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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“Determinación de la presencia de Mycoplasma haemofelis en refugios
felinos de la ciudad de quito y sus valles”.
Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del
Título de Médico Veterinario Zootecnista
AUTORA
TAPIA GILER DIANA ELIZABETH
TUTOR
DR. RENÁN MENA PÉREZ
COTUTORA
DRA. NADIA LÓPEZ
Quito, Febrero 2018
ii
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, Diana Elizabeth Tapia Giler en calidad de autora y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación investigación “Determinación
de la presencia de Mycoplasma haemofelis en refugios felinos de la ciudad
de Quito y sus valles” modalidad presencial , de conformidad con el Art. 114
del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de
la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no
exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservamos a mi/nuestro favor todos los derechos de autor
sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual,
de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior
.
La autora declara que la obra objeto de la presente autorización es original en
su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo
la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta
causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
En la ciudad de Quito, 11 de diciembre del 2017.
Diana Elizabeth Tapia Giler
Cd. N°:1722015649
Dirección electrónica: [email protected]
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Renán Patricio Mena Pérez en mi calidad de tutor del trabajo de
titulación, modalidad presencial , elaborado por DIANA ELIZABETH TAPIA
GILER ; cuyo título es: “DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE
Mycoplasma haemofelis EN REFUGIOS FELINOS DE LA CIUDAD DE
QUITO Y SUS VALLES”, previo a la obtención del Grado a la obtención del
Título de Médico Veterinario Zootecnista ; considero que el mismo reúne
los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y
epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del tribunal
examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo
sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por
la Universidad Central del Ecuador.
Quito, a los 3 días del mes de agosto del 2017
Dr. Renán Patricio Mena Pérez
CI: 1717090433
iv
APROBACIÓN DE LA CO-TUTORA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Nadia Valeria López Paredes en mi calidad de cotutora del trabajo de
titulación, modalidad presencial , elaborado por DIANA ELIZABETH TAPIA
GILER ; cuyo título es: “DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE
Mycoplasma haemofelis EN REFUGIOS FELINOS DE LA CIUDAD DE
QUITO Y SUS VALLES”, previo a la obtención del Grado a la obtención del
Título de Médico Veterinario Zootecnista ; considero que el mismo reúne
los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y
epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del tribunal
examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo
sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por
la Universidad Central del Ecuador.
Quito, a los 20 días del mes de noviembre del 2017
Dra. Nadia Valeria López Paredes
CI: 1712538691
v
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dra. Susana Gallo Presidenta, Dra. Juliette
Cardier Vocal Principal y Dra. Yolanda Cedeño Vocal Principal
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título (o grado académico) de Médico Veterinario Zootecnista,
presentado por la señorita Diana Elizabeth Tapia Giler.
Con el título: “DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE Mycoplasma
haemofelis EN REFUGIOS FELINOS DE LA CIUDAD DE QUITO Y SUS
VALLES”.
Emite el siguiente veredicto: (aprobado/reprobado) __________________
Fecha: _________________________
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre y Apellido Calificación Firma
Presidente: Dra. Susana Gallo _______ __________
Vocal 1 Dra. Juliette Cadier _______ __________
Vocal 2 Dra. Yolanda Cedeño ______ __________
vi
DEDICATORIA
A Dios por guiarme y mostrarme que este es el camino correcto.
A mi familia, sobre todo a mis padres por todo su esfuerzo y apoyo que
me han brindado siempre.
A mis peludos por siempre ser la respuesta.
vii
AGRADECIMIENTOS
A mi familia por apoyarme en este sueño.
A mi tutor el Dr. Renán Mena y Cotutora Dra. Nadia López por brindarme
la guía y apoyo durante el desarrollo de esta investigación
A los docentes que conforman la Facultad de medicina Veterinaria y
Zootecnia por brindarme la guía, conocimientos, consejos, experiencias
durante la carrera.
A la Ing. Natali Chamba y la Empresa Inventagri por el apoyo y la
colaboración brindada durante la fase de diagnóstico molecular.
A la Dra. Paulina Cabezas por su colaboración en la fase de diagnóstico
Al Dr. César Tapia por brindarme el apoyo, confianza y permitirme
enriquecer mi experiencia profesional en la Veterinaria Cocker, durante
todo este tiempo. Gracias por dejarme ser parte de este equipo.
A mis amigas y amigos por su apoyo en los buenos y malos que hemos
pasado a lo largo de este camino.
viii
ÍNDICE GENERAL
pág.
© DERECHOS DE AUTOR ............................................................................................ ii
INFORME DE TUTOR ...................................................... ¡Error! Marcador no definido.
INFORME DE COTUTORA ............................................. ¡Error! Marcador no definido.
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL .................................... v
DEDICATORIA .................................................................................................................vi
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................... vii
ÍNDICE GENERAL ......................................................................................................... viii
LISTA DE TABLAS .......................................................................................................... x
LISTA DE ANEXOS ......................................................................................................... xi
RESUMEN........................................................................................................................ xii
ABSTRAC ........................................................................................................................ xiii
CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1
OBJETIVOS .................................................................................................................. 3
HIPÓTESIS ................................................................................................................... 4
CAPÍTULO II ..................................................................................................................... 5
REVISIÓN DE LITERATURA ..................................................................................... 5
2.1 Etiología .............................................................................................................. 5
2.2 Factores Predisponentes.................................................................................. 7
2.3 Transmisión ................................................................................................... 7
2.4 Patogenia ............................................................................................................ 8
2.5 Diagnóstico ....................................................................................................... 10
2.6 Tratamiento ....................................................................................................... 12
2.7 Pronóstico ......................................................................................................... 13
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 15
3.1 Materiales ......................................................................................................... 15
3.2 Métodos............................................................................................................. 16
CAPITULO IV .................................................................................................................. 23
RESULTADOS Y DISCUCIÓN ................................................................................ 23
ix
CAPITULO V ................................................................................................................... 27
CONCLUSIONES....................................................................................................... 27
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 28
ANEXOS .......................................................................................................................... 31
x
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1 Signos clínicos ............................................................................ 10
Tabla 2 Ubicación de los centros de rescate ........................................... 16
Tabla 3 Población de los diferentes refugios ........................................... 17
Tabla 4 Número de gatos a muestrear ................................................... 18
Tabla 5 Positividad en cada refugio ......................................................... 24
Tabla 6 Nivel de hematocrito y pirexia en cada refugio del estudio ......... 24
Tabla 7 Ambiente de los gatos en los refugios. ....................................... 25
Tabla 8 Presencia de Ectoparásitos ........................................................ 25
Tabla 9 Resumen de cambios celulares semanales ................................ 26
Tabla 10 Prueba exacta de Fisher de los cambios celulares ................... 26
xi
LISTA DE ANEXOS
pag.
Anexo 1 Refugio A ................................................................................... 31
Anexo 2 Refugio B ................................................................................. 31
Anexo 3 Refugio C .................................................................................. 31
Anexo 4 Hoja de registro de datos .......................................................... 32
Anexo 5 Protocolo de extracción rápida de ADN parte 1 ........................ 33
Anexo 6 Protocolo de extracción rápida de ADN parte 2 ......................... 34
Anexo 7 Guía de extracción rápida de ADN ............................................ 35
Anexo 8. Protocolo de kit PCR para Micoplasma Haemofelis parte 1 ..... 36
Anexo 9 Protocolo de kit PCR para Micoplasma Haemofelis parte 2 ...... 37
Anexo 10 Guía de uso de kit PCRun Micoplasma Haemofelis ................ 38
Anexo 11 Caso negativo (izquierda) y positivo (derecha) ........................ 39
Anexo 12 Policromasia ............................................................................ 39
Anexo 13 Cuerpos de Howell Jolly .......................................................... 40
Anexo 14 Cambios celulares ................................................................... 40
xii
TEMA: “Determinación de la presencia de Mycoplasma haemofelis en
refugios felinos de la ciudad de quito y sus valles”.
RESUMEN
Los gatos que llegan a los centros de rescate usualmente no todos cuentan
con un buen estado de salud- sanitario, por lo que son más susceptibles en
adquirir enfermedades como la Micoplasmosis hemotrópica felina, en
donde la pulga es el principal vector de contagio, por lo que es importante
investigar sobre dicha enfermedad con el fin de sugerir la implementación
de medidas sanitarias en los refugios de la ciudad de Quito y sus valles,
que manejen gatos. Para llegar al diagnóstico de esta patología se
utilizaron dos métodos: frotis sanguíneo seriado con tinción Wright durante
3 semanas, el cual se ha manejado como prueba principal en la clínica
diaria, con la observación directa del Mycoplasma y el uso del PCRunTM
Feline Mycoplasma Molecular Detection Kit como diagnóstico definitivo de
la misma. En este estudio se muestrearon 65 individuos de los cuales 7
cumplían con los criterios de inclusión, tener un hematocrito >26% y/o una
temperatura < a 39,5°C. Obteniendo mediante frotis que el 100% de ellos
fueron negativos y con el uso del PCRunTM Feline Mycoplasma Molecular
Detection Kit se obtuvo un 29% de positividad a micoplasmosis.
Palaras claves: Mycoplasma haemofelis, Micoplasmosis hemotrópica
felina, PCRunTM Feline Mycoplasma Molecular Detection Kit.
xiii
TITLE: “Determination of presence of Mycoplasma haemofelis in cat
shelters in Quito city ans its valleys”
ABSTRAC
Not all the cats arrive in rescue enters are in good health or sanitary
conditions, therefore, they are more likely to attain sicknesses like
Mycoplasma haemofelis, where flea is the main vector of contagiousness.
This is the reason why it is very important to research about that sickness
for the purpose of recommending implementation of sanitary measures in
the cat shelters of Quito and its valleys. Two methods were used in order to
obtain diagnosis of this pathology: Wright serial blood swab for three e,
which has been used as main proof in diary clinic, whit direct observation of
Mycoplsma and the usage of PCRun TM Feline Mycoplasma Molecular
Detection Kit as final diagnosis. 65 individuals were taken for the sample in
this study; 7 from which meet the criteria of inclusion, hematocrits >26%
and/or temperature < 39,5°C. Obtaining through swab that 100% of them
were negative and means of PCRun TM Feline Mycoplasma Molecular
Detection Kit, it was detected a 29% of positivity to mycoplasmosis.
Key words: Mycoplasma haemofelis, feline hemotropic mycoplasmosis,
PCRunTM Feline Mycoplasma Molecular Detection Kit.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La población de animales de estima y compañía ha incrementado en la ciudad
de Quito. El poco conocimiento sobre la tenencia responsable de mascotas ha
provocado abandonos, incrementando la tasa de reproducción de animales
callejeros y evidenciando un aumento en la presencia de patologías infecciosas.
Al incrementarse la población se han creado lugares de acogida como son
albergues y refugios, que sirven como hogares de paso antes de que estos
animales lleguen a un hogar. Estos lugares no siempre disponen de ingresos
económicos constantes por lo que es complicado mantenerlos bajo un control
sanitario eficiente. En un estudio realizado en la ciudad de Quito se encontró que
la relación de perro: humano es de 2,3:1 y perro: gato es de 11:1, (Vinueza,
2015), valores que indican que la población de felinos en Quitos llega a una cifra
alarmante.
En base a esta problemática, asociaciones municipales como Urbanimal y
albergues o refugios privados, acogen a estos animales en lugares con limitada
capacidad, provocando un colapso rápido de los mismos. Este hacinamiento
aumenta el riesgo de contagio y transmisión de enfermedades, además de los
conflictos de convivencia que se pueden llegar a dar entre los miembros de los
refugios.
Un factor de riesgo importante en la transmisión de ciertas enfermedades es la
presencia de ectoparásitos, principalmente de la pulga (Ctenocephalides felis,
Ctenocephalides canis), la cual es uno de los vectores de contagio de
Micoplasmosis hemotrópica felina, siendo considerada por algunos autores
como pandémica. Se transmite por medio de contacto de heridas, mordeduras y
de manera iatrogénica; la vía transplacentaria aún se encuentra en estudio; por
lo que es de gran importancia conocer el grado de presencia de la enfermedad
en estos lugares.
A nivel nacional se han realizado investigaciones usando como método
diagnostico la observación directa, frotis, encontrando en Machala, donde la
2
prevalencia de micoplasmosis es del 7,89% (Martínez, 2012) mientras que en
Guayaquil se obtuvo una prevalencia del 37,25 % (González, 2014). En la ciudad
de Quito se realizan análisis individuales sobre casos compatibles con esta
patología, pero no se han reportado para saber el porcentaje de aparición de la
misma.
La Micoplasmosis hemotrópica felina es una enfermedad bacteriana producida
por el Mycoplama haemofelis, previamente conocido como Hemobartonella felis
o Eperitrozoon felis.
Hasta la fecha se conocen los siguientes tipos de mycoplasma
• Mycoplasma haemofelis (Mhf)
• Candidatus Mycoplasma Haemominutum (Mhm)
• Candidatus Mycoplasma turicensis (Mtc)
• Candidatus Mycoplasma haematoparvum (Mhp)
.
3
OBJETIVOS
Objetivo general
• Determinar la presencia de Micoplasmosis hemotrópica felina en
centros de rescate de la ciudad de Quito y sus valles.
Objetivos específicos
• Identificar gatos positivos a Micoplasmosis hemotrópica felina en
refugios de animales rescatados mediante frotis seriado y la detección
molecular mediante el kit PCRun.
• Identificar la asociación de Micoplasmosis hemotrópica felina con
factores como estado anémico-febril, características celulares en frotis,
ambiente y la presencia de ectoparásitos en lo gatos de estudio.
4
HIPÓTESIS
H0: En los refugios felinos de la ciudad de Quito y sus valles existe Mycoplasma
haemofelis
H1: En los Refugios felinos de la Ciudad de Quito y sus valles no existe
Mycoplasma haemofelis
5
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Etiología
La anemia hemotrópica felina se produce por el Mycoplasma haemofelis que
anteriormente se la denominaba Haemobartonella felis, pero con el avance de
las técnicas moleculares y por medio de codificación y secuenciación de ADN se
encontró que el Mycoplasma haemofelis tiene relación filogenéticamente más
con el género Mycoplasma.
Mycoplasma haemofelis es una bacteria gram negativa perieritrocitaria de forma
cocoide, incapaz de producir energía y sintetizar algunos componentes
celulares, por lo que depende de una célula anfitriona, como es el eritrocito, para
poder desarrollarse y producir los signos clínicos (Cushing, 2013).
Se han realizado estudios a nivel mundial donde los resultados de prevalencia
varían según las regiones y condiciones climáticas. En Reino Unido, mediante
observación directa, se obtuvo una prevalencia entre el 5,15 y 42%; mientras
que en Estados Unidos en el año 2001 se reportó un 19,5%. En el año 2013 se
realiza otro estudio en Reino Unido, en el cual se obtiene una prevalencia del
18,5% y en Suiza en el 2005 se reporta una prevalencia del 8,5 % (Tasker S. B.-
J., 2003) .
A nivel nacional se han realizado investigaciones en Machala, donde la
prevalencia fue del 7,89% (Martínez, 2012) mientras que en Guayaquil se obtuvo
una prevalencia del 37,25 % (González, 2014).
La mayoría de las veces se presenta en fase subclínica, pero existen casos que
se manifiestan de forma aguda, causando una anemia hemolítica grave y pirexia
(Neimark, 2002). Los microorganismos poseen una membrana simple y su
citoplasma contiene gránulos, se puede observar algunos organelos y vacuolas
6
en su interior. La microscopía electrónica permite observar la adherencia del
hemoparásito a ciertos puntos de la membrana del eritrocito.
Se han identificado cuatro especies en gatos domésticos:
(a) Ohio o Mycoplasma haemofelis (Mhf), la más patógena.
(b) California o Candidatus Mycoplasma haemominutum (Mhm), menos
patógena.
(c) Mycoplasma turicensis (Mtc) (Sykes, 2009).
(d) Candidatus Mycoplasma haematoparvum (Mhp) (Sykes, 2010).
Cada una de las especies tiene una presentación variada, siendo así que la
Micoplasmosis dada por Mhf, al ser la especie más patógena, causa cuadros de
anemias hemolíticas intensas acompañada de una reticulocitosis,
normoblastosis y en ocasiones leucopenia y trombocitopenia, junto con cuadros
febriles e ictericia; evidente aún en animales inmunosuprimidos por
enfermedades virales asociadas como la leucemia viral felina (FeVL) o
inmunodeficiencia viral felina (FIV) (Sykes, 2009).
La Micoplasmosis causada por Mhm. puede considerarse levemente patógena,
en gatos inmunocompetentes; provocando ocasionalmente cuadros anémicos.
En caso de que los gatos presenten patologías que afecten al sistema
inmunológico, está micoplasmosis puede cursar con cuadros anémicos intensos
y puede darse el caso de que estos estén siendo desencadenados por otros
factores, a diferencia, de gatos inmunosuprimidos infectados por Mhm. Los
cuales curzan con cuadros anémicos intensos (Sykes, 2009).
En caso de las infecciones producidas por Mtc no se ha llegado a establecer la
verdadera patogenicidad, aunque parece considerablemente menos patógeno a
comparación de Mhf en los gatos infectados de forma natural (Sykes, 2010).
En algunos gatos pueden producirse infecciones simultáneas con múltiples
especies de hemoplasmas (Sykes, 2009).
7
2.2 Factores Predisponentes
Existen factores que pueden aumentar la susceptibilidad del gato frente a la
enfermedad, como la presencia de ectoparásitos hematófagos, y cuadros de
inmunosupresión como los provocados por enfermedades virales, por ejemplo,
el Virus de Inmunodeficiencia Felina (FIV) o Leucemia viral Felina (FeVL). En
cuanto a la edad, raza y sexo no se ha llegado a demostrar una susceptibilidad
específica; pero en investigaciones recientes, se ha encontrado que los machos
jóvenes tienen mayor probabilidad de contagio de la enfermedad. Algunos
autores consideran que este hecho se debe a su comportamiento, ya que se
pueden presentar peleas, y contagio de ectoparásitos durante el vagabundeo
(Foster, 2012).
2.3 Transmisión
Las formas de contagio son varias:
(a) Transmisión entre individuos: de forma experimental se han realizado
inoculaciones de sangre completa infectada vía peritoneal, oral, subcutánea,
intravenosa.
(b) Inoculación subcutánea por peleas: se creía poco probable, pero en la
actualidad se considera una vía de contagio por la presencia de heridas, las
cuales entran en contacto con la saliva y sangre contaminada. Estudios
recientes han logrado aislar Mycoplasma haemofelis en heces y saliva de
gatos (Santos, 2008; Tasker, 2010).
(c) Ectoparásitos: La pulga se considera como un potencial vector en la
transmisión de la enfermedad. Estudios recientes indican que
Ctenocephalides felis contagia la enfermedad de manera experimental
(Spada et al, 2014).
8
(d) Vertical: Las vías: transplacentaria, transmamaria y uterina se han
planteado como posibles formas de contagio, pero aún no han sido
comprobadas.
(e) Iatrogénica: En caso de las trasfusiones con sangre contaminada.
2.4 Patogenia
2.4.1 Periodo de incubación.
Mediante estudios experimentales, se ha determinado que en promedio la
aparición de síntomas varía entre 2 a 34 días siendo el pico de bacteriemia entre
las 2 a 3 semanas post infección; lo que no está directamente relacionado con la
presentación de síntomas (Foster,2012; Tasker, 2010).
Se describen cuatro fases en la infección por Mycoplasma:
(a) Fase Prepara sistémica. - se da luego de que el gato es expuesto al
microorganismo, antes que este inicie su reproducción. La cual puede durar de
dos a tres semanas y luego pueden iniciar los signos clínicos, también se pueden
encontrar pacientes asintomáticos o que presenten signos hasta 6 semanas
después (Foster, 2012; Cushing, 2013).
(b) Fase Aguda.- Se evidencian los microorganismos mediante observación
directa en frotis y a su vez se hacen notorios los signos clínicos; caracterizados
por cuadros piréxicos, anémicos, ocasionados por la capacidad del Mycoplasma
sp para adherirse a la membrana eritrocitaria, afectando su integridad y por tanto
reduciendo su vida media; además se presume la producción de anticuerpos
antieritrocitarios o específicos a hemoplasmas, causando una reacción Ag-Ac-
Complemento y produciendo hemolisis. Los eritrocitos infectados son retirados
por los macrófagos de bazo, hígado, médula y pulmón (Mayors lab, 2016), por lo
que la gravedad de la anemia se relaciona con el estado inmunitario y esplénico,
debido a que los eritrocitos secuestrados a este nivel pierden su biconcavidad,
debilitando a su membrana (Tasker, 2010).
9
(c) Fase de Recuperación. – El volumen glomerular vuelve a la normalidad o se
aproxima a la misma. Los microorganismos no tienden a ser vistos en frotis
sanguíneo (Sykes., 2003).
(d) Fase asintomática. – Los gatos no presentan signos clínicos, pero se
convierten en portadores crónicos lo cual puede durar 2 años o más, donde la
replicación y la eliminación del Mycoplasma sp se encuentra en equilibrio. En
algunos casos se puede dar la recidiva de la enfermedad debido a situaciones
de estrés, enfermedades sistémicas, neoplasias, preñez y retrovirus (Tasker,
2004; Harvey, 2006; Miranda, 2008; Foster, 2012; Cushing, 2013).
2.4.2 Signos clínicos.
Se han registrado tres categorías de presentaciones clínicas, pero no es posible
catalogar a todos los gatos en una de estas. La variabilidad clínica depende de
la patogenicidad del agente y la variación en la susceptibilidad del huésped y
cantidad inoculada (Cushing, 2013).
(a) Gatos cachorros y algunos adultos: presentan anemia hiperaguda,
letargia, palidez e hipotermias repentinas. Antes de la presentación de estos
síntomas por lo general se encuentran en estado normal.
(b) Algunos gatos cachorros y la mayoría de los adultos: cursan por
cuadros febriles, anemia aguda, debilidad, palidez, soplos cardíacos,
esplenomegalia, ictericia, dolor corporal difuso, disnea y taquipnea.
(c) Gatos adultos: pueden presentar cuadros de anemia leve con fiebre
moderada, debilidad y baja de condición corporal (Tasker, 2004).
10
Tabla 1 Signos clínicos
Agudo Crónico
Letargia
Anemia
Hepatomegalia
Esplenomegalia
Dolor corporal
Taquipnea
Disnea
Pirexia
Ictericia
Pérdida de peso
Anemia moderada
Pirexia intermitente
Foster, D. (2012). Haemobartonella felis. Manual de hematología y transfusión
en pequeños animales (Ediciones, pp. 109–118).
2.5 Diagnóstico
Debido a que el microorganismo es incultivable fuera del hospedador, los
métodos diagnósticos se ven reducidos. Los frotis de sangre periférica sometidos
a distintas tinciones siguen siendo el de preferencia al momento del diagnóstico,
sin embargo, los avances en técnicas moleculares han permitido tener pruebas
como el PCR que pueden implementarse en el protocolo diagnóstico, adicional
a las pruebas de biometría y química sanguínea que complementan el
diagnóstico.
2.5.1 Frotis sanguíneo.
Se debe tener en cuenta que la sensibilidad fluctúa de 0 al 37,5% y la
especificidad entre el 84 al 98% en casos de Mhf, a diferencia de Mhm y Mtc, los
cuales son difíciles de evidenciar mediante esta técnica (Sykes, 2009).
11
2.5.1.1 Técnicas de tinción.
Se pueden utilizar distintas técnicas como: Diff Quick, T15, naranja de acridina,
Wright, Wright-gienmsa
Tinción de Wright
Técnica desarrollada por el patólogo James Homer Wright en 1902, modificando
la tinción de Romanoswky, se considera policromática ya que tiñe compuestos
celulares ácidos o básicos, se emplea en la diferenciación de los elementos
sanguíneos y medulares evaluados mediante frotis. El reactivo Wright está
compuesto por eosina y azul de metileno, que al oxidarse se convierte en azur B
a una concentración de 0,8 g/L diluido en alcohol metílico. La eosina tiñe los
componentes alcalinos dando una coloración rosada anaranjada a nivel del
citoplasma y rojo intenso en caso de células eritrocitarias, en tanto que el núcleo
se adquiere una coloración morada (López et al, 2014).
2.5.2 Hematología.
El detectar el grado de anemia puede dar información de si esta es regenerativa
o no y de los cambios celulares que pueden estar presentes como anisocitosis,
macrocitosis y reticulocitosis (Foster, 2012).
2.5.3 PCR.
Con el desarrollo de las técnicas moleculares la sensibilidad y especificidad al
momento de diagnosticar micoplamosis han aumentado, esta técnica se basa en
la detección del gen 16S rRNA, la ventaja es que se puede detectar la presencia
de Mycoplasma haemofelis en el gato ya sea que se encuentra en fase aguda o
de portador, adicionalmente, es de utilidad para saber si en caso de una
transfusión sanguínea el donante es portado (Tasker et al, 2003),
2.5.4 Pruebas adicionales.
12
En gatos que se sospeche de una enfermedad viral se recomienda realizar los
test para FeVL y FIV. Adicionalmente realizar pruebas de bioquímica sanguínea,
si bien no son específicas, pero ayudan al clínico a tener una visión más amplia
del estado del paciente al momento del tratamiento y pronóstico (Foster, 2012).
2.6 Tratamiento
Existen varias medidas terapéuticas las cuales se elegirán dependiendo de
estado del paciente.
2.6.1 Antibioticoterapia.
Para el tratamiento de micoplasmosis es habitual el uso de antibióticos
como tetraciclinas, cloranfenicol, enrofloxacina, doxiciclina, terapia inmuno-
supresora y en casos muy severos, la transfusión sanguínea es sugerida como
componentes en el tratamiento de la enfermedad (Foster, 2012).
Las tetracilinas y fluorouinolonas ayudan en la disminución de la parasitemia,
pero la capacidad de eliminar la infección no se ha demostrado, lo que sí está
comprobado es que con su uso mejoran los signos clínicos y las alteraciones
hematologías asociadas a la enfermedad (Tasker, 2010).
La doxiciclina es el antibiotico de uso predilecto, se maneja una dosis de
10mg/kg/día durante cuatro semanas, en casos de presentarse cuadros
eméticos se suguiere dismunir la dosis a la mitad en dos tomas al día. Se
recomienda administrar el medicamento junto con alimento o agua para disminuir
efectos adversos como la esofagitis con estenosis esófagica secuandaria
(Sykes, 2009).
El uso de enrofloxacina a dosis de 5 mg/kg/día ha sido efectica en gatos
infectados con Mhf de manera experimental con la precaución de que se han
dado casos de degeneración retiniana y cegera repentina asociados al uso de
esta droga (Foster, 2012).
13
El uso de marbofloxacina a 2/mg/kg/ día ha dado buenos resultados en la
reducción de Mhf y Mhm, hasta el momento no se ha descrito efectos
desfavorables con este tratamiento (Harvey, 2006).
El uso de imidocarb se puede considerar en casos crónicos y donde los
resultados tanto con tetraciclinas y fluoroquinolonas no han sido favorables y se
usa a dosis de 5mg/kg por vía subcutánea cada dos semanas por dos a cuadro
aplicaciones (Universidad de Chile, 2010)
2.6.2 Inmunosupresión.
La corticoterapia ha estado en discución en los últimos años ya que hay estudios
que desmuestran que la eliminación del Mhf se ha visto disminuida durante su
uso, ciartos autores suguieren que solo sean usadas en casos excepcionales
donde este presenta la heolisis inmunomediada (Foster, 2012).
2.6.3 Terapias de soporte.
(a) Fluidoterapia.- Al encontrar cuadros de deshidratación es necesario
monitoriar de manea constante los valores hematologicos hasta que se
complete la terapia (Tasker, 2004).
(b) Alimentación enteral: en casos de inapetencia prolongada se recomienda
el uso de sondas nasogastricas y tubos enterales (Tasker, 2004).
(c) Hemoterapia
Las transfuciones se recomiendan en grados severos de anemia con
signos clinicos asociados. Previo al procedimiento se debe realizar la
prueba de compatibilidad sanguinea y el test de PCR al donante para estar
seguros que no este infectado y este en fase de portador (Tasker, 2004).
2.7 Pronóstico
14
En general se considera un pronóstico de regular a favorable ya que el 65 % de
los gatos infectados se recuperan sin tratamiento y el 75% de los gatos tratados
sobreviven (Tasker, 2004).
15
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
En la presente investigación se utilizaron los siguientes materiales:
- Medidor portátil de Hemoglobina Mission®
- Hb100 test strip Hb hemoglobin
- Jeringas de 3ml
- Agujas hipodérmicas 23 G
- Torundas de algodón
- Alcohol
- Termómetro
- Fonendoscopio
- Cooler
- Recolector de cortopunzantes
- 100 portaobjetos
- Esparadrapo
- Bolsa para gatos
- Ketamina
- Xilacina
- Tubos minicollet con EDTA
- Guantes desechables
- Tabla de anotaciones
- Kit de extracción de ADN Biogal
- Kit de PCRun Mycoplasma haemofelis Biogal
16
3.2 Métodos
3.2.1 Tipo de Investigación.
El presente estudio fue de tipo transversal, observacional.
3.2.2 Ubicación Geográfica.
Quito es una ciudad ubicada sobre la hoya de Guayllabamba, en las laderas
occidentales del estrato volcán activo Pichincha, en la parte oriental de los Andes y
su altitud va desde los 2800 msnm en los lugares llanos y los 3100 msnm en los
barrios más elevados la temperatura promedio oscila de 10 a 27 °C. La Ciudad se
encuentra divida en 8 zonas con 32 parroquias urbanas y 33 rurales y suburbanas.
3.2.3 Población en estudio.
Los animales en estudio fueron gatos que se encontraban en centros de rescate
tanto de fundación como de rescatistas independientes que colaboraron en la
presente investigación, los refugios se encuentran ubicados en la provincia de
Pichincha en la ciudad de Quito y sus valles.
Tabla 2 Ubicación de los centros de rescate
Refugio Dirección
A.- Protección Animal Ecuador Ulloa y Rumipamba
B.- Rescatista Independiente Julio Larrea y Carlos V
C.- Anita Barragán (rescatista
independiente) Capelo – Valle de los chillos
Ubicación de los diferentes centros de rescate que colaboraron en la investigación
17
Unidades de muestreo
Los gatos albergados en varios refugios de la ciudad y sus valles que se encuentran
interesados en la investigación suman una población de 147 gatos la cual será la
población universo.
Tabla 3 Población de los diferentes refugios
Refugio Total
A 98
B 29
C 20
Total 147
Datos del total de gatos existentes en los refugios al momento de realizar la
encuesta
Tamaño de la muestra
n = [1 − (1 − 𝑝1) 1𝑑] [𝑁 −
𝑑
2] + 1
Donde:
n tamaño de muestra requerida
d número mínimo de animales afectados esperados en la población
p1 probabilidad de encontrar al menos un caso en la muestra
N es el tamaño de la población;
n = [1 − (1 − 0.05)1/139] [147 −139
2] + 1
n= 77
Ajuste de la muestra
𝑛𝑎𝑑𝑗 𝑁 ∗ 𝑛
𝑁 + 𝑁
18
Donde
nadj muestra ajustada
n tamaño de muestra
N tamaño de población
𝑛𝑎𝑑𝑗 147 ∗ 77
147 + 77= 50.5
- Para garantizar que la muestra sea representativa se realizó el muestreo de
65 gatos en los refugios felinos de la ciudad de Quito y sus valles, los cuales
se seleccionaron al azar en los distintos refugios, en relación al total de su
población.
Tabla 4 Número de gatos a muestrear
Refugio Total Muestra
A 98 43
B 29 13
C 20 9
Total 147 65
En base al total de gatos existentes en los refugios y al número de la muestra se
hizo una relación para determinar el número de gatos muestreados por refugio
3.2.3 Factores en estudio.
En esta investigación se realizó una evaluación físico- clínica, para detectar
cuadros febriles, presencia de ectoparásitos, simultáneamente se determinó los
niveles de hematocrito mediante el medidor portátil de Hemoglobina Mission® Hb.
Los individuos cuyo hematocrito fue menor a <26 % y temperatura mayor a
>39.5°C, se les extrajo muestras sanguíneas, mediante venopunción de la yugular
y estas fueron conservadas en tubos Minicollet con EDTA para ser procesados
mediante PCRun DNA Extraction Kit y PCRun Feline Mycoplasma Molecular
19
Detection Kit y mediante punción de vena auricular se extrajo la muestra para
realizar extensiones las cuales fueron sometidas a tinción Wright, de manera
seriada durante 3 semanas.
3.2.4 Protocolos de la investigación.
3.2.4.1 Determinación de hematocrito.
Con el uso de medidor portátil de Hemoglobina Mission® Hb se determinó de
manera cuantitativa la hemoglobina (Hb) y el cálculo de hematocrito (Hct) en sangre
completa. El sistema, consiste en un medidor portátil que analiza la intensidad y
color de la luz reflectada del área del reactivo de la tira de examen, asegurando
resultados rápidos y precisos (ACON laboratories, 2010).
Procedimiento
• Prender medidor portátil de Hemoglobina Mission® Hb
• Realizar venopunción de la oreja del gato para obtener sangre
• Colocar la tira de lectura de Mission® Hb
• Esperar indicador y colocar la gota de sangre
• Esperar resultado y registrarlo (ACON laboratories, 2010).
3.2.4.2 Protocolo de PCRun ® Rapid DNA Extraction Kit.
1. Limpiar y desinfectar el área de trabajo
2. Componentes:
• PCRun tubo tapa roja con buffer para extracción de ADN
• Tubo tapa verde con diluyente de buffer para extracción de ADN
• Capilares de 50 ul
• Tapas de cierre
• Jeringa de 10 ml
20
3. Encender la incubadora y programarla a una temperatura de 95 °C, una vez
que llegue a dicha temperatura continuar.
• Colocar 50 ul de sangre en el tubo de tapa roja.
• Incubar durante 5 minutos a 95°C.
• Retirar el seguro inferior del tubo tapa roja y colocarlo en el tubo tapa
verde con el diluyente del buffer.
• Centrifugar a 1500 rpm durante 1 minuto.
• Retirar el tubo con el buffer y colocar la tapa verde en el tubo con el
diluyente y el DNA extraído (Ver anexos 5, 6, 7) (Biogal, 2016).
3.2.4.3 PCRunTM Feline Mycoplasma Molecular Detection Kit.
Técnica que permite la detección cualitativa de Mycoplasma haemofelis a partir
de ADN extraído de sangre entera. PCRun es un ensayo molecular basado en
la amplificación isotérmica de parte del gen 16S RNA (Biogal, 2016) (Anexos
8,9, 10).
1. El área de trabajo debe estar limpia y desinfectada
2. Preparar todas las partes del ensayo:
• Muestra de ADN extraída
• Bolsa con tubos de reacción
• Tubos capilares para dispensar 20 μl de volumen
• Marcador permanente
3. Encender la incubadora y programar a 60°C.
4. Retirar la tira PCRun ™ de su bolsa protectora.
• Cortar y separar los tubos necesarios, los sobrantes guardar en la
bolsa de aluminio y sellar con cinta adhesiva para evitar ingreso de
humedad.
• Colocar los tubos en una superficie y observe que el pequeño pellet
blanco se encuentra en la parte inferior del tubo.
5. Etiquetar la tapa de los tubos para la identificación de la muestra.
21
6. Abrir con cuidado la tapa de los tubos de reacción de forma individual y
coloque con un capilar 20 μl de ADN se extrajo con PCRun ™ Sample Prep Kit,
permitir que el gránulo se disuelva completamente.
7. Coloque el tubo de reacción en la incubadora (60 °C) e incubar durante
exactamente 1 hora.
8. Al final del período de incubación (1 h), retire el tubo de la incubadora y analice
inmediatamente en el kit PCRun:
- Se necesita un dispositivo de detección de ácido nucleico desechable
para cada prueba.
- Abrir y retirar los componentes del dispositivo de detección.
o Verificar la presencia de fluido en la bombilla.
o Identificar cada una.
o Alinee la sección de la tapa del tubo de reacción PCRun ™ con el
bulbo de amortiguación.
o Aplique una ligera presión en el tubo de reacción al cartucho
Amplicon.
o Doble el cartucho Amplicon en dos para cerrar.
o Presione la palanca hacia abajo para bloquear el dispositivo.
o Espere 15-30 minutos para leer los resultados. Resultados leídos
después de 30 los minutos no son válidos
Lectura e interpretación de los resultados
Una prueba válida debe presentar una banda de control rojo. La línea de control
debe aparecer independientemente de un resultado positivo o negativo.
• Resultado positivo: aparecen dos bandas, la línea de control superior
y la línea de prueba inferior. La apariencia de la línea de control y de
la línea de prueba indica la presencia de Mycoplasma haemofelis.
• Resultado negativo: aparece solo la línea de control. La apariencia de
una línea de control solamente, indica la ausencia de Mycoplasma
haemofelis DNA o que el número de copias esté por debajo de la
detección límite (Biogal, 2016, p.1-4).
22
3.2.4.4 Frotis sanguíneo.
Protocolo.
o Sujeción del felino
o Localizar la vena auricular
o Desinfectar el área a punzar con alcohol antiséptico
o Tomar la muestra con una aguja descartable 25 G o lanceta de la
vena auricular.
o Se deposita una gota de sangre, en un extremo o en el centro de un
portaobjeto bien limpio, previamente rotulado con la identificación del
paciente.
o Con el empleo de otro portaobjeto se hace un frotis o extensión de
sangre, para lo cual se coloca este último portaobjeto en un ángulo
de aproximadamente 30º - 45º con respecto al portaobjeto horizontal
y se permite que éste tome contacto con la gota de sangre.
o Es conveniente realizar dos o tres extensiones, con el fin de
seleccionar la mejor.
o Las extensiones o frotis deben secarse al aire lo más rápidamente
posible. La rápida desecación evita la deformación de los glóbulos
sanguíneos y la crenación (arrugamiento) (González, 2014).
Tinción.
• Se cubre la extensión completamente con colorante Wright y se deja actuar
durante 1 – 2 minutos. De esta forma se fija la extensión.
• Se añade al portaobjetos un volumen de agua destilada tamponada que sea
aproximadamente el doble del colorante ya presente. Se mezclan
uniformemente el colorante y el agua destilada tamponada haciendo oscilar
suavemente el soporte de tinción. Se deja actuar durante 5 minutos
• El colorante diluido se elimina lavando el portaobjetos en posición horizontal
• Se enjuaga la cara opuesta del portaobjetos, y se seca seguidamente la
extensión colocando el portaobjetos verticalmente sobre un trozo de papel
filtro (López et al, 2014).
23
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
Luego de realizar el examen físico clínico y la determinación de hematocrito se
obtuvo que el 10,7% que representa 7 gatos, cuyo hematocrito y/o estado febril se
encontraban alterados, los cuales pasaron a ser sometidos a pruebas de
observación directa mediante frotis, utilizando la tinción Wright, seguidas de
pruebas moleculares con el kit PCRunTM para Mycoplasma haemofelis, obteniendo
los siguientes resultados:
- Mediante la prueba de observación directa en frotis no se evidenciaron
casos positivos, comparando con estudios realizados previamente en ciertos
lugares del país como en Cuenca, donde obtuvieron igual resultado el 0%
de casos positivos de 105 animales muestreados y en Guayaquil donde se
obtuvo el 37,25% de positividad de 400 felinos muestreados (Hidalgo, 2013;
González, 2014). Teniendo en cuenta que el frotis tiene descrita una
sensibilidad entre 0 y 37,5% y una especificidad de 84 a 98% se considera
que no es un método diagnóstico confiable. (Tabla 5) (Tasker, 2010).
- Al utilizar los kits de PCRunTM para Mycoplasma haemofelis, el 29% de los
gatos sometidos a este método diagnóstico dieron positivos a micoplasmosis
felina, teniendo en cuenta que mediante este método molecular de
diagnóstico no se han realizado estudios. En comparación a resultados
obtenidos en investigaciones realizadas en otros países mediante detección
por PCR, en el 2001 en E.E.U.U. se reportó el 19,5% , en el 2004 el 20, 5%
y en el 2006 el 27,7%, mientras en el 2003 en Reino unido se reportado el
18,5%, en Suiza en el 2005 el 8,5 % , en Korea el 14,5% en el 2007 y en
Canadá se reportó el 11,5% en el 2011 (Luria, 2004; Eberhardt, 2006; Yu,
2007; Juvet, 2010, Witman, 2010 y Stojanovic, 2011).
24
Tabla 5 Positividad en cada refugio
Refugio Frotis PCRun
Positivo % Negativo % Positivo % Negativo %
A 0 0 43 66 2 3 41 63
B 0 0 13 20 0 0 13 20
C 0 0 9 14 0 0 9 14
TOTAL 0 0 65 100 2 3 63 97
Para considerar los pacientes que presentan signos clínicos de la patología, se
analizó el hematocrito y la presencia de pirexia; de acuerdo a estos criterios se
encontró que el 10,7% de los 65 gatos muestreados presentaron un hematocrito
menor al 25% y una temperatura mayor a 39,5°C (Tabla 6). Se realizó un análisis
utilizando prueba exacta de Fischer y encontró una diferencia significativa entre el
número de individuos positivos y la variación de hematocrito con un valor de
p=0.010 (p<0.05). De la misma forma se analizó la variable temperatura y se obtuvo
un p=0.010 (p<0.05); estos resultados tienen relación con lo que menciona Foster
(2012) de acuerdo a que estos signos clínicos son evidenciados en pacientes
positivos a micoplasmosis felina durante la fase aguda y el 84,6 % presentaron
infestación de ectoparásitos, en particular de la pulga, considerando que es uno de
los vectores que hace posible la transmisión del patógeno (Cushing, 2013).
Tabla 6 Nivel de hematocrito y pirexia en cada refugio del estudio
Hematocrito Temperatura
Bajo % Normal % Normal % Alta %
A 4 6,15 38,00 58,46 38,00 58,46 4,00 6,15
B 1 1,54 12,00 18,46 12,00 18,46 1,00 1,54
C 2 3,08 8,00 12,31 8,00 12,31 2,00 3,08
TOTAL 7 10,77 58 89,23 58 89,23 7 10,77
Según Foster (2012) el ambiente es un factor variable ya que debido a las
condiciones climáticas la presencia de ectoparásitos es variable, por lo que se
analizó mediante prueba exacta de Fischer p=0.304 (p>0.05) determinando que el
ambiente no es un factor significativo para que se presente la enfermedad.
25
Tabla 7 Ambiente de los gatos en los refugios.
Ambiente
Frecuencia Porcentaje Porcentaje
válido
Válido Interior 43 66,2 66,2
Interior y exterior 22 33,8 33,8
Total 65 100 100
La presencia de ectoparásitos es considerando como el principal vector de
transmisión de la enfermedad, usando prueba exacta de Fischer p=0.375 (p>0.05)
se analizaron los datos obtenidos en la investigación, ya que el 84,6 % presentaron
infestación de pulgas, lo que no tiene una relación significativa con la enfermedad,
ya que su presencia no predispone a que este presente la enfermedad. Tabla
Tabla 8 Presencia de Ectoparásitos
Ectoparásitos
Frecuencia Porcentaje Porcentaje
válido
Válido Si 55 84,6 84,6
No 10 15,4 15,4
Total 65 100 100
Cambios morfológicos celulares (Anexo 14)
En el presente estudio respecto anisocitosis se encontró en la primera semana en
un 85,7 %, en la segunda semana un 57,14% y la última semana un 71,43% de los
animales que fueron sometidos tanto a frotis como PCR, teniendo en cuanta que
este hallazgo se encuentra relacionado con los procesos anémicos y también está
presente en cuadros de micoplasmosis (Foster, 2012).
La policromasia, se evidenció en la primera y segunda semana con un 42,8 % y un
14,2% respectivamente. Cambio que se producen en cuadros de anemia
posiblemente regenerativos (Anexo 12) (Lima, 2011).
26
Las inclusiones celulares como la presencia de cuerpos de Howell Jolly solamente
se evidenciaron en un 28,8% en la primera semana. Ese cambio se puede observar
cuando existen cuadros anémicos ya sean regenerativos o no regenerativos (Anexo
13) (Lima, 2011).
En un gato se reportó la presencia de linfocitos atípicos, en la primera semana; esto
representa el 28,5 %. Estas alteraciones se dan en respuesta a una afección viral,
por lo que no tiene una relevancia para el análisis de la investigación.
Pese a que los cambios celulares son evidentes en micoplasmosis no son
exclusivos de esta enfermedad, ya que están presentes en varias patologías que
cursen con cuadros anémicos, mediante prueba exacta de Fisher se obtuvo que la
presencia de los cambios celulares no tiene relación con la presencia la enfermedad
(Tabla 10).
Tabla 9 Resumen de cambios celulares semanales
CAMBIOS CELULARES SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA 3
Anisocitosis 85,7 57,14 71,43
Policromasia 42,8 14,2 -
Cuerpos de Howell Jolly 28,8 - -
linfocitos atípicos 28,5 - -
Tabla 10 Prueba exacta de Fisher de los cambios celulares
Cambio Celular 1ra Semana 2da Semana 3ra Semana
Anisocitosis 1 0,143 1
Policromasia 0,429 1 -
Cuerpos de Howell Jolly 1 - -
Linfocitos Atipicos 1 - 1
27
CAPITULO V
CONCLUSIONES
- En el estudio realizado se determinó la presencia de Mycoplasmosis felina
en un 29% mediante PCRunTM Feline, Mycoplasma Molecular Detection kit
de en los refugios de la ciudad de Quito y sus valles que colaboraron en la
presente investigación, teniendo en cuenta la sensibilidad que presenta el kit
en comparación al diagnóstico por observación directa la cual no tuvo
resultados positivos; por lo que la implementación del uso de los kit PCRTM
en el diagnóstico de la enfermedad evitaría caer en un subdiagnóstico de los
pacientes. Teniendo en cuenta que no requiere numerosos equipos y
reactivos a diferencia de un PCR convencional.
- Al finalizar la presente investigación se evidenció mediante los datos
obtenidos que el ambiente no es un factor determinante para contraer la
enfermedad, pero esto es variable dependiendo de las condiciones
geográficas, ya que la infestación por pulgas es un factor de contagio,
teniendo en cuenta que todos los gatos positivos a micoplasmosis felina se
encontraban infestados de estos ectoparásitos, pero no es un factor
asociado para que se presente la enfermedad.
- Se evidenciaron cambios celulares como: anisocitosis, policomasia, cuerpos
de Howell Jolly en los gatos positivos los cuales son descritos en cuadros de
micoplasmosis aunque no están directamente asociados con la enfermedad.
28
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31
ANEXOS
Anexo 1 Refugio A
Anexo 2 Refugio B
Anexo 3 Refugio C
32
Anexo 4 Hoja de registro de datos
CONSTANTES
# REFUGIO EDAD SEXO RAZA AMBIENTE Ectoparásitos Peso Ht% T °C LINFONODOS FR FC
años H M I E SI NO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
33
Anexo 5 Protocolo de extracción rápida de ADN parte 1
Fuente: Biogal ©
34
Anexo 6 Protocolo de extracción rápida de ADN parte 2
Fuente: Biogal ©
35
Anexo 7 Guía de extracción rápida de ADN
Fuente: Biogal ©
36
Anexo 8. Protocolo de kit PCR para Micoplasma Haemofelis parte 1
Fuente: Biogal ©
37
Anexo 9 Protocolo de kit PCR para Micoplasma Haemofelis parte 2
Fuente: Biogal ©
38
Anexo 10 Guía de uso de kit PCRun Micoplasma Haemofelis
Fuente: Biogal ©
39
Anexo 11 Caso negativo (izquierda) y positivo (derecha)
Anexo 12 Policromasia
Fuente:( Aguiló,2001,pag 78)
40
Anexo 13 Cuerpos de Howell Jolly
Fuente:( Aguiló,2001, pág 78)
Anexo 14 Cambios celulares
Fuente: (Sykes, 2009, pág. 33)