éteres. Acifluorfen. Inhibición de la síntesis de
clorofila.
Anilidas,
piridazinonas.
Diflufenican,
norflurazon.
Bloqueo de la síntesis de
carotenoides.
Ésteres de ácidos
ariloxi-fenoxi-
alcanoicos, ácidos
haloalifáticos,
oximas,
tiolcarbamatos.
Dichlofop-
metil, dalapon,
sethoxydim,
EPTC.
Inhibición de la biosíntesis
de lípidos.
Crecimiento.
Amidas, carbamatos,
cloroacetanilidas,
dinitroanilinas.
Difenamida,
asulam,
alachlor,
pendimethalin.
Inhibición de la división
celular.
Ácidos
arilcarboxílicos,
ácidos (ariloxi)
alcanoicos, ácidos
quinolino-
carboxílicos.
Dicamba; 2,4-
D, HCPA;
quinclorac.
Acción sobre el ácido indol-
acético (AIA).
Nitrilos. Bromoxynil. Desacoplamiento de la
fosforilación oxidativa.
Imidazolinonas,
sulfonilureas.
Imazethapyt,
metsulfuron.
Bloqueo de la síntesis de
aminoácidos de cadena
ramificada.
Compuestos
organofosforados.
Glifosato,
glufosinato.
Bloqueo de la síntesis de
aminoácidos aromáticos,
bloqueo de la síntesis de
glutamina.
Fuente: Labrada et al. (1996)
15
Tabla 2: Mecanismos y modos de acción de los principales grupos de herbicidas.
Clasificación Familias químicas Mecanismo de acción Modo de acción
Reguladores del
crecimiento
Fenoxicarboxílicos,
benzoicos,
piridincarboxílicos,
quinolincarboxílicos.
Mecanismos múltiples e
indeterminados. Alteran el
balance hormonal normal de las
plantas que regula procesos
como la división y
elongación celular, la síntesis
de proteínas y la respiración.
Retorcimiento de
pecíolos y tallos,
formación de
callosidades,
malformación de hojas,
necrosis y muerte de la
planta.
Inhibidores del
crecimiento de
plántulas
Dinitroanilinas,
cloroacetamidas,
tiocarbamatos.
Inhibición de la división
celular, probablemente
inhibición de la síntesis de
lípidos y proteínas.
Inhibición del desarrollo
de radículas en las
plantas, inhibición del
desarrollo de las
plántulas en procesos de
emergencia.
Inhibidores de la
fotosíntesis
Móviles: triazinas,
triazinonas, fenilureas,
uracilos. De contacto:
nitrilos, benzotiadizoles,
amidas.
Interrupción del flujo de
electrones en el fotosistema II,
formación de radicales libres
que destruyen las membranas
celulares.
Amarillamiento entre las
nervaduras de las hojas
(clorosis intervenial),
necrosis.
Inhibidores de la
síntesis de pigmentos
Isoxazolidinonas,
triazoles, isoxazoles,
piridazinonas.
Inhibición de la formación de
carotenoides y destrucción de la
clorofila.
Albinismo, desarrollo de
coloración rosa a violeta,
necrosis de hojas y
tallos.
Inhibidores de la
síntesis de lípidos
Ariloxifenoxipropionato
s y ciclohexanodionas.
Inhibición de la enzima acetil
coenzima-A carboxilasa en la
síntesis de lípidos.
Inhibición del
crecimiento,
enrojecimiento de hojas
y tallos, necrosis.
Inhibidores de la
síntesis de
aminoácidos
Sulfonilureas,
imidazolinonas,
triazolopirimidinas,
pirimidiniltiobenzoatos.
Glifosato. Glufosinato
Inhibición de la enzima
acetolactato sintetasa (ALS),
que cataliza la síntesis de los
aminoácidos esenciales valina,
leucina e isoleucina. Inhibición
de la enzima 5-enolpiruvil-
shikimato 3-fosfato sintetasa
(EPSP) en el ciclo metabólico
del ácido shikimico, lo cual
bloquea la producción de los
aminoácidos fenilalanina,
tirosina y triptófano. Inhibición
de la enzima glutamina
sintetasa en el metabolismo del
nitrógeno.
Clorosis y necrosis de
los puntos de
crecimiento, inhibición
de raíces secundarias,
enrojecimiento,
arrugamiento.
16
Tabla 2: (Continuación)
Clasificación Familias químicas Mecanismo de acción Modo de acción
Destructores de
membranas celulares
Bipiridilos,
difeniléteres, aril
triazolinonas, fenil-
phthalimidas.
Arsenicales orgánicos.
Aceptación de electrones en el
fotosistema I y formación de
compuestos de oxígeno que
destruyen las membranas
celulares. Inhibición de la
enzima PPO oxidasa en la
biosíntesis de la clorofila, lo
que origina la formación de
oxígeno simple. El mecanismo
de acción de los arsenicales
orgánicos es desconocido.
Clorosis, necrosis.
Fuente: Rosales (2006)
Toxicidad.
Según Gangstad (1989), la toxicidad de un herbicida se refiere a “‟qué tan venenoso‟
el (componente) químico es para el aplicador y/o para la población, separadamente de las
especies de hierbas o arbustos que son su blanco”.
El autor también menciona que un herbicida altamente tóxico utilizado de forma muy
diluida o por un aplicador experto puede ser menos peligroso para sí mismo, para las
personas y para el ambiente, que uno que tiene baja o moderada toxicidad y que es
aplicado sin precaución.
Labrada et al. (1996) coinciden en que los herbicidas pueden ser de uso seguro para el
agricultor y presentar pocos riesgos para el ambiente si se usan juiciosamente. Sin
embargo, los autores señalan que especialmente en países en desarrollo se dificulta el
proceso de capacitación de los agricultores sobre el adecuado manejo de los herbicidas,
debido a su bajo nivel cultural y bajo poder económico.
Entre la variedad de herbicidas existentes en el mercado, se encuentran aquellos que se
bioacumulan en tejidos animales. Estos residuos pueden ser dañinos para la salud humana,
no solo al bioacumularse en los tejidos sino también al afectar la salud de animales y
vegetales que contribuyen a la alimentación humana. Este problema se atenúa en el caso de
los herbicidas que se degradan rápidamente a materiales menos peligrosos y que
usualmente causan menos problemas al ambiente.
17
Los herbicidas persistentes permanecen en el ambiente por períodos considerables de
tiempo, pero no necesariamente se bioacumulan en tejidos animales (Gangstad, 1989). Sin
embargo, sí se mantienen en suelos y aguas, por lo que constituyen un riesgo toxicológico.
Diversos estudios realizados en varios países del mundo concluyen que los residuos de
herbicidas encontrados en las aguas subterráneas sobrepasan los límites permitidos por la
legislación correspondiente. Esto ha desembocado en la prohibición o restricción de ciertos
herbicidas en varias regiones. Un ejemplo de esto es el alachlor, cuyo uso fue prohibido en
la Unión Europea (Quevauviller et al., 2009). El alachlor corresponde químicamente a una
cloroacetanilida (figura 2), compuestos que son ampliamente usados como herbicidas
(Feigenbrugel et al., 2005).
La población más expuesta a los efectos severos de los plaguicidas en general son los
trabajadores agrícolas, cuyo trabajo es rociar estas sustancias en los cultivos. Madeley
(2002) menciona que: “algunas consecuencias resultantes son defectos congénitos,
esterilidad y cáncer: autoridades reconocidas han clasificado a 160 ingredientes activos de
los plaguicidas como carcinógenos hasta cierto punto, mientras que se encontró que 118
plaguicidas alteran el equilibrio hormonal”.
La mayoría de plaguicidas prohibidos en el Ecuador corresponden a insecticidas y
fungicidas. En la lista de 43 plaguicidas se encuentran el 2,4,5 T, el amitrole y el dinoseb
(figura 5), tres herbicidas de uso prohibido con el justificativo de “ser nocivos para la salud
y de fabricación, comercialización o uso prohibido en otros países” y “producir
contaminación ambiental, efectos tóxicos y tener registro cancelado en otros países”
(MAGAP, 2015). Los efectos de estos herbicidas fueron evidenciándose durante el tiempo
en que su uso estuvo en vigencia.
2,4,5 T
Amitrole/amitrol
Dinoseb
Figura 5: Estructuras químicas del 2,4,5 T, amitrole y dinoseb.
Fuente: Sigma-Aldrich
18
Generalmente, los herbicidas tienen una toxicidad baja en comparación con los
insecticidas, pero pueden ser irritantes y peligrosos dependiendo de su forma de uso.
Para los permisos de comercialización de los herbicidas, es necesario establecer su
toxicidad, tanto para los operadores y consumidores como para el ambiente. Mediante los
valores de DL50 (dosis letal para el 50% de un grupo de animales uniformes) se pueden
establecer las toxicidades relativas de los herbicidas. Mientras más alto sea el DL50, menor
será su toxicidad. En la tabla 3 se muestran los valores de DL50 de algunos herbicidas.
El NOEL (nivel en que no se observa efecto alguno) es utilizado para establecer una
ADI (ingesta diaria aceptable). Para esto, se determinan los residuos del herbicida y sus
metabolitos en los cultivos.
Tabla 3: Valores de DL50 de algunos herbicidas.
Herbicida DL50 Herbicida DL50
Toxicidad alta
Paraquat 120 Endotal amina 206
Bromoxynil 190 Diquat 231
Bromoxynil octonoato hasta 365 Cyanazina 288
Toxicidad moderada
Diclofop-metil 563-693 Propanil 1870
2,4-D sal sódica 666-805 Glufosinato 2000
2,4-D isopropil 700 Fenoxaprop-etil 2357
CDAA 750 Metolachlor 2828
MCPA 800 Atrazina 3080
Metribuzin 1090 Diuron 3328
EPTC 1652 Fluazifop-butil 3330
Alachlor 1800 Aciflurofen 3460
Baja toxicidad
Asulam >5000 Imazethapyr >5000
Dalapon >5000 Simazina >5000
Glifosato >5000 Sulfometuron-metil >5000
Productos químicos comunes DL50 Toxicidad
Nicotina 50 Muy alta
Cafeína 200 Alta
Aspirina 1750 Moderada
Sal común 3000 Moderada
Fuente: Labrada et. al (1996)
19
El glifosato (figura 1) es el herbicida más utilizado en el mundo y en el Ecuador, junto
con el paraquat (El Comercio, 2009). Este herbicida fue incorporado en el 2015 a la lista
2A (sustancias probablemente carcinógenas para humanos) de la Agencia Internacional
para la Investigación del Cáncer (IARC), tras una revisión de diversos estudios científicos
de respaldo (Elcacho, 2015; IARC). El paraquat (figura 1) aún no ha sido evaluado por la
IARC para la lista de carcinogenicidad, pero su uso ya ha sido prohibido en 32 países,
principalmente por constituir un peligro para la salud humana (Watts, 2011). El paraquat
no consta en la lista de plaguicidas de uso prohibido en el Ecuador.
Selectividad.
La selectividad es un atributo muy importante en la acción del herbicida. Los
tratamientos selectivos concentran su punto de acción sobre las malezas causando daños
mínimos al cultivo, por lo que pueden ser aplicados sobre toda el área del cultivo.
Sin embargo, factores físicos y mecánicos, como: aplicaciones dirigidas, aplicaciones
localizadas, uso de protectores, incorporación y colocación de herbicidas, época de
aplicación, condiciones del suelo, estructura del herbicida; factores ambientales, como:
humedad relativa, humedad del suelo, temperatura, luz; y factores de la planta, como: edad,
tasa de crecimiento, factores morfológicos y anatómicos, procesos biofísicos, procesos
bioquímicos, constitución genética; tienen efecto sobre la selectividad del herbicida
(Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1981).
La selectividad tiene mucha dependencia de la dosis utilizada, de tal forma que
algunos herbicidas a dosis mayores a las recomendadas causan fitotoxicidad al cultivo.
Para aminorar este inconveniente, técnicas moleculares y de mejoramiento genético han
contribuido al desarrollo de plantas cultivables resistentes a los herbicidas (Labrada et al.,
1996).
El metabolismo del herbicida tiene mucha incidencia sobre la selectividad del mismo,
debido a las diferencias existentes entre el metabolismo de las malezas y de los cultivos. El
metabolismo de los herbicidas puede definirse en cuatro fases: conversión, conjugación,
segunda conversión y transporte en la vacuola y deposición del metabolito final. En la fase
I, las moléculas del ingrediente activo sufren modificaciones químicas que disminuyen su
fitotoxicidad. En la fase II, las moléculas del herbicida o de los metabolitos de la fase I se
conjugan en azúcares, aminoácidos o con el tripéptido glutatión, generando metabolitos
con poca o nula actividad herbicida. En la fase III, estos metabolitos se transportan
activamente a la vacuola, con la posibilidad de formar conjugaciones secundarias que
producen metabolitos no tóxicos. Finalmente, en la fase IV, los metabolitos del proceso de
detoxificación pueden asociarse con componentes de la pared celular, formando residuos
insolubles. El metabolismo de los herbicidas se caracteriza por la conversión de moléculas
20
letales a componentes no tóxicos que se almacenen en lugares donde no causen daño a la
planta (Pinto et al., 2009).
Por la complejidad que involucra la selectividad, es importante evaluar la acción de
los herbicidas en condiciones locales (Labrada et al., 1996).
Resistencia.
Vencill et al. (2012) hace una distinción entre las definiciones de tolerancia y
resistencia, según lo establecido por la WSSA (Weed Science Society of America).
Tolerancia es “la habilidad inherente de una especie para sobrevivir y reproducirse después
del tratamiento herbicida. Esto implica que no hubo selección o manipulación genética que
haga tolerante a la planta”. A la resistencia la definen como “la habilidad heredada de una
planta para sobrevivir y reproducirse tras la exposición de un herbicida que normalmente
sería letal para el tipo silvestre”.
Los herbicidas concentran su actividad sobre uno o más puntos de una planta. Se dice
que la planta ha desarrollado resistencia a un herbicida cuando ha sufrido alguna mutación
o modificación de una función que “refuerza” el punto sobre el que actúa el herbicida
evitando su efecto letal. Cuando la planta muestra resistencia a otros herbicidas que actúan
sobre el mismo punto, el fenómeno se denomina resistencia cruzada. Muy rara vez la
planta desarrolla resistencia en varios puntos o varios mecanismos de resistencia (Prather
et al., 2000).
La resistencia puede desarrollarse en años, dependiendo de la estructura del herbicida
y de la especie de las malezas. Por ejemplo, la resistencia a los herbicidas de triazina se
evidenció después de 10 años de su uso continuo.
Desde 1970, año en el que se reportó por primera vez la resistencia a los herbicidas,
este problema ha ido en aumento. Alrededor del mundo se han confirmado más de 300
biotipos resistentes a herbicidas. La resistencia también puede ser inducida por un
mejoramiento de la habilidad de la planta para metabolizar el herbicida (Prather et al.,
2000). Esta es una cualidad requerida particularmente en cultivos en los que se aplican
herbicidas no selectivos. Sin embargo, el desarrollo de cultivos resistentes a los herbicidas
presenta desventajas que incluyen la posible transformación de plantas de estos cultivos a
malezas de otros cultivos, transferencia de los genes de resistencia entre cultivos o a
malezas de especies afines y la presencia de material genético involuntario en granos o
productos alimenticios. Se ha documentado la migración de los genes de resistencia
mediante el pólen y semillas (Vencill et al., 2012).
21
2.2.2 Productos naturales para el manejo de malezas.
Los extractos de productos naturales son una mezcla de compuestos neutrales, ácidos,
básicos, lipofílicos, hidrofílicos, anfifílicos (Sarker et al., 2006).
Muchas plantas acumulan sustancias orgánicas extraíbles a las que se les puede dar
usos no solo como materias primas, sino también aplicaciones de tipo científico,
tecnológico y comercial. Estas sustancias pueden clasificarse en metabolitos primarios y
metabolitos secundarios.
Los metabolitos primarios generalmente se concentran en las semillas y órganos
vegetativos de almacenamiento y tienen incidencia directa sobre el metabolismo celular.
Usualmente, los metabolitos primarios de las plantas tienen usos como materias primas;
por ejemplo, los ácidos grasos y aceites vegetales para la elaboración de jabones y
detergentes; y carbohidratos como la sucrosa, la pectina y la celulosa (Balandrin et al.,
1985).
Algunos de estos metabolitos primarios han demostrado bioactividad en roles
ecológicos. Ácidos grasos como el ácido pelargónico, ácido succínico, ácido láctico y
ácido glicólico son usados en preparaciones de herbicidas no selectivos utilizados en la
agricultura orgánica, para el control de musgos y plantas hepáticas. El ácido oleico también
forma parte de estas formulaciones (Dayan et al., 2009).
Ácido pelargónico
Ácido succínico
Ácido láctico
Ácido glicólico
Ácido oleico
Figura 6: Estructuras químicas de algunos ácidos grasos usados en preparaciones de
herbicidas orgánicos.
Fuente: Sigma-Aldrich
Los metabolitos secundarios se derivan de los metabolitos primarios y se acumulan en
las plantas en menores cantidades que éstos. Sus formas de obtención, extracción y
22
purificación son más complejas, pero muestran un espectro de actividades biológicas que
los hacen focos de diversas investigaciones. Rai & Carpinella (2006) señalan que existen
más de 10 000 compuestos conocidos como metabolitos secundarios de plantas. Los
autores mencionan a fenoles simples, derivados fenilpropanoides, coumarinas, flavonoides,
taninos, quinonas, aceites etéreos, derivados del isopropeno (iridoides, lactonas
sesquiterpenos, diterpenos, saponinas triterpenos, saponinas esteroides), heterósidos
cardiotónicos, alcaloides (pirolidonas, pirolisinas y alcaloides piperidinas, purinas,
alcaloides diterpenos y esteroideos) y glicósidos cianogénicos como ejemplos de estos
metabolitos secundarios. La separación de los metabolitos secundarios de los productos
naturales se describe más detalladamente en el apartado 2.2.4.
Los procesos de registro y aprobación de pesticidas se han vuelto más estrictos debido
a sus potenciales impactos sobre el ambiente y la salud humana. Esto ha limitado el uso de
muchos pesticidas y ha impulsado la búsqueda de otras alternativas al control químico
convencional para el manejo de plagas, por esta razón, la búsqueda de fuentes naturales
como potenciales pesticidas se ha incrementado.
La “revolución verde” ha reforzado las prácticas de la agricultura orgánica, en la que
no se admite el uso de plaguicidas de origen sintético como en las prácticas
convencionales. Dayan et al. (2009) enlista los siguientes ejemplos de herbicidas utilizados
en la agricultura orgánica (tabla 4):
Tabla 4: Usos y mecanismos/modos de acción de productos usados como herbicidas en la
agricultura orgánica.
Producto Uso Mecanismo y/o modo de acción
Harina de gluten
de maíz
Fertilizante, herbicida
pre-emergente, pro-
herbicida.
Mecanismo de acción exacto
indeterminado. Al hidrolizarse por
las bacterias del suelo, produce
oligopéptidos tóxicos para la
semilla. Afectan la división celular,
la integridad de la membrana y el
desarrollo nuclear.
Ácido acético Herbicida no selectivo. Quema las partes aéreas de la planta,
no tiene efecto sobre raíces.
Ácidos grasos Herbicidas no selectivos. Disrupción de la membrana celular.
Aceites esenciales
Herbicidas. Los aceites
de pino y de clavo de
olor son dos de los más
utilizados.
---
Fuente: Dayan et. al (2009)
23
Entre otras alternativas de métodos no químicos para el manejo de malezas, Vencill et
al. (2012) mencionan a la prevención de contaminaciones, control cultural, rotación de
cultivos, cubiertas vegetales, manipulación de la fecha de siembra, uso de cultivos
competidores, aumento de la velocidad de siembra, métodos mecánicos y de labranza, uso
de agentes alelopáticos, entre otros.
2.2.2.1 Factores que afectan la producción de compuestos bioactivos en las plantas.
La producción de compuestos bioactivos en las plantas está sujeta a una diversidad de
factores que pueden causar inconvenientes al momento de utilizar preparaciones crudas.
Rai & Carpinella (2006) manifiestan que puede haber “variación en la cantidad del
componente activo con condiciones geográficas, climáticas y ecológicas o con los órganos
de la planta y su morfología”. La diversidad de compuestos puede estar en dependencia de
efectos como el sinergismo y el antagonismo.
Rai & Carpinella (2006) definen al sinergismo como las interacciones que ocurren
“cuando la actividad combinada de dos o más compuestos es mayor que la de sus
actividades individuales”, mientras que al antagonismo lo definen como las interacciones
“que están presentes cuando una actividad combinada de dos o más (compuestos) químicos
es menor que la de sus actividades individuales”.
Se ha reportado que factores ambientales de estrés como aumento de temperatura,
reducción de la disponibilidad de agua y la herbivoría podrían causar la liberación de
metabolitos secundarios bioactivos (Kelton et al., 2012).
Otros factores que pueden causar pérdidas de la bioactividad son la variabilidad en la
recolección, el tratamiento y el almacenamiento de la materia prima (Rai & Carpinella,
2006).
2.2.2.2 La alelopatía y los aleloquímicos en el manejo de malezas.
La alelopatía fue definida por Rice (1984) como “la ciencia que estudia procesos, en
los que están involucrados metabolitos secundarios de plantas y microorganismos,
afectando el crecimiento y el desarrollo de sistemas biológicos”. Las interacciones
biológicas entre especies de plantas pueden ser claves para la protección de cultivos.
La observación de posibles interacciones biológicas o ecológicas es el primer paso
para estudios referentes al tema. Por ejemplo, la observación de plantas en cuyos
alrededores no crecen otras especies, podría dar indicios de un efecto inhibitorio. Una vez
identificada la planta, se estudia su influencia sobre otras plantas, cómo y qué sustancias
24
libera al ambiente y se identifica las sustancias responsables de la interacción alelopática
(Macías et al., 2004).
Los aleloquímicos o agentes alelopáticos son las sustancias químicas responsables de
las interacciones alelopáticas. Putnam (1988) referido por Bhadoria (2011) menciona seis
clases de aleloquímicos: alcaloides, benzoxazinonas, derivados del ácido cinámico,
compuestos cianogénicos, etileno y otros estimulantes de la germinación de semillas, y
flavonoides. Kelton et al. (2012) apuntan a los ácidos fenólicos, las coumarinas y los
glucosinolatos como aleloquímicos que han demostrado efecto herbicida en ciertas plantas.
Los autores también mencionan a los benzoxazinoides (ácidos hidroxámicos,
benzoaxazolinonas, lactamas, derivados de metilo), los helanuoles (sesquiterpenos
fenólicos) y las benzoquinonas como “clases de aleloquímicos bajo investigación” en el
control de malezas.
Estructura general de
ácidos fenólicos
Coumarina
Estructura general de los glucosinolatos
Estructura general de
ácidos hidroxámicos
Estructura general de
benzoaxazolinonas
Estructura general de
lactamas
Estructura general de
derivados de metilo
Helanuol A
Benzoquinona
Figura 7: Estructuras químicas de aleloquímicos que han demostrado efecto herbicida.
Fuentes: Bravo et al. (2013), Sigma-Aldrich, Wikimedia commons (2008), Sindbjerg
Fomsgaard (2009), Kelton et al. (2012)
25
Los efectos de los aleloquímicos sobre las plantas incluyen la inhibición o
ralentización de la velocidad de crecimiento, oscurecimiento e hinchazón de las semillas,
reducción de la raíz o radícula y extensión de los brotes o cubiertas de los brotes,
hinchazón o necrosis en las puntas de las raíces, enroscamiento del eje de la raíz,
decoloración, ausencia de pelos radicales, aumento del número de raíces seminales,
reducción de acumulación del peso seco y disminución de la capacidad reproductiva
(Bhadoria, 2011).
Aleloquímicos como los helanuoles del girasol podrían usarse como plantillas para el
desarrollo de nuevos modelos de herbicidas, mientras que los esteroides del trébol de olor
son un ejemplo de aleloquímicos que estimulan la germinación y el crecimiento (Macías et
al., 2004).
Bhadoria (2011) distingue cuatro vías por las que los aleloquímicos pueden ser
liberados de las plantas:
Lixiviación desde las hojas y tallo de las plantas.
Volatilización de compuestos fitotóxicos de las partes verdes de la planta.
Compuestos fitotóxicos de la descomposición de material vegetal.
Compuestos fitotóxicos liberados de las raíces.
Limitaciones del uso de la alelopatía en el manejo de malezas.
La identificación, el aislamiento y la evaluación de la bioactividad de los
aleloquímicos no se consideran suficientes para la propuesta de un producto natural como
modelo agroquímico. Se deben discurrir otros aspectos como la sustentabilidad, desde
puntos de vista agroquímicos, económicos y ambientales; y factores inherentes a la planta
y a las condiciones externas que inciden en el efecto alelopático. La estabilidad de los
productos es uno de los factores que se debe tener en cuenta, pues ciertos aleloquímicos
pueden sufrir de degradación al contacto con hongos o bacterias del suelo. De igual forma,
factores como el sinergismo y el antagonismo con sustancias exudadas y/o producidas por
estos microorganismos deben tenerse en consideración (Macías et al., 2004).
Desde el punto de vista económico, el uso de aleloquímicos como herbicidas naturales
se considera poco rentable en la mayoría de los casos. Esto, principalmente, porque deben
ser aplicados en cantidades superiores a las utilizadas en métodos convencionales de
control químico.
La síntesis de aleloquímicos que tienen un excelente efecto herbicida, como la
tentoxina (figura 8), es muy costosa (Bhadoria, 2011). Al no tener tanta actividad como sus
contrapartes sintéticas, los herbicidas naturales generalmente deben ser aplicados en
26
grandes cantidades, lo que tiene impacto en el gasto económico y constituye un potencial
riesgo para la fauna y microbiota del suelo (Dayan et al., 2009).
Los productos naturales presentan el riesgo de provocar alergias en los humanos. El
sorgoleone (figura 8) es un aleloquímico perteneciente al grupo de compuestos
benzoquinónicos, que ha sido aislado del sorgo y que ha demostrado su incidencia en la
inhibición del crecimiento de ciertas plantas (Kelton et al., 2012). Se ha reportado que este
compuesto puede provocar dermatitis (Inderjit & Mallik, 2002).
Tentoxina
Sorgoleone
Figura 8: Estructuras químicas de la tentoxina y el sorgoleone.
Fuentes: Sigma-Aldrich, Kelton et al. (2012)
Una de las mayores limitantes en la implementación de la alelopatía como herramienta
en el manejo de malezas es la falta de conocimiento del tema en general y la complejidad
de la determinación del potencial alelopático de los exudados de las plantas (Kelton et al.,
2012).
2.2.3 Uso de leguminosas como cubiertas vegetales.
El término cubiertas vegetales se refiere a cultivos que son plantados como
herramientas para la reducción de la erosión del suelo, aumento de la fertilidad del suelo,
mejoramiento de la calidad del suelo y del agua, control de plagas y otros beneficios en los
agroecosistemas (Lu et al., 2007). El uso de cubiertas vegetales es muy común dentro de
las prácticas culturales para el control de plagas, como la rotación de cultivos.
En países como México y Estados Unidos se menciona a Mucuna spp., Canavalia
spp., Vicia villosa Roth, Trifolium spp., Medicago lupulina L. y Pisum sativum L, como
27
ejemplos de especies de leguminosas que se usan como cubiertas vegetales (Caamal et al.,
2001; Kelton et al., 2012).
Las leguminosas, como cubiertas vegetales, no solo protegen el suelo de la erosión
sino que también lo enriquecen con materia orgánica y nitrógeno, constituyendo una fuente
de fertilidad y a la vez de supresión de plagas (Caamal et al., 2001; Snapp et al, 2005).
Las leguminosas tienen la habilidad de fijar el nitrógeno, produciendo residuos de alta
calidad y en cantidades limitadas y asegurando un hábitat de insectos beneficioso (Snapp et
al., 2005).
Los aleloquímicos liberados de las leguminosas tienen incidencia sobre sus
potenciales propiedades para el control de malezas.
Este mismo efecto se ha observado en extractos procedentes de cereales en grano
usados con el mismo fin (Kelton et al., 2012).
Como ejemplos de aleloquímicos que se han identificado en especies de leguminosas,
Mondal et al. (2015) menciona a (tabla 5):
Tabla 5: Compuestos químicos identificados en diferentes especies de leguminosas.
Compuestos identificados Especie Autores
Ácidos benzoico, salicílico y
malónico
Exudados de las raíces
de P. vulgaris Asaduzzaman & Asao
Ácidos láctico, benzoico, p-
hidroxibenzoico, vanílico, adípico,
succínico, málico, glicólico y p-
hidroxifenilacético
V. faba Asaduzzaman & Asao
Pisatina P. sativum Kato-Noguchi
Ácidos malónico, benzoico, p-
hidroxibenzoico y vanílico
Extractos de las raíces
de L. oduratus Asao et al.
Cis,trans-xantoxina; trans, trans-
xantoxina
Extracto metanólico-
acuoso de hojas de
Pueraria thunbergiana
Kato-Noguchi
Ácidos caféico, clorogénico,
isoclorogénico, p-coumárico, p-
hidroxibenzoico y ferúlico
Exudados y residuos
de M. sativa
Abdul-Rahmanand &
Habib
Ácidos clorogénico y salicílico M. sativa Chung et al.
Aminoácido L-DOPA Vicia villosa Fujii
Cianamida M. pruriens Fujii
Fuente: Mondal et al. (2015)
28
Ácido benzoico
Ácido salicílico
Ácido malónico
Ácido vanílico
Ácido adípico
Ácido málico
Ácido glicólico
Ácido clorogénico
Ácido p-coumárico
Ácido ferúlico
L-DOPA
Cianamida
Figura 9: Estructuras químicas de algunos compuestos identificados en leguminosas.
Fuente: Sigma-Aldrich
2.2.4 Fraccionamiento de extractos naturales.
Una vez demostrada alguna función bioactiva de un extracto natural, el paso siguiente
en la investigación es averiguar qué es lo que provoca dicha actividad. Houghton & Raman
(1998) mencionan dos razones principales por las que esta determinación se considera
necesaria:
Variación de actividad de las muestras: La cantidad de un ingrediente activo en
un organismo puede variar dependiendo de diversos factores, y esto provoca
diferencias cuando se aplican dosis del extracto crudo. Puede haber toxicidad
si la cantidad es más alta de lo normal, o ausencia de efecto si la cantidad es
más baja. Cuando se identifican los componentes activos, eventualmente se
pueden llegar a cuantificar, y de esta manera formular dosis efectivas de dichas
sustancias.
Desarrollo de otras sustancias activas: Es de mayor interés el descubrimiento y
desarrollo de moléculas activas que de extractos activos, debido a dificultades
29
como el limitado acceso a la materia prima o su posible sobreexplotación. Una
vez conocida la estructura molecular del ingrediente activo se pueden proponer
formas de sintetizar derivados del mismo, o tomar dicha estructura como
patrón para el diseño de moléculas similares.
El fraccionamiento se refiere a la separación inicial del extracto crudo en fracciones
discretas que contienen compuestos con polaridades o tamaños moleculares similares
(Sarker et al., 2006). El fraccionamiento es el paso previo a la identificación y el
aislamiento de las sustancias activas y el paso siguiente a la determinación de la
bioactividad del extracto crudo.
Durante la extracción de metabolitos de plantas se debe minimizar la interferencia de
compuestos que puedan ser extraídos junto con los de interés, evitar la contaminación del
extracto y prevenir la descomposición de metabolitos importantes o la formación de
compuestos indeseables por las condiciones de extracción o por impurezas en el solvente
(Sarker et al., 2006).
El fraccionamiento puede incluir particiones como en las extracciones líquido-líquido,
métodos cromatográficos, extracciones en fase sólida, etc.
2.2.4.1 Particiones líquido-líquido.
Las técnicas de fraccionamiento se fundamentan en la naturaleza fisicoquímica de los
componentes del extracto. En las particiones líquido-líquido, la diferencia de polaridades
entre los componentes es el factor determinante en las separaciones. Casi siempre, en un
extracto “total” se emplean solventes orgánicos polares con el fin de extraer tantos
compuestos como sea posible. Solventes apolares extraen compuestos lipofílicos, como
alcanos, ácidos grasos, pigmentos, ceras, esteroles, algunos terpenoides, alcaloides y
coumarinas. Solventes de mediana polaridad extraen compuestos con polaridad media,
como algunos alcaloides y flavonoides. Solventes polares extraen compuestos polares,
como glicósidos flavonoides, taninos y algunos alcaloides (Sarker et al., 2006).
Las formas más comunes de compuestos apolares incluyen estructuras con anillos
aromáticos, dobles enlaces carbono-carbono y grupos carbonilos, mientras que los
compuestos polares se manifiestan con estructuras que involucran pares de electrones
libres y también se asocian con átomos electronegativos, como nitrógeno, oxígeno, cloro y
otros halógenos (Houghton & Raman, 1998). En la tabla 6 se enlistan ejemplos de
compuestos usados como solventes orgánicos ordenados en forma creciente de polaridad.
30
Tabla 6: Polaridad y estructura molecular de los principales solventes orgánicos.
Compuesto Estructura Polaridad (compuestos listados
en orden creciente de polaridad)
Hexano Muy apolar, sin dobles enlaces o
átomos electronegativos.
Tolueno
Muy ligera polaridad debida a los
electrones 𝝿 del anillo aromático.
Diclorometano
Poca polaridad debida a los átomos
electronegativos de Cl.
Cloroformo
Polaridad mayor que la del
diclorometano por los 3 átomos de
Cl en lugar de 2.
Acetato de etilo
Apreciable polaridad por los
electrones 𝝿 y los pares de
electrones del O.
Butano-1-ol Polar debido al grupo OH libre.
Agua Polar - molécula pequeña y sin
porción lipofílica apolar.
Ácido acético
(ácido etanoico)
Más polar que el agua porque
puede ocurrir ionización que
confiere carga negativa al O.
Autores: Houghton & Raman (1998)
La partición con solventes generalmente involucra el uso de dos solventes inmiscibles,
en los que los compuestos se distribuyen de acuerdo a sus coeficientes de partición, en un
embudo de separación (Sarker et al., 2006).
En las particiones líquido-líquido se emplea un esquema general que utiliza la
extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente (Lock de Ugaz, 1994).
Además de la polaridad, otros factores secundarios para la selección de los solventes
para este fraccionamiento son: selectividad, recuperabilidad del solvente, viscosidad y
punto de ebullición, tensión superficial, toxicidad y flamabilidad, corrosividad, estabilidad
térmica y química, disponibilidad y costos e impacto ambiental (Bart & Pilz, 2011).
31
2.2.4.2 Técnicas cromatográficas.
La técnica cromatográfica más usada es la cromatografía en capa fina (TLC), que es la
técnica más fácil y menos costosa para el aislamiento de productos naturales.
Entre las variantes de técnicas cromatográficas utilizadas para estos procedimientos se
encuentran la cromatografía de adsorción, cromatografía de partición, cromatografía de
inclusión/exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía en
gel y cromatografía de bioafinidad (Bart & Pilz, 2011).
La cromatografía en capa fina puede ser una herramienta útil para el “rastreo” de los
productos naturales después de otros procesos de separación, como los de particiones
líquido-líquido (Sarker et al., 2006).
La TLC en silica gel es el método más usado, pero Sarker et al. (2006) mencionan
ciertas consideraciones que deben ser tomadas en cuenta al utilizar esta técnica:
Los compuestos ácidos pueden unirse a la sílica por las interacciones entre los
compuestos acídicos y los silanoles.
Los compuestos básicos pueden comportarse pobremente en la sílica. La
adición de bases débiles podría erradicar esta dificultad.
Compuestos altamente apolares como ácidos grasos, glicéridos, alcanos y otros
terpenoides inferiores requieren sistemas de solventes apolares y esto puede
causar dificultades al detectar con UV o con reactivos de revelado.
Metabolitos altamente polares como azúcares, glicósidos, taninos, polifenoles
y ciertos alcaloides requieren sistemas de solventes polares. Estas sustancias
pueden ser absorbidas en la sílica.
32
Tabla 7: Sistemas de solventes utilizados comúnmente para TLC.
Sistema de solventes Sorbente (Fase
estacionaria) Observaciones
Hexano:acetato de etilo Sílica gel
Sistema universal - puede sustituirse el
hexano por alcohol de petróleo o
pentano.
Gasolina:dietil éter Sílica gel
Un sistema universal para metabolitos
relativamente apolares. Excelente para
terpenos y ácidos grasos. Debe tenerse
cuidado con las mezclas explosivas de
dietil éter que se forman en el aire.
Gasolina:cloroformo Sílica gel
Considerablemente útil para la
separación de derivados del ácido
cinámico y en particular las coumarinas.
Tolueno:acetato de
etilo:ácido acético (TEA) Sílica gel
Varía la composición, por ejemplo,
80:18:2 o 60:38:2 - excelente para
metabolitos acídicos.
Cloroformo:acetona Sílica gel Un sistema general para productos
medianamente polares.
Benceno:acetona Sílica gel
Útil para la separación de productos
aromáticos. Debe tenerse cuidado ya
que el benceno es un solvente altamente
carcinogénico. Sustituirlo con tolueno.
Butanol:ácido acético:agua
(BAW) Sílica gel
Un sistema polar para flavonoides y
glicósidos.
Butanol:agua:piridina:tolueno Sílica gel
Sistema para análisis de azúcares.
Intentar con 10:6:6:1. El desarrollo
puede tomar 4 horas.
Metanol:agua C18
Comenzar con metanol 100% para
determinar si los metabolitos se
moverán de la línea base. Incrementar
la concentración del agua para retardar
a los productos. La adición de pequeñas
cantidades de ácido o base pueden
mejorar la cromatografía.
Acetonitrilo:agua C18/C2 Un sistema universal simple de fase
reversa.
Metanol:agua Poliamida Universal.
Metanol:agua Celulosa
Utilizado para la separación de
compuestos altamente polares como
azúcares y glicósidos.
Autores: Sarker et al. (2006)
33
2.2.4.3 Ensayos cualitativos.
En las fracciones resultantes del proceso de fraccionamiento se pueden aplicar
técnicas de “screening” fitoquímico que, con el uso de procedimientos y reactivos
específicos, permiten la detección de grupos fitoquímicos comunes en extractos naturales.
En la tabla 8 se enlistan algunos ensayos con reacciones específicas que se realizan para la
detección de estos grupos.
Tabla 8: Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos.
Ensayo Grupo fitoquímico que detecta
Ensayo de Sudan Compuestos grasos
Ensayos de Dragendorff, Mayer y
Wagner Alcaloides
Ensayo de Baljet Lactonas y coumarinas
Ensayo de Liebermann-Burchard Triterpenos-esteroides
Ensayo de hidroxamato férrico Coumarinas
Ensayo de Bornträger Quinonas
Ensayo de Fehling Azúcares reductores
Ensayo de la espuma Saponinas esteroidales y triterpénicas
Ensayo del cloruro férrico Compuestos fenólicos en general y/o taninos
Ensayo de la ninhidrina Aminoácidos libres o aminas en general
Ensayo de Shinoda Flavonoides
Ensayo de Kedde Glucósidos cardiotónicos
Ensayo de Grignard Glucósidos cianogenéticos
Fuente: Lock de Ugaz (1994)
Ensayo de Sudán: El reactivo Sudán III (figura 10) es utilizado para la detección de
grasas en una muestra debido a su capacidad de otorgarles una coloración roja vistosa. Esta
coloración se debe a que por la baja polaridad del reactivo, es más afín a solubilizarse en
los lípidos de la muestra que en el solvente de extracción (generalmente polar o
moderadamente polar). Por esta razón, al añadir gotas de este reactivo y calentar la muestra
para evaporar el solvente, en una muestra que contiene grasas, se observará gotas o una
película roja en el seno del líquido. En este caso, el ensayo se considera positivo.
34
Figura 10: Estructura química del reactivo Sudán III.
Fuente: Sigma-Aldrich
Ensayo de Dragendorff: El reactivo de Dragendorff está compuesto de yoduro de
potasio, ácido tartárico y nitrato de bismuto. Este reactivo ayuda a la detección de
alcaloides en una muestra, específicamente, aminas terciarias y algunas aminas
secundarias. Un alcaloide es, por definición, un compuesto químico que posee un nitrógeno
heterocíclico procedente del metabolismo de los aminoácidos. Se han identificado cerca de
12000 estructuras, algunos ejemplos se muestran en la figura 12.
El mecanismo de reacción entre el reactivo y los alcaloides se fundamenta en la
combinación de los iones del metal pesado y el yodo presentes en el reactivo con el
nitrógeno del alcaloide para formar un par iónico que da origen a un precipitado insoluble
de color anaranjado, amarillo, rojo oscuro, rosado violeta, etc (figura 13) (Coe &
Anderson, 1996). Los falsos positivos que se podrían obtener en ensayos para alcaloides se
atribuyen a constituyentes nitrogenados (como péptidos) presentes en la matriz vegetal o
constituyentes no nitrogenados, que generalmente corresponden a compuestos que
contienen oxígeno.
Amina primaria
Amina secundaria
Amina terciaria
Figura 11: Estructuras generales de las aminas primarias, secundarias y terciarias.
Fuente: Wikimedia Commons
35
Teobromina
(árbol de cacao)
Capsaicina
(pimientos picantes)
Aconitina
(acónito)
Nicotina
(planta de tabaco)
Cafeína
(planta de café)
Rhoeadina
(amapola)
Cocaína
(planta de coca)
Ergotamina
(cornezuelo del centeno)
Quinina
(corteza del quino)
Figura 12: Estructuras químicas de algunos alcaloides presentes en productos naturales.
Fuentes: Sigma-Aldrich, Wikimedia Commons
N
N
CH3N
N
CH3
IBi
+K I
Bi(NO3)OH
H2NO3
Alcaloide Precipitado rojo ladrillo
Figura 13: Reacción de Draggendorf.
36
Ensayo de Mayer: El reactivo de Mayer está constituido de cloruro mercúrico, yoduro
de potasio y agua. Se emplea en la caracterización de alcaloides, considerándose un
resultado positivo la formación de un precipitado blanco o amarillo al colocar el reactivo
en la muestra. Este precipitado corresponde a una sal compleja que, al igual que en el
mecanismo de reacción entre el reactivo de Dragendorff y los alcaloides, es resultado de la
reacción entre los iones del metal (Hg) y el yodo con el nitrógeno del alcaloide (figura 14).
N
N
CH3N
N
CH3
IOHg2
K2(HgI4)
KOH
+ +K I OH2
Alcaloide Tetrayodo mercuriato de K Precipitado blanco
Figura 14: Reacción de Mayer.
Ensayo de Wagner: El reactivo de Wagner consiste en una solución de yodo – yoduro
de potasio. Con los alcaloides forma un precipitado de color marrón fácilmente reconocible
en el seno del líquido (figura 15).
N
N
CH3N
N
CH3
I2
+K I
I2
K I
Alcaloide Precipitado marrón
Figura 15: Reacción de Wagner.
Ensayo de Baljet: Permite la identificación de sesquiterpenolactonas (sesquiterpenos
con un anillo lactónico; figura 16). El ensayo de Baljet se fundamenta en la formación de
un complejo de color rojo, resultante de la reacción entre el ácido pícrico del reactivo y la
lactona α, β y γ insaturada (figura 17) (Orantes, 2008). Los falsos positivos podrían darse
con otros compuestos que poseen un anillo lactónico en su estructura, como las
37
coumarinas, por lo que generalmente esta prueba se realiza para la detección de
compuestos lactónicos en general.
Figura 16: Estructuras químicas de algunas sesquiterpenolactonas.
Fuente: Wikimedia Commons
Figura 17: Reacción de Baljet.
Ensayo de Liebermann-Burchard: Se emplea en el reconocimiento de triterpenos y
esteroides. Los triterpenos están formados por tres unidades terpénicas. Dos ejemplos de
estos compuestos son el hopano y el colesterol (figura 18).
Para esta prueba se trabaja con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado que se
adicionan a la muestra. El ensayo se considera positivo si se observa la formación de una
coloración verde, que se debe a la reacción del grupo hidroxilo del esteroide con los
reactivos. Como consecuencia de esta reacción, se incrementa la conjugación de la
insaturación en el anillo fusionado adyacente, lo que ocasiona la coloración (figura 19).
38
Hopano
Colesterol
Figura 18: Estructuras químicas del hopano y del colesterol.
Fuente: Wikimedia Commons
CH3
CH3
CH3
H
H
H
HCH3
CH3
OH
H+
CH3
CH3
CH3
H
H
H
HCH3
CH3
.H2O+
CH3
CH3
CH3
H
H
H
HCH3
CH3
H2SO4 Colestatexaeno acido sulfonoico
anillo azul
Figura 19: Reacción de Liebermann-Burchard.
Ensayo de hidroxamato férrico: Este ensayo sirve para la detección de coumarinas, y
en general para sustancias con funcionalidad éster o lactona (figura 20). Para esta prueba,
se añade a la muestra clorhidrato de hidroxilamina disuelto en etanol al 10%, gotas de
hidróxido de potasio al 10% en etanol y se calienta hasta burbujeo, se añaden gotas de
ácido clorhídrico 0,5M y una gota de cloruro férrico al 1% en agua (Lock de Ugaz, 1994).
Se considera un resultado positivo si aparece una coloración violeta. En la primera etapa
del mecanismo de esta reacción, el éster se convierte en un ácido hidroxámico, catalizado
por la base añadida. A continuación, este producto reacciona con el cloruro férrico
produciendo un hidroxamato (complejo) de coloración intensa (Arias, 2015).
39
Coumarina
Umbeliferona
Aesculetina
Herniarina
Psoraleno
Imperatorina
Figura 20: Estructuras químicas de la coumarina y algunos derivados de origen natural.
Fuente: Wikimedia Commons
Ensayo de Bornträger: Permite el reconocimiento de quinonas (nafto y antraquinonas;
figura 21) en la muestra. La reacción consiste en una oxidación de las antronas y
antraquinoles a antraquinonas, hidrólisis de los glucósidos e identificación por la aparición
de una coloración rojiza en la fase acuosa (Martínez, 2012) debida a la formación de
complejos coloreados (figura 22). No solo las antraquinonas pueden dar positivo a esta
prueba, sino también las naftoquinonas. Así mismo, si hay la presencia de antraquinonas
parcialmente reducidas en la muestra, la solución se torna roja lentamente, mientras va
ocurriendo la oxidación, pasando primero por coloraciones amarillas y verdes.
Antraquinona
α-Naftoquinona
Figura 21: Estructuras químicas de la antraquinona y la α-naftoquinona.
Fuente: Sigma-Aldrich
40
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
ONa
ClH
H2SO4
Na OH
Alizarina (antraquinona) Coloración rojiza
Figura 22: Reacción de Bornträger.
Ensayo de Fehling: Permite reconocer la presencia de azúcares reductores. El reactivo
de Fehling está conformado por sulfato cúprico, tartrato mixto de potasio y sodio,
hidróxido de sodio y agua. Este ensayo se fundamenta en el poder reductor del grupo
carbonilo de un aldehído. En esta reacción, el ión cúprico, Cu(II), proveniente del reactivo
se reduce a ión cuproso, Cu(I), que precipita en forma de óxido de color rojo ladrillo
(figura 23). El ensayo de Fehling suele funcionar mejor con α-hidroxialdehídos y azúcares
(Dupon & Gokel, 2007). Un falso positivo podría darse en el caso de que por el medio
alcalino fuerte en que se produce la reacción, algunos compuestos no reductores se
enolicen.
Figura 23: Reacción del ensayo de Fehling para azúcares reductores.
Fuente: Daniel (2012)
( ) ( )
Ensayo de la espuma: Este ensayo se utiliza para el reconocimiento de saponinas
(figura 24). Se trata de un procedimiento simple en el que solo se añade agua a la muestra y
se agita, considerando un resultado positivo si la espuma formada por el efecto de la
agitación tiene al menos 2mm de espesor y permanece por al menos 2 minutos. Esto se
41
fundamenta en las propiedades tensoactivas de las saponinas, que forman soluciones
espumosas en agua (figura 25).
La estructura química de las saponinas es muy similar a la de los triterpenos y
esteroides. Están conformadas por una aglicona policíclica (sapogenina) ligada a una o más
cadenas de azúcares. La sapogenina corresponde a un triterpeno o a un esteroide.
Figura 24: Estructura básica de las saponinas.
Fuente: Daniel (2012)
Figura 25: Reacción de las saponinas con agua.
Ensayo del cloruro férrico: Se utiliza para la determinación tanto de fenoles como
taninos en extractos alcohólicos, y fundamentalmente taninos cuando la prueba se realiza
en extractos acuosos (Lock de Ugaz, 1994). El fundamento de este ensayo es la formación
de un complejo coloreado entre estos compuestos con el Fe(III) del reactivo. Un falso
positivo podría ocurrir por la presencia de enoles, que también dan positivo a esta prueba.
Los taninos se clasifican en tres grupos principales: taninos hidrolizables, taninos
condensados y florotaninos (figura 26). Las moléculas de taninos requieren al menos 12
grupos hidroxilo y 5 grupos fenil (monómeros) para enlazar proteínas.
6 Ar - OH + FeCl3 [ ( Ar - O)6 Fe ]H3 + 3HCl
coloracion azul
42
Ácido gálico
(taninos hidrolizables)
Flavona
(taninos condensados)
Floroglucinol
(florotaninos)
Figura 26: Monómeros de los tres tipos de taninos.
Fuente: Wikimedia Commons
Ensayo de la gelatina: Este ensayo ayuda a la detección de taninos, debido a la
propiedad de estos compuestos de reaccionar con las proteínas (de la solución de gelatina)
formando compuestos insolubles (figura 27).
Tanino Gelatina Precipitado Blanco
Figura 27: Reacción de la gelatina.
Ensayo de la ninhidrina: Permite el reconocimiento de aminoácidos libres o aminas en
general. Se considera un resultado positivo para aminoácidos y/o aminas primarias al tomar
una coloración azul/violeta en la reacción que también se conoce con el nombre de
condensación de la ninhidrina (figura 28). La reacción de la ninhidrina con aminas
secundarias da como producto una sal de iminio, que es de color anaranjado.
43
Figura 28: Mecanismo de reacción de condensación de la ninhidrina con una amina
primaria.
Fuente: Wikimedia Commons
Ensayo de Shinoda: Permite la detección de todos los flavonoides (figura 29) con
núcleo benzopirona. Para este ensayo, se agrega ácido clorhídrico concentrado, magnesio o
zinc en polvo y alcohol amílico. El fundamento de la reacción entre los reactivos y los
flavonoides consiste en que el zinc o el magnesio reaccionan con el ácido clorhídrico
concentrado, generando hidrógeno, que por reducción produce el ion flavilio (figura 30) a
partir del flavonoide. Este ion produce coloración desde rosa débil hasta roja intensa, por lo
que la aparición de este resultado visible se considera positiva. Los flavonoides a
excepción de las chalconas, auronas e isoflavonas dan positivo a esta reacción (PSANJ
BOSCO, 2009).
Figura 29: Estructura básica de los flavonoides y sistema de numeración.
Fuente: Pérez (2003)
44
Figura 30: Estructura química del ion flavilio.
Fuente: González (2011)
Chalconas
Ejemplo: Buteína
Flavonas
Ejemplo: Apigenina
Flavonoles
Ejemplo: Quercetina
Flavandioles
Ejemplo: Leucocianidina
Antocianidinas
Ejemplo: Pelargonidina
Auronas
Ejemplo: Aureusidina
Flavanonas
Ejemplo: Naringenina
Figura 31: Clasificación de los flavonoides.
Fuentes: Wikimedia Commons, Sigma-Aldrich
45
O
OH
OH
O
OH
Mg2+
ClH
Flavonoide Coloración rojiza
Figura 32: Reacción de Shinoda.
Ensayo de Kedde: Permite el reconocimiento de glucósidos cardiotónicos (figura 33).
En este ensayo, se adiciona ácido 3,5 dinitrobenzoico en medio metanólico y solución de
hidróxido de potasio. Si aparece un color azul/violeta, el ensayo se considera positivo. El
desarrollo de la coloración se debe a la formación de una lactona butenólida (α-insaturada)
(figura 34) (PSANJ BOSCO, 2009).
Figura 33: Estructura general de los cardiotónicos (R=H, aglicona; R=H, glucósido).
Fuente: Martínez (2001)
Figura 34: Reacción de Kedde.
Ensayo de glucósidos cianogenéticos: El reconocimiento de glucósidos cianogéneticos
(figura 25) se lo realiza embebiendo una tira de papel filtro en solución de picrato de sodio
46
(carbonato de sodio y ácido pícrico) y colocándolo en la muestra humedecida con
suficiente agua y cloroformo. Un resultado positivo se obtiene si al calentar hasta por tres
horas, se observa el desarrollo de una coloración naranja/roja en el papel. La reacción se
fundamenta en que el ácido pícrico en presencia del cianuro de hidrógeno, liberado de la
muestra en el medio ácido, forma isopurpurato de sodio, compuesto responsable de la
coloración (Carrasco, 2014).
Figura 35: Estructura general de los glucósidos cianogenéticos.
Figura 36: Hidrólisis de los glucósidos cianogenéticos.
Fuente: Carrasco (2014)
2.2.5 Descripción botánica y fisicoquímica de Calliandra carbonaria.
Calliandra carbonaria Benth es el nombre científico del „carbonero rojo‟, árbol
ornamental cuyo follaje destaca por la presencia de inflorescencias globosas de color rojo.
Las inflorescencias están conformadas por pequeñas flores de pétalos poco vistosos, pero
de largos estambres rojos que sobresalen del tubo de cada flor (figura 37) (OpEPA).
Calliandra crece entre 4-6 metros en una amplia variedad de suelos, siendo sus
preferidos los suelos bien drenados pues no soporta el anegamiento. Puede soportar
períodos secos pero no se considera una planta muy tolerante a las sequías. Es una planta
bastante resistente a plagas y enfermedades, siendo afectada solo por algunos hongos
fitopatógenos como Armillaria mellea. Su madera es útil para combustible y sus hojas
pueden ser consideradas como cubiertas vegetales para otros cultivos al ser capaces de fijar
nitrógeno (The Organic Farmer, 2015).
47
Figura 37: Inflorescencia de Calliandra carbonaria.
Autor: Weigell (2008)
Tabla 9: Caracterización taxonómica de Calliandra carbonaria.
TAXONOMÍA
Nombre científico Calliandra carbonaria
Reino Plantae
División Angiosperms
Phylum Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Fabales
Familia Fabaceae/Leguminosae/Mimosaceae
Género Calliandra
Epíteto específico carbonaria
Autor del epíteto específico Benth
Fuentes: Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis; Instituto de Ciencias Naturales
de la Universidad Nacional de Colombia (2007)
El extracto crudo de las inflorescencias de C. carbonaria ha mostrado actividad
selectiva para inhibir la germinación de dos especies de malezas del cultivo de quinua:
falsa quinua y holco (Hernández, 2015).
48
2.2.5.1 Composición química de especies afines al género Calliandra.
El género Calliandra incluye alrededor de 132 especies, la mayoría nativas de
América y otras pocas de Asia y África (Zeid et al., 2006).
Calliandra portoricensis. Se han identificado varios ácidos grasos y metil ésteres en el
extracto hexánico de las raíces de C. portoricensis. Se distinguen: 14-metil-
metilpentadecanoato, ácido hexadecanoico (figura 38), metilhexadecanoato, 9-oxo-
metilnonanoato, etc. (Orishadipe et al., 2010).
Figura 38: Estructura química del ácido hexadecanoico.
Fuente: Sigma-Aldrich
Calliandra surinamensis. En las flores se ha identificado 3-orhamnosilquercitrina,
kaempferol 5‟-prenilado y quercetina (Muhayyah et al., 2013).
Calliandra haematocephala. En el extracto de acetato de etilo de las partes aéreas de
C. haematocephala se identificaron flavonoides agliconas: quercetina, kaempferol,
miricetina; flavonoides glicósidos: quercetina-3-O-rhamnopiranósido, kaempferol-3-O-(2“-
O-galoil)- rhamnopiranósido, miricetina-3-O-(2“,3“-di-O-gaoil)-rhamnopiranósido (Zeid et
al., 2006). En la fracción con actividad antibacterial del extracto de acetato de etilo de la
corteza se reveló la presencia de ácido p-hidroxibenzoico, ácido cafeico, ácido
protocatéquico, astilbina, neo-isoastilbina y catequina-3-O-ramnósido. En una fracción no
activa se identificó lupeol y ácido betulínico (Nia et al., 1999). En la hoja se han
determinado prodelfinidinas (taninos condensados). En la corteza del tallo y las ramas
también se han identificado taninos condensados como procianidinas, catequinas y
epicatequinas (Wei et al., 2015). Los constituyentes de las hojas incluyen flavonoides,
alcaloides, carbohidratos, proteínas, esteroides y glicósidos (Shaheen et al., 2015).
49
Quercetina
Kaempferol
Miricetina
Ácido p-hidroxibenzoico
Ácido cafeico
Astilbina
Lupeol
Ácido protocatéquico
Ácido betulínico
Figura 39: Estructuras químicas de algunos compuestos identificados en Calliandra
haematocephala.
Fuente: Sigma-Aldrich
Calliandra calythorsus. Contiene compuestos fenólicos en general, taninos
hidrolizables, taninos condensados en hojas y tallos. Presenta un perfil de aminoácidos
balanceado, exhibiendo una mayor cantidad de metionina en los tallos que en las hojas
(FAO; Salawu et al., 1997).
50
2.2.6 Descripción general de Chenopodium quinoa Willd., Chenopodium album L. y
Holcus lanatus L.
2.2.6.1 Chenopodium quinoa Willd.
C. quinoa es una planta herbácea anual que llega a medir entre 0,2 y 3m de altura. Las
semillas (figura 40) miden entre 1 y 2,6mm y son de color blanco, amarillo, rojo, púrpura,
marrón o negro. La quinua puede adaptarse a condiciones ambientales adversas como el
frío y la sequía. Su ciclo de producción varía entre 120 y 240 días (Hernández & León,
1994).
Figura 40: Semillas de quinua (Chenopodium quinoa Willd.), variedad Tulcanaza.
Tabla 10: Caracterización taxonómica de Chenopodium quinoa Willd.
TAXONOMÍA
Reino Plantae
Subreino Viridiplantae
Infrareino Streptophyta
Superdivisión Embryophyta
División Tracheophyta
Subdivisión Spermatophytina
Clase Magnoliopsida
Superorden Caryophyllanae
Orden Caryophylliales
Familia Amaranthaceae
Género Chenopodium L.
Especie Chenopodium quinoa Willd.
Fuente: ITIS
La quinua, cuyo nombre científico corresponde a Chenopodium quinoa Willd, se
considera un pseudocereal reconocido como un alimento nutricionalmente completo
51
debido al buen balance aminoacídico que posee y que es comparable con el de la leche. Es
una fuente importante de vitaminas, minerales y compuestos como polifenoles,
fitoesteroles y flavonoides que le conceden potenciales beneficios nutracéuticos (Abugoch,
2009).
Los centros de producción de quinua en el Ecuador se concentran en seis provincias:
Chimborazo, Imbabura, Cotopaxi, Tungurahua, Pichincha y Carchi; mientras que en
Cañar y Azuay el cultivo ha desaparecido. A más del control manual de malezas por
deshierba, para el control químico se usa Afalón o Alachlor. Ambos herbicidas se aplican
en pre-emergencia, es decir inmediatamente después de la siembra y en suelo húmedo, y
están destinados al control de malezas de hoja ancha y angosta (Peralta, 2009).
Para el 2017, la producción de quinua se proyecta a 16 mil hectáreas, ubicadas en las
provincias de Carchi, Chimborazo, Imbabura y Pichincha (MAGAP).
2.2.6.2 Chenopodium album L.
Figura 41: Semillas de falsa quinua (Chenopodium album L.).
Tabla 11: Caracterización taxonómica de Chenopodium album L.
TAXONOMÍA
Reino Plantae
Subreino Viridiplantae
Infrareino Streptophyta
Superdivisión Embryophyta
División Tracheophyta
Subdivisión Spermatophytina
Clase Magnoliopsida
Superorden Caryophyllanae
Orden Caryophylliales
Familia Amaranthaceae
Género Chenopodium L.
Especie Chenopodium album L.
Fuente: ITIS
52
C. album L. es una hierba anual erecta más o menos cubierta con pubescencia harinosa
de color blanco. Crece de 0,2 a 2m de altura en regiones temperadas o subtemperadas. Es
una maleza común en 40 cultivos en 47 países, siendo una de las malezas principales en
Canadá, Europa, India, México, Nueva Zelanda, Pakistán y América del Sur (CABI).
Las semillas de C. album L. (figura 41) pueden permanecer por muchos años en los
suelos infestando los cultivos (Spehar et al., 2003). C. album se ha convertido en la hierba
resistente más común en el mundo. Se ha reportado su resistencia a herbicidas de triazina
(Caseley et al., 1991).
En promedio, alrededor de 72000 semillas se producen por planta y son adaptables a
varias condiciones ambientales. Pueden crecer en casi cualquier tipo de suelo, pero se
adaptan mejor a áreas abiertas con suelos bien drenados. La falsa quinua (nombre vulgar de
C. album) puede competir con otras plantas y la presencia de sus residuos podría ralentizar
el crecimiento de otras plantas (Jarvis et al., 2011).
Se ha reportado que C. album exhibe efectos alelopáticos indeseables en cultivos de
maíz, soya, zanahoria, pepino, cebolla, tomate, girasol, lechuga, chayote y avena
(Bhowmik, 1982; Reinhardt et al., 1994).
A la falsa quinua se le atribuyen diversas propiedades medicinales, que incluyen el
tratamiento de quemaduras, tratamiento de dolores de extremidades y de problemas
intestinales. Se considera una planta comestible, como muchas otras variantes del género
Chenopodium. Sus hojas y tallos jóvenes se consumen frescos, cocinados o fritos y sus
semillas pueden ser usadas como harina para pan (Jarvis et al., 2011).
2.2.6.3 Holcus lanatus L.
Figura 42: Semillas de holco (Holcus lanatus L.).
53
Tabla 12: Caracterización taxonómica de Holcus lanatus L.
TAXONOMÍA
Reino Plantae
Subreino Viridiplantae
Infrareino Streptophyta
Superdivisión Embryophyta
División Tracheophyta
Subdivisión Spermatophytina
Clase Magnoliopsida
Superorden Lilianae
Orden Poales
Familia Poaceae
Género Holcus L.
Especie Holcus lanatus L.
Fuente: ITIS
El holco (Holcus lanatus L.) es una hierba aterciopelada perenne que crece hasta 50cm
de altura. Sus hojas son planas, de ancho de 10mm y vellosas. Las cabezas de las semillas
varían en apariencia de acuerdo a su madurez. Inicialmente tienen forma de espiga, con las
ramas plegadas hacia el tallo y de color púrpura. En el florecimiento, las ramas se abren y
cuando las semillas (figura 42) maduran, se vuelven del color de la paja y las ramas se
contraen lejos del tallo.
El holco tolera un amplio rango de condiciones, siendo más invasivo en suelos
húmedos en ambientes soleados o con poca sombra (ESC).
La producción de semillas es alta. Sus semillas pueden germinar inmediatamente o
mantenerse en el suelo por hasta 10 años formando un banco de semillas (DiTomaso,
2013).
Para su control, se utilizan métodos culturales, mecánicos o manuales de deshierba.
Para el control químico, se sugiere el uso de herbicidas inhibidores de la síntesis de lípidos,
como Fluaxifop y Sethoxydim, e inhibidores de la fotosíntesis como la hexazinona.
(DiTomaso, 2013) También se sugiere el uso de glifosato en spray 0,5% cuando aparecen
las primeras cabezas de semillas (FloraBase).
54
2.3 Marco legal
SENPLADES promueve la transformación de la matriz productiva, lo que involucra la
generación de riqueza basada “no solo en la explotación de nuestros recursos naturales,
sino en la utilización de las capacidades y los conocimientos de la población”, siendo
priorizados 14 sectores productivos y 5 industrias estratégicas para el proceso de
transformación. Entre los 14 sectores productivos priorizados se incluyen a las industrias
de alimentos frescos y procesados, biotecnología (bioquímica y biomedicina) y
petroquímica (urea, pesticidas, herbicidas, fertilizantes, foliares, plásticos, fibras sintéticas
y resinas) (SENPLADES, 2012).
El Art. 15 de la Constitución de la República del Ecuador señala que “el Estado
promoverá, en el sector público y privado, el uso de tecnologías ambientalmente limpias y
de energías alternativas no contaminantes y de bajo impacto”.
La Ley de Gestión Ambiental ampara el desarrollo sustentable dentro de los principios
de Gestión Ambiental incluidos en la Declaración de Río de Janeiro de 1992, sobre el
Medio Ambiente y Desarrollo.
En el Decreto Ejecutivo Nº 3609: Texto Unificado de Legislación Secundaria del
Ministerio de Agricultura y Ganadería; se establece la normativa correspondiente a los
plaguicidas y productos afines de uso agrícola, como procesos de registro, utilización,
publicidad, etc. (MAGAP, 2003).
La norma NTE-INEN 1838:98 establece definiciones generales, clasificación y tipos
de formulaciones de plaguicidas y productos afines. En esta norma se contempla a los
“herbicidas biológicos” dentro del grupo de plaguicidas (INEN, 1998).
2.4 Hipótesis
2.4.1 Hipótesis de trabajo (Hi). Aplicando los principios del fraccionamiento con
particiones líquido-líquido, ensayos de actividad, reacciones fitoquímicas específicas y
cromatografía en capa fina se puede separar e identificar cualitativamente la fracción de
mayor actividad herbicida del extracto de las inflorescencias de Calliandra carbonaria.
2.4.2 Hipótesis nula (Ho). No es posible separar e identificar cualitativamente la
fracción de mayor actividad herbicida del extracto de las inflorescencias de Calliandra
carbonaria mediante la aplicación de los principios del fraccionamiento con particiones
líquido-líquido, ensayos de actividad, reacciones fitoquímicas específicas y cromatografía
en capa fina.
55
2.5 Conceptualización de variables
2.5.1 Variables independientes.
2.5.1.1 V1: Método de extracción. Se evaluaron dos métodos de obtención del extracto:
con nitrógeno líquido y con etanol al 70%. Se estableció el efecto de estos dos métodos
sobre la variable dependiente.
2.5.1.2 V2: Tipo de semilla. Se trabajó con tres tipos de semilla; una correspondiente a
semillas del cultivo principal (quinua); y dos correspondientes a las malezas más
recurrentes de este cultivo (falsa quinua y holco).
2.5.1.3 V3: Fracción del extracto. Se trabajó con 5 fracciones que se obtuvieron de cada
extracto y con dos fracciones de referencia: extractos y blancos (agua estéril para el primer
método de extracción y etanol al 16% para el segundo método).
2.5.2 Variable dependiente.
2.5.2.1 V4: Efecto herbicida. Para evaluar el efecto herbicida se trabajó con dos
indicadores: porcentaje de germinación y crecimiento radicular.
2.5.3 Variables de interés.
2.5.3.1 V5: Composición cualitativa de las fracciones. Esta variable se estudió en la parte
correspondiente a la determinación de los grupos fitoquímicos presentes en las fracciones
obtenidas de los extractos.
2.5.3.2 V6: Composición cuantitativa de flavonoides totales. Esta variable se estudió en la
determinación de flavonoides totales de la fracción con mayor actividad.
56
CAPÍTULO 3: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1 Diseño de la investigación
La primera parte del estudio se ejecutó bajo las directrices del paradigma cuantitativo
de investigación que, como señalan Barragán et al. (2003), tiene como enfoque los
resultados en magnitudes, proporciones y/o datos agregables. También se siguió el
paradigma cualitativo en la parte de identificación cualitativa de los grupos fitoquímicos de
las fracciones del extracto, por lo que la investigación englobó un enfoque mixto.
Se trabajó dentro de un nivel explicativo: manejándose dentro de los parámetros que
este nivel investigativo establece, se determinó experimentalmente la fracción del extracto
de las inflorescencias de C. carbonaria que mayor actividad herbicida presenta sobre
semillas de dos malezas del cultivo de quinua. Este nivel toma muy en consideración el
inventario, clasificación y ordenamiento de los datos (Olivera, 2008) para evitar una mala
interpretación de los mismos, por lo que se hizo uso de guías de observación pertinentes.
Las variables dependientes e independientes fueron definidas en base a este nivel.
Además, se trabajó dentro del nivel exploratorio al realizar el reconocimiento
cualitativo de los grupos fitoquímicos presentes en las fracciones de los extractos de C.
carbonaria. Los resultados del estudio explicativo inicial sirvieron de precedente para el
estudio exploratorio. (Romero)
Se utilizó las herramientas de la investigación experimental al emplear el
razonamiento hipotético-deductivo, así como el uso de muestras representativas,
ordenamiento de datos dentro de un diseño experimental y una metodología cuantitativa
para el análisis de los mismos.
El estudio también correspondió a una investigación de laboratorio, pues se realizó en
un ambiente controlado, adecuando las condiciones óptimas para la obtención de
resultados pertinentes dentro un ambiente de laboratorio.
El estudio se llevó a cabo en las instalaciones de la Agencia Ecuatoriana de
Aseguramiento de la Calidad del Agro (Agrocalidad), ubicada en la Vía Interoceánica km
14 ½ y Eloy Alfaro, parroquia Tumbaco, cantón Quito, Ecuador.
Las pruebas cualitativas de las fracciones de los extractos de C. carbonaria, así como
la cuantificación de flavonoides totales se ejecutaron en el Laboratorio de Productos
Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador,
57
ubicada en la Ciudadela Universitaria, calles Francisco Viteri s/n y Gato Sobral, cantón
Quito, Ecuador.
3.2 Población y muestra
La población que es el objeto de estudio de esta investigación corresponde a las
inflorescencias de Calliandra carbonaria. La muestra con la que se trabajó son 106g,
repartidos en dos grupos (de 53g cada uno), de inflorescencias de C. carbonaria
recolectadas de arbustos ornamentales ubicados en la parroquia de Cumbayá.
3.3 Métodos y materiales
Como equipo de protección primaria se utilizó mandil, guantes y mascarilla. Las
observaciones y resultados se registraron en un cuaderno de notas y se utilizó un marcador
indeleble para etiquetar el material cuando así se requirió.
En el Anexo B se expone el diagrama de flujo de la metodología general de esta
investigación.
3.3.1 Extracción.
Previamente a las extracciones se lavaron las inflorescencias con una solución de
hipoclorito de sodio al 1%, se enjuagaron con agua destilada y se seccionaron en trozos
pequeños.
Los extractos iniciales se obtuvieron por dos métodos:
Extracción con etanol al 70% (M1). Los trozos se colocaron en un vaso de
precipitación de 600mL y se maceraron con una solución de etanol al 70% por 48 horas. El
vaso de precipitación estuvo cubierto con papel aluminio y se lo conservó en un lugar
alejado de la luz durante el tiempo de la maceración. La mezcla se filtró al vacío y el
líquido filtrado se concentró a la mitad del volumen en un rotavapor y se conservó para su
posterior fraccionamiento.
Extracción con nitrógeno líquido (M2). Se colocaron los trozos pequeños en un
mortero para ser triturados y macerados añadiendo nitrógeno líquido, según el método
sugerido por Rueda (2015) referido por Hernández (2015). Las partes maceradas se
colocaron en una prensa extractora para la obtención del extracto crudo. El extracto se
58
centrifugó por 15 minutos a 3500 rpm y se separó el sobrenadante para su posterior
fraccionamiento.
Materiales Sustancias y reactivos Equipos
Inflorescencias de C.
carbonaria Hipoclorito de sodio 1% Centrífuga
Mortero y pistilo Agua destilada Bomba de vacío
Prensa extractora Etanol 70%
Rotavapor
Tubos para centrífuga Nitrógeno líquido
Vaso de precipitación 600mL
Papel aluminio
Papel filtro cualitativo
Embudo Büchner
Matraz kitasato 500mL
Manguera
3.3.2 Fraccionamiento.
Los dos extractos obtenidos se fraccionaron con solventes de diferente polaridad. Cada
extracto se separó en volúmenes iguales para las cuatro particiones.
Fraccionamiento con cloroformo (F1) para investigación de alcaloides. Se acidificó
la porción del extracto con una solución de HCl al 5% hasta pH 2-3 (que se verificó con
papel indicador). Se adicionó gota a gota una solución de NaOH al 20% hasta un pH 10-12
(que se verificó con papel indicador). Se extrajo el extracto alcalinizado con cloroformo en
un embudo de separación, realizándose tres lavados con dicho solvente y separando la fase
orgánica cada vez. La fase orgánica se concentró hasta sequedad en el rotavapor y se
reconstituyó con agua estéril (fracción 1). Se conservó un 10% de esta fracción para las
respectivas pruebas cualitativas, así como la fase acuosa obtenida.
Fraccionamiento con éter de petróleo (F2) para investigación de triterpenos y
esteroles. La porción del extracto se separó con éter de petróleo en un embudo de
separación, realizándose tres lavados con dicho solvente y separando la fase orgánica cada
vez. La fase orgánica se concentró hasta sequedad en el rotavapor y se reconstituyó con
agua estéril (fracción 2). Se conservó un 10% de esta fracción para las respectivas pruebas
cualitativas. La fase acuosa se conservó para su posterior fraccionamiento.
59
Fraccionamiento con metanol/agua (50:50) (F3 y F4) para investigación de
flavonoides, antraquinonas, taninos y saponinas. La fase acuosa obtenida en el
fraccionamiento con éter de petróleo se extrajo con una mezcla metanol/agua 50:50 por
maceración por 24 horas. El residuo sólido se separó por filtración al vacío y se redisolvió
en cloroformo. Se concentró a sequedad en el rotavapor y se reconstituyó con agua estéril
(fracción 3). Se conservó un 10% de esta fracción para las respectivas pruebas cualitativas.
El residuo líquido resultante de la filtración se concentró hasta sequedad y se reconstituyó
con agua estéril (fracción 4). Se conservó un 10% de esta fracción para las respectivas
pruebas cualitativas.
Fraccionamiento con acetato de plomo y cloroformo (F5) para investigación de
sesquiterpenolactonas, coumarinas y heterósidos cardiotónicos. La porción del extracto se
precipitó añadiendo gota a gota una solución de acetato de plomo al 20% hasta que dejó de
precipitar. Se filtró al vacío y se desechó el residuo sólido. El líquido filtrado se extrajo con
cloroformo. El extracto clorofórmico se separó y se trató con sulfato de sodio anhidro y se
filtró por gravedad. El líquido resultante se concentró a sequedad en el rotavapor y se
reconstituyó con agua estéril (fracción 5). Se conservó un 10% de esta fracción para las
respectivas pruebas cualitativas.
Materiales Sustancias y reactivos Equipos
Papel indicador HCl 5% Rotavapor
Vasos de precipitación 50mL,
100mL, 600mL NaOH 20% Bomba de vacío
Embudos de separación 150mL Cloroformo Autoclave
Soporte universal Agua estéril
Pinzas para soporte universal Éter de petróleo
Aro Metanol
Matraces Erlenmeyer 50mL,
100mL, 250mL Acetato de plomo 20%
Balones aforados 50mL, 100mL Sulfato de sodio anhidro
Papel aluminio
Papel filtro cualitativo
Embudo Büchner
Matraz kitasato 500mL
Manguera
Pipetas Pasteur
60
Probetas 25mL, 50mL, 100mL
Embudo de vidrio
Pera de succión
Frascos ámbar con tapa 50mL
3.3.3 Ensayos de inhibición de germinación y crecimiento radicular.
La evaluación de la actividad herbicida de las fracciones obtenidas se basó en la
medición de la inhibición de la germinación y del crecimiento radicular de semillas de C.
quinoa Willd, C. album L. y H. lanatus L.
Los ensayos se efectuaron con semillas de C. quinoa Willd, variedad Tulcanaza,
obtenidas en el INIAP Santa Catalina; y semillas de C. album L. y H. lanatus L. obtenidas
de plantas recolectadas en un lote de quinua del cantón Mejía (Pichincha), tras un proceso
de secado y prensado.
Se desinfectaron las semillas con el fungicida Vitavax (dosis 150-200mL/kg semillas)
previo a su colocación en las cajas Petri. Las cajas Petri fueron desinfectadas con etanol al
70% y expuestas a una cámara de radiación UV por 30 minutos.
Se dosificó 3mL de cada fracción obtenida en cajas Petri de dos divisiones (1,5mL en
cada división) que contenían 20 semillas de cada planta (por caja) dispuestas sobre una
superficie de papel filtro cualitativo autoclavado. Se trabajó con un control del extracto
crudo sin fraccionar (F0), un blanco de agua estéril (B2) y uno de etanol al 10% (B1) y se
efectuaron tres repeticiones de cada tratamiento. Las cajas se sellaron con cinta Parafilm y
se codificaron de acuerdo a la fracción añadida (B, F0, F1, F2, F3, F4, F5) proveniente de
los extractos obtenidos mediante los métodos M1 y M2, al tipo de semilla (Q: para quinua;
FQ: para falsa quinua y H: para holco) y la fecha de siembra. El proceso de dosificación y
sellado se realizó dentro de una cabina de flujo laminar para evitar contaminaciones de
microorganismos del ambiente. Las cajas se introdujeron en una cámara de germinación
(23ºC), midiéndose el porcentaje de germinación de las plantas de quinua por 4 semanas y
de las de falsa quinua y holco por 5 semanas. Transcurridos estos tiempos se midieron las
radículas de las plantas que germinaron extrayéndolas de las cajas y extendiéndolas sobre
una superficie de papel milimetrado, para los datos de crecimiento radicular. Si germinaron
menos de 10 semillas en cada caja se tomaron las medidas de las radículas de todas las que
germinaron; si germinaron más de 10 semillas se seleccionaron 10 de estas al azar y se
midió sus radículas.
61
Materiales Sustancias y reactivos Equipos
Semillas de C. quinoa Willd Fungicida Vitavax Autoclave
Semillas de C. album L. Agua estéril Cámara de germinación
Semillas de H. lanatus L. Etanol 70% Cámara de radiación UV
Cajas Petri de plástico de dos
divisiones Cabina de flujo laminar
Papel filtro cualitativo
Pipetas graduadas 1mL, 5mL
Cinta Parafilm
Papel milimetrado
Papel aluminio
Pera de succión
3.3.4 Pruebas cualitativas de las fracciones.
Las fracciones obtenidas fueron analizadas por cromatografía en capa fina para el
reconocimiento de los grupos fitoquímicos presentes, según lo enlistado en la tabla 13.
Tabla 13: Fases móviles y reveladores que se utilizaron en la TLC de cada fracción
obtenida.
Grupo fitoquímico Fracción Fase móvil Revelador
Alcaloides Fracción 1 Cloroformo –metanol
(19:1)
Reactivo de Dragendorff
Esteroles Fracciones 2 y 4 Éter de petróleo-
acetona
(80:20)
Anhídrido
acético+H2SO4+etanol
Flavonoides Fracción 3 Butanol-ácido acético-
agua (4:1:5)
UV/Fluorescencia
Antraquinonas Fracción 3 Benceno-acetato de
etilo-ácido acético
(75:24:1)
KOH 10%
Sesquiterpenos Fracción 5 Diclorometano-acetona
(60:40)
KOH
Fuente: Domínguez (1985)
62
Para el reconocimiento de grupos fitoquímicos también se realizaron pruebas
cualitativas utilizando reacciones y reactivos específicos, según lo que se indica en la tabla
14.
Tabla 14: Ensayos fitoquímicos que se realizaron en cada fracción.
Fracción Prueba Grupo fitoquímico
Fracción 1
Ensayo de Mayer
Alcaloides Ensayo de Dragendorff
Ensayo de Wagner
Fracción 2
Ensayo de Liebermann-
Burchard Triterpenos y esteroides
Ensayo de Zack
Fracciones 3 y 4
Ensayo de Shinoda Flavonoides
Ensayo de Borntrager Antraquinonas
Ensayo de la gelatina Taninos
Ensayo de la espuma Saponinas
Ensayo de cloruro férrico Taninos
Ensayo de Fehling Azúcares reductores
Fracción 5
Ensayo de Liebermann-
Burchard Triterpenos y esteroides
Ensayo de Baljet Lactonas y coumarinas
Reacción de Kedde Glucósidos cardiotónicos
Ensayo de hidroxamato
férrico Coumarinas
Fuente: Domínguez (1985)
Materiales Sustancias y reactivos Equipos
Tubos de ensayo 4mL, 9mL Cloroformo Baño María
Pipetas graduadas 1mL, 2mL,
5mL Metanol
Cámara
UV/Fluorescencia
Pera de succión Reactivo de Dragendorff
Vasos de precipitación 50mL,
100mL Éter de petróleo
Pipetas Pasteur Acetona
Cocineta Anhídrido acético
Papel filtro cualitativo Ácido sulfúrico concentrado
Embudo de vidrio Etanol
Butanol
63
Ácido acético
Agua destilada
Benceno
Acetato de etilo
Hidróxido de potasio 10%
Diclorometano
Reactivo de Kedde
Reactivo de Wagner
Reactivo de Mayer
Cloruro férrico 20%
Ácido clorhídrico
Limaduras de magnesio
Hidróxido de amonio
Solución de gelatina 1%
Solución de cloruro de sodio 10%
Reactivo de Baljet
Clorhidrato de hidroxilamina
Aceite
3.3.5 Cuantificación de flavonoides totales.
Se realizó la determinación de la concentración de flavonoides totales presente en la
fracción 3 (F3) del extracto obtenido con el segundo método. Para el efecto, se siguió el
método estándar empleado en los laboratorios de Productos Naturales.
Se elaboró una curva de calibración con un estándar de quercetina. Para esto, se
preparó 5mL de soluciones etanólicas del estándar de las siguientes concentraciones: 2,0;
1,0; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,0625mg/mL. La muestra (F3) fue disuelta en etanol con una
relación 1/10 en peso (0,5/5,0g). A continuación se agregó, tanto a la muestra como a los
estándares, 1,25mL de etanol y 0,075mL de nitrito de sodio al 5% y se dejó reposar por 6
minutos. Después de este tiempo, se agregó 0,15mL de cloruro de aluminio al 10% y se
dejó en reposo por 5 minutos. Se adicionó 0,5mL de hidróxido de sodio 1M y se completó
el volumen con etanol a 2,5mL. Transcurrida media hora, se leyeron la muestra y los
estándares a 510nm en el espectrofotómetro.
64
Para poder realizar las conversiones respectivas y expresar el resultado en mg de
quercetina por g de inflorescencias, se realizó la determinación de la densidad de la
fracción utilizando un picnómetro de 10mL.
Materiales Sustancias y reactivos Equipos
Matraces Erlenmeyer Etanol 96% Balanza 0,001
Pipetas graduadas Agua destilada Espectrofotómetro
Balones aforados Muestra
Tubos de ensayo
Estándar de quercetina
(100%)
Espátula Nitrito de sodio 5%
Celdas Cloruro de aluminio 10%
Picnómetro Hidróxido de sodio 1M
3.4 Diseño experimental
El diseño experimental que se utilizó para el análisis del efecto inhibitorio corresponde
a un diseño completamente al azar (DCA 2x3x7) con los factores de estudio y niveles que
se indican en la tabla 15. Se trabajó con un total de 42 tratamientos y con 3 repeticiones por
cada tratamiento.
Tabla 15: Factores de estudio y niveles.
Factores Niveles Codificación
A: Fracción del extracto
Blanco B
Extracto E
Fracción 1 F1
Fracción 2 F2
Fracción 3 F3
Fracción 4 F4
Fracción 5 F5
B: Método de extracción Con nitrógeno líquido M1
Con etanol M2
C: Tipo de semilla
Quinua Q
Falsa quinua FQ
Holco H
65
Las siguientes hipótesis fueron planteadas para el análisis de varianza correspondiente
a cada indicador de la variable respuesta efecto herbicida (tabla 16).
3.4.1 Hipótesis nulas.
El factor A (fracción del extracto) no tiene efecto significativo.
El factor B (método de extracción) no tiene efecto significativo.
El factor C (tipo de semilla) no tiene efecto significativo.
La interacción entre los factores A y B no tiene efecto significativo.
La interacción entre los factores A y C no tiene efecto significativo.
La interacción entre los factores B y C no tiene efecto significativo.
3.4.2 Hipótesis alternativas.
El factor A tiene efecto significativo.
El factor B tiene efecto significativo.
El factor C tiene efecto significativo.
La interacción entre los factores A y B tiene efecto significativo.
La interacción entre los factores A y C tiene efecto significativo.
La interacción entre los factores B y C tiene efecto significativo.
66
3.5 Operacionalización de las variables
Tabla 16: Matriz de operacionalización de variables.
Variables Dimensión Indicadores Ítems
Extractos crudos Método de obtención
Extracción con nitrógeno
líquido ---
Extracción con etanol 70% ---
Fracciones de extractos
Método de obtención
(según el solvente
orgánico utilizado)
Fracción 1 ---
Fracción 2 ---
Fracción 3 ---
Fracción 4 ---
Fracción 5 ---
Blanco ---
Extracto (Fracción 0) ---
Tipos de semillas
Del cultivo principal Quinua ---
De las malezas Falsa quinua ---
Holco ---
Efecto herbicida
(inhibición)
Germinación % germinación ---
Crecimiento radicular Longitud de radículas, mm ---
Composición cualitativa
de las fracciones
Ensayos cualitativos con
reacciones específicas
Grupos fitoquímicos
Presencia/ausencia de
alcaloides, flavonoides,
antraquinonas, esteroles,
sesquiterpenos, glucósidos
cardiotónicos. Análisis cromatográfico
(TLC)
Composición cuantitativa
de flavonoides totales
Análisis
espectrofotométrico mg quercetina/g fracción ---
3.6 Técnicas e instrumentos de recolección de datos
Se manejó la observación como técnica de recolección de datos. Se utilizaron guías de
observación como instrumentos de recolección de los datos correspondientes a los
indicadores de la variable “efecto herbicida”: porcentaje de germinación (anexo C1) y
crecimiento radicular (anexo C2).
Los instrumentos de recolección de datos para la identificación cualitativa de las
fracciones fueron listas de cotejo. En el caso de la cuantificación de flavonoides totales, se
recogieron los datos de absorbancia de los estándares y la muestra, como se expone en la
tabla 30.
67
3.7 Técnicas de análisis e interpretación de resultados
El porcentaje de germinación se calculó mediante la fórmula:
Con los valores obtenidos se realizó el análisis estadístico de los resultados mediante
un ANOVA general para cada indicador de la variable respuesta: porcentaje de
germinación y crecimiento radicular. El tratamiento estadístico se llevó a cabo utilizando el
software Statgraphics Centurion XVII.II. Con los resultados del ANOVA se evaluó la
incidencia de los factores de estudio sobre la variable respuesta al 95% de confianza.
Los factores de estudio que demostraron un efecto significativo sobre los indicadores
de la variable respuesta fueron sometidos a una prueba de comparación de medias (prueba
de Tukey al 95% de confianza) para la evaluación de los tratamientos causantes de la
diferencia.
Los valores de Rf de las manchas obtenidas en la cromatografía de capa fina de los
flavonoides se calcularon dividiendo la distancia recorrida por la muestra sobre la distancia
recorrida por la fase móvil.
La densidad de la fracción de mayor actividad fue calculada mediante la fórmula:
Dónde:
M1= Peso de picnómetro vacío
M2= Peso de picnómetro con agua destilada
M3= Peso de picnómetro con muestra
La cantidad de flavonoides totales en la fracción de mayor actividad se calculó
mediante la fórmula:
; donde a y b son constantes obtenidas mediante la curva de
calibración, A es la absorbancia de la muestra y C es la concentración. El valor obtenido
fue dividido por el peso de la muestra utilizado (0,498g) para obtener la concentración en
mg de quercetina por g de fracción (Cf).
68
Para expresar la concentración de flavonoides totales en mg de quercetina por g de
flores, se utilizó la siguiente fórmula, considerando que:
- La masa de inflorescencias que se utilizó para la obtención de 40,0mL de extracto
corresponde a 53,239g.
- Estos 40,0mL de extracto se dividieron en 5 volúmenes de 8,0mL cada uno para
realizar cada fraccionamiento descrito en la metodología.
- El volumen de aforo con agua estéril de cada fracción obtenida fue de 50,0mL;
utilizando reglas de tres para las equivalencias:
- La primera equivalencia (mg quercetina/g fracción 3) se puede sustituir por Cf,
mientras que la segunda (g fracción 3/mL fracción 3) corresponde a la densidad,
. Por la eliminación, las unidades de Cftotales quedan expresadas en mg
quercetina/g flores.
- Finalmente, se desarrollaron los cálculos numéricos, de tal manera que la fórmula
con la que se calculó la concentración final quedó expresada como:
69
CAPÍTULO 4: ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
4.1 Análisis estadístico del efecto de los factores de estudio sobre el indicador
germinación
Mediante el análisis de varianza para la evaluación de la germinación de las semillas
(tabla 17) se determinó que los factores: fracción del extracto y tipo de semilla, ejercieron
un efecto significativo sobre la germinación, expresada en porcentaje; por lo que se
aceptaron las hipótesis alternativas correspondientes. Estos resultados indican que las
fracciones de los extractos de las inflorescencias de C. carbonaria tuvieron efectos que
difieren estadísticamente sobre la germinación en los tres tipos de semillas (de quinua,
falsa quinua y holco). El método de obtención del extracto crudo no tuvo un efecto
estadísticamente significativo sobre la variable anteriormente mencionada, por lo que
únicamente en este caso se aceptó la hipótesis nula.
Tabla 17: Análisis de varianza para la evaluación de la germinación de las semillas de
quinua, falsa quinua y holco aplicando siete fracciones de los extractos de C. carbonaria
obtenidos por dos métodos de extracción.
Fuente Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
EFECTOS
PRINCIPALES
A:Fracción 6,1x103 6 1,0x10
3 9,3 0,00**
B:Método de extracción 2,9x102 1 2,9x10
2 2,6 0,11
C:Tipo de semilla 2,4x104 2 1,2x10
4 1,1x10
2 0,00**
INTERACCIONES
AB 4,9x103 6 8,2x10
2 7,5 0,00**
AC 3,2x103 12 2,7x10
2 2,5 0,01**
BC 4,2x103 2 2,1x10
3 1,9x10
1 0,00**
RESIDUOS 1,1x104 96 1,1x10
2
TOTAL (CORREGIDO) 5,3x104 125
**Diferencia altamente significativa al 95% de confianza (Valor P<0,05).
70
4.1.1 Comparaciones de medias de los niveles del primer factor (fracción del extracto)
sobre el indicador germinación.
La prueba de múltiples rangos, prueba de Tukey al 95% de confianza (tabla 18), para
la evaluación del efecto de los tratamientos concernientes a la fracción de los extractos
utilizada sobre la germinación, evidenció la existencia de 3 grupos homogéneos: 1)
fracciones 0 y 3; 2) blanco y fracciones 3, 4 y 5; y 3) blanco y fracciones 4, 5, 2 y 1. La
fracción 0 corresponde al control, es decir, al extracto crudo sin fraccionar. Los resultados
muestran que la fracción de los extractos que tuvo un efecto similar al de los extractos sin
fraccionar sobre la variable germinación corresponde a la fracción 3. En el gráfico de
medias (gráfico 1) se distingue esta similitud al observarse que los intervalos de la fracción
3 son los únicos que se traslapan con la fracción 0.
Tabla 18: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para porcentaje de germinación por
fracción del extracto aplicada sobre las semillas.
Fracción Casos* Media LS* Sigma LS* Grupos Homogéneos
F0 18 4,6x101 2,5 X
F3 18 5,3x101 2,5 XX
B 18 6,2x101 2,5 XX
F4 18 6,3x101 2,5 XX
F5 18 6,3x101 2,5 XX
F2 18 6,6x101 2,5 X
F1 18 6,6x101 2,5 X
*Casos: Número de observaciones en el nivel especificado del factor.
*Media LS: Media estimada por mínimos cuadrados (promedio de las observaciones en el nivel del
factor indicado).
*Sigma LS: Error estándar estimado de la media por mínimos cuadrados.
X=Primer grupo homogéneo; X=Segundo grupo homogéneo; X=Tercer grupo homogéneo
Gráfico 1: Gráfico de medias para porcentaje de germinación por fracción del extracto
aplicada sobre las semillas.
71
4.1.2 Comparaciones de medias de los niveles del tercer factor (tipo de semilla) sobre el
indicador germinación.
Mediante la prueba de Tukey al 95% de confianza (tabla 19) se encontraron 3 grupos
homogéneos en el factor tipo de semilla. Del análisis de esta tabla se infiere que cada uno
de los tres niveles de este factor causó un efecto significativo sobre la germinación. Es
decir, las semillas exhibieron un porcentaje de germinación que difiere estadísticamente de
acuerdo a la especie a la que corresponden, siendo las semillas de holco las que menor
porcentaje de germinación presentaron y las de quinua las que mostraron un mayor
porcentaje de germinación. Esta distinción se aprecia con claridad en el gráfico de medias
correspondiente al porcentaje de germinación por tipo de semilla (gráfico 2). Este gráfico
también muestra un intervalo alrededor de cada media. El tamaño de las barras indica que
los datos son homocedásticos (varianzas homogéneas).
Tabla 19: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para porcentaje de germinación por
tipo de semilla.
Tipo de semilla Casos* Media LS* Sigma LS* Grupos Homogéneos
H 42 4,3x101 1,6 X
FQ 42 6,0x101 1,6 X
Q 42 7,6x101 1,6 X
*Casos: Número de observaciones en el nivel especificado del factor.
*Media LS: Media estimada por mínimos cuadrados (promedio de las observaciones en el nivel del
factor indicado).
*Sigma LS: Error estándar estimado de la media por mínimos cuadrados.
X=Primer grupo homogéneo; X=Segundo grupo homogéneo; X=Tercer grupo homogéneo
Gráfico 2: Gráfico de medias para porcentaje de germinación por tipo de semilla.
72
4.1.3 Efecto de las interacciones entre los factores sobre el indicador germinación.
El análisis de varianza inicial (tabla 17) mostró que las interacciones entre fracción y
método de obtención del extracto; fracción y tipo de semilla; y método de obtención y tipo
de semilla, tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre la germinación. Se
aceptaron todas las hipótesis alternativas correspondientes a las interacciones.
El gráfico de las interacciones entre el método de extracción y la fracción del extracto
(gráfico 3) revela que las fracciones de los extractos obtenidos con uno u otro método
tuvieron un efecto específico sobre la variable mencionada. De esta manera, las fracciones
correspondientes al extracto obtenido mediante el método de extracción con nitrógeno
líquido (método 2) exhibieron un mayor efecto inhibitorio en la germinación que sus
contrapartes derivadas del extracto crudo etanólico (método 1). Las fracciones que mayor
efecto presentaron son la fracción 0 (extracto crudo sin fraccionar) y la fracción 3 del
extracto obtenido con nitrógeno líquido.
Gráfico 3: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del
extracto y método de extracción para el porcentaje de germinación.
Las fracciones de los extractos afectaron de manera específica la germinación de cada
tipo de semilla. En el gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción
del extracto y tipo de semilla (gráfico 4) se aprecia que las semillas que menor porcentaje
de germinación presentaron corresponden a las de holco. En el gráfico también se distingue
el pronunciado efecto inhibitorio de los extractos crudos sin fraccionar sobre la
germinación de los tres tipos de semillas y el de la fracción 3 sobre la germinación de las
malezas (holco y falsa quinua). En el caso de la quinua, ninguna de las fracciones mostró
un efecto inhibitorio equiparable al de los extractos crudos.
Del gráfico de interacciones de los factores correspondientes a método de extracción y
tipo de semilla (gráfico 5) se deduce que los métodos de obtención de los extractos crudos
73
incidieron de manera diferente en la germinación de las semillas según su tipo. Con los dos
métodos de obtención se obtuvo un mayor porcentaje de germinación en las semillas de
quinua y un menor porcentaje en las semillas de holco, pero en el gráfico se evidencia que
con los extractos obtenidos con nitrógeno líquido se obtuvo un mejor efecto inhibitorio
sobre las malezas y una menor incidencia sobre la germinación de las semillas de quinua.
Gráfico 4: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del
extracto y tipo de semilla para el porcentaje de germinación.
Gráfico 5: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a método de
extracción y tipo de semilla para el porcentaje de germinación.
74
4.2 Análisis estadístico del efecto de los factores de estudio sobre el indicador
crecimiento radicular
El análisis de varianza para la evaluación del crecimiento radicular (tabla 20) reveló
que los tres factores estudiados ejercieron un efecto estadísticamente significativo sobre
esta variable, por lo que se aceptaron las hipótesis alternativas. Los resultados señalan que
las fracciones de los extractos crudos de las inflorescencias de C. carbonaria obtenidos por
los dos métodos afectaron significativamente al crecimiento radicular de los tres tipos de
semillas.
Tabla 20: Análisis de varianza para la evaluación del crecimiento radicular de las
semillas de quinua, falsa quinua y holco aplicando siete fracciones de los extractos de C.
carbonaria obtenidos por dos métodos de extracción.
Fuente Suma de
Cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:Fracción 2,6x102 6 4,3x10
1 1,2x10
2 0,00**
B:Método de extracción 4,3x101 1 4,3x10
1 1,2x10
2 0,00**
C:Tipo de semilla 1,4x102 2 6,8x10
1 1,9x10
2 0,00**
INTERACCIONES
AB 4,6x101 6 7,7 2,1x10
1 0,00**
AC 6,0x101 12 5,0 1,4x10
1 0,00**
BC 1,4 2 7,0x10-1
1,9 0,14
RESIDUOS 4,4x102 1229 3,6x10
-1
TOTAL (CORREGIDO) 9,9x102 1258
**Diferencia altamente significativa al 95% de confianza (Valor P<0,05).
4.2.1 Comparaciones de medias de los niveles del primer factor (fracción del extracto)
sobre el indicador crecimiento radicular.
La prueba de Tukey al 95% de confianza para la fracción del extracto (tabla 21)
demostró la existencia de tres grupos homogéneos: 1) fracciones 0 y 3; 2) fracciones 4 y 5;
y 3) blanco y fracciones 1 y 2. Así como en el caso de la prueba análoga realizada para el
efecto de las fracciones del extracto sobre la germinación (tabla 18), los resultados indican
que la fracción que tuvo un efecto inhibitorio sobre el crecimiento radicular comparable
con el del extracto crudo sin fraccionar corresponde a la fracción 3.
En el gráfico de medias correspondiente (gráfico 6) es notable la distinción entre los
tres grupos homogéneos encontrados y la similitud en los efectos inhibitorios ejercidos por
el extracto crudo y la fracción 3.
75
Tabla 21: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para crecimiento radicular por fracción
del extracto aplicada sobre las semillas.
Fracción Casos* Media LS* Sigma LS* Grupos Homogéneos
F0 180 2,2x10-1
4,5x10-2
X
F3 180 3,6x10-1
4,5x10-2 X
F4 180 1,1 4,5x10-2 X
F5 180 1,1 4,5x10-2 X
F2 180 1,3 4,5x10-2 X
B 180 1,4 4,5x10-2 X
F1 180 1,4 4,5x10-2 X
*Casos: Número de observaciones en el nivel especificado del factor.
*Media LS: Media estimada por mínimos cuadrados (promedio de las observaciones en el nivel del
factor indicado).
*Sigma LS: Error estándar estimado de la media por mínimos cuadrados.
X=Primer grupo homogéneo; X=Segundo grupo homogéneo; X=Tercer grupo homogéneo
Gráfico 6: Gráfico de medias para crecimiento radicular por fracción del extracto
aplicada sobre las semillas.
4.2.2 Comparaciones de medias de los niveles del segundo factor (método de extracción)
sobre el indicador crecimiento radicular.
Mediante la prueba de Tukey al 95% de confianza (tabla 22) se determinaron dos
grupos homogéneos, uno por cada método de extracción aplicado. Esto indica que el
76
crecimiento radicular de las semillas fue significativamente diferente con cada extracto
obtenido. Según los resultados obtenidos en la prueba de Tukey y en el gráfico de medias
(gráfico 7), con el método de extracción por maceración etanólica se tuvo un crecimiento
radicular más bajo en las semillas. El blanco (B) constituido de etanol al 16% y evaluado
para este método demostró afectar el crecimiento de las semillas, por lo que este efecto
más pronunciado en la inhibición con el extracto etanólico podría ser atribuido no solo al
extracto en sí, sino también a los residuos de etanol que podría contener.
Tabla 22: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para crecimiento radicular por método
de obtención del extracto.
Método de extracción Casos* Media LS* Sigma LS* Grupos Homogéneos
1 630 8,0x10-1
2,4x10-2
X
2 630 1,2 2,4x10-2
X *Casos: Número de observaciones en el nivel especificado del factor.
*Media LS: Media estimada por mínimos cuadrados (promedio de las observaciones en el nivel del
factor indicado).
*Sigma LS: Error estándar estimado de la media por mínimos cuadrados.
X=Primer grupo homogéneo; X=Segundo grupo homogéneo
Gráfico 7: Gráfico de medias para crecimiento radicular por método de obtención del
extracto crudo.
77
4.2.3 Comparaciones de medias de los niveles del tercer factor (tipo de semilla) sobre el
indicador crecimiento radicular.
Mediante la prueba de Tukey al 95% de confianza (tabla 23) se encontraron 3 grupos
homogéneos en el factor correspondiente al tipo de semilla. Este resultado muestra que el
crecimiento radicular de las semillas difirió estadísticamente de acuerdo a su especie. En el
gráfico de medias (gráfico 8) se observa que las semillas con menor crecimiento radicular
fueron las de quinua, mientras que las que exhibieron una mayor longitud en sus raíces
fueron las semillas de falsa quinua.
Tabla 23: Prueba de Tukey (al 95% de confianza) para crecimiento radicular por tipo de
semilla.
Tipo de semilla Casos* Media LS* Sigma LS* Grupos Homogéneos
Q 420 5,8x10-1
2,9x10-2
X
H 420 1,0 2,9x10-2 X
FQ 420 1,4 2,9x10-2 X
*Casos: Número de observaciones en el nivel especificado del factor.
*Media LS: Media estimada por mínimos cuadrados (promedio de las observaciones en el nivel del
factor indicado).
*Sigma LS: Error estándar estimado de la media por mínimos cuadrados.
X=Primer grupo homogéneo; X=Segundo grupo homogéneo; X=Tercer grupo homogéneo
Gráfico 8: Gráfico de medias para crecimiento radicular por tipo de semilla.
78
4.2.4 Efecto de las interacciones entre los factores sobre el indicador crecimiento
radicular.
El análisis de varianza para el crecimiento radicular (tabla 20) reveló que las
interacciones entre fracción y método de obtención del extracto y fracción y tipo de semilla
tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre la variable, mientras que la
interacción entre método de obtención y tipo de semilla no. Solo en este último caso se
aceptó la hipótesis nula, en los demás, las hipótesis alternativas.
El gráfico de las interacciones entre el método de extracción y la fracción del extracto
(gráfico 9) muestra que las fracciones correspondientes al extracto obtenido mediante
extracción con nitrógeno líquido (método 2) exhibieron un efecto inhibitorio ligeramente
mayor en el crecimiento radicular que las fracciones obtenidas a partir del extracto
etanólico. Es evidente el efecto inhibitorio similar que se obtuvo entre los extractos crudos
y las fracciones 3.
Gráfico 9: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del
extracto y método de extracción para el crecimiento radicular.
Del gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del extracto y
tipo de semilla (gráfico 10) se deduce que las fracciones de los extractos afectaron de
manera específica el crecimiento radicular de cada tipo de semilla, sin embargo, la
diferencia en los efectos no es tan drástica como la que se observó en el análisis de esta
interacción sobre la germinación (gráfico 4). Se aprecia que la inhibición del crecimiento
radicular ejercida por las fracciones 3 fue similar a la de los extractos crudos, y que dicha
inhibición fue más pronunciada en el caso de las malezas que en las semillas de quinua.
79
En el análisis de varianza (tabla 20) se determinó que la interacción entre el método de
extracción y el tipo de semilla no causó un efecto significativo en el crecimiento radicular.
El método de obtención de los extractos crudos no tuvo influencia específica sobre uno u
otro tipo de semilla, sin embargo, el gráfico de interacciones (gráfico 11) evidencia que el
crecimiento radicular fue menor en los tres tipos de semillas con el método de extracción
por maceración etanólica.
Gráfico 10: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del
extracto y tipo de semilla para el crecimiento radicular.
Gráfico 11: Gráfico de interacciones de los factores correspondientes a fracción del
extracto y método de extracción para el crecimiento radicular.
80
4.3 Resultados de las pruebas cualitativas de las fracciones
Se realizaron los ensayos fitoquímicos que se detallan en las tablas 24 y 25. En la
fracción 1 de los dos extractos se descartó la presencia de alcaloides mediante los ensayos
de Mayer, Dragendorff y Wagner, por lo que se determinó que esta fracción no poseía
ningún grupo fitoquímico importante. Este resultado se confirmó en la cromatografía de
capa fina (tabla 26).
Tabla 24: Lista de cotejo con los resultados de los ensayos fitoquímicos para las
fracciones correspondientes al extracto obtenido mediante maceración etanólica.
Método Fracción Prueba Resultado Observaciones
M1
F1
Ensayo de Mayer - -
Ensayo de Dragendorff - -
Ensayo de Wagner - -
F2
Ensayo de Liebermann-
Burchard - -
Ensayo de Zack - -
F3
Ensayo de Shinoda + Coloración roja.
Ensayo de Borntrager - -
Ensayo de la gelatina ++ Precipitado blanco.
Ensayo de la espuma - -
Ensayo del cloruro férrico + Coloración azul.
Ensayo de Fehling ++ Coloración roja.
F4
Ensayo de Shinoda - -
Ensayo de Borntrager - -
Ensayo de la gelatina - -
Ensayo de la espuma - -
Ensayo del cloruro férrico - -
Ensayo de Fehling - -
F5
Ensayo de Liebermann-
Burchard - -
Ensayo de Baljet + Coloración café
rojiza.
Reacción de Kedde - - Ensayo de hidroxamato
férrico - -
81
Tabla 25: Lista de cotejo con los resultados de los ensayos fitoquímicos para las
fracciones correspondientes al extracto obtenido con nitrógeno líquido.
Método Fracción Prueba Positivo Observaciones
M2
F1
Ensayo de Mayer - -
Ensayo de Dragendorff - -
Ensayo de Wagner - -
F2
Ensayo de Liebermann-
Burchard - -
Ensayo de Zack + Coloración verde.
F3
Ensayo de Shinoda + Coloración rosada.
Ensayo de Borntrager - -
Ensayo de la gelatina - -
Ensayo de la espuma - -
Ensayo del cloruro férrico + Coloración azul.
Ensayo de Fehling + Coloración roja.
F4
Ensayo de Shinoda - -
Ensayo de Borntrager - -
Ensayo de la gelatina - -
Ensayo de la espuma - -
Ensayo del cloruro férrico - -
Ensayo de Fehling - -
F5
Ensayo de Liebermann-
Burchard - -
Ensayo de Baljet ++ Coloración rojiza.
Reacción de Kedde - - Ensayo de hidroxamato
férrico +++ Coloración violeta.
La fracción 2 dio un resultado negativo en el ensayo de Liebermann-Burchard en los
dos extractos. El ensayo de Zack para la confirmación de triterpenos y esteroides arrojó un
resultado negativo en la fracción 2 del primer extracto, pero dio positivo en la del segundo
extracto. Se descartó la presencia de esteroles en la cromatografía de capa fina y se observó
un resultado positivo para sesquiterpenos en las fracciones de los dos extractos (tabla 26).
A pesar de que los dos métodos de obtención de los extractos crudos utilizados
corresponden a extracciones “en frío” (recomendadas para cuando se tienen componentes
volátiles o termolábiles en la muestra) (Bart & Pilz, 2011), en el caso de la maceración
etanólica, la muestra pasa un mayor período de tiempo expuesta al ambiente, por lo que
podría haber pérdidas de componentes volátiles como los triterpenos presentes en los
aceites esenciales; mientras que en el método con nitrógeno líquido, la liberación de los
metabolitos de la matriz vegetal es inmediata y por tanto estas pérdidas serían inferiores.
82
Esto podría explicar la ausencia de triterpenos en el primer extracto y la presencia de los
mismos en el segundo. En el análisis cromatográfico de sesquiterpenos se halló un
resultado positivo en ambos extractos, siendo una posible explicación el hecho de que no
todos los sesquiterpenos se encuentran formando parte de aceites esenciales ni están libres
en la matriz vegetal, por lo que la volatilidad de estos es reducida. Constituyendo el grupo
más abundante de compuestos terpénicos, algunos sesquiterpenos forman parte de tejidos
vegetales de flores, hojas, leños, raíces, cortezas, frutos y semillas, mismos que pudieron
arrojar el resultado positivo observado en el análisis cromatográfico.
Tabla 26: Lista de cotejo con los resultados de la cromatografía en capa fina para las
fracciones de los dos extractos.
Método Grupo fitoquímico Resultado
M1
Alcaloides Negativo
Esteroles Negativo
Flavonoides Positivo
Antraquinonas Negativo
Sesquiterpenos Positivo
Glucósidos cardiotónicos Negativo
M2
Alcaloides Negativo
Esteroles Negativo
Flavonoides Positivo
Antraquinonas Negativo
Sesquiterpenos Positivo
Glucósidos cardiotónicos Negativo
En las fracciones 3 de ambos extractos se obtuvieron resultados positivos para los
ensayos de Shinoda, cloruro férrico y Fehling, que confirmaron la presencia de
flavonoides, taninos hidrolizables o pirogalactónicos (coloración azul) y azúcares
reductores, respectivamente. La fracción 3 del primer extracto dio positivo, además, en el
ensayo de la gelatina (para reconocimiento de taninos). Adicionalmente, los flavonoides
fueron identificados mediante cromatografía de capa fina bajo la revelación en luz UV y
fluorescente. En la placa se obtuvieron 2 manchas, con las características expuestas en la
tabla 27, al correr la muestra de la fracción 3 proveniente del extracto obtenido por
maceración etanólica; y 4 manchas cuyas características se resumen en la tabla 28, con la
fracción análoga proveniente del extracto obtenido con nitrógeno líquido. Al comparar las
características, tanto de valores del Rf como color, se estableció que estas manchas
guardan relación con algunos datos bibliográficos obtenidos para estos compuestos en
corridas realizadas en las mismas condiciones (misma fase estacionaria y misma fase
móvil) (tabla 29). Sin embargo, este reconocimiento solo da una pauta para la
determinación del tipo de compuestos flavonoidicos (flavonas, flavonoles, isoflavonas,
83
flavanonas, auronas, chalconas) que se podrían encontrar en el extracto si se realizara un
análisis cualitativo más exhaustivo.
Tabla 27: Características de las manchas identificadas en la cromatografía de capa fina
de la fracción 3 proveniente del extracto obtenido por maceración etanólica.
Rf Color en luz visible Color en luz UV Color en fluorescencia
0,57 --- Marrón Amarillo verdoso
0,39 Amarillo pardo Marrón Amarillo verdoso
Tabla 28: Características de las manchas identificadas en la cromatografía de capa fina
de la fracción 3 proveniente del extracto obtenido con nitrógeno líquido.
Rf Color en luz visible Color en luz UV Color en fluorescencia
0,92 Amarillo Azul intenso No
0,75 Amarillo Amarillo pardo No
0,57 Amarillo pardo Marrón No
0,39 Amarillo pardo Marrón Amarillo verdoso
Tabla 29: Datos bibliográficos de las características de algunos flavonoides en
cromatografía de capa fina (fase móvil: butanol-ácido acético-agua 4:1:5).
Rf Color en luz UV Color en fluorescencia Compuesto
0,93 Azul --- Kampferol 3,5,7,4'-tetrametil
0,75 Amarillo --- Quercetina 5,7,3',4-tetrametil
0,56 Marrón oscuro --- Saponaretina
0,4 --- Amarillo verdoso Robinetina
Fuente: Harborne (1959)
Se ha observado que muchos compuestos fenólicos, tales como los flavonoides,
taninos y coumarinas pueden alterar el balance hormonal de una planta, lo que conlleva a
una inhibición de su crecimiento. Algunos flavonoides inhiben la respiración y afectan la
absorción mineral, mientras que los taninos tienen un efecto inhibitorio debido a su
capacidad de unirse a las proteínas y pueden inhibir la acción de fitohormonas cuando se
unen a moléculas hormonales o bloquean su proceso (Sampietro, 2001).
Los compuestos fenólicos en general suelen exhibir diversos efectos alelopáticos,
como el efecto herbicida observado en este caso sobre las semillas ensayadas. De acuerdo
con los resultados detallados anteriormente, con las fracciones 3 se obtuvo un efecto
inhibitorio más marcado.
En las fracciones 4 de los dos extractos se realizaron los mismos ensayos que en las
fracciones 3, pero se descartó la presencia de los grupos fitoquímicos analizados. En la
84
fracción 5 del primer extracto se obtuvo un resultado positivo en el ensayo de Baljet,
reconociéndose la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico. En la fracción 5
del segundo extracto también se confirmó la presencia de compuestos con agrupamiento
lactónico mediante este ensayo y adicionalmente se reconoció la presencia de coumarinas
con el resultado positivo del ensayo de hidroxamato férrico.
4.4 Cuantificación de flavonoides
Se realizó la cuantificación de flavonoides de la fracción 3 del extracto obtenido con
nitrógeno líquido, al considerarse que dicha fracción fue la que evidenció un mayor efecto
sobre la inhibición de la germinación y del crecimiento radicular de las malezas. La curva
de calibración realizada para el cálculo de la concentración de flavonoides totales en la
fracción (gráfico 12) fue obtenida con los valores indicados en la tabla 30.
Tabla 30: Valores de absorbancia obtenidos de la lectura de absorbancia de 6 soluciones
etanólicas estándar de quercetina de concentraciones: 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,0625
mg/mL.
Estándar Concentración, mg/mL Absorbancia
1 2,0 2,398
2 1,0 1,277
3 5,0x10-1
0,431
4 2,5x10-1
0,210
5 1,2x10-1
0,141
6 6,2x10-2
0,049
Gráfico 12: Curva de calibración.
y = 1,2x - 0,062
R² = 0,99
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Ab
sorb
anci
a
Concentración, mg/mL
85
La absorbancia de la muestra fue de 1,583. Se ejecutaron los cálculos correspondientes
mediante la ecuación de la recta obtenida de la curva de calibración y se determinó que la
concentración de flavonoides de la fracción corresponde a 2,7mg de quercetina por gramo
de fracción.
Se calculó la densidad de dicha fracción con los valores expuestos en la tabla 31 para
expresar el resultado en mg de quercetina por g de flores. La densidad calculada fue de
1,024g/mL.
Tabla 31: Valores para el cálculo de la densidad de la fracción 3 del extracto obtenido
con nitrógeno líquido.
Picnómetro Peso, g
Vacío 11,198
Con agua destilada 12,191
Con fracción 12,215
Teniendo en cuenta el valor de la densidad de la fracción y que, de acuerdo al peso de
las flores de C. carbonaria utilizadas para el fraccionamiento, 50,0mL de fracción
equivalen a 10,65g de flores, se estimó que la cantidad de flavonoides totales es de 12,8mg
de quercetina por gramo de flores.
86
CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
Mediante los ensayos fitoquímicos y la cromatografía en capa fina, se
identificó la presencia de sesquiterpenos, flavonoides, taninos hidrolizables,
azúcares reductores y compuestos con agrupamiento lactónico en las
fracciones obtenidas del extracto etanólico; y triterpenos, sesquiterpenos,
flavonoides, taninos hidrolizables, azúcares reductores, compuestos con
agrupamiento lactónico y coumarinas en las fracciones correspondientes al
extracto obtenido con nitrógeno líquido.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se determinó que la fracción de
mayor actividad herbicida entre las que fueron ensayadas sobre las malezas fue
la fracción 3 del extracto obtenido con nitrógeno líquido. Esta fracción se
obtuvo realizando una extracción de una alícuota del extracto madre con éter
de petróleo, separando la fase acuosa, extrayendo esta fase con metanol-agua
(50:50) y separando el residuo líquido. En esta fracción fueron identificados
los siguientes grupos fitoquímicos: flavonoides, taninos hidrolizables y
azúcares reductores.
El efecto inhibitorio tanto de la germinación como del crecimiento radicular
ejercido por las fracciones derivadas del extracto obtenido con nitrógeno
líquido fue más pronunciado en las malezas (falsa quinua y holco) que en la
quinua. Las semillas de quinua presentaron porcentajes de germinación de
aproximadamente 74%, las de falsa quinua de 62% y las de holco de 52% con
el blanco. Con la fracción de mayor actividad, el porcentaje de germinación de
las semillas de quinua fue de aproximadamente un 80%, de la falsa quinua
50% y del holco 26%. A pesar de que las semillas de quinua exhibieron un
menor crecimiento radicular, en comparación con el blanco, las semillas de
holco fueron las más afectadas en esta característica. Con el blanco, el
crecimiento radicular obtenido para las semillas de quinua fue
aproximadamente de 0,8cm, de 1,7cm para las semillas de falsa quinua y de
1,6cm para las de holco. Con la fracción de mayor actividad, los resultados de
crecimiento radicular fueron de 0,4cm para las semillas de quinua, 0,5cm para
las de falsa quinua y 0,2cm para las de holco. El efecto inhibitorio de la
87
germinación de las semillas de holco también fue más marcado en
comparación con el de las otras semillas.
Se cuantificó la cantidad de flavonoides totales en la fracción de mayor
actividad. La concentración obtenida fue de 2,7mg de quercetina por g de
fracción, o 12,8mg de quercetina por g de inflorescencias de C. carbonaria.
Este resultado podría compararse con la cantidad de flavonoides determinada
en otras plantas que también han demostrado tener actividad herbicida. Por
ejemplo, se ha verificado el efecto inhibitorio del extracto de flores y hojas de
Zygophyllum album sobre malezas como Bromus tectorum (Nesrine et al.,
2012). La cantidad de flavonoides que se ha cuantificado en las partes aéreas
de esta planta corresponde a 4,1mg de quercetina por g de planta, según los
resultados de un estudio realizado por Mnafgui et al (2012).
5.2 Recomendaciones
Probar métodos más específicos para la separación de los grupos fitoquímicos
presentes en la fracción de mayor actividad (flavonoides, taninos) para
determinar con cuál se obtiene una mayor acción herbicida.
Realizar un análisis cualitativo más exhaustivo de la fracción de mayor
actividad que determine los posibles compuestos específicos presentes en ella,
por ejemplo, mediante técnicas cromatográficas como cromatografía de gases
acoplada con espectrometría de masas.
Realizar un análisis cuantitativo de los grupos fitoquímicos presentes en la
fracción de mayor actividad.
88
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96
ANEXOS
A. Diagrama de Ishikawa (espina de pescado)
97
B. Diagrama de flujo
Inicio
Recolección de
material vegetal
Acondicionamiento Desechos (aguas de
lavado, residuos sólidos)
Extracción Desechos
Fraccionamiento
Pruebas de
inhibición
Inflorescencias
Extractos crudos
Extractos
crudos Fracciones
Fracciones,
semillas
Pruebas cualitativas
Fracciones,
reactivos
específicos
Análisis estadístico
(determinación de
fracción activa)
Cuantificación de flavonoides Fracción activa
Interpretación de
resultados
Fin
98
C. Instrumentos de recolección de datos
C1. Guía de observación (porcentaje de germinación).
Código
muestra
Número de semillas que germinaron por caja
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
M1F1Q 5 8 7 7 14 9 * * * * * * 9 17 10
M1F1FQ 6 4 5 7 4 5 * * * * * * 14 9 11
M1F1H 0 0 0 0 0 0 * * * * * * 0 0 0
M1F2Q 8 6 4 9 10 11 * * * * * * 13 14 12
M1F2FQ 5 7 1 5 8 2 * * * * * * 11 14 9
M1F2H 0 0 0 1 0 0 * * * * * * 1 0 0
M1F3Q 3 3 3 8 5 4 * * * * * * 12 10 8
M1F3FQ 4 4 6 4 5 8 * * * * * * 9 10 8
M1F3H 0 0 0 1 0 0 * * * * * * 1 0 0
M1F4Q 8 6 7 10 9 13 * * * * * * 12 12 16
M1F4FQ 3 2 4 4 2 5 * * * * * * 13 13 6
M1F4H 0 0 0 0 0 0 * * * * * * 2 0 2
M1F5Q 6 10 7 11 13 9 * * * * * * 15 12 11
M1F5FQ 4 5 6 6 6 8 * * * * * * 9 10 11
M1F5H 0 0 0 0 0 0 * * * * * * 0 0 0
M1F0Q 1 0 4 7 2 4 * * * * * * 7 5 5
M1F0FQ 0 1 0 3 3 2 * * * * * * 4 3 4
M1F0H 0 0 0 0 0 0 * * * * * * 0 0 0
M1BQ 5 9 7 10 9 11 * * * * * * 13 12 13
M1BFQ 2 5 1 3 5 1 * * * * * * 11 9 7
M1BH 0 0 0 0 0 0 * * * * * * 1 0 0
M2F1Q 11 11 9 * * * 14 13 10 * * * 14 13 15
M2F1FQ 4 3 4 * * * 8 8 5 * * * 8 15 7
M2F1H 0 0 0 * * * 0 1 0 * * * 3 1 0
M2F2Q 3 2 4 * * * 12 7 8 * * * 13 12 12
M2F2FQ 2 4 1 * * * 3 5 4 * * * 6 13 5
M2F2H 0 0 0 * * * 0 0 0 * * * 1 0 0
99
C2. Guía de observación (crecimiento radicular).
Método
de
extracción
Código de
muestra
Longitud de radícula (cm)
Método
de
extracción
Código de
muestra
Longitud de radícula (cm)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M1
F1Q1 0,5 0,2 0,5 0,8 0,9 0,4 0,2 0,2 0,4 0,2
M2
F1Q1 1,0 0,9 0,9 0,7 1,0 0,8 1,6 0,9 0,4 0,5
F1Q2 0,5 0,6 0,5 0,6 0,9 0,7 0,5 0,4 0,6 0,4
F1Q2 1,6 0,3 1,6 0,9 1,1 0,7 0,9 0,4 2,1 0,4
F1Q3 1,0 0,4 0,6 0,4 0,3 0,3 0,4 0,5 0,4 0,3
F1Q3 2,2 0,7 0,5 0,8 2,3 1,0 1,1 1,0 1,0 0,6
F1FQ1 1,3 1,3 1,8 2,1 1,7 1,4 2,2 1,7 1,2 1,9
F1FQ1 1,0 2,3 2,6 1,7 1,8 1,6 2,5 1,3 3,0 0,9
F1FQ2 1,1 2,6 1,9 1,2 2,5 0,7 0,7 1,9 0,8 1,1
F1FQ2 4,1 3,2 2,0 3,8 2,0 1,9 2,6 1,8 3,3 2,5
F1FQ3 1,5 2,0 2,1 1,6 2,7 1,6 1,7 2,0 0,8 1,1
F1FQ3 4,6 3,6 1,1 5,0 2,7 1,5 5,2 2,0 1,3 1,3
F1H1 1,0 1,5 2,5 1,6 1,1 0,6 2,4 0,8 0,7 0,2
F1H1 0,5 1,0 1,0 1,3 1,8 2,0 3,8 0,6 1,2 0,0
F1H2 0,8 1,0 0,5 0,9 1,4 0,3 0,1 0,5 0,0 0,0
F1H2 1,5 2,4 1,6 2,3 1,5 1,7 1,9 1,1 1,3 1,0
F1H3 0,9 0,9 1,5 2,3 0,8 0,7 1,1 0,4 0,8 1,2
F1H3 2,0 2,2 2,6 3,2 3,3 1,9 2,8 2,1 1,6 2,8
F2Q1 0,4 0,5 0,8 0,6 1,0 0,8 0,4 0,8 1,3 0,6
F2Q1 1,0 0,5 2,5 1,4 1,0 1,1 0,9 2,6 3,5 1,3
F2Q2 1,4 0,5 0,4 0,9 0,5 0,7 0,3 0,4 0,7 0,3
F2Q2 2,7 0,8 1,3 0,6 1,2 1,2 0,9 0,8 0,4 0,4
F2Q3 0,4 0,5 0,3 0,9 0,3 0,4 0,4 0,4 0,7 0,3
F2Q3 0,8 0,7 0,8 1,1 0,6 0,7 0,5 1,1 0,5 0,3
F2FQ1 2,2 1,5 1,6 1,1 2,5 2,3 1,7 1,1 1,5 1,9
F2FQ1 3,4 2,9 1,3 1,5 1,7 1,5 2,0 1,8 1,0 1,2
F2FQ2 2,5 2,4 1,7 1,5 1,0 1,8 2,4 1,0 1,6 1,1
F2FQ2 2,5 2,9 1,5 1,2 1,3 2,7 2,9 2,2 2,3 1,0
F2FQ3 3,4 0,8 1,0 1,0 2,4 1,1 1,0 1,1 0,7 0,9
F2FQ3 1,8 2,5 0,8 2,6 2,0 2,1 1,4 1,0 1,2 0,9
F2H1 1,0 0,8 0,5 0,2 0,5 0,7 0,9 2,0 1,7 2,2
F2H1 3,0 2,2 1,5 2,5 1,0 1,4 0,7 0,0 0,0 0,0
F2H2 1,0 2,0 0,9 1,6 0,8 2,2 1,9 2,1 0,7 1,5
F2H2 2,1 1,8 2,6 3,0 1,6 2,0 1,6 2,1 1,8 1,2
F2H3 0,4 2,1 0,5 0,8 1,2 1,0 0,7 0,0 0,0 0,0
F2H3 1,1 2,7 3,4 2,6 1,8 1,2 1,9 2,8 3,1 1,9
F3Q1 0,9 0,6 0,4 0,3 0,5 0,3 0,2 0,3 0,4 0,3
F3Q1 0,5 0,5 0,3 0,3 0,3 0,3 1,0 0,2 0,2 0,2
F3Q2 0,3 0,5 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2
F3Q2 0,8 0,5 0,9 0,6 0,4 0,4 1,0 0,2 0,5 0,5
F3Q3 0,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
F3Q3 0,5 0,4 0,6 0,3 0,2 0,5 0,2 0,4 0,3 0,2
100
D. Tabla de medias por mínimos cuadrados para germinación con intervalos
de confianza del 95,0%
Error Límite Límite
Nivel Casos Media Est. Inferior Superior
MEDIA GLOBAL 126 59,8413
Fracción
B 18 62,5 2,46713 57,6028 67,3972
F0 18 45,8333 2,46713 40,9361 50,7306
F1 18 65,8333 2,46713 60,9361 70,7306
F2 18 65,8333 2,46713 60,9361 70,7306
F3 18 53,0556 2,46713 48,1583 57,9528
F4 18 62,7778 2,46713 57,8806 67,675
F5 18 63,0556 2,46713 58,1583 67,9528
Método_extracción
1 63 61,3492 1,31874 58,7315 63,9669
2 63 58,3333 1,31874 55,7157 60,951
Tipo_semilla
FQ 42 60,119 1,61511 56,9131 63,325
H 42 42,9762 1,61511 39,7702 46,1822
Q 42 76,4286 1,61511 73,2226 79,6346
Fracción por Método_extracción
B,1 9 56,1111 3,48905 49,1854 63,0368
B,2 9 68,8889 3,48905 61,9632 75,8146
F0,1 9 60,0 3,48905 53,0743 66,9257
F0,2 9 31,6667 3,48905 24,741 38,5924
F1,1 9 63,8889 3,48905 56,9632 70,8146
F1,2 9 67,7778 3,48905 60,8521 74,7035
F2,1 9 67,7778 3,48905 60,8521 74,7035
F2,2 9 63,8889 3,48905 56,9632 70,8146
F3,1 9 58,8889 3,48905 51,9632 65,8146
F3,2 9 47,2222 3,48905 40,2965 54,1479
F4,1 9 62,2222 3,48905 55,2965 69,1479
F4,2 9 63,3333 3,48905 56,4076 70,259
F5,1 9 60,5556 3,48905 53,6298 67,4813
F5,2 9 65,5556 3,48905 58,6298 72,4813
Fracción por Tipo_semilla
B,FQ 6 61,6667 4,27319 53,1844 70,1489
B,H 6 51,6667 4,27319 43,1844 60,1489
B,Q 6 74,1667 4,27319 65,6844 82,6489
F0,FQ 6 46,6667 4,27319 38,1844 55,1489
F0,H 6 24,1667 4,27319 15,6844 32,6489
F0,Q 6 66,6667 4,27319 58,1844 75,1489
F1,FQ 6 65,8333 4,27319 57,3511 74,3156
F1,H 6 51,6667 4,27319 43,1844 60,1489
F1,Q 6 80,0 4,27319 71,5178 88,4822
F2,FQ 6 68,3333 4,27319 59,8511 76,8156
F2,H 6 54,1667 4,27319 45,6844 62,6489
F2,Q 6 75,0 4,27319 66,5178 83,4822
F3,FQ 6 51,6667 4,27319 43,1844 60,1489
F3,H 6 26,6667 4,27319 18,1844 35,1489
F3,Q 6 80,8333 4,27319 72,3511 89,3156
F4,FQ 6 69,1667 4,27319 60,6844 77,6489
F4,H 6 41,6667 4,27319 33,1844 50,1489
F4,Q 6 77,5 4,27319 69,0178 85,9822
F5,FQ 6 57,5 4,27319 49,0178 65,9822
F5,H 6 50,8333 4,27319 42,3511 59,3156
F5,Q 6 80,8333 4,27319 72,3511 89,3156
Método_extracción por Tipo_semilla
1,FQ 21 67,8571 2,28412 63,3232 72,3911
1,H 21 45,9524 2,28412 41,4184 50,4863
1,Q 21 70,2381 2,28412 65,7041 74,772
2,FQ 21 52,381 2,28412 47,847 56,9149
2,H 21 40,0 2,28412 35,4661 44,5339
2,Q 21 82,619 2,28412 78,0851 87,153
101
E. Tabla de medias por mínimos cuadrados para crecimiento radicular con
intervalos de confianza del 95,0%
Error Límite Límite
Nivel Casos Media Est. Inferior Superior
MEDIA GLOBAL 1263 0,985784
Fracción
B 180 1,35389 0,044765 1,26615 1,44163
F0 180 0,217222 0,044765 0,129484 0,30496
F1 180 1,37271 0,0448922 1,28473 1,4607
F2 180 1,33611 0,044765 1,24837 1,42385
F3 180 0,359444 0,044765 0,271707 0,447182
F4 180 1,11556 0,044765 1,02782 1,20329
F5 180 1,14556 0,044765 1,05782 1,23329
Método de extracción
1 630 0,800952 0,0239279 0,754054 0,84785
2 630 1,17062 0,0239473 1,12368 1,21755
Tipo de semilla
FQ 420 1,38354 0,0293413 1,32604 1,44105
H 420 0,995238 0,0293056 0,9378 1,05268
Q 420 0,578571 0,0293056 0,521133 0,636009
Fracción por Método de extracción
B,1 90 0,884444 0,0633073 0,760364 1,00852
B,2 90 1,82333 0,0633073 1,69925 1,94741
F0,1 90 0,252222 0,0633073 0,128142 0,376302
F0,2 90 0,182222 0,0633073 0,0581421 0,306302
F1,1 90 0,997778 0,0633073 0,873698 1,12186
F1,2 90 1,74765 0,0636665 1,62287 1,87243
F2,1 90 1,08222 0,0633073 0,958142 1,2063
F2,2 90 1,59 0,0633073 1,46592 1,71408
F3,1 90 0,425556 0,0633073 0,301475 0,549636
F3,2 90 0,293333 0,0633073 0,169253 0,417414
F4,1 90 1,07222 0,0633073 0,948142 1,1963
F4,2 90 1,15889 0,0633073 1,03481 1,28297
F5,1 90 0,892222 0,0633073 0,768142 1,0163
F5,2 90 1,39889 0,0633073 1,27481 1,52297
Fracción por Tipo de semilla
B,FQ 60 1,70333 0,0775352 1,55137 1,8553
B,H 60 1,57833 0,0775352 1,42637 1,7303
B,Q 60 0,78 0,0775352 0,628033 0,931967
F0,FQ 60 0,285 0,0775352 0,133033 0,436967
F0,H 60 0,0916667 0,0775352 -0,0602999 0,243633
F0,Q 60 0,275 0,0775352 0,123033 0,426967
F1,FQ 60 2,02814 0,0781943 1,87488 2,1814
F1,H 60 1,375 0,0775352 1,22303 1,52697
F1,Q 60 0,715 0,0775352 0,563033 0,866967
F2,FQ 60 1,71333 0,0775352 1,56137 1,8653
F2,H 60 1,445 0,0775352 1,29303 1,59697
F2,Q 60 0,85 0,0775352 0,698033 1,00197
F3,FQ 60 0,481667 0,0775352 0,3297 0,633633
F3,H 60 0,231667 0,0775352 0,0797001 0,383633
F3,Q 60 0,365 0,0775352 0,213033 0,516967
F4,FQ 60 1,76333 0,0775352 1,61137 1,9153
F4,H 60 1,085 0,0775352 0,933033 1,23697
F4,Q 60 0,498333 0,0775352 0,346367 0,6503
F5,FQ 60 1,71 0,0775352 1,55803 1,86197
F5,H 60 1,16 0,0775352 1,00803 1,31197
F5,Q 60 0,566667 0,0775352 0,4147 0,718633
Método de extracción por Tipo de semilla
1,FQ 210 1,21333 0,0414443 1,1321 1,29456
1,H 210 0,764286 0,0414443 0,683056 0,845515
1,Q 210 0,425238 0,0414443 0,344009 0,506468
2,FQ 210 1,55375 0,0415453 1,47233 1,63518
2,H 210 1,22619 0,0414443 1,14496 1,30742
2,Q 210 0,731905 0,0414443 0,650675 0,813134
102
F. Fotografías del proceso realizado y de los resultados obtenidos
F1. Acondicionamiento de la muestra.
Muestras recolectadas de
inflorescencias de C. carbonaria
Lavado de las muestras con hipoclorito de sodio 1%
F2. Obtención de los extractos crudos.
Maceración con etanol al 70%
Filtrado del extracto crudo etanólico
103
Extracto etanólico centrifugado
Extracto obtenido con nitrógeno líquido
centrifugado
F3. Análisis de alcaloides (fracción 1).
Acidificación del extracto con HCl 5%
Alcalinización del extracto con NaOH 20%
104
Extracción con cloroformo
Separación de fase acuosa y clorofórmica
F4. Análisis de esteroles, flavonoides, antraquinonas, taninos y saponinas (fracciones 2, 3
y 4).
Extracción con éter de
petróleo
Filtrado del residuo obtenido
de la maceración de la fase
acuosa con metanol:agua
(1:1)
Residuo lavado con
cloroformo
105
F5. Análisis de sesquiterpenolactonas, coumarinas, heterósidos cardiotónicos (fracción
5).
Precipitación del extracto con
acetato de plomo 20%
Filtrado del precipitado
Extracción del filtrado con
cloroformo
F6. Concentración en el rotavapor.
106
F7. Dosificación de las fracciones.
Dosificación de las fracciones en las
cajas Petri con las semillas
Cajas colocadas en la cámara de germinación
F8. Ensayos cualitativos de las fracciones.
Ensayo de Zack
Ensayo de Shinoda
Ensayo de la gelatina
107
Ensayo de Fehling
Ensayo de Baljet
Ensayo de cloruro
férrico
Ensayo de
hidroxamato
férrico
Placa de cromatografía en capa
fina de flavonoides vista a la luz
visible
Placa de cromatografía en
capa fina de flavonoides
vista a la luz UV
Placa de cromatografía en
capa fina de flavonoides
vista en fluorescencia
108
Placa de cromatografía en
capa fina de sesquiterpenos
Placa de cromatografía en
capa fina de antraquinonas
Placa de cromatografía
en capa fina de esteroles
F9. Ensayos de inhibición (fracciones del extracto crudo etanólico).
Germinación y crecimiento
de la quinua con el blanco
de etanol al 16%
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con el
blanco de etanol al 16%
Germinación y crecimiento
del holco con el blanco de
etanol al 16%
109
Germinación y crecimiento
de la quinua con el extracto
crudo sin fraccionar (F0)
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con el
extracto crudo sin
fraccionar (F0)
Germinación y crecimiento
del holco con el extracto
crudo sin fraccionar (F0)
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 1
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 1
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 1
110
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 2
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 2
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 2
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 3
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 3
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 3
111
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 4
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 4
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 4
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 5
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 5
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 5
112
F10. Ensayos de inhibición (fracciones del extracto obtenido con nitrógeno líquido).
Germinación y crecimiento
de la quinua con agua
(blanco 2)
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con agua
(blanco 2)
Germinación y crecimiento
del holco con agua (blanco 2)
Germinación y crecimiento
de la quinua con el extracto
crudo sin fraccionar (F0)
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con el
extracto crudo sin fraccionar
(F0)
Germinación y crecimiento
del holco con el extracto
crudo sin fraccionar (F0)
113
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 1
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 1
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 1
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 2
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 2
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 2
114
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción
3
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 3
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 3
.
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 4
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 4
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 4
115
Germinación y crecimiento
de la quinua con la fracción 5
Germinación y crecimiento
de la falsa quinua con la
fracción 5
Germinación y crecimiento
del holco con la fracción 5