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Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris
DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE
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ADNpatient *Cy3
ADNtémoin*Cy5
Cohybridation
Lavage
Lecture parscanner
Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5
par un logicieladapté
Marquagedes ADN
Principe de la CGH Principe de la CGH arrayarray
Puce 2500clones (BAC)
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Wolf-Hirschhorn Cri du Chat
Williams-Beuren
Langer-Giedion
Prader-Willi / Angelman
Miller-Dieker
Smith-Magenis
DiGeorge
13
21
18
YX
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Quelle technologie utilise Prenatal BoBs?
BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence.5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.
Prenatal BoBs
ACs n ead
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Random Primer SolutionBiotin-dNTP MixPolymeraseSample Diluent
Marquage de l’ADN à la Biotine
Biotine
J1
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Purification de l’ADN
Kit de purification Purelink INVITROGEN Biotine
Colonne avec filtre
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Hybridation de l’ADN sur les billes
Biotine
Sonde fixée sur les micro billes
Hybridation à 52°C à 1200 rpm16 à 20H
Dénaturation 5 mn à 85°C
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Wash Buffer 1
Lavages
Elimination de l’ADN non hybridé
ADN marqué non-hybridé
Filtre 0,45 µm en µplaque
J2
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Reporter ConcentrateReporter Diluent
Révélation du signal
Biotine
Streptavidine
Phycoérythrine
37°C 1200 rpm
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Wash Buffer 2
Lavages
Filtre 0,45 µm en µplaque
Streptavidine non couplée
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Lectures des billes
Lecture d’une plaque complète = 2h
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Lectures des billes
Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN
Le laser rouge identifie le signal de la bille
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Profil féminin normal
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Profil masculin anormal
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Notre expérienceà Robert Debré
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BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.
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Nos résultatsDe avril 2011 à juillet 2012
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Intérêts
– Rendu de résultats rapide– Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL
de LA ou 1 petite villosité– Comparaison avec des références mâles et
femelles– Jusqu’à 44 patients par plaque– Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8
sondes par région étudiée– Screening plus large (dont contrôles sur
quelques autosomes)
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Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus
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Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un
RCIU à 34SA
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Inconvénients
– Non détection des translocations équilibrées ?– Difficulté d’interprétation des triploïdies– Technique très manuelle– Technique coûteuse ?– Certaines microdel étudiées inutiles ?
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Exemple d’une triploïdie chez un fœtus