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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Escherichia coli
RESISTENTES A BETALACTÁMICOS DE ESPECTRO EXTENDIDO
MEDIANTE AISLAMIENTO BACTERIANO DE CANINOS EN LA ZONA
URBANA DE QUITO.
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título
de Médico Veterinario Zootecnista
AUTORA:
EUNICE ELIZABETH ESPINOZA ALBERCA
TUTOR:
DR. RENÁN MENA PÉREZ
Quito, Febrero 2017
ii
DEDICATORIA
A mis padres Doris y Hugo por sus ejemplos de perseverancia y constancia,
por su amor y apoyo incondicional, que me han ayudado a salir adelante,
pero más que nada por inculcarme el amor a Dios, el pilar fundamental en
todo lo que soy
A mi esposo Jaime quien me brindó su amor, su cariño, y apoyo constante
cuando pensaba que me iba a rendir
A Estefanía Belén y Junior, quienes me enseñaron que si queremos hacer
grandes cosas en la vida, no puedes hacerlo solo, el mejor equipo siempre
serán los hermanos
A mis maestros por sus consejos y enseñanzas que me ayudaron en mi
formación profesional
A mi ángel que con su ternura e inocencia me enseñó que no importa la
dificultad del camino, siempre habrá alguien dispuesto a darme su amor
incondicional
Y sin desmerecer al resto de mis familiares y amigos quienes sin lugar a
duda han aportado una invaluable contribución en la elaboración de este
trabajo
Con todo mi cariño y mi amor.
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por todas sus bendiciones que me han permitido cumplir uno de mis
más anhelados sueños.
A mis queridos Padres, por ser un ejemplo de sacrificio y esfuerzo, por
siempre darme todo sin pedir nada, gracias porque sin su apoyo este merito
no hubiese sido posible.
Al Dr. Christian Vinueza, y a todo el personal de UNIETAR por compartir sus
conocimientos y brindarme apoyo en la elaboración de este trabajo de
investigación.
A mi tutor el Dr. Renán Mena por su guía y acompañamiento durante todo el
proceso de titulación.
Al personal de la Clínica Veterinaria de la Universidad Central del Ecuador, por
la apertura brindada en la fase del muestreo.
Además, agradezco a la Dra. María Inés Baquero, y a todo el personal del
Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia, por su apoyo en la realización de este trabajo de titulación.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo EUNICE ELIZABETH ESPINOZA ALBERCA, en calidad de autora del
trabajo de investigación realizada sobre “AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
DE CEPAS DE Escherichia coli RESISTENTES A BETALACTÁMICOS DE
ESPECTRO EXTENDIDO MEDIANTE AISLAMIENTO BACTERIANO DE
CANINOS EN LA ZONA URBANA DE QUITO”. Por el presente, autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos
que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines
estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley Propiedad
Intelectual y su Reglamento.
Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio
virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior.
En la ciudad de Quito, 15 de Febrero del 2017
-----------------------------------
Eunice Elizabeth Espinoza Alberca
C.I.: 1500849599
E- mail: [email protected]
v
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por la alumna
Eunice Elizabeth Espinoza Alberca, para optar el Título o Grado de Médico
Veterinario Y Zootecnista, cuyo título es “AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
DE CEPAS DE Escherichia coli RESISTENTES A BETALACTÁMICOS DE
ESPECTRO EXTENDIDO MEDIANTE AISLAMIENTO BACTERIANO DE
CANINOS EN LA ZONA URBANA DE QUITO”. Considero que dicho trabajo
reúne los requisitos y méritos para ser sometido a la presentación pública y
evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 15 días del mes de febrero del 2017
-----------------------------------
Dr. Renán Mena
CI: 0401228036
vi
vii
viii
ix
INDICE GENERAL
DEDICATORIA ............................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS .................................................................................... iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ....................................... iv
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR.................................................... v
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... xi
LISTA DE CUADROS ................................................................................... xii
RESUMEN................................................................................................... xiii
CAPÍTULO I ................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1
OBJETIVOS: ................................................................................................. 5
MARCO TEORICO ........................................................................................ 6
Antecedentes de la investigación ................................................................ 6
Fundamentación Teórica ............................................................................. 7
Historia de Escherichia coli .......................................................................... 7
Características estructurales y fisiológicas de Escherichia coli .................... 8
Antimicrobianos ......................................................................................... 10
Antibióticos β-lactámicos ........................................................................... 10
Inhibidores de β-lactamasas ...................................................................... 10
Resistencia bacteriana .............................................................................. 11
Causas de la resistencia a los antibióticos ................................................ 12
Tipos de Resistencia Bacteriana ............................................................... 12
Elementos que participan en la trasferencia de genes de resistencia ........ 13
Mecanismos de resistencia hacia antibióticos β-lactámicos ...................... 13
β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) ............................................. 15
β-lactamasas tipo AmpC ........................................................................... 16
Escherichia coli productora de β-lactamasas de espectro extendido en
caninos ...................................................................................................... 17
Diagnóstico microbiológico de Escherichia coli.......................................... 18
Detección fenotípica de Escherichia coli BLEE.......................................... 19
x
Detección fenotípica de Escherichia coli AmpC ......................................... 19
CAPÍTULO III ............................................................................................... 20
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 20
METODOLOGÍA ........................................................................................ 21
Tipo de investigación ................................................................................. 21
Descripción de la zona de estudio ............................................................. 21
Factores de Estudio................................................................................... 22
Población .................................................................................................. 22
Muestra ..................................................................................................... 22
Procedimiento de la investigación ............................................................. 23
Fase de campo (muestreo) ........................................................................ 23
Procesamiento de las muestras en el laboratorio ...................................... 24
Prueba de difusión en agar Doble disco .................................................... 26
Identificación de fenotipos BLEE/AmpC .................................................... 28
Registro y Análisis de Datos ...................................................................... 29
CAPÍTULO IV .............................................................................................. 30
RESULTADOS ............................................................................................ 30
Aislamiento de E. coli Resistente a β-lactámicos ....................................... 30
Resultados de acuerdo a la Zona Administrativa de la Ciudad de Quito .... 31
Resultados de acuerdo a la edad de los caninos ....................................... 33
Resultados de acuerdo al sexo de los caninos .......................................... 35
Determinación fenotípica de E. coli resistente a β-lactámicos por la Técnica
de Doble Disco .......................................................................................... 36
DISCUSIÓN ................................................................................................. 37
CAPÍTULO V ............................................................................................... 41
CONCLUSIONES ........................................................................................ 41
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 42
ANEXOS ..................................................................................................... 52
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la familia Enterobacteriaceae ................................. 9
Figura 2. Principales Mecanismos de Resistencia a los Antibióticos .......... 15
Figura 3. Toma de Muestra, mediante hisopado rectal en caninos ............ 24
Figura 4. Siembra de la muestra en el cultivo bacteriológico TBXC ........... 24
Figura 5. Colonias de Escherichia coli ....................................................... 25
Figura 6. Prueba bioquímica TSI ................................................................ 25
Figura 7. Almacenamiento de cepas de E. coli en tubos eppendorf ........... 26
Figura 8. Siembra de una colonia en Agar Mueller Hinton ........................ 27
Figura 9. Disolución del inóculo en cloruro de sodio ................................. 27
Figura 10. Distribución de los sesidiscos en Agar Mueller Hinton ............. 28
Figura 11. Fenotipo BLEE de E. coli .......................................................... 28
Figura 12. Fenotipo AmpC de E.coli........................................................... 29
Figura 13. E. coli productora de β-lactamasas de espectro extendido ....... 30
Figura 14. Resultados del aislamiento de E. coli resistente a β-lactámicos
del contenido fecal en caninos de la ciudad de Quito .................................. 31
Figura 15. Porcentaje de casos positivos a E. coli resistente a β-lactámicos
de espectro extendido de acuerso a la Zona Administrativa ........................ 33
Figura 16. E. coli productora de β-lactamasas de acuerdo a la edad de los
caninos...........................................................................................................34
Figura 17. Cepas BLEE y AmpC de E. coli en caninos .............................. 36
xii
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Escherichia coli ................................ 7
Cuadro 2. Clasificación de los antibióticos β-lactámicos ............................. 11
Cuadro 3. Clasificación de β-lactamasas según Ambler ............................. 17
Cuadro 4. División por Administraciones de Quito D.M. ............................. 21
Cuadro 5. Resultados del Aislamiento de E. coli resistente a β-lactámicos de
acuerdo a las Zonas Administrativas ........................................................... 32
Cuadro 6. Presencia de E. coli resistente a β-lactámicos de acuerdo a la
edad de los caninos. .................................................................................... 34
Cuadro 7. Presencia de E. coli resistente a β-lactámicos de acuerdo al sexo
de los caninos. ............................................................................................. 35
xiii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Escherichia coli RESISTENTES A BETALACTÁMICOS DE ESPECTRO EXTENDIDO MEDIANTE AISLAMIENTO BACTERIANO DE CANINOS EN LA ZONA URBANA DE QUITO.
Autora: Eunice Elizabeth Espinoza Alberca Tutor: Dr. Renán Mena
Fecha: Febrero, 2017
RESUMEN
Escherichia coli es un bacilo Gram negativo que forma parte de la microbiota
normal del canino durante toda su vida. La mayoría de las cepas de E. coli se
puede considerar como organismos comensales y son de baja virulencia, sin
embargo ciertas cepas pueden causar infecciones intestinales y
extraintestinales. Los antibióticos betalactámicos constituyen un grupo de
fármacos con acción bactericida de extenso uso para el tratamiento de las
infecciones bacterianas, esto promueve la generación de mecanismos de
resistencia. E. coli es capaz de producir enzimas que suprimen la acción de
antibióticos betalactámicos de tercera generación (BLEE) e inhibidores de
betalactamasas (AmpC). La presente investigación tuvo como objetivo reportar
la presencia de cepas de Escherichia coli resistente a betalactámicos de
espectro extendido, en muestras fecales provenientes de caninos que llegaron
por atención médica a la clínica de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. De 270 aislamientos se
encontró una presencia del 32.97% (89/270) de muestras positivas.
Posteriormente se aplicó la técnica de doble disco, y se comprobó la presencia
de cepas BLEE (87.64%) y AmpC (12.35%). En conclusión el extenso uso de
antibióticos en la práctica veterinaria de pequeñas especies, podrían
desencadenar una proliferación de bacterias resistentes, convirtiéndose en
una amenaza para la salud pública.
Palabras claves
Escherichia coli, caninos, Betalactamasas de espectro extendido BLEE,
AmpC, resistencia, doble disco, salud pública.
xiv
CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF VETERINARY MEDICINE AND ZOOTECHNICS SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE AND ZOOTECHNICS
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF STRAINS OF Escherichia coli, RESISTANT TO BETALACTAMIC OF SPREAD SPECTRUM, THROUGH BACTERIAL ISOLATION OF CANS IN THE URBAN ZONE OF QUITO
Author: Eunice Elizabeth Espinoza Alberca
Tutor: Dr. Renán Mena
Date: February 2017
ABSTRACT
Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, which is a part of the normal microbiota of the dog, during all its life. Most of strains of E coil can be considered as eating mechanisms, and are of low virulence. However, certain strains can cause infections in intestinal and extra-Intestinal. Betalactamic antibiotic are a group of pharmaceutical products with extensively use bactericidal action for the treatment of bacterial infections. It promotes the generation of resistance mechanisms. E coli is capable to produce enzymes that suppress the action of third generation betalactamic antibiotics (ESBL) and inhibitors of betalactamases (AmpC). The current investigation was intended to report the presence of strains of Escherichia coli resistant to extended spectrum betalactamic, in fecal samples taken from dogs that were admitted for medical attention to the Clinic of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics of the Universidad Central del Ecuador. Out of 270 isolations a presence of 32.97% (891270) of positive samples were found. Afterwards, the double disk technique was applied and the existence of ESBL (87.64%) and AmpC (12.35%) strains was verified. In conclusion the extensive use of antibiotics in the veterinary practice of small species could trigger production of resistant bacteria, which becomes a menace for the public health.
KEYWORDS: Escher ich ia co l i , DOGS, EXTENDED SPECTRUM BETALACTAMASES ESBL, AmpC, RESISTANCE, DOUBLE DISC, PUBLIC HEALTH
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia
Enterobacteriaceae descrita por primera vez por Theodore Escherich en 1885,
desde entonces ha servido como modelo en numerosas investigaciones por
presentar cualidades como su pequeño tamaño y su rápida multiplicación
(Pierce, 2010).
Este microorganismo es relativamente benigno y forma parte de la microbiota
normal del canino durante toda su vida, aunque la mayoría de las cepas de E.
coli se puede considerar como organismos comensales y son de baja
virulencia, pueden causar infecciones oportunistas en localizaciones
extraintestinales tales como la glándula mamaria y tracto urinario, o ser
factores de agravación de infecciones como parvovirosis o Distemper (Couto,
2010 ; Quinn et al.,2011) .
La colonización del tracto intestinal de los mamíferos con E. coli sucede poco
después de nacer a partir del contacto con fuentes ambientales contaminadas
(Quinn, Markey , Leonard, FritzPatrck, Fanning, & Hartigan, 2011). Aunque
esta bacteria actúa como comensal puede asociarse al desarrollo de una
enfermedad, que puede ser provocada por diversos factores como la
respuesta del hospedador, presencia de tejidos dañados, y la capacidad
patogénica de las bacterias. (Tizard, 2009 ;Quinn et al ., 2011).
Para el control de las diferentes bacteremias que se presentan en animales de
compañía, los agentes antimicrobianos son la principal herramienta que el
2
médico veterinario tiene contra las infecciones, sin embargo el uso de
antibióticos se ha incrementado de sobremanera en la práctica veterinaria
(García, García & Hernández , 2011).
Los antibióticos β-lactámicos constituyen un grupo de fármacos con acción
bactericida de extenso uso para el tratamiento de las infecciones bacterianas,
esto promueve la generación de mecanismos de resistencia (Pereyra,
Puigdevall, Testorelli, Rumi, Denamiel & Gentilini, 2013).
Actualmente el fracaso terapéutico en las infecciones por enterobacterias, ha
hecho que los estudios se dirijan hacia estos mecanismos de resistencia y se
ha comprobado la presencia de bacterias productoras de enzimas capaces de
inactivar antibióticos β-lactámicos (García, García & Hernández , 2011). A
este grupo se suman las bacterias productoras de betalactamasas de espectro
extendido (BLEE) capaces de inactivar cefalosporinas de tercera generación,
monobactámicos y en menor medida a los aminoglucósidos (Wilfredo,
Godínez, Hernández, Padrón Sánchez, & De Armas Moreno, 2006).
Las AmpC constituyen otro tipo de β-lactamasas, que se caracterizan por ser
activas frente a penicilinas y cefalosporinas, pudiendo hidrolizar cefamicinas,
oximino cefaloporinas y monobactams con excepción de cefalosporinas de
cuarta generación y carbapenémicos (Seral, Gude, & Castillo, 2012). A
diferencia de las betalactamasas de espectro extendido (BLEE), estas
enzimas se caracterizan por ser resistentes a la combinación de β-lactámicos
con inhibidores de β-lactamasas, con la posible excepción de piperacilina-
tazobactam (Seral et al., 2012).
La rápida aparición de cepas BLEE ha llevado a la búsqueda del reservorio
principalmente en animales para el consumo, no obstante los animales de
compañía también pueden llegar a ser colonizados por estas bacterias
3
resistentes, lo cual ha sido notificado en algunos países con prevalencias
desde el 1% hasta el 55% (Damborg, Morsing, Petersen, Bortolaia, &
Guardabassi, 2015).
La primera detección de cepas BLEE en muestras de caninos se reportó en
Japón en 1988, desde entonces numerosos estudios han demostrado la
presencia de cepas BLEE en animales de compañía en todo el mundo
(O’Keefe et al., 2010 ; Tamang et al.,2012 & So et al., 2012).
En Berlín, una ciudad que cuenta con la mayor cantidad de caninos por
habitante, se realizó un estudio publicado por Schaufler y colaboradores en
el año 2015, donde se identificó 14 de 100 muestras fecales de caninos
resistentes a cefotaxima, de las cuales 10 (10%) eran BLEE y 4 (4%) AmpC
(Schaufler et al., 2015). Se comprobó la resistencia a antibióticos tales como
ampicilina 100%, amoxicilina más ácido clavulánico 71,4%, gentamicina 64%,
kanamicina 85%, doxiciclina 92%, cloranfenicol 28% y ácido nalidíxico 50%.
Este estudio recalcó la importancia de la resistencia a antibióticos en caninos,
los cuales podrían contribuir a la propagación de bacterias productoras de
BLEE/AmpC (Schaufler et al., 2015).
Los caninos pueden llegar a ser un reservorio potencial de cepas BLEE y
contribuir a la diseminación de cepas multirresistentes entre humanos y
animales de compañía, debido al estrecho contacto que existe entre los
mismos (Rzewuska et al., 2015). Esta transmisión zoonótica se produce
principalmente por la vía fecal-oral, ya que las heces del canino son una fuente
de agentes patógenos transmisibles (Damborg et al., 2015).
En un estudio realizado en los Países Bajos se demostró que entre pollos de
engorde y granjeros existe trasferencia de genes de resistencia, por lo cual
entre animales de compañía y propietarios no se podría descartar un hecho
4
similar, no obstante estudios sobre el tema no han sido mayormente detallados
(Dierikx, J, Fabri, Smith, & Mevius, n.d.; Falgenhauer, Schmiedel & Ghosh,
2014).
Actualmente el Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI), recomendó
iniciar una investigación para la detección de cepas BLEE, mediante la prueba
de control de crecimiento en un medio selectivo que contenga 1mg/L de un
antibiótico de amplio espectro, donde la sospecha inicial puede confirmarse
con el método de aproximación de doble disco, considerado como un método
rentable y sencillo (García-Hernandez et al., 2011).
En nuestro país actualmente no se ha registrado datos sobre cepas
BLEE/AmpC en caninos, por lo tanto, los resultados de la presente
investigación son esenciales, pues se convertirá en un hallazgo para
establecer criterios de vigilancia epidemiológica en la práctica veterinaria,
puesto que los caninos a menudo viven cerca de los humanos y por el
comportamiento que tienen de olfatear sumado a la falta de medidas
higiénicas le dan al canino un papel de portador potencial de cepas
multirresistentes, esto puede contribuir a la propagación zoonótica y ambiental
de cepas productoras de BLEE/AmpC (Schaufler et al., 2015).
Además es importante saber qué grado de susceptibilidad tienen estos
microorganismos a los β-lactámicos, ya que con el incremento del uso de
antimicrobianos para el tratamiento de enfermedades infecciosas ha causado
que los microrganismos se adapten, desarrollando mecanismos de defensa
convirtiéndose en una gran preocupación para la salud pública (Okubo, Sato,
Yokota, Usui, & Tamura, 2014).
5
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Aislar e identificar bacteriológicamente cepas de Escherichia coli resistente a
β-lactámicos de espectro extendido, en muestras fecales provenientes de
caninos que llegan por atención médica a la clínica de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.
Objetivos Específicos:
1.- Identificar la presencia de cepas de E. coli productoras de BLEE en
muestras fecales de caninos de la ciudad de Quito.
2.- Identificar la presencia de cepas de E. coli productoras de AmpC en
muestras fecales de caninos de la ciudad de Quito.
3.- Asociar la resistencia a antibióticos β-lactámicos de espectro extendido con
la edad, el sexo y el distrito al cual pertenecen los caninos, mediante la prueba
de ji-cuadrado.
6
CAPITULO II
MARCO TEORICO
Antecedentes de la investigación
En el año 2013, en Berlín se analizaron 100 hisopados rectales de caninos
pertenecientes a diferentes barrios de la ciudad, el 14 % de las muestras dio
positivo para Escherichia coli productora de β-lactamasas (Schaufler et al.,
2015).
En Corea del Sur, un estudio de 628 muestras intestinales de perros callejeros,
obtuvo un total de 12 y 23 muestras positivas para Escherichia coli productora
de BLEE Y AmpC respectivamente (Tamang et al., 2012).
En Polonia en 2013, se aisló Escherichia coli productora de β-lactamasas en
muestras clínicas de caninos enfermos, de las 119 muestras tomadas, el 3.4%
(4/119) fueron positivas para BLEE (Rzewuska et al., 2015).
En Dinamarca, Copenhague se recogieron 209 muestras fecales de caninos
en nueve jardines públicos del área metropolitana, se obtuvo 4 muestras
positivas para Escherichia coli productoras de betalactamasas (Damborg et
al., 2015).
En Rio de Janeiro, Brasil un estudio de 134 muestras fecales de caninos fueron
recolectadas durante un año, los cuales además no recibieron terapia
antimicrobiana 3 meses antes del estudio, se obtuvo un 28,5% de cepas BLEE
(Carvalho et al., 2016).
Actualmente en nuestro país no se han publicado estudios sobre la presencia
de cepas de Escherichia coli productoras de betalactamasas tipo BLEE/AmpC
en caninos.
7
Fundamentación Teórica
Historia de Escherichia coli
La especie Escherichia coli fue descrita por el pediatra Alemán Theodore
Escherich en 1885, debido a estudios que realizó en la flora intestinal humana,
al descubrir que empezaban a crecer bacterias en la heces fecales de niños
recién nacidos poco después de iniciada la lactancia (Ledermann, 2007;
Songer & Post, 2005). Bacterium coli commune fue el nombre que se le asignó,
posteriormente la taxonomía le otorgó el nombre de Escherichia coli, en honor
a su descubridor (Ledermann, 2007). La clasificación taxonómica de este
bacilo se muestra en el cuadro 1.
Fuente: Bodero, 2010 ; Stanchi, 2007
Modificado por: La autora
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Escherichia coli
Reino Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Gamma Proteobacteria
Orden Eubacteriales
Familia Enterobacteriaceae
Tribu Escherichieae
Género Escherichia
Especie Coli
8
Características estructurales y fisiológicas de Escherichia coli
Escherichia coli es un bacilo gram negativo anaerobio facultativo que mide
entre 1 y 1.5 µm x 2 y 6 µm, pueden presentarse aislados o en pares
dependiendo las condiciones, tienen un metabolismo fermentativo, son
oxidasa negativo, catalasa positiva, no producen esporas y la mayoría de
cepas son móviles ( Stanchi, 2007).
Los elementos constitutivos de su estructura son cápsula, pared bacteriana,
membrana externa, pili o fibrinas, y flagelos perítricos (ver Figura 1) (P. R.
Murray, Rosentha, & Pfaller, 2009).
La capsula está ubicada por fuera de la pared celular, tiene actividad
antigénica y está formada por polisacáridos, origina una amplia gama de
antígenos “K”( Stanchi, 2007 ; Murray, 2009). Mientras que la pared bacteriana
está conformada por una membrana externa, una delgada capa de
peptidoglucano y por un espacio periplásmico que recubre a la membrana
citoplasmática (Stanchi, 2007).
La membrana externa ejerce protección contra la acción de las sales biliares
y de los fermentos digestivos, está constituida por una doble capa lipídica, la
cual contiene moléculas de liposacárido (LPS), estos azucares además
originan el antígeno somático “O” (Quinn, P ; Markey , B ; Leonard, F ;
FritzPatrck, E ; Fanning, S & Hartigan, 2011).
El peptidoglucano es una capa conformada por cadenas lineales de poliosidas
unidas por péptidos (Merino, n.d.).
El espacio periplásmico posee enzimas que son necesarias para el
metabolismo bacteriano (Tortora, Funke, & Case, 2007).
La membrana citoplasmática está formada por una doble capa fosfolipídica
que regula el paso de nutrientes, metabolitos y macromoléculas (Puerta &
Mateos, 2010).
9
Las fimbrias o pili son estructuras proteicas filamentosas que sirven como
adherencia, sin embargo hay otros pilis llamados sexuales que ayudan al
intercambio de material genético. Las Fimbrias también expresan antígenos
denominados antígenos fimbriales “F” (P. R. Murray et al., 2009).
Existen cepas de Escherichia coli que no presentan movilidad y por
consiguiente, sin flagelos, por otro lado las cepas móviles poseen un grupo de
antígenos proteicos constituyentes de los flagelos, denominados antígenos H
(P. R. Murray et al., 2009).
Plásmidos y episomas son elementos genéticos que están conformados por
secuencias de ADN, cortos y circulares que mantienen una replicación
autónoma, poseen factores de resistencia a antibióticos y producen toxinas
(Koneman & Allen, 2008).
Por lo expuesto anteriormente, la clasificación epidemiológica (serológica) de
Escherichia coli se basa en 4 grandes grupos de antígenos: somáticos (O),
capsulares (K), flagelares (H) y fimbriales (F) (P. R. Murray et al., 2009).
Fuente: Puerta & Mateos, 2010
Figura 1. Estructura de la familia Enterobacteriaceae
10
Antimicrobianos
Los antimicrobianos se definen como sustancias químicas producidas de
forma natural, sintética o semisintética, capaces de inhibir el crecimiento o
destruir a un microorganismo (Quintana, 2002 ; Seija & Vignoli, 2008).
Los antibióticos tienen las mismas cualidades, excepto que son producidos
naturalmente por un microorganismo (Gentilini, 2007).
En 1928, fue Alexander Fleming quien noto como el crecimiento de un hongo
Penicillium notatum, causaba lisis en un cultivo de estafilococos, por ello se
conoció a la penicilina como el primer antibiótico en honor al género de hongos
que lo producían: Penicillium, dando paso a la revolución de la terapia
antimicrobiana (Sumano & Ocampo, 2006).
Antibióticos β-lactámicos
Los antibióticos β-lactámicos poseen un anillo central de 4 átomos llamado
anillo β-lactámico (Stanchi, 2007). Este grupo de fármacos tienen acción
bactericida que actúan sobre la fase final de síntesis de peptidoglicano
(García-Hernández et al., 2011). La clasificación de estos antibióticos se
detalla en el cuadro 2.
Inhibidores de β-lactamasas
En la actualidad se han desarrollado distintas estrategias para neutralizar la
producción de β-lactamasas, uno de los principales mecanismos de
resistencia bacteriana a los antibióticos betalactámicos. El uso de inhibidores
de β-lactamasas es considerada una alternativa terapéutica para asegurar un
mayor espectro bacteriano. El ácido clavulánico (AC), sulbactam (SUL), y
tazobactam (TAZ) están comercialmente disponibles en la actualidad
(Barcelona et al., 2008).
11
Cuadro 2. Clasificación de los antibióticos β-lactámicos
Clase Grupo Ejemplos
β-lactámicos Penicilinas naturales Penicilina G, penicilina V
Penicilina resistentes a la penicilinasa Meticilina, nafcilina (Cloxacilina, dicloxacilina, ofloxacina)
Aminopenicilinas Amoxicilina, ampicilina
Carboxipenicilinas Carbenicilina, ticarcilina
Ureidopenicilinas Azlocilina, mezlocilina, piperacilina
Cefalosporinas de primera generación Cefazolina, cefalotina, cefapirina, cefradina
Cefalosporinas de segunda generación Cefamandol, cefonicida, cefuroxima
Cefamicinas Cefmatazol, cefotetán, cefoxitina
Cefalosporinas de tercera generación Cefoperazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftizoxima, ceftrioxona
Cefalosporinas de cuarta generación Cefepime
Carbacefem Loracarbef
Monobactámicos Aztreonam
Carbapenémicos Ertapenem, imipenem, meropenem
Combinaciones β-lactámicos- inhibidores de β-lactamasas
Amoxicilina- ácido clavulánico, ampicilina –sulbactam, piperacilina-tazobactam
Fuente: Koneman & Allen, 2008
Modificado por: La Autora
Resistencia bacteriana
El descubrimiento y la síntesis de nuevos antimicrobianos han provocado una
revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin
embargo los microorganismos (bacterias, hongos, virus y parásitos) sufren
cambios al verse expuestos a los antibióticos, y como resultado los
12
medicamentos tienen acción nula frente a los patógenos provocando que las
infecciones persistan en el organismo (OMS, 2016 ; Sumano & Ocampo,
2006).
Causas de la resistencia a los antibióticos
Un informe de la OMS en 2014 reconoció que las causas de la resistencia a
los antibióticos, es la utilización incontrolada e inapropiada de los antibióticos
en la población (Embid & Amc, n.d.;OMS, 2014). Además la versatilidad y
adaptabilidad de los microorganismos han impedido la eficacia de la terapia
antimicrobiana (Sumano & Ocampo, 2006).
Tipos de Resistencia Bacteriana
Resistencia Natural
Depende de la estructura y fisiología natural de la especie, este tipo de
resistencia no está correlacionado con el incremento o el uso inadecuado de
antibióticos (Songer & Post, 2005).
Resistencia Adquirida
Es un tipo de resistencia evolutiva y la frecuencia depende a menudo de la
utilización de antibióticos. Los procesos básicos de la transferencia de genes
son la transducción, transformación y conjugación, mediante elementos
genéticos como son los plásmidos, los transposones e integrones (Sumano &
Ocampo, 2006).
Conjugación: en este mecanismo la célula donadora transfiere a la
célula receptora, mediante el pili sexual copias de genes resistentes mediados
por plásmidos (Sánchez, Muñoz, & Gutiérrez, 2012).
Transformación: es la transferencia de genes desde un ADN desnudo
de una bacteria previamente lisada a otra que lo recibe y lo incorpora a su
genoma (Cabrera, Gómez, & Zúñiga, 2007).
13
Transducción: en este mecanismo se transfiere DNA de una célula a
otra mediante la participación de bacteriófagos (Sánchez et al., 2012 ; Quinn
et al., 2011).
Elementos que participan en la trasferencia de genes de resistencia
Plásmidos: son moléculas extra cromosómicas que al igual que el
cromosoma, poseen doble cadena de ADN, tienen replicación independiente
del cromosoma bacteriano (Quinn et al., 2011;Sánchez et al., 2012). Están
presentes normalmente en gran cantidad de bacterias, donde su número
puede variar (Quinn et al., 2011).
Se han identificado diferentes tipos de plásmidos, entre los cuales se
encuentran los integrativos, que poseen la capacidad de insertarse en el
cromosoma bacteriano y los conjugativos o sexuales (Sánchez et al., 2012).
Transposones: son secuencias de DNA (doble cadena) que pueden
ser traslocados entre cromosomas o de un cromosoma a un plásmido o entre
plásmidos, esto debido a un sistema de recombinación propio (Quinn, 2011).
Integrones: son considerados una familia de elementos genéticos
potencialmente móviles, que son capaces de integrar y expresar genes de
resistencia a los antibióticos (Sánchez et al., 2012).
Mecanismos de resistencia hacia antibióticos β-lactámicos
Alteración de la diana
La alteración del sitio de unión del antimicrobiano se convierte en una pérdida
de la afinidad y por tanto imposibilita realizar la destrucción del microorganismo
(ver Figura 2) (Pérez, 2007).
14
Disminución de la permeabilidad
Las bacterias tienen la capacidad de generar cambios de la bicapa lipídica,
donde la permeabilidad de la membrana se ve alterada, además suceden
cambios en las porinas, que son proteínas que conforman canales llenos de
agua embebidos en la membrana externa, los cuales regulan la entrada de
algunos elementos, entre ellos, los antibióticos (Vignoli & Seija, 2000). Los
cambios en su conformación pueden llevar a que la membrana externa no
permita el paso de estos agentes al espacio periplásmico (ver Figura 2) (Tafur
& Villegas, 2008).
Mecanismos de Bombas de eflujo o expulsión del antibiótico
Las Bombas de Eflujo son proteínas transportadoras de membrana
involucradas en la expulsión de sustancias toxicas desde el espacio
periplásmico al exterior (ver Figura 2) (Marchetti, Errecalde, & Mestorino,
2011).
Inactivación enzimática por betalactamasas
La resistencia de E. coli a los antibióticos β-lactámicos se debe principalmente
a la producción de β-lactamasas, enzimas capaces de inactivar al anillo β-
lactámico (Akhtardanesh, Ghanbarpour, & Yazdani, 2015). La producción de
β-lactamasas puede suceder en el espacio extracelular o en el espacio
periplásmico y pueden ser sintetizadas por codificación de DNA plasmídico,
cromosómico y también transposónico (C. S. García, de la Gándara, & García,
2010).
Actualmente hay dos tipos de clasificación para las β-lactamasas, la primera
se basa en la combinación de descripciones fenotípicas según Bush y col,
mientras la segunda de Ambler toma en cuenta los grupos moleculares
(Koneman & Allen, 2008). De acuerdo con su posición genómica dentro de los
microorganismos, las β-lactamasas pueden ser cromosómicas o plasmídicas,
sin embargo una importante proporción de β-lactamasas descriptas hasta este
15
momento es codificada por genes de ubicación plasmídica, es decir en
material genómico bacteriano fácilmente transmisible (Winn et al., 2013).
1. Enzimas modificadoras de resistencia a los antibióticos. 2. Bombas de salida 3. Cierre de porinas 4. Proteínas unidoras de penicilinas.
Fuente: Tafur & Villegas, 2008
β-lactamasas de espectro extendido (BLEE)
La producción de β-lactamasas es el mecanismo de resistencia más común e
importante en las bacterias Gram negativas, estas enzimas son capaces de
hidrolizar el anillo β-lactámico inactivando los antibióticos (Huber, Zweifel,
Wittenbrink, & Stephan, 2013).
Las BLEE son un grupo importante de enzimas que tienen la capacidad de
hidrolizar y causar resistencia a penicilinas, oximino-cefalosporinas
(cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefepima) y monobactámicos
(aztreonam), pero no a cefamicinas (cefoxitina) ni a carbapenémicos, siendo
inhibidas por el ácido clavulánico (Schaufler et al., 2015). Los genes que las
Figura 2. Principales Mecanismos de Resistencia a los Antibióticos
Β-lactámicos
16
codifican se encuentran en elementos móviles es decir en material genómico
bacteriano transmisible, lo cual facilitan su propagación y a menudo presentan
resistencia a otros antibacterianos como aminoglucósidos, cotrimoxazol y
quinolonas (Calvo, Cantón, Fernández-Cuenca, Mirelis, & Navarro, 2011).
β-lactamasas tipo AmpC
Las AmpC son serin-betalactamasas pertenecientes al grupo 1 según la
clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros y a la clase C de la clasificación
estructural de Ambler (D. Martínez, 2009), como se muestra en el cuadro 3.
Son enzimas capaces de hidrolizar penicilinas, cefamicinas,
oximinocefalosporinas y monobactams, con la excepción de cefalosporinas de
cuarta generación (cefepima, cefpiroma) y carbapenémicos, además se
caracterizan por ser resistentes a antibióticos β-lactámicos combinados con
inhibidores de β-lactamasas (Porres, 2015).
Las AmpC se codifican de manera específica en el cromosoma bacteriano de
algunas especies de enterobacterias, su síntesis es inducible en la mayoría de
ellas (Martinez, Garzón, & Mattar, 2012). Esto significa que se producen a
bajos niveles de manera natural y aumentan su síntesis en presencia de β-
lactámicos (D. Martínez, 2009).
En el caso de Escherichia coli son intrínsecamente constitutivas esto significa
que su expresión es a niveles muy bajos sin mostrar resistencia (D. Martínez,
2009). Sin embargo en la actualidad la localización de los genes de las β-
lactamasas AmpC no solo puede ser cromosómicas; se estima que algunas
de sus variantes cromosómicas llegaron hasta los plásmidos (Porres, 2015)
Una bacteria portadora de β-lactamasas AmpC plasmídicas posee mayor
grado de resistencia a antibióticos e incluso los plásmidos pueden llevar genes
de resistencia a otros antibióticos (Porres, 2015).
17
En general, la prevalencia de las AmpC plasmídicas suele ser relativamente
baja, aunque mantiene la tendencia a incrementarse (Calvo et al., 2011). La
producción de β-lactamasas de tipo AmpC plasmídicas puede dar lugar a
fracasos terapéuticos por lo cual estas enzimas tienen mucha mayor
relevancia o trascendencia que las AmpC cromosómicas, debido a su
capacidad para movilizarse (Calvo et al., 2011).
Cuadro 3. Clasificación de β-lactamasas según Ambler
Clasificación Enzimas Espectro de resistencia
Clase A Carbapenemasas Penicilinas Cefalosporinas Monobactam Carbapenémicos
Betalactamasas de espectro extendido
Penicilinas Cefalosporinas Monobactam
Clase B Metalo betalactamasas Penicilinas Cefalosporinas Monobactam
Clase C AmpC betalactamasas Penicilinas Cefalosporinas Monobactam Inhibidores de betalactamasas
Clase D OXA betalactamasas Penicilina Inhibidores de betalactamasas combinados con carbapenémicos
Fuente: Janon, 2016
Modificado por: La Autora
Escherichia coli productora de β-lactamasas de espectro extendido en
caninos
En los últimos años los caninos han pasado a formar parte importante de las
familias humanas, siendo esta proximidad un factor que aumenta la posibilidad
de transmisión de bacterias resistentes (Carvalho et al., 2016). E. coli es un
microorganismo que forma parte de la microbiota normal del canino, y al mismo
tiempo puede convertirse en un importante patógeno nosocomial (Wu et al.,
2013).
18
Una fuente reconocida de agentes zoonóticos son las heces del perro,
incluyendo bacterias resistentes clínicamente relevantes que podrían ser
transmitidas a los seres humanos a través de la vía fecal-oral (Damborg et al.,
2015).
Es importante tener en cuenta la capacidad de E. coli para transferir casetes
genéticos que confieren resistencia a multiples fármacos, en el caso actual son
los antibióticos β-lactámicos de mayor uso en la clínica de pequeñas especies
para tratamientos de infecciones. Este uso generalizado pudo haber
contribuido al aumento sustancial en la aparición de cepas BLEE/AmpC de E.
coli en caninos, lo que plantea un grave riesgo potencial para la salud pública
(Tamang et al., 2012).
Diagnóstico microbiológico de Escherichia coli
Para identificar la presencia de E. coli se utiliza medios selectivos para
enterobacterias y la confirmación se realiza mediante pruebas bioquímicas
(Tobergte & Curtis, 2013). Los medios de cultivos usados de forma habitual
contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben el crecimiento de
bacterias gram positivas y permite la propagación de Gram negativas
(Tobergte & Curtis, 2013).
El agar TBX es un medio de cultivo altamente selectivo, debido al complejo
cromogénico X-glucorónido de su fórmula, la presencia de la enzima
glucoronidasa de E.coli rompe este complejo provocando la liberación de un
cromóforo que proporciona el color verdoso característico de las colonias
(Perez, 2015). Las sales biliares contenidas en su formulación inhiben el
crecimiento de bacterias Gram positivas, mientras que la triptosa adiciona
nutrientes para el crecimiento de la bacteria (Perez, 2015). El agente selectivo
que permite el crecimiento de bacterias resistentes a β-lactámicos es la
cefotaxima (Perez, 2015). La confirmación de colonias sospechosas a E. coli
se realiza mediante pruebas bioquímicas, como formación de indol, reacción
19
de Voges y Proskauer, prueba del rojo de metilo y la utilización de citrato
(Stanchi, 2007).
El agar Triple Sugar Iron (TSI), es un medio de cultivo empleado para la
diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa,
sacarosa, lactosa y a la producción de ácido sulfhídrico. E. coli por su
capacidad de fermentar los tres azucares expresa una reacción ácida en el
medio (pico amarillo/fondo amarillo), también es posible detectar una reacción
positiva en la producción de gas y una reacción negativa en la producción de
ácido sulfúrico (Tobergte & Curtis, 2013).
Detección fenotípica de Escherichia coli BLEE
Se han desarrollado diversas pruebas fenotípicas para la detección de BLEE,
donde la mayoría se basan en la actividad inhibitoria del ácido clavulánico
(Navarro, Calvo, Cantón, Fernández-Cuenca, & Mirelis, 2011). La técnica de
doble discos o discos combinados, utiliza discos con cefalosporinas de 3º
generación, sola y combinados con inhibidores de β-lactamasas, se confirma
la presencia de BLEE cuando el halo de inhibición de la combinación es igual
a 5 mm o mayor, respecto a la cefalosporina sola (Delfín & Almanza, 2010;
CLSI, 2014).
Detección fenotípica de Escherichia coli AmpC
Actualmente no existen métodos fenotípicos estandarizados por el CLSI, para
la detección de enzimas AmpC (T. García, Castillo, & Salazar, 2014). Sin
embargo se ha diseñado procedimientos con elevada sensibilidad y
especificidad que resulten económicos, sencillos y eficaces, entre ellos la
técnica de sinergia de doble disco (usando discos de cloxacilina o ácido fenil-
borónico y discos de cefotaxima y ceftazidima), y el método de discos
combinados con inhibidores de β-lactamasas (Martínez, 2009; Lezameta,
Gonzáles-Escalante, & Tamariz, 2010).
20
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES
En la presente investigación se utilizaron los siguientes materiales:
Recolección de las muestras:
Hisopos
Guantes látex
Hisopos estériles
Tubos de ensayo estériles
Marcadores permanentes
Cooler
Materiales y equipos de Laboratorio
Pipetas
Probetas
Cajas Petri plásticas
Tubos de ensayo
Pipeta automática (Rango: 200-1000 µl) marca Gilson
Autoclave
Balanza electrónica
Cámara de flujo laminar con filtros HEPA
Incubadora
Refrigeradora
Ultra congelador
21
Vortex marca Heidolph
Centrífuga
Densitómetro
METODOLOGÍA
Tipo de investigación
El presente estudio fue una investigación observacional y transversal
Descripción de la zona de estudio
La investigación se realizó en la Clínica de la FMVZ de la Universidad Central
del Ecuador, incluyendo a caninos que asistieron por atención médica,
pertenecientes al área urbana de la ciudad de Quito. Para lo cual se utilizó el
mapa de distribución por Distritos de las Unidades Operativas de Quito D.M.,
según el Ministerio de Salud Pública y el mapa de Administraciones y
parroquias urbanas de Quito D.M. (ver Anexo 1 y 2).
Cuadro 4. División por Administraciones de Quito D.M.
Fuente: EPMMOP, 2011
Modificado por: La Autora
ADM. Quitumbe
ADM. Sur Eloy Alfaro
ADM. Centro Manuelita Sáenz
ADM. Norte Eugenio Espejo
ADM. Equinoccial La Delicia
Guamaní La Mena Puengasí Belisario Quevedo
Cotocollao
Turubamba Solanda La Libertad Mariscal Sucre Ponceano
La Ecuatoriana
La Argelia Centro Histórico Iñaquito Comité del Pueblo
Quitumbe San Bartolo Itchimbía Rumipamba El Condado
Chillogallo La Ferroviaria San Juan Jipijapa Carcelén
Chilibulo Cochapamba
La Magdalena Concepción
Chimbacalle Kennedy San Isidro del
Inca
22
Factores de Estudio
La identificación de cepas de E. coli resistentes a antibióticos β-lactámicos de
tercera generación se realizó mediante aislamiento bacteriológico en un medio
cromogénico altamente selectivo para E. coli, Tryptone Bile Glucuronic Agar
(TBX), que se ve reforzado por la adición en su fabricación de un agente
cromógeno el X-glucorónido, detectando la actividad específica β-D
glucoronidasa de E. coli (NEOGEN, 2009).
Actualmente el Clinical and Laboratory Standars Institute (CLSI) recomendó
iniciar una investigación para la detección de cepas BLEE, mediante la prueba
de control de crecimiento en un medio selectivo que contenga 1 mg/L de un
antibiótico de amplio espectro (García-Hernández et al., 2011). En el presente
estudio se utilizó 3 µg/L de cefotaxima un antibiótico de tercera generación.
La sospecha inicial de cepas resistentes a antibióticos betalactámicos se
confirmó con la técnica de discos combinados o dobles discos. El esquema del
aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos se detalla en el Anexo 3.
Población
La población objeto del estudio fueron caninos del área urbana de la ciudad
de Quito, que no recibieron medicación antimicrobiana en las últimas 4
semanas y que no presentaron síndrome diarreico.
Muestra
El muestreo fue de tipo estratificado, en el cual seleccionó a la población
dividiéndola en estratos o subgrupos. Para obtener la muestra completa se
combinaron las unidades muestreadas de cada estrato designado (Lagares &
Puerto, 2001).
Se estima que aproximadamente en la ciudad de Quito hay alrededor de 1
canino por cada 4 habitantes (Alarcón, 2015).
23
Tomando en cuenta que existen 1’619.146 habitantes en la ciudad de Quito,
el número de caninos fue de 404.787 (INEC, 2012). Por lo tanto el tamaño del
Universo fue de 404.787 perros y la fórmula aplicada fue la siguiente:
𝑛 =𝑁𝜎2𝑍2
(𝑁 − 1)𝑒2 + 𝜎2𝑍2
Dónde:
n = el tamaño de la muestra
N = tamaño de la población
𝜎 = Desviación estándar de la población
Z = Valor obtenido mediante niveles de confianza
e = Límite aceptable de error muestral
Para calcular el tamaño de la muestra se utilizó la desviación estándar de la
población con una constante 0,5 con un nivel de confianza del 90%(1,62), y
el límite aceptable del error muestral del 5%(0,05) (Suarez, 2004).
𝑛 =404.787(0,5)2(1,65)2
(404.787 − 1)(0,05)2 + (0,5)2(1,65)2
𝑛 = 270
Procedimiento de la investigación
Fase de campo (muestreo)
- Se seleccionó al paciente según la zona distrital de la ciudad de Quito,
con el previo consentimiento informado de los propietarios para la toma
de la muestra fecal. Los datos registrados después de una breve
anamnesis fueron raza, edad, sexo y estado de salud.
24
- La toma de la muestra rectal se realizó con hisopos estériles, previo a
la limpieza de la zona perianal del canino con suero fisiológico, como lo
muestra la figura 3, colocándose la muestra en tubos estériles,
posteriormente fueron transportados al laboratorio UNIETAR donde se
procedió a la siembra en el medio bacteriológico.
Fuente: La Autora
Procesamiento de las muestras en el laboratorio
- Las muestras fueron sembradas en medio de cultivo selectivo (TBX+C),
incubadas por 24 h a 37 ºC (Figura 4).
Fuente: La Autora
Figura 3. Toma de Muestra, mediante hisopado rectal en caninos
Figura 4. Siembra de la muestra en el cultivo bacteriológico TBXC
25
- Las colonias positivas para Escherichia coli, se observaron de color
verde azulado característico, mientras que las muestras negativas
fueron autoclavadas (Figura 5).
Figura 5. Colonias de Escherichia coli
Fuente: La Autora
- Posteriormente se realizó la siembra de dos colonias en TSI, incubadas
por 24 h a 37 ºC (Figura 6).
Figura 6. Prueba bioquímica TSI
Fuente: La Autora
- Las cepas que dieron como resultado A/A+ producción de gas, fueron
respaldadas en 500 µl de TSB incubadas a 37ºC por 24 h.
26
Finalmente se adicionó 1000 µl de glicerol para ser guardados en tubos
eppendorf a -80ºC.
Prueba de difusión en agar Doble disco
- Se procedió a descongelar las cepas almacenadas en el criocongelador
a -80 °C, tomando una asada del microtubo y se realizó una estriación
en el medio TBX, con una incubación a 37°C por 24 horas (Figura 7).
Fuente: La Autora
- Posteriormente se realizó la siembra de una colonia en Agar Mueller
Hinton, con una incubación a 37°C por 24 horas (Figura 8).
Figura 7. Almacenamiento de cepas de E. coli en tubos eppendorf
27
Figura 8. Siembra de una colonia en Agar Mueller Hinton
Fuente: La Autora
- Se inoculó en cloruro de sodio de 4 a 5 colonias, hasta obtener 0,5
escala de McFarland, con la ayuda de hisopos estériles se realizó la
distribución de la dilución obtenida en agar Mueller Hilton (Figura 9).
Fuente: La Autora
- Finalmente se distribuyó los discos impregnados sólo con antibiótico y
discos impregnados con el inhibidor de β-lactamasas más antibiótico,
ubicándolos estratégicamente en cada caja Petri, fueron incubadas a
37 ºC por 24h (Figura 10).
Figura 9. Disolución del inóculo en cloruro de sodio
28
Figura 10. Distribución de los sesidiscos en Agar Mueller Hinton
Fuente: La Autora
Identificación de fenotipos BLEE/AmpC
Cepas BLEE
Se observó en los halos de inhibición, una diferencia mayor a 5 mm entre el
antimicrobiano y su inhibidor de β-lactamasas: CTX y CTX+C, CAZ y CAZ+C
y/o FEP y FEP+C; cualquiera de las tres formas o las tres es positivo para
BLEE.
Fuente: La Autora
Figura 11. Fenotipo BLEE de E. coli
29
Cepas AmpC
Se observó en los halos de inhibición, una diferencia menor a 5 mm entre
antimicrobiano y su inhibidor de β-lactamasas: CTX y CTX+C, CAZ y CAZ+C
y FEP y FEP+C; siempre las tres formas juntas.
Fuente: La Autora
Registro y Análisis de Datos
Registro de Datos
Los datos fueron registrados en un cuaderno de laboratorio y agrupados en
una base de datos en una hoja de Microsoft Excel ® (versión 15.0.4805.1003),
donde consta la fecha en que se tomó la muestra, el nombre de la mascota, la
raza, el sexo, el nombre del propietario de la mascota, el motivo de consulta y
el número de distrito al cual pertenece.
Análisis de datos
Para el análisis de datos se aplicó estadística descriptiva, y mediante la prueba
de ji-cuadrado utilizando el programa informático “R” (versión 3.0.1), se
demostró si existe asociación entre la resistencia antibiótica con la edad, el
sexo y el distrito al cual pertenecen los caninos.
Figura 12. Fenotipo AmpC de E.coli
30
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Aislamiento de E. coli Resistente a β-lactámicos
Se aisló E. coli resistente a β-lactámicos, en agar TBX (Tryptone Bile X-
Glucuronide), suplementado con Cefotaxima y se confirmó con la prueba de
TSI.
Fuente: Investigación directa
Elaboración: La Autora
En la figura 13 se observa colonias de E. coli, teñidas de una coloración azul
verdosa por la liberación del cromóforo atrapado dentro de las células.
Figura 13. E. coli productora de β-lactamasas de espectro extendido
31
En base a estos resultados, durante los seis meses de muestreo se alcanzaron
89 muestras positivas a E. coli resistente a β-lactámicos de un total de 270;
equivalente al 32,97%.
Figura 14. Resultados del aislamiento de E. coli resistente a β-lactámicos
del contenido fecal en caninos de la Ciudad de Quito
Fuente: Investigación directa
Elaboración: La Autora
Resultados de acuerdo a la Zona Administrativa de la Ciudad de Quito
En el estudio se muestrearon las 5 Zonas Administrativas pertenecientes al
área urbana de la ciudad de Quito, donde se obtuvieron 54 muestras por zona.
Los resultados positivos se detallan en el cuadro 5.
32,97%
67,03%
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
Muestras Positivas Muestras Negativas
32
Cuadro 5. Resultados del Aislamiento de E. coli resistente a β-lactámicos de
acuerdo a las Zonas Administrativas
Resultados de acuerdo a la Zona Administrativa
ZONAS ADMINISTRATIVAS
Número de muestras obtenidas
Número de muestras positivas
Porcentaje de muestras positivas
ADM. QUITUMBE 54 11 20,37%
ADM. SUR ELOY ALFARO
54 22 40,74%
ADM. CENTRO MANUELA SAENZ
54 17 31,48%
ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO
54 15 27,78%
ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA
54 24 44,44%
Total de Muestras 270 89
Fuente: Investigación directa
Elaboración: La Autora
La Administración Equinoccial La Delicia presentó el mayor número de casos
positivos perteneciendo al 44,44% del total, seguida por la Administración Sur
Eloy Alfaro con un 40,74%, mientras que el menor número de casos positivos
se presentaron en las administraciones Manuela Sáenz, Eugenio Espejo y
Quitumbe con porcentajes del 31,48%, 27,78% y 20,37% respectivamente.
33
Figura 15. Porcentaje de casos positivos a E. coli resistente a β-lactámicos
de espectro extendido de acuerdo a la Zona Administrativa
Fuente: Investigación Directa
Elaborado por: La Autora
La significancia se determinó mediante la prueba de Chi-cuadrado, utilizando
el software "R" (versión 3.0.1) y el nivel de significación se fijó en p <0,05 para
la determinación de asociación o independencia entre la presencia de E. coli
resistente a β-lactámicos y las Administraciones a las cuales pertenecían los
caninos. Se comprobó que la zona fue un factor determinante para presencia
de E. coli resistente a β-lactámicos de tercera generación, donde la
Administración La Delicia presentó diferencia significativa (p=0,012).
Resultados de acuerdo a la edad de los caninos
Para la evaluación de esta variable se clasificó a los animales del estudio en
tres categorías de edad; cachorros desde 0 a 12 meses de nacidos, adultos
de 13 a 60 meses y geriátricos de 61 meses en adelante, los resultados se
muestran en el cuadro 6 y se representan en la figura 16.
20,37%
40,74%
31,48%27,78%
44,44%
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
ADM. QUITUMBE ADM. SUR ELOYALFARO
ADM. MANUELASAENZ
ADM. EUGENIOESPEJO
ADM. LA DELICIA
34
Cuadro 6. Presencia de E. coli resistente a β-lactámicos de acuerdo a la edad
de los caninos.
Resultados
Rango Nº de canes POS. %POS. NEG. %NEG. Total
0 a 12 meses 84 29 10,74 55 20,37 31,11
13 a 60 meses 103 33 12,22 70 25,92 38,14
Más de 61 meses 83 27 10 56 20,74 30,74
Total 270 89 32,96 181 67,07 100
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
Sobre una muestra de 270 caninos estudiados en los 5 Distritos de la zona
urbana de Quito D.M, se encontraron 29, 33, y 27 casos positivos
correspondientes a cachorros, adultos y geriátricos respectivamente, lo que
equivale al 10,74%, 12,22% y al 10% de presencia de cepas de E. coli
resistente a β-lactámicos de tercera generación.
Figura 16. E. coli productora de β-lactamasas de acuerdo a la edad de los
caninos
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
10,7412,22
10
20,37
25,92
20,74
0
5
10
15
20
25
30
De 0 a 12 meses De 13 a 60 meses > 60 meses
Muestras Positivas % Muestras Negativas %
35
De acuerdo al análisis de datos, la edad no fue un factor que determine la
resistencia a β-lactámicos (p=0,442); aunque en la figura 16 se observa que
los adultos presentan un mayor porcentaje de resistencia, sin embargo el
resultado no es estadísticamente importante.
Resultados de acuerdo al sexo de los caninos
Para evaluar esta variable se clasificó a los caninos en dos grupos; uno de
hembras y otro de machos, para establecer la presencia de E. coli en cada
sexo, cuyos resultados se demuestran en el cuadro 7.
Cuadro 7. Presencia de E. coli resistente a β-lactámicos de acuerdo al sexo
de los caninos.
Resultados
Género N. de Canes Positivos % Negativos % Total
Hembras 137 45 16,67 92 34,07 50,74
Machos 133 44 16,30 89 32,96 49,26
Total 270 89 32,96 181 67,03 100
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
De los 89 casos positivos detectados, 45 corresponden a las hembras y 44
pertenecen a los machos, equivalente a un 16,67% y 16,30% respectivamente.
Es decir los machos tuvieron un menor porcentaje de presencia de E. coli
resistente a β-lactámicos, con respecto a las hembras. Sin embargo esta
diferencia no es significativa (p= 0,0001).
36
Determinación fenotípica de E. coli resistente a β-lactámicos por la
Técnica de Doble Disco
Mediante la Técnica de Doble Disco se pudo observar el fenotipo característico
de cepas BLEE y AmpC con resultados del 87,64% y 12,35% respectivamente.
Figura 17. Cepas BLEE y AmpC de E. coli en caninos
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La autora
87,64%
12,35%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BLEE AmpC
37
DISCUSIÓN
El objetivo de nuestra investigación fue aislar e identificar cepas de E. coli
resistente a β-lactámicos, en caninos del área urbana de la Ciudad de Quito,
mediante cultivos bacteriológicos y la técnica de doble disco.
De las 270 muestras analizadas, el 32,97 % (n=89) fueron positivas, lo cual
difiere con los resultados encontrados en un estudio publicado por So y
colaboradores el 2012, en el cual se aisló E. coli resistente a β-lactámicos a
partir de hisopados rectales de perros internados en un hospital veterinario de
Corea, encontrando una presencia de 57,13% (So et al., 2012),
probablemente este resultado mayor al encontrado en nuestro estudio se
deba al aumento en la prescripción de β-lactámicos a los pacientes de las
clínicas veterinarias (Murphy, Reid-smith, Boerlin, Weese, & John, 2012).
En cuanto a la fenotificación de cepas de E. coli BLEE y AmpC, se aisló en
un 87,64% (n=78/89) y 12,36% (n=11/89) respectivamente; estos resultados
corroboran con datos alcanzados en una investigación realizada en Alemania
por Schaufler y colaboradores en el 2013, donde se reportó 71,43% para E.
coli BLEE y 28,57% para AmpC, en muestras obtenidas mediante hisopados
rectales de caninos (Schaufler et al., 2015), demostrando que la presencia de
E. coli BLEE en general es alta con respecto a las enzimas AmpC.
Esto probablemente se deba a que las enzimas BLEE son codificadas por
genes localizados en elementos móviles, tales como plásmidos y
transposones, para posteriormente ser transmitidos ampliamente entre
diferentes bacterias, mientras que las AmpC se codifican de manera específica
en el cromosoma bacteriano (L. Martínez & Calvo, 2010).
Sin embargo, una investigación en Corea del sur demostró que el 65,71 % de
cepas de E. coli aisladas de 35 muestras rectales de perros fueron AmpC y el
38
34,29% fueron BLEE (Tamang et al., 2012), lo que podría ser adjudicado a las
diferencias en la población de estudio, debido a que este estudio se realizó en
perros callejeros los cuales están más expuestos a contaminación fecal y por
ende a la diseminación de cepas resistentes. Belas y colaboradores en el
2014, demostraron que los caninos de refugios o callejeros tienen
aproximadamente tres veces más probabilidades de presentar E. coli BLEE
o AmpC, a diferencia de los caninos que tienen propietarios (Belas, Salazar,
Gama, Couto, & Pomba, 2014).
Se ha demostrado que las tasas más altas de presencia de E. coli resistentes
a betalactámicos en caninos provienen de Asia (57,13%), podría ser
adjudicado al creciente uso de cefalosporinas, de acuerdo a la publicación de
la Asociación de Productos de Salud Animal de la República de Corea, donde
se mencionó que el antibiótico más utilizado durante el 2005 en la práctica
veterinaria fue la cefalexina (Tamang et al., 2012). En tanto en Europa y Norte
América se ha reportado un 14% y 3,8 % de presencia de E. coli resistente a
β-lactámicos (So et al., 2012; Rzewuska et al., 2015; Damborg et al., 2015).
En América del Sur aún no han sido publicados datos al respecto.
Adicionalmente con el presente estudio se demostró que las cepas de E. coli
productoras de β-lactamasas están presentes en caninos sin infecciones
intestinales, lo que pone de manifiesto que los perros pueden ser portadores
asintomáticos de esta bacteria y por ende de cepas multiresistentes,
corroborando estudios donde se detectó cepas resistentes de E.coli en
muestras fecales de caninos y gatos sanos (Belas et al., 2014; Hordijk et al.,
2013)
El análisis de datos según la Administración Zonal a la cual pertenecen los
caninos demostró diferencia significativa entre los animales positivos de la
Administración La Delicia con respecto al resto de la ciudad, presentándose
más casos negativos en el centro y sur de Quito. Los resultados podrían estar
39
influenciados por las condiciones medioambientales, donde el clima
generalmente cálido templado favorece una mayor proliferación bacteriana
(Varela & Grotiuz, 2008). En este caso los excrementos de perro pueden llegan
a ser un vector para la difusión de E. coli resistente a β-lactámicos en las
zonas urbanas (Rzewuska et al., 2015).
Adicionalmente los resultados de la presente investigación muestran que la
Administración Quitumbe tiene un menor porcentaje de casos positivos que
podría deberse a las condiciones socioeconómicas de los propietarios, puesto
que los caninos no son mayormente expuestos a la consulta médica; sin
embargo la información detallada acerca de las propiedades de E. coli BLEE
en caninos y su distribución geográfica son todavía limitados.
Además los resultados fueron clasificados según los grupos etarios; tomando
en cuenta a los cachorros como menores de 12 meses, a los adultos de 13 a
60 meses y a los geriátricos mayores de 61 meses, de esta manera se analizó
si existe alguna relación entre los resultados. Los adultos presentaron un
mayor porcentaje de casos positivos (12,22%) con relación a los cachorros
(10,74%) y geriátricos (10%), la razón principal es que en la edad adulta es el
periodo más largo donde pueden estar expuestos a consulta médica y por
ende a los tratamientos médicos, sin embargo la diferencia entre edades no
fue estadísticamente significativa, lo que corrobora los resultados obtenidos
en una investigación publicada por Bang y colaboradores en el 2016, sobre la
resistencia antibiótica en caninos, donde los resultados sugieren que la
presencia de bacterias resistentes es independiente a la edad (Bang et al.,
2016).
Por otra parte los datos sobre la presencia de E. coli productora de β-
lactamasas de acuerdo con el sexo de los caninos fueron (16,65%) hembras
y (16,28%) machos, sin encontrarse diferencias significativas, adicionalmente
la literatura no menciona una predisposición por sexo, edad o raza.
40
Los resultados fenotípicos de E. coli productora de β-lactamasas expuestos en
el presente estudio son los primeros informes en Ecuador a nivel de animales
de compañía. No obstante, estudios más detallados de estas cepas podrían
demostrar la epidemiología de la transferencia de genes, como lo detalla un
estudio publicado en Brasil por Carvalho y colaboradores en el 2016, donde
demostró la relación genética de E.coli de caninos con sus dueños, la
presencia de genes BLEE fue similar (8/18). Por lo tanto existen altas
probabilidades de compartir cepas multirresistentes entre los seres humanos
y los animales domésticos que comparten un mismo entorno (Carvalho et al.,
2016).
Finalmente los datos obtenidos permiten suponer que el excesivo uso de
tratamientos con antibióticos β-lactámicos es un factor de riesgo para la
diseminación de cepas bacterianas multiresistentes, constituyendo un
potencial problema de salud pública, como lo expone la OMS en su primer
informe mundial sobre la resistencia a los antibióticos. En el mencionado
documento se pone en manifiesto la grave amenaza de los microorganismos
resistentes para la población (OMS, 2014).
41
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES
- Se aisló e identificó un 32,97% (89/270) de cepas de E. coli resistente
a β-lactámicos de espectro extendido en muestras fecales de caninos
del área urbana de la ciudad de Quito.
- Las cepas BLEE de E. coli tuvieron un mayor porcentaje (87,64%), en
relación con la cantidad de cepas AmpC (12,35%), identificadas por la
Técnica de Doble Disco.
- Se demostró la asociación entre la resistencia antibiótica de E. coli con
la Administración Zonal La Delicia, mientras que no se comprobó
asociación de E. coli productora de β-lactamasas con la edad y sexo de
los caninos.
42
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Koneman Diagnóstico microbiológico Texto y Atlas en color (6ta. ed., pp.
129 – 160). México, D.F.: Editorial Médica Panamericana.
Wu, G., Day, M. J., Mafura, M. T., Nunez-garcia, J., Fenner, J. J., Essen-
zandbergen, A. Van, … Mevius, D. (2013). Comparative Analysis of ESBL-
51
Positive Escherichia coli Isolates from Animals and Humans from the UK
, The Netherlands and Germany, 8(9), 1–10.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0075392
52
ANEXOS
Anexo 1. Mapa de la Distribución de Circuitos por Distritos de Quito D. M.
Fuente: Ministerio de Salud Pública, Coordinación Zonal 9.
53
Anexo 2. Parroquias Urbanas de la Ciudad de Quito
Fuente: EPMMOP, 2011
54
Anexo 3. Esquema de Aislamiento de E. coli resistente a β-lactámicos y
Método de Doble Disco
Hisopado rectal
Siembra en TBXC
Negativa
Tomar dos asadas desde TSI y colocar en un tubo epperdorff con 500 µl de TSB
Sembrar dos colonias en TSI
Observar las colonias azules
Incubar a 37°C por 24 horas
Positivo A/A+ Gas
Autoclavar
Incubar a 37°C por 24 horas
Adicionar 1000ul de glicerol y guardar los tubos
a -80 °C
Metodología para el aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos de espectro extendido y técnica de doble disco Fuente: UNIETAR
Repique de las cepas aisladas en TBX,
incubación de 24h a 37º C
Realizar la siembra de una colonia en Mueller
Hinton, incubación de 24h a 37ºC
Inocular en cloruro de sodio 4 a 5 colonias
aisladas hasta obtener 0,5 escala de McFarland
Distribución de la dilución obtenida en agar
Muller Hilton
Distribución estratégica de los sensidiscos,
Incubar a 37°C por 24 horas
Interpretación de cepas AmpC y BLEE
55
Anexo 4. Preparación de Agar TBX+C
En 1 litro de agua destilada disolver 33,6 gramos del medio.
Mezclar hasta obtener una suspensión homogénea.
Calentar lentamente agitando con frecuencia, y llevar a ebullición.
Esterilizar en el autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Diluir 3mg de Cefotaxima en 1500 µl de agua destilada estéril,
cuando la temperatura del medio sea de aproximadamente 50ºC.
Dispensar el agar en las cajas Petri desechables.
Anexo 5. Preparación de Triple Sugar Iron Agar® (TSI Agar)
Disolver 62,5 g del polvo en 1 litro de agua destilada.
Mezclar y calentar con agitación frecuente, y llevar a ebullición.
Colocar 5 ml de medio en los tubos de ensayo.
Esterilizar a 121°C por 15 minutos en el autoclave.
Enfriar en pico de flauta profundo.
Anexo 6. Preparación de Trypton Soya Broth® (Caldo TSB)
Disolver 30 g de polvo deshidratado en 1 litro de agua destilada.
Mezclar y calentar agitando y llevar a ebullición.
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.
Anexo 7. Preparación Mueller - Hinton® (Agar MH)
Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de agua
destilada.
Mezclar y calentar con agitación frecuente y hervir durante 1
minuto.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 45°-50°C y distribuir 4 ml en las cajas de Petri, sobre una
superficie horizontal aproximadamente 25-30ml.
56
Anexo 8. Preparación de la Escala de Mc Farland
Disolver 8.5 g de Cloruro de Sodio en 1 litro de agua destilada.
Mezclar hasta obtener una suspensión homogénea.
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.
Colocar 5 ml de la suspensión en tubos de ensayo
57
Anexo 9. Resultados del Aislamiento de E.coli en caninos de la Zona Urbana de la Ciudad de Quito.
FECHA PACIENTE EDAD SEXO MOTIVO DE CONSULTA PROPIETARIO ADM. ZONAL RESULTADO
13/4/2016 REINA 72 meses H CONSULTA GENERAL HOSPITALIZACIÓN ADM. SUR ELOY ALFARO AmpC
13/4/2016 CARAMELO 12 meses M ALERGIA ALIMENTARIA HOSPITALIZACIÓN ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
18/4/2016 POLACA 96 meses H DISTEMPER CANINO JORGE ZUÑIGA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
18/4/2016 ADA 6 meses H ECTROPION CARLOS BRREZUETA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
18/4/2016 FLOYD 3 meses H CHEQUEO GENERAL FRANCISCO GALARRAGA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
18/4/2016 CHIRIPA 60 meses M CONSULTA GENERAL FABIOLA DE BORJA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
18/4/2016 LEYDI 24 meses H CONSULTA GENERAL RAMIRO LARA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
20/4/2016 ELLA 11 meses H CONSULTA GENERAL DAVID CADENA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
20/4/2016 FIOCO 120 meses M CONSULTA GENERAL TANIA MONLERA ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
20/4/2016 TOBY 36 meses M CONSULTA GENERAL IVONNE GUAMANI ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
27/4/2016 TOBY 24 meses M CONSULTA GENERAL MARIA SONETA ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
27/4/2016 DULCE 36 meses H CONSULTA GENERAL MARIA BASTIDAS ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
27/4/2016 FRIDA 2 meses H CONSULTA GENERAL DIEGO ROSAS ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
27/4/2016 SUCA 72 meses H CONSULTA GENERAL TATANIANA ALMEIDA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
2/5/2016 FRIJOLITA 132 meses H CONSULTA GENERAL VICRORIA VALENCIA ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
4/5/2016 AARON 120 meses M CONSULTA GENERAL ROSARIO JURADO ADM. CENTRO MANUELA SAENZ AmpC
4/5/2016 CUQUI 48 meses H TRAUMATOLOGIA KATHERINE VELASCO ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
9/5/2016 FIFI 12 meses H TRAUMATOLOGIA SANDRA ROMERO ADM. SUR ELOY ALFARO AmpC
9/5/2016 PRINCESA 60 meses H CONTROL PREÑEZ ALEX SARANGO ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO AmpC
9/5/2016 RUFO 12 meses M ALERGIA SILVIO FLORES ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
11/5/2016 NINA 72 meses H PROBLEMA DERMATOLÓGICO LORENA RIVERA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
15/5/2016 CHOPI 144 meses M MASA EN MAI SANDRA NOBOA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
58
15/5/2016 CIELO 12 meses H ATROPELLADO JUANA MONTEGUANO ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
23/5/2016 BAMBINO 12 meses M ALERGIA ALIMENTARIA MONICA VEGA ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
30/5/2016 DEXTER 12 meses M CASTRACION KARINA SOLIS ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
30/5/2016 TITO 48 meses M ALERGIA DANIEL ORDOÑEZ ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
1/6/2016 BRUNO 36 meses M TRAUMATOLOGIA ANA TIRADA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
1/6/2016 LILA 60 meses H MASA MAD EDISON PUEBLA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
6/6/2016 BLAKE 36 meses M CONSULTA GENERAL MICHELLE GOMEZ ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
9/6/2016 CHESTER 60 meses M MASA EN MAI JORGE ACOSTA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA AmpC
9/6/2016 JOY 72 meses H CALCULO URINARIO CESAR TENOCO ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
9/6/2016 LUCAS 36 meses M TVT VIVIANA SALAZAR ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
9/6/2016 MAYA 11 meses H PROBLEMA OFTALMOLÓGICO PAULINA DÁVALOS ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
9/6/2016 ODDIE 96 meses M TRAUMATOLOGIA DILAN PARCO ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
13/6/2016 PELUCHE 12 meses M EFUSIÓN PLEURAL MIRIAM PACA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ AmpC
13/6/2016 MUÑECA 96 meses H PENFIGO FERNANDA ROMA ADM. QUITUMBE BLEE
13/6/2016 DOKI 24 meses M ULCERA CORNEAL GUADALUPE JÁCOME ADM. SUR ELOY ALFARO AmpC
15/6/2016 GEORGINA 12 meses H CONSULTA GENERAL M J JARAMILLO ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
15/6/2016 DUKY 36 meses M PROBLEMA TRAUMATOLOGICO FLOR PALACIOS ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
20/6/2016 QUIMBA 72 meses M OSTEOSARCOMA CHRISTINA PUCACHAQUI ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
22/6/2016 CAMILO 72 meses M DERMATITIS POR PULGAS GLORIA PAREDES ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
27/6/2016 MARTIN 96 meses M TRAUMATOLOGIA GUADALUPE JARAMILLO ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
27/6/2016 MAGA 3 meses H CONSULTA GENERAL ISMET RODRIGUEZ ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
29/6/2016 LADY 7 meses H FRACTURA MPI EDGAR TOBAR ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA AmpC
4/7/2016 CHOCOLATIN 108 meses M TRAUMATOLOGIA ANGELO GARCIA ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
4/7/2016 REX 4 meses M VAUNACION BRYAN ARSENEGA ADM. NORTE EUGENIO ESPEJO BLEE
4/7/2016 REICA 9 meses H DISTEMPER ISMET RODRIGUEZ ADM. QUITUMBE AmpC
59
4/7/2016 MALVA 48 meses H CONSULTA GENERAL ISMET RODRIGUEZ ADM. QUITUMBE BLEE
4/7/2016 CHATO 3 meses M SHOCK SÉPTICO CHINTYA ALVAREZ ADM. QUITUMBE AmpC
6/7/2016 DAKOTA 48 meses H TRAUMATOLOGIA GREOMARY MALAVER ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
13/7/2016 WHITY 120 meses H ESTERILIZACIÓN ERICKA SÁNCHEZ ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
20/7/2016 GASPER 36 meses M COMEDONES EMILSEN CASTILLO ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
20/7/2016 VITO 36 meses M PLACAS RX SABRINA CRUZ ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
25/7/2016 PONGO 84 meses M MASA EN BELFO KATHERINE MONTESDEOCA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
25/7/2016 TOBI 84 meses M MASA EN ZONA LUMBAR GABRIEL YUQUILEMA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
25/7/2016 BRUNO 4 meses M ANOREXIA EDISON BENAVIDES ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
25/7/2016 LULU 48 meses H TRAUMATOLOGIA VICTOR HERNANDEZ ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
26/7/2016 CANTINEL 96 meses M TRAUMATOLOGIA ANDRES LOPEZ ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
26/7/2016 SIN NOMBRE 72 meses H PLACAS RX MARIA JOSE DE LA CRUZ ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
1/8/2016 NANI 120 meses H FRACTURA DE CADERA DIEGO CAIZA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
1/8/2016 CHIGO 12 meses H FRACTURA MAD ROCIO PEREZ ADM. QUITUMBE BLEE
3/8/2016 ZUCO 12 meses M TRAUMATOLOGIA HOSPITALIZACIÓN ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
15/8/2016 TEO 3 meses M VACUNA EDISSON MURILLO ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
15/8/2016 SAMANTHA 24 meses H HIPOREXIA ALEJANDRO FLORES ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
12/9/2016 MAX 96 meses M CONSULTA GENERAL JAIME CRUZ ADM. QUITUMBE BLEE
14/9/2016 KIMI 12 meses H FRACTURA CARPO FRANKLIN QUISHPE ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
14/9/2016 MAX 168 meses M OSTEOSARCOMA MIRIAM ESCOBAR ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
20/9/2016 TOMAS 60 meses M HERIDA POR MORDEDURA ROSA LEMA ADM. QUITUMBE BLEE
20/9/2016 LOLA 5 meses H FRACTURA NICOLE REYES ADM. CENTRO MANUELA SAENZ BLEE
26/9/2016 CLEOPATRA 24 meses H CONSULTA GENERAL JAVIER SÁNCHEZ ADM. QUITUMBE BLEE
26/9/2016 BONGO 120 meses M CONSULTA GENERAL PIEDAD GUERRA ADM. QUITUMBE BLEE
28/9/2016 NENA 4 meses H HOSPITALIZACION CLÍNICA DR. XAVIER VILLACÍS ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
60
28/9/2016 LIA 4 meses H HOSPITALIZACION CLÍNICA DR. XAVIER VILLACÍS ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
28/9/2016 SOL 96 meses H HOSPITALIZACION CLÍNICA DR. XAVIER VILLACÍS ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
28/9/2016
36 meses H NEUROLOGIA SANDRA TASINGERO ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
5/10/2016 JACKO 24 meses H CONSULTA GENERAL DAVID SALAZAR ADM. QUITUMBE BLEE
5/10/2016 NENA 42 meses H CONSULTA GENERAL JUAN CARLOS ARMAS ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
5/10/2016 SOL 60 meses H CONSULTA GENERAL JUAN CARLOS ARMAS ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
5/10/2016 TOBIAS 48 meses M CONSULTA GENERAL JUAN CARLOS ARMAS ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
5/10/2016 LUNA 156 meses H CONSULTA GENERAL JUAN CARLOS ARMAS ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
5/10/2016 FRESITA 12 meses H CONSULTA GENERAL INGRID PARRA ADM. SUR ELOY ALFARO BLEE
10/10/2016 BLAKE 36 meses M TRICOFITOSIS DIEGO GOMEZ ADM. CENTRO MANUELA SAENZ AmpC
17/10/2016 NICO 2 meses M ANEMIA ALEXANDER CARAQUILLA ADM. QUITUMBE BLEE
24/10/2016 PANCHO 72 meses M CONSULTA GENERAL PEDRO SAAVEDRA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
24/10/2016 MICKEY 48 meses M CONTROL PREÑEZ PEDRO SAAVEDRA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
24/10/2016 NEGRA 72 meses H DESPARASITACIÓN TERESA CHANTA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
24/10/2016 MANGO 24 meses M CONSULTA GENERAL BYRON ANGUIETA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
24/10/2016 CANDY 48 meses H CONSULTA GENERAL BYRON ANGUIETA ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
24/10/2016 MAX 72 meses M DESPARASITACIÓN CHANNEL IMBAQUINGO ADM. EQUINOCCIAL LA DELICIA BLEE
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