8/2/2019 Trasposicin

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 7 6 , N o . 4 , p p . 1 9 3 3 - 1 9 3 7 , A p r i l 1 9 7 9G e n e t i c s

M o l e c u l a r m o d e l f o r t h e t r a n s p o s i t i o n a n d r e p l i c a t i o n o fb a c t e r i o p h a g e Mu a n d o t h e r t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s(DNA i n s e r t i o n e l e m e n t s / n o n h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n / s i t e - s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o n / r e p l i c o n f u s i o n / t o p o i s o m e r a s e s )

J A M E S A . S H A P I R OD e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , T h e U n i v e r s i t y o f C h i c a g o , C h i c a g o , I l l i n o i s 6 0 6 3 7C o m m u n i c a t e d b y H e w s o n S w i f t , D e c e m b e r 1 1 , 1 9 7 8ABSTRACT A s e r i e s o f m o l e c u l a r e v e n t s w i l l e x p l a i n h o wg e n e t i c e l e m e n t s c a n t r a n s p o s e f r o m o n e D N A s i t e t o a n o t h e r ,g e n e r a t e a s h o r t o l i g o n u c l e o t i d e d u p l i c a t i o n a t b o t h e n d s o f t h en e w i n s e r t i o n s i t e , a n d r e p l i c a t e i n t h e t r a n s p o s i t i o n p r o c e s s .T h e s e e v e n t s i n c l u d e t h e f o r m a t i o n o f r e c o m b i n a n t m o l e c u l e sw h i c h h a v e b e e n p o s t u l a t e d t o b e i n t e r m e d i a t e s i n t h e t r a n s -p o s i t i o n p r o c e s s . T h e m o d e l e x p l a i n s h o w t h e r e p l i c a t i o n o fb a c t e r i o p h a g e Mu i s o b l i g a t o r i l y a s s o c i a t e d w i t h m o v e m e n t t on e w g e n e t i c s i t e s . I t p o s t u l a t e s t h a t a l l t r a n s p o s a b l e e l e m e n t sr e p l i c a t e i n t h e t r a n s p o s i t i o n p r o c e s s s o t h a t t h e y r e m a i n a t t h e i ro r i g i n a l s i t e w h i l e m o v i n g t o n e w s i t e s . A c c o r d i n g t o t h i s m o d e l ,t h e m e c h a n i s m o f t r a n s p o s i t i o n i s v e r y d i f f e r e n t f r o m t h e i n -s e r t i o n a n d e x c i s i o n o f b a c t e r i o p h a g e X .R e c e n t r e s e a r c h o n t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s i n b a c t e r i a h a s p r o -v i d e d i m p o r t a n t i n s i g h t s i n t o t h e r o l e o f n o n h o m o l o g o u s r e -c o m b i n a t i o n i n g e n e t i c r e a r r a n g e m e n t s ( 1 - 4 ) . T h e s e e l e m e n t si n c l u d e s m a l l i n s e r t i o n s e q u e n c e s ( I S e l e m e n t s ) , t r a n s p o s a b l er e s i s t a n c e d e t e r m i n a n t s ( T n e l e m e n t s ) , a n d b a c t e r i o p h a g e Mu( 3 ) . T h e r e a r e d e t a i l e d d i f f e r e n c e s i n t h e g e n e t i c b e h a v i o r o ft h e s e v a r i o u s e l e m e n t s ( s u c h a s d i f f e r e n c e s i n s p e c i f i c i t y o f s i t es e l e c t i o n f o r i n s e r t i o n ) , b u t t h e r e i s a c o n s e n s u s t h a t t h e y a l ls h a r e u n d e r l y i n g r e c o m b i n a t i o n m e c h a n i s m s ( 3 , 5 ) . A l t h o u g ht h i s c o n s e n s u s o r i g i n a l l y i n c l u d e d t h e b a c t e r i o p h a g e X ( c f . r e f s .3 a n d 4 ) , t h e c o n s i d e r a t i o n s e l a b o r a t e d b e l o w a r g u e t h a t p h a g eMu a n d o t h e r t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s d i f f e r r a d i c a l l y f r o m t h ee l e g a n t a n d s i m p l e X m o d e l ( 6 , 7 ) .

T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s m o v e f r o mo n e g e n e t i c s i t e t o a n o t h e r a r e s t i l l u n k n o w n . H o w e v e r , t h e r eh a s b e e n a r a p i d a c c u m u l a t i o n o f i n f o r m a t i o n a b o u t t h es t r u c t u r a l c o n s e q u e n c e s o f t r a n s p o s i t i o n e v e n t s , t h e g e n e t i cc o n t r o l o f t r a n s p o s i t i o n , a n d t h e r e p l i c a t i o n o f b a c t e r i o p h a g eMu f r o m w o r k i n m a n y l a b o r a t o r i e s . W h i l e s o m e o f t h i s i n f o r -m a t i o n i s n o t y e t b a s e d o n c o m p l e t e l y u n a m b i g u o u s d a t a , t h eo u t l i n e s a p p e a r s u f f i c i e n t l y c l e a r t o p r o p o s e a p a r t i a l l y d e t a i l e dm o l e c u l a r m o d e l t o e x p l a i n t h e t r a n s p o s i t i o n p r o c e s s . T h i sm o d e l a l s o e x p l a i n s h o w p h a g e Mu r e p l i c a t e s . I t s j u s t i f i c a t i o nd r a w s e x a m p l e s f r o m w o r k o n v a r i o u s e l e m e n t s ( p a r t i c u l a r l yM u , I S 1 , T n 3 , a n d T n 5 ) o n t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e y a r e a l lm e c h a n i s t i c a l l y e q u i v a l e n t a s f a r a s t h e d e t a i l s o f t h e p r e s e n tm o d e l g o . T h i s p r o p o s a l d o e s n o t a d d r e s s t h e q u e s t i o n o f s i t es e l e c t i o n f o r t r a n s p o s i t i o n e v e n t s a n d s p e c i f i c a l l y d e a l s o n l y w i t he v e n t s t h a t o c c u r a f t e r a n i n i t i a l d o n o r - t a r g e t c o m p l e x h a s b e e nf o r m e d .

OBSERVATIONS T O B E EXPLAINEDA m o d e l f o r t h e m e c h a n i s m o f t r a n s p o s i t i o n a n d r e p l i c a t i o n o fp h a g e Mu a n d t h e i n s e r t i o n o f o t h e r t r a n s p o s a b l e e l e m e n t ss h o u l d b e a b l e t o e x p l a i n t h e f o l l o w i n g o b s e r v a t i o n s .( i ) I n s e r t i o n o f a t r a n s p o s a b l e e l e m e n t i n t o a g e n e t i c s i t e

BI %

A a % / ; Cz x

y

B yI

xzV

F I G . 1 . R e p l i c o n f u s i o n . T h e b o x e s w i t h a n a r r o w i n d i c a t e c o p i e so f a t r a n s p o s a b l e e l e m e n t . T h e l e t t e r s m a r k a r b i t r a r y r e g i o n s o f t h et w o r e p l i c o n s t o i n d i c a t e t h e r e l a t i v e p o s i t i o n s o f t h e e l e m e n t s i n t h ed o n o r a n d c o i n t e g r a t e m o l e c u l e s .r e s u l t s i n t h e d u p l i c a t i o n o f a s h o r t o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c ei n t h e t a r g e t . T h e d u p l i c a t e d s e q u e n c e b r a c k e t s t h e i n s e r t e de l e m e n t ( 8 , 9 ) . T h i s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e i n s e r t i o n p r o c e s s h a sb e e n d e t e c t e d i n s e q u e n c e d a t a o n i n s e r t i o n s o f I S 1 , T n 5 , T n 9 ,a n d T n l O [ a l l h a v i n g n i n e b a s e p a i r ( b p ) d u p l i c a t i o n s ] a n d a l s oi n s e r t i o n s o f I S 2 , T n 3 , g a m m a - d e l t a , a n d p h a g e Mu ( 5 b p d u -p l i c a t i o n s ) ( s u m m a r i z e d i n r e f . 1 0 ) . G r i n d l e y a n d S h e r r a t t h a v ep r o p o s e d a m o d e l t o a c c o u n t f o r t h i s p h e n o m e n o n ( 1 0 ) , a n ds o m e f e a t u r e s o f t h e i r p r o p o s a l a r e i n c o r p o r a t e d i n t h e p r e s e n tm o d e l . S t u d i e s o n t h e s p e c i f i c i t y o f i n s e r t i o n a n d c o m p a r i s o no f s i b l i n g T n 9 i n s e r t i o n s i n d i c a t e t h a t t h e r e i s n o f u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s e q u e n c e s f l a n k i n g t h e d o n o r i n s e r t i o na n d t h e r e p e a t g e n e r a t e d a t t h e t a r g e t s i t e ( 1 1 ) . A u s e f u l w a yt o c o n s i d e r t h e s e o b s e r v a t i o n s i s t o t h i n k o f i n s e r t i o n o n b o t hs i d e s o f t h e 5 - o r 9 - b p s e q u e n c e t h a t i s t o b e d u p l i c a t e d .( i i ) T r a n s p o s a b l e e l e m e n t s c a n s e r v e t o f u s e t w o r e p l i c o n s ,a n d r e p l i c o n f u s i o n o c c u r s w h e n o n l y o n e o f t h e p a r e n t a l m o l -e c u l e s o r i g i n a l l y c o n t a i n e d a t r a n s p o s a b l e e l e m e n t ( 1 2 - 1 4 ) . I na l l c a s e s i n w h i c h t h e r e i s d a t a o n t h e s t r u c t u r e o f t h e c o i n t e g r a t ep r o d u c t , i t c o n t a i n s a d i r e c t l y r e p e a t e d c o p y o f t h e t r a n s p o s a b l ee l e m e n t a t e a c h j u n c t u r e o f t h e t w o r e p l i c o n s ( F i g . 1 ; r e f s . 1 2 ,1 5 , a n d 1 6 ) . I n t h e c a s e o f p h a g e M u , r e p l i c o n f u s i o n r e q u i r e se x p r e s s i o n o f t h e A g e n e b u t n o t o f t h e B g e n e ( 1 2 ) . I n t h e c a s eo f T n 3 , r e p l i c o n f u s i o n i s o b s e r v e d o n l y w h e n a s p e c i f i c i n t e r n a lr e g i o n o f t h e t r a n s p o s o n h a s b e e n d e l e t e d ( 1 3 , 1 5 ) . A b s e n c e o ft h i s r e g i o n c a u s e s a c i s - d o m i n a n t c h a n g e i n r e c o m b i n a t i o nb e h a v i o r s o t h a t d e l e t e d t r a n s p o s o n s c a t a l y z e r e p l i c o n f u s i o ni n t h e p r e s e n c e o f a n o r m a l T n 3 ( 1 5 ) . T h e r e i s p r e l i m i n a r y g e -n e t i c e v i d e n c e t h a t d e r i v a t i v e s o f T n 5 c a n c a t a l y z e r e p l i c o nf u s i o n . T h e s e d e r i v a t i v e s a r e g e n e r a t e d b y s u b s t i t u t i o n o f t h ei n t e r n a l T n 5 H i n d I I I f r a g m e n t b y a t r p f r a g m e n t , a n d i n t h i sc a s e t h e f u s i o n p h e n o t y p e i s r e c e s s i v e t o a w i l d - t y p e T n 5 e l e -m e n t ( 1 7 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e c o i n t e g r a t e f u s e dr e p l i c o n s r e p r e s e n t i n t e r m e d i a t e s i n t h e t r a n s p o s i t i o n p r o c e s s( 1 5 - 1 7 ) .A b b r e v i a t i o n s : I S , i n s e r t i o n sequence; b p , b a s e p a i r .

1 9 3 3

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g ec h a r g e p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d -v e r t i s e m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t et h i s f a c t .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 )c o l i A c o l i

C , , ^ -ISI S

F I G . 2 . S p e c i f i c " c u t - o u t " r e a c t i o n s . The b o x e s i n d i c a t e p a r a l l e lI S 1 e l e m e n t s . ( L e f t ) T h e r e a c t i o n o b s e r v e d i n t h e f o r ma t i o n o f X : : I S 1p h a ge s f r o m A : : T n 9 p h a g e s d u r i n g v e g e t a t i v e g r o w t h ( 1 8 ) . ( R i g h t ) T her e a c t i o n o b s e r v e d i n t h e e x c i s i o n o f an I S 1 - b o u n d e d p r o p h a g e f r o mt h e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e t o y i e l d A : : I S 1 p h a g e progeny ( 1 6 ) . Thed a s h e d l i n e i n d i c a t e s X s e que n c e s.

( i i i ) DNA b r a c k e t e d b y d i r e c t r e p e a t s o f t h e I S 1 e l e m e n t i ss p e c i f i c a l l y e x c i s e d u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s . G r o w t h o f Xp h a g e s c o n t a i n i n g t h e c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s t a n c e transposonTn9 r e s u l t s i n a h i g h r a t e o f rec- a n d r e d - i n d e p e n d e n t p r e c i s ee x c i s i o n o f m a t e r i a l b e t w ee n h o m o l o g o u s s i t e s i n t h e t wo I S 1e l e m e n t s ( F i g . 2 l e f t ; r e f 1 8 ) . T h i s " c a m c u t - o u t " r e a c t i o n i s n o to b s e r v e d w i t h Tn9 e l e m e n t s i n t h e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e o r i nr e p r e s s e d p r o p h a g e s ( 1 4 ) . An a n a l o g o u s I S I - s p e c i f i c e x c i s i v er e c o m b i n a t i o n e v e n t occurs a f t e r d e r e p r e s s i o n o f a X p r o p h a g eb r a c k e t e d b y d i r e c t r e p e a t s o f I S I ( F i g . 2 r i g h t ; r e f . 1 6 ) . T h e s er e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e I S I e l e m e n t s may serve a s s i t e s f o r as p e c i f i c r e c i p r o c a l r e c o m b i n a t i o n e v e n t . T h e o b s e r v a t i o n t h a tt h e e x c i s i o n o f I S I - b o u n d e d p r o p h a g e s f r o m t h e c h r o m o s o m eo c c u r s e f f i c i e n t l y i n rec r e d - c o n d i t i o n s h a s l e d me t o b e l i e v et h a t a s p e c i f i c " c u t - o u t " e v e n t p l a y s a r o l e i n t h e t r a n s p o s i t i o np r o c e s s ( 1 6 ) .( i v ) R e p l i c a t i o n o f p h a g e Mu DNA s h o w s s e v e r a l s t r i k i n gc h a r a c t e r i s t i c s , two o f w h i c h a r e e s p e c i a l l y s i g n i f i c a n t . F i r s t ,r e p l i c a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h t r a n s p o s i t i o n o f p r o p h a g e DNAf r o m s i t e t o s i t e ( 1 9 ) a n d r e q u i r e s t h e a c t i v i t y o f t h e Mu A genep r o d u c t , t h e p h a g e i n s e r t i o n f u n c t i o n ( 2 0 ) . S e c o n d , d e r e p r e s s i o no f a Mu p r o p h a g e l e a d s q u i c k l y t o t h e r e p l i c a t i o n o f Mu DNAb u t n o t t o d e t e c t a b l e r e p l i c a t i o n o f DNA i m m e d i a t e l y a d j a c e n tt o t h e p r o p h a g e ( 2 1 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t i n s e r t i o n o f Mui n new s i t e s may b e e s s e n t i a l t o i n i t i a t e p h a g e r e p l i c a t i o n a n dt h a t r e p l i c a t i o n b e g i n s o r e n d s ( o r b o t h ) p r e c i s e l y a t t h e p r o -p h a g e t e r m i n i .( v ) T r a n s p o s a b l e e l e m e n t s appear t o b e a b l e t o move f r o mone s i t e t o a n o t h e r w i t h o u t l e a v i n g t h e o r i g i n a l s i t e . T h i s p o i n ti s n o t y e t f i r m l y e s t a b l i s h e d i n b a c t e r i a , b u t t wo l i n e s o f e v i -d e n c e s u g g e s t t h a t i t w i l l prove t o b e c o r r e c t . F i r s t , t h e e x p e r i -ments o f L j u n g q u i s t a n d B u k h a r i i n d i c a t e t h a t a Mu p r o p h a g ecan r e p l i c a t e a n d t r a n s p o s e w i t h o u t l e a v i n g t h e o r i g i n a l s i t e ( 2 2 ) .S e c o n d , t r a n s d u c t i o n e x p e r i m e n t s w i t h Tn5 i n d i c a t e t h a t a c e l lcan h a r b o r T n 5 b o t h a t an o r i g i n a l s i t e i n t h e l a c Z gene a n d a l s oa t a s e c o n d s i t e i n t h e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e ( 2 3 ) . P r e l i m i n a r yr e v e r s i o n a n d t r a n s d u c t i o n d a t a on t h e Tn7 e l e m e n t i n s e r t e di n t o P s e u d o m o n a s p l a s m i d a lk genes a l s o s u g g e s t s t h a t c e l l s c a nh a r b o r Tn 7 a t i t s o r i g i n a l s i t e a s w e l l a s on t h e c h r o m o s o m e ( M .F e n n e w a l d a n d J . S h a p i r o , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . I n o t h e r w o r d s ,t h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t t h e d o n o r e l e m e n t i s r e t a i n e dor r e g e n e r a t e d i n t h e t r a n s p o s i t i o n e v e n t . A s i m i l a r c o n c l u s i o nh a s b e e n r e a c h e d b y B e n n e t t e t a l . on t h e b a s i s o f q u a n t i t a t i v emeasurements o f t r a n s p o s i t i o n a n d e x c i s i o n e v e n t s w i t h t h e T n le l e m e n t ( 2 4 ) . I t i s w o r t h n o t i n g t h a t t h e appearance o f a n e l e -m e n t a t a new s i t e w i t h o u t l o s s f r o m t h e o r i g i n a l s i t e i s p r e c i s e l yt h e b e h a v i o r o f t h e y e a s t m a t i n g - t y p e " c a s s e t t e s " ( 2 5 ) .( v a ) T r a n s p o s i t i o n w i l l occur i n r ec s t r a i n s b e t w e e n i n t a c tr e p l i c o n s ( 1 , 3 , 5 ) , w i t h i n a s i n g l e r e p l i c o n ( 4 , 5 , 2 2 , 2 6 ) , a n df r o m an i n c o m p l e t e r e p l i c o n ( i . e . , l i n e a r DNA m o l e c u l e ) t o t h eb a c t e r i a l c h r o m o s o m e ( 1 9 , 2 7 ) . Hence, h o m o l o g o u s r e c o m b i -n a t i o n f u n c t i o n s , s u p e r c o i l i n g o f d o n o r DNA ( c f . r e f . 7 ) , a n dr e p l i c a t i o n f r o m an o r i g i n o u t s i d e t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t a r eno t necessary f o r t r a n s p o s i t i o n t o oc cur.

T HE M O D E LT h e m o d e l i n v o l v e s f o u r s t e p s ( w h i c h c a n b e f u r t h e r s u b d i -v i d e d ) a n d i s s c h e m a t i z e d i n F i g . 3 :S t e p I : F o u r s i n g l e - s t r a n d c l e a v a g e s o c c u r . T h e s e a r e p r o b a b l yn o t s i m u l t a n e o u s a n d a l m o s t c e r t a i n l y n o t i n d e p e n d e n t e v e n t s .T h e d o n o r m o l e c u l e i s c l e a v e d o n e i t h e r s t r a n d a t t h e e x t r e m i t yo f t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t . T h e c l e a v a g e i s d r a w n a t t h e 3 ' -h y d r o x y l e n d o n e a c h s t r a n d . T h e e n d o n u c l e a s e r e s p o n s i b l e f o rt h i s c l e a v a g e i s p r o b a b l y a n e l e m e n t - s p e c i f i c e n z y m e ( e . g . , MuA g e n e p r o d u c t ) . T h e t a r g e t m o l e c u l e i s c l e a v e d a t s i t e s c h o s e nw i t h g r e a t e r o r l e s s e r s p e c i f i c i t y ( d e p e n d i n g o n t h e e l e m e n t )t o y i e l d 5 - o r 9 - b p c o h e s i v e e n d s , a s f i r s t p o s t u l a t e d b y G r i n d l e ya n d S h e r r a t t ( 1 0 ) . I t i s c r i t i c a l t h a t t h e p o l a r i t y o f t h i s c l e a v a g eb e o p p o s i t e t h a t o f t h e d o n o r c l e a v a g e , s o t h a t t h i s c l e a v a g e h a sb e e n d r a w n a t t h e 5 ' - p h o s p h a t e e n d s o f t h e o l i g o n u c l e o t i d es e q u e n c e o n e a c h s t r a n d . T h e e n d o n u c l e a s e r e s p o n s i b l e f o r t h i sc l e a v a g e i s p r o b a b l y a c e l l u l a r f u n c t i o n t h a t m a y b e a c t i v a t e db y t h e e l e m e n t - s p e c i f i c e n d o n u c l e a s e , a s f i r s t s u g g e s t e d b yG r i n d l e y a n d S h e r r a t t ( 1 0 ) . A l t h o u g h t h e t w o p a i r s o f c l e a v a g e s

a-A-I-4--US--wa-

V s l

0 - -. 000l~=85

F I G . 3 . T r a n s p o s i t i o n a n d r e p l i c a t i o n . T h e t o p c a r t o o n i l l u s t r a t e sh o w v a r i o u s D N A r e g i o n s m a y b e b r o u g h t i n t o c l o s e p h y s i c a l p r o x -i m i t y f o r t h e s u b s e q u e n t c l e a v a g e a n d l i g a t i o n e v e n t s . T h e b o t t o mf o u r d r a w i n g s s h o w v a r i o u s s t e p s i n t h e t r a n s p o s i t i o n p r o c e s s a s d e -s c r i b e d i n t h e t e x t . S o l i d l i n e s i n d i c a t e d o n o r D N A ; d a s h e d l i n e s i n -d i c a t e t a r g e t D N A ; t h e h e a v y b a r s a r e p a r e n t a l D N A o f t h e t r a n s -p o s a b l e e l e m e n t , a n d o p e n b a r s a r e n e w l y s y n t h e s i z e d D N A ; t h e s m a l lb o x e s i n d i c a t e t h e o l i g o n u c l e o t i d e t a r g e t s e q u e n c e ( f i l l e d , p a r e n t a lDNA; o p e n , n e w l y s y n t h e s i z e d D N A ) . T h e a r r o w h e a d s i n d i c a t e 3 ' -h y d r o x y l e n d s o f D N A c h a i n s a n d t h e d o t s i n d i c a t e 5 ' - p h o s p h a t e e n d s .T h e l e t t e r s a , b , c , a n d d i n t h e d u p l e x arms f l a n k i n g t h e t r a n s p o s a b l ee l e m e n t s a n d t a r g e t o l i g o n u c l e o t i d e s e r v e t o i n d i c a t e t h e g e n e t i cs t r u c t u r e o f t h e v a r i o u s d u p l e x p r o d u c t s .

A Tn9 A---c

1 9 3 4 G e n e t i c s : S h a p i r o

8/2/2019 Trasposicin

3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 ) 1 9 3 5m u s t h a v e o p p o s i t e p o l a r i t i e s , t h e r e i s n o c o m p e l l i n g r e a s o n nowf o r c h o o s i n g t h e p a r t i c u l a r o n e s d e p i c t e d i n F i g . 3 .S t e p I I : T h e d o n o r a n d t a r g e t s t r a n d s a r e l i g a t e d t o g e n e r a t ea x - s h a p e d s t r u c t u r e h e l d t o g e t h e r b y t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n td u p l e x a s s h o w n i n F i g . 3 . T h e l i g a t i o n w o u l d a l m o s t c e r t a i n l yb e c a t a l y z e d b y a s p e c i f i c e n z y m e c o m p l e x , p e r h a p s i n c l u d i n gt h e s a m e p r o t e i n r e s p o n s i b l e f o r t h e o r i g i n a l e l e m e n t - s p e c i f i cc l e a v a g e s . B e c a u s e b o t h e n d s o f t h e d o n o r e l e m e n t h a v e e x p o s e d3 ' - h y d r o x y l g r o u p s a n d b o t h e n d s o f t h e t a r g e t o l i g o n u c l e o t i d eh a v e e x p o s e d 5 ' - p h o s p h a t e g r o u p s , t h e j o i n i n g c a n t h e o r e t i c a l l yt a k e p l a c e i n e i t h e r o r i e n t a t i o n . ( T h e o r i e n t a t i o n m a y , h o w e v e r ,b e d e t e r m i n e d b y t h e e x a c t s e q u e n c e o f r e a c t i o n . ) A l t h o u g ht h e r e i s p r o b a b l y s o m e f r a y i n g a t t h e e n d s o f t h e t r a n s p o s a b l ee l e m e n t d u p l e x , t h i s s t r u c t u r e s h o u l d b e s t a b l e b e c a u s e t h e o n l yr e g i o n s t h a t m u s t b e s i n g l e - s t r a n d e d a r e t h e 5 - o r 9 - b p s e q u e n c e sf r o m t h e t a r g e t m o l e c u l e .I h a v e d e s c r i b e d t h e r e a c t i o n s i n s t e p s I a n d I I s e p a r a t e l y i no r d e r t o c l a r i f y t h e s i t e s o f b r e a k i n g a n d j o i n i n g o f D N A s t r a n d s .T h i s d e s c r i p t i o n i s n o t m e a n t t o i m p l y e i t h e r a b i o c h e m i c a lm e c h a n i s m o r a p a r t i c u l a r t e m p o r a l s e q u e n c e f o r t h e s e e v e n t s .I n o r d e r t o g u a r a n t e e m a x i m a l s t a b i l i t y t o t h e i n t e r m e d i a t es t r u c t u r e s , f o r e x a m p l e , o n e c o u l d p r o p o s e t h a t t h e r e i s i n i t i a l l yo n l y o n e c l e a v a g e o f t h e t a r g e t o l i g o n u c l e o t i d e f o l l o w e d b y l i -g a t i o n t o t h e d o n o r e l e m e n t a n d t h e n b y a c o n c e r t e d c l e a v -a g e - l i g a t i o n r e a c t i o n a t t h e o t h e r t a r g e t s i t e . T h e t y p e s o f b i o -c h e m i c a l r e a c t i o n s p o s t u l a t e d a r e n o t u n p r e c e d e n t e d . T 4 R N Al i g a s e w i l l j o i n s i n g l e D N A s t r a n d s t h a t a r e n o t h e l d t o g e t h e rb y d u p l e x r e g i o n s ( 2 8 ) . A n u m b e r o f t o p o i s o m e r a s e s w i l l c a t a -l y z e c o n c e r t e d c l e a v a g e - l i g a t i o n ( n i c k i n g - c l o s i n g ) r e a c t i o n s( 2 9 ) . I n f a c t , t h e p r o p e r t i e s o f o n e o f t h e s e e n z y m e s , D N A g y -r a s e , a r e v e r y s i m i l a r t o t h e p o s t u l a t e d c e l l u l a r f u n c t i o n r e -s p o n s i b l e f o r t h e s t a g g e r e d 5 - o r 9 - b p c l e a v a g e o f t h e t a r g e t , f o rs p e c i a l c o n d i t i o n s w i l l i n d u c e g y r a s e t o c a t a l y z e n o n r a n d o mD N A c l e a v a g e s l e a v i n g a f o u r - b a s e c o h e s i v e e n d ( r e f . 3 0 ; A .M o r r i s o n a n d N . C o z z a r e l l i , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e Xi n t e g r a s e c o m p l e x w i l l c a t a l y z e s i t e - s p e c i f i c , c o n c e r t e d c l e a v a g ea n d l i g a t i o n r e a c t i o n s i n v o l v i n g d i f f e r e n t m o l e c u l e s t o g e n e r a t er e c o m b i n a n t s t r u c t u r e s ( 7 ) . A n d i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h eO X 1 7 4 c i s A p r o t e i n c a r r i e s o u t a n o n c o n c e r t e d c l e a v a g e a n dl i g a t i o n r e a c t i o n t h a t h a s a p r o t e i n - s t a b i l i z e d n i c k e d D N A i n -t e r m e d i a t e ( 3 1 ) .S t e p I I I : T h e r e i s f i l l i n g i n o f t h e u n p a i r e d o l i g o n u c l e o t i d es e q u e n c e s a t t h e e n d s a n d s e m i c o n s e r v a t i v e r e p l i c a t i o n o f t h et r a n s p o s a b l e e l e m e n t . T h e l i g a t i o n s t e p a c t u a l l y r e s u l t s i n f o r -m a t i o n o f a r e p l i c a t i o n f o r k a t e a c h e n d o f t h e t r a n s p o s a b l ee l e m e n t . D i s p l a c e m e n t s y n t h e s i s f r o m t h e u n l i g a t e d 3 ' - h y d r o x y lg r o u p s w i l l r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f l a r g e s i n g l e - s t r a n d e d r e -g i o n s a d j a c e n t t o a n u n l i g a t e d 5 ' e n d , a n d s o s e e m s u n l i k e l y t op r o c e e d v e r y f a r w i t h o u t d i s c o n t i n u o u s r e p l i c a t i o n o n t h e o p -p o s i t e s t r a n d . ( T h i s s i t u a t i o n w i l l n o t b e a l t e r e d b y r e v e r s i n g t h ep o l a r i t i e s o f t h e o r i g i n a l c l e a v a g e s . ) T h e r e p l i c a t i o n m a y p r o -c e e d f r o m b o t h f o r k s t o t h e i n t e r i o r o f t h e e l e m e n t , f r o m o n ef o r k c o m p l e t e l y a c r o s s t h e e l e m e n t , o r ( c o n c e i v a b l y b u t n o tl i k e l y ) b i d i r e c t i o n a l l y f r o m a n i n t e r n a l s i t e . T h e f i r s t t w op o s s i b i l i t i e s p r o v i d e a v e r y a t t r a c t i v e e x p l a n a t i o n o f w h y Mum u s t t r a n s p o s e i n o r d e r t o r e p l i c a t e . P o l y m e r i z a t i o n a n dc o m p l e t i o n o f t h i s r e p l i c a t i o n r e q u i r e n o n e w b i o c h e m i c a l a c -t i v i t i e s , b u t i n s o m e c a s e s s p e c i f i c p r o t e i n s m a y b e i n v o l v e d ( e . g . ,Mu B g e n e p r o d u c t d u r i n g v e g e t a t i v e p h a g e g r o w t h ) . T h e r e s u l to f t h i s r e p l i c a t i o n w i l l b e t w o r e c o m b i n a n t d u p l e x e s e a c hc o n t a i n i n g a s e m i c o n s e r v e d t r a n s p o s a b l e e l e m e n t a d j a c e n t t ot h e t a r g e t 5 - o r 9 - b p s e q u e n c e . T h i s o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c eh a s b e e n d u p l i c a t e d i n t h e p r o c e s s . N o t e t h a t i f t h e d o n o r a n dt a r g e t m o l e c u l e s a r e b o t h i n t a c t r e p l i c o n s , t h e a a n d b d u p l e xa r ms w i l l b e c o n n e c t e d , a n d t h e c a n d d a r m s w i l l a l s o b e c o n -n e c t e d . I n o t h e r w o r d s , t h e r e c o m b i n a n t p r o d u c t s i n F i g . 3 w i l lc o n s t i t u t e t h e j o i n r e g i o n s o f a f u s e d r e p l i c o n ( F i g . 1 ) .

S t e p I V : S i t e - s p e c i f i c r e c i p r o c a l r e c o m b i n a t i o n t a k e s p l a c eb e t w e e n t h e t w o t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s t o g e n e r a t e b o t h t h eo r i g i n a l d o n o r m o l e c u l e ( w i t h s o m e n e w l y s y n t h e s i z e d m a t e r i a li n t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t ) a n d t h e t a r g e t m o l e c u l e c o n t a i n i n ga n i n s e r t e d e l e m e n t f l a n k e d b y a 5 - o r 9 - b p r e p e a t . A l t h o u g hh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n s y s t e m s c a n c a t a l y z e t h i s s t e p , t h e r em u s t b e s o m e r e c A - i n d e p e n d e n t p r o c e s s b e c a u s e t r a n s p o s i t i o no c c u r s n o r m a l l y i n r e c A s t r a i n s . T h i s r e c o m b i n a t i o n p r o b a b l yi n v o l v e s s p e c i f i c p r o t e i n s ( e . g . , t h e p r o d u c t l a c k i n g i n T n 5 - t r ph y b r i d s ; r e f . 1 7 ) a c t i n g o n s p e c i f i c s i t e s ( e . g . , t h e s i t e d e l e t e d i nc e r t a i n T n 3 m u t a n t s t h a t g e n e r a t e r e p l i c o n f u s i o n s ; r e f . 1 3 ) . I ti s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t t h e r e i s a g e n e r a l c e l l u l a r r e c o m b i -n a t i o n f u n c t i o n t h a t r e c o g n i z e s p a r t i c u l a r s i t e s w h e n t h e D N Ai s r e p l i c a t i n g ( c f . r e f . 1 6 ) . I n t h i s c a s e , I w o u l d s u g g e s t t h a t s t e p sI I I a n d I V o v e r l a p i n t i m e , s o t h a t t h e r e c i p r o c a l r e c o m b i n a t i o ne v e n t o c c u r s b e t w e e n d u p l i c a t e d s e g m e n t s o f t h e r e p l i c a t i n ge l e m e n t b e f o r e t h e r e p l i c a t i o n p r o c e s s i s f i n i s h e d . T h i s l a s t s t e pi s n o t e s s e n t i a l f o r Mu r e p l i c a t i o n , a n d i t s e f f i c i e n c y m a y v a r yf r o m e l e m e n t t o e l e m e n t . I n t h e c a s e o f X : : T n 9 i n f e c t i o n o f r e c -E s c h e r i c h i a c o l i c e l l s , c o i n t e g r a t e f o r m a t i o n ( s t e p s I - I I I ) o c c u r sa p p r o x i m a t e l y a s o f t e n a s t r a n s p o s i t i o n ( s t e p s I - I V ) ( 1 6 ) .

DISCUSSIONT h i s m o d e l s a t i s f a c t o r i l y e x p l a i n s t h e s i x o b s e r v a t i o n s l i s t e da b o v e a n d i s n o t i n c o n s i s t e n t w i t h a n y o f t h e o t h e r g e n e t i cp h e n o m e n a [ s u c h a s a d j a c e n t d e l e t i o n f o r m a t i o n ( 3 2 ) ] t h a ta p p e a r t o b e c o m m o n t o t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s . I n f a c t , i t i sp a r t i c u l a r l y i n s t r u c t i v e t o c o n s i d e r t h e c o n s e q u e n c e s o f o n es i m p l e a l t e r a t i o n i n t h e p r o c e s s j u s t o u t l i n e d : a f a i l u r e t o c o m -p l e t e s t e p I V . ( A s i m p l e g e n e t i c f o r m a l i s m f a c i l i t a t e s t h i s k i n do f a n a l y s i s b e c a u s e t h e n e t r e s u l t o f s t e p s I - I I I i s t o g e n e r a t e t w oc o m p l e t e r e c o m b i n a n t d u p l e x e s : a - e l e m e n t - o l i g o n u c l e o t i d e - da n d c - o l i g o n u c l e o t i d e - e l e m e n t - b . T h u s , i t i s n o t n e c e s s a r y t og o t h r o u g h a l l t h e d e t a i l s o f c l e a v a g e , l i g a t i o n , a n d r e p l i c a t i o nt o w o r k o u t r e c o m b i n a n t s t r u c t u r e s . ) I f d o n o r a n d t a r g e t m o l -e c u l e s a r e b o t h i n t a c t c i r c u l a r r e p l i c o n s , t h e p r o d u c t w i l l b e ac o i n t e g r a t e r e p l i c o n f u s i o n w i t h d i r e c t l y r e p e a t e d e l e m e n t s ,a n d i t i s c e r t a i n l y s u g g e s t i v e t h a t T n 3 a n d T n 5 a p p e a r t o g e n -e r a t e f u s i o n s o n l y w h e n p a r t o f t h e t r a n s p o s o n h a s b e e n d e l e t e d( 1 3 , 1 5 , 1 7 ) . I f t h e d o n o r a n d t a r g e t s i t e s a r e b o t h o n t h e s a m er e p l i c o n , t h e r e c o m b i n a n t p r o d u c t s o f t h e r e p l i c a t i o n s t e p w i l ld e p e n d o n t h e o r i e n t a t i o n o f t h e l i g a t i o n s t e p . I f t h e d u p l e x a r m sb r a c k e t i n g t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t ( m a r k e d a a n d b i n F i g .3 ) a n d t h o s e b r a c k e t i n g t h e t a r g e t s i t e ( c a n d d ) a r e a r r a n g e da s s h o w n i n t h e u p p e r p a n e l o f F i g . 4 , t h e p r o d u c t s w i l l b e t w oc i r c l e s . ( a , b , c , a n d d i n F i g . 3 a r e s h o w n a s A , B , C , a n d D i nF i g . 4 . ) T h e l a r g e r o n e c o u l d r e p r e s e n t a n a d j a c e n t d e l e t i o nm u t a n t o f t h e p a r e n t a l r e p l i c o n . B o t h c o u l d r e p r e s e n t t h e h e t -e r o g e n e o u s M u - c o n t a i n i n g c i r c l e s o b s e r v e d d u r i n g Mu r e p l i -c a t i o n ( 1 9 , 3 3 ) . T h u s , t h e m o d e l r e a d i l y a c c o u n t s f o r t w o o b -s e r v a t i o n s t h a t d i d n o t e n t e r i n t o t h e o r i g i n a l f o r m u l a t i o n . I ft h e d u p l e x a r m s o f t h e d o n o r e l e me n t a n d t a r g e t s i t e a r e a r -r a n g e d a s d e p i c t e d i n t h e l o w e r p a n e l o f F i g . 4 , t h e n t h e p r o d -u c t s w i l l f o r m a n i n v e r s i o n b r a c k e t e d b y i n v e r t e d r e p e a t s o f t h et r a n s p o s a b l e e l e m e n t . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t s u c he v e n t s m i g h t h a v e g i v e n r i s e t o s t r u c t u r e s l i k e t h o s e o f T n 5 a n dT n l O ( 3 ) . T h e s e h y p o t h e t i c a l a d j a c e n t i n v e r s i o n e v e n t s d o n o ty i e l d s t r u c t u r e s i d e n t i c a l t o t h o s e a l r e a d y o b s e r v e d b y K l e c k n e ra n d R o s s ( 3 4 ) . A l t h o u g h i t i s p o s s i b l e t o g e n e r a t e t h e i r s t r u c t u r e si n t h e s a m e f o u r s t e p s o u t l i n e d a b o v e , I t h i n k t h e d i s c r e p a n c yp r o v i d e s a n i m p o r t a n t t e s t o f t h e m o d e l . T h e m o d e l p r e d i c t st h a t i n v e r s i o n s s u c h a s t h o s e s c h e m a t i z e d i n t h e l o w e r p a n e l o fF i g . 4 w i l l b e t h e m o s t c o m m o n k i n d o f a d j a c e n t i n v e r s i o n w h e nt h e r e h a s b e e n n o s e l e c t i o n f o r g e n e t i c f u s i o n o r l o s s o f a p a r -t i c u l a r t r a n s p o s o n f u n c t i o n . A l t h o u g h t h e d a t a h a v e n o t y e t b e e np u b l i s h e d , F a e l e n a n d T o u s s a i n t r e f e r t o M u - m e d i a t e d i n v e r -s i o n s o f t h e s t r u c t u r e d e p i c t e d i n F i g . 4 ( 3 5 ) .

G e n e t i c s : S h a p i r o

8/2/2019 Trasposicin

4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 )

D

D

cF I G . 4 . C o n s e q u e n c e s o f i n s e r t i o n a n d r e p l i c a t i o n w i t h i n a c i r -c u l a r D N A m o l e c u l e . T h e l o n g b o x e s i n d i c a t e c o p i e s o f a t r a n s p o s a b l ee l e m e n t , a n d t h e s m a l l b o x e s i n d i c a t e t h e o l i g o n u c l e o t i d e t a r g e t s e -

q u e n c e . A , B , C , a n d D i n d i c a t e t h e d u p l e x regions s i m i l a r l y l a b e l e di n l o w e r c a s e i n F i g . 3 . T h e upper a n d l o w e r p a n e l s i l l u s t r a t e t h econsequences o f s t e p s I - 1 1 1 , d e p e n d i n g o n t h e o r i e n t a t i o n o f t h e l i -g a t i o n r e a c t i o n .A p a r t i c u l a r l y a p p e a l i n g f e a t u r e o f t h e m o d e l i s t h e i n t i m a t er e l a t i o n s h i p i t p o s t u l a t e s b e t w e e n t r a n s p o s i t i o n a n d r e p l i c a t i o n .T h i s r e l a t i o n s h i p h a s b e e n p r o p o s e d f o r p h a g e Mu ( 1 9 ) , a n d t h em o d e l p r o v i d e s an e x p l a n a t i o n o f many u n u s u a l f a c t s o f Mur e p l i c a t i o n . F u r t h e r m o r e , i t m a k e s c l e a r p r e d i c t i o n s a b o u t t h e

s t r u c t u r e i n v o l v e d i n t h e i n i t i a t i o n o f M u - s p e c i f i c D N A syn-t h e s i s .T h e m o d e l m a k e s s e v e r a l o t h e r g e n e t i c a n d b i o c h e m i c a lp r e d i c t i o n s . A m o ng t h e s e a r e t h e f o l l o w i n g :( i ) T r a n s p o s i t i o n o f an e l e m e n t t o a new s i t e d o e s n o t removet h e e l e m e n t f r o m i t s o r i g i n a l s i t e . T h u s , c e l l s w i l l a c c u m u l a t em u l t i p l e e l em en t s w i th t i m e u n l e s s t r a n s p o s i t i o n i s r e p r e s s e d .T h e d i s c o v e r y o f a t r a n s p o s i t i o n r e p r e s s o r f o r T n3 i s p a r t i c u l a r l yi n t e r e s t i n g i n r e g a r d t o t h i s p r o b l e m ( 1 3 , 1 5 ) .( i i ) T r a n s p o s a b l e e l e m e n t systems w i l l c o d e f o r t h r e e k i n d so f f u n c t i o n s : a s t r a n d c l e a v a g e f u n c t i o n f o r s t e p I , a l i g a t i o nf u n c t i o n f o r s t e p I I , a n d a s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o n f u n c t i o n f o rs t e p I V . A s s u g g e s t e d a b o v e , one p r o t e i n may p a r t i c i p a t e i n b o t he l e m e n t - s p e c i f i c c l e a v a g e a n d l i g a t i o n r e a c t i o n s . T h e r e c o m -b i n a t i o n f u n c t i o n may b e e i t h e r a s p e c i f i c e n z y m e - s i t e s y s t e m( a n a l o g o u s t o t h e i n t e g r a s e - a t t s y s t e m o f X ) o r s i m p l y a s i t ew h i c h m a k e s use o f some c e l l u l a r r e c - i n d e p e n d e n t s y s t e m f o ri l l e g i t i m a t e r e c o m b i n a t i o n . T r a n s p o s a b l e e l e m e n t s t h a t r e p l i -c a t e , s u c h a s p h a g e Mu, may a l s o h a v e s p e c i f i c p r o t e i n s f o r s t e pI I I .( i i i ) T h e r e c o m b i n a n t s t r u c t u r e s f o r m e d a f t e r s t e p I I I a r eo b l i g a t o r y i n t e r m e d i a t e s i n t r a n s p o s i t i o n e v e n t s . F o r t wo c i r -c u l a r m o l e c u l e s t h i s means a r e p l i c o n f u s i o n s t r u c t u r e ( F i g . 1 ) .F o r g e n e t i c a l l y l i n e a r m o l e c u l e s ( s u c h a s A p h a g e s ) t h i s meanst h a t a t r a n s p o s a b l e e l e m e n t w i l l serve a s a s i t e f o r r e c i p r o c a lr e c o m b i n a t i o n when t h e f u l l process i s a b o r t e d a f t e r s t e p I I I .I n s u c h c r o s s e s , o n l y one p a r e n t a l m o l e c u l e w i l l carry t h et r a n s p o s a b l e e l e m e n t , a n d r e c o m b i n a t i o n events w i l l occur a tv a r i o u s s i t e s on t h e o t h e r p a r e n t a l m o l e c u l e . B o t h r e c o m b i n a n tp r o d u c t s w i l l carry t h e t r a n s p o s a b l e e l em e n t . T h e s e r e c o m b i -n a t i o n events w i l l not r e q u i r e DNA sequence h o m o l o g y norh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n systems a n d w i l l d i f f e r f r o m t h ep o s t u l a t e d s t e p I V r e a c t i o n , w h i c h w i l l occur a t d e f i n e d s i t e son b o t h p a r e n t a l m o l e c u l e s .

( i v ) T h e d o n o r m o l e c u l e i n a t r a n s p o s i t i o n e v e n t w i l l b e r e -g e n e r a t e d w i t h t w o s e g m e n t s o f n e w l y s y n t h e s i z e d D N A o no p p o s i t e s t r a n d s , a n d t h e n e w l y i n s e r t e d t r a n s p o s o n w i l l c o n t a i np a r e n t a l D N A f r o m t h e d o n o r m o l e c u l e i n t w o s e g m e n t s o no p p o s i t e s t r a n d s . T h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t i n b o t h d o n o r a n dt a r g e t m o l e c u l e s w i l l c o n s i s t o f o n l y h y b r i d ( n e w - o l d ) D N A .T h e r e a r e f o u r a d d i t i o n a l a s p e c t s o f t h i s m o d e l t h a t m e r i te m p h a s i s . F i r s t , t h e r e i s n o a u t o n o m o u s e x i s t e n c e o f t h e t r a n -s p o s a b l e e l e m e n t . T h i s i s o n e o f t h e s t r i k i n g f e a t u r e s o f p h a g eM u , i n w h i c h e v e n t h e v i r u s p a r t i c l e c o n t a i n s a n i n s e r t e d p r o -p h a g e r a t h e r t h a n a n a u t o n o m o u s v i r a l g e n o m e f r e e o f h o s tD N A ( 1 9 ) . S e c o n d , a l l r e a c t i o n s a r e l i m i t e d t o t h e l o c a l r e g i o n so f t h e d o n o r e l e m e n t a n d t h e t a r g e t s i t e . T h u s , t h e r e i s n o r e -q u i r e m e n t f o r p h y s i c a l c i r c u l a r i t y o f e i t h e r m o l e c u l e . T h i r d ,t h e d o n o r m o l e c u l e i s r e g e n e r a t e d i n t a c t a n d d o e s n o t h a v e t oc o m m i t s u i c i d e i n o r d e r t o d o n a t e i t s t r a n s p o s a b l e e l e m e n t t oa n e w s i t e . T h u s , i t i s p o s s i b l e t o h a v e t r a n s p o s i t i o n b e t w e e n s i t e si n t h e s a m e r e p l i c o n . F o u r t h , t h e i n i t i a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e nd o n o r a n d t a r g e t d u p l e x e s i n v o l v e e n d - t o - e n d j o i n i n g o f s i n g l eD N A s t r a n d s . T h u s , t h e r e i s n o r o l e f o r b a s e - p a i r i n g ( i . e . , g e n e t i ch o m o l o g y ) i n t h e r e c o m b i n a t i o n p r o c e s s a t t h e s i t e o f i n s e r t i o n .T h i s f e a t u r e d i s t i n g u i s h e s t h e p r e s e n t p r o p o s a l f r o m m e c h a -n i s m s b a s e d o n t h e a c t i v i t y o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s .T h i s m o d e l o w e s a g r e a t d e a l t o t h e e a r l i e r p r o p o s a l o fG r i n d l e y a n d S h e r r a t t ( 1 0 ) . T h e i d e a s o f s t a g g e r e d c l e a v a g e sa t t h e t a r g e t s i t e , o f r e p l i c a t i n g t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t , a n do f r e g e n e r a t i n g t h e d o n o r m o l e c u l e w e r e f i r s t e x p l i c i t l y s t a t e db y t h e m . T h u s , p r e d i c t i o n i a b o v e i s t h e s a m e f o r b o t h m o d e l sa n d d i s t i n g u i s h e s t h e m f r o m m o d e l s b a s e d o n X e x c i s i o n a n di n s e r t i o n . T h e r e a r e , h o w e v e r , i m p o r t a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e nt h e t w o p r o p o s a l s . T h e m o d e l d e s c r i b e d a b o v e p o s t u l a t e s t h a tc l e a v a g e s a n d l i g a t i o n s a t b o t h e n d s o f t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n to c c u r p r i o r t o D N A r e p l i c a t i o n . T h e G r i n d l e y - S h e r r a t t p r o p o s a lp o s t u l a t e s d i s p l a c e m e n t s y n t h e s i s a c r o s s t h e t r a n s p o s a b l e e l e -m e n t b e t w e e n t h e f i r s t l i g a t i o n a t o n e o f i t s e n d s a n d t h e s u b -s e q u e n t l i g a t i o n a t t h e o t h e r e n d . T h u s , t h e s t r u c t u r e o f t r a n s -p o s i t i o n i n t e r m e d i a t e s , t h e n a t u r e o f c l e a v a g e a n d l i g a t i o n r e -a c t i o n s , a n d t h e f u n c t i o n s o f t h e e l e m e n t - s p e c i f i c e n z y m e s a r ed i f f e r e n t . I n p a r t i c u l a r , p r e d i c t i o n i i i o f t h i s m o d e l i n c l u d e s t w op o t e n t i a l l y s t a b l e r e c o m b i n a n t d u p l e x e s a s i n t e r m e d i a t e s . B yp o s t u l a t i n g a s t r a n d s w i t c h d u r i n g d i s p l a c e m e n t s y n t h e s i s a c r o s st h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t , i t i s p o s s i b l e t o g e n e r a t e r e c o m b i n a n td u p l e x s t r u c t u r e s f r o m t h e G r i n d l e y - S h e r r a t t m o d e l . H o w e v e r ,t h e s e a r e n o t i n t e r m e d i a t e s f o r t r a n s p o s i t i o n , s o t h a t t h e p r e s -e n c e o f a r e c - i n d e p e n d e n t r e c i p r o c a l r e c o m b i n a t i o n s y s t e m f o rs i b l i n g e l e m e n t s i s n o t a f e a t u r e o f t h e i r p r o p o s a l . T h e n a t u r eo f e l e m e n t - s p e c i f i c r e p l i c a t i o n i s a l s o v e r y d i f f e r e n t i n t h e t w om o d e l s . A c c o r d i n g t o G r i n d l e y a n d S h e r r a t t , t h e t r a n s p o s a b l ee l e m e n t i s d u p l i c a t e d b y t w o s u c c e s s i v e d i s p l a c e m e n t r e a c t i o n sf r o m f r e e 3 ' - h y d r o x y l e n d s f o r m e d b y s e p a r a t e c l e a v a g e e v e n t s .T h e s e r e a c t i o n s c a n r e s u l t i n c o n s e r v a t i v e r e p l i c a t i o n o f a t l e a s tp a r t o f t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t . T h e m o d e l p r o p o s e d h e r ep o s t u l a t e s s t r i c t l y s e m i c o n s e r v a t i v e r e p l i c a t i o n o f t h e t r a n -s p o s a b l e e l e m e n t . T h u s , p r e d i c t i o n i v a b o u t t h e p r e s e n c e o f o n l yh y b r i d D N A i n f i n a l t r a n s p o s i t i o n p r o d u c t s d o e s n o t a p p l y t ot h e G r i n d l e y - S h e r r a t t m o d e l . A n a d d i t i o n a l ( a n d m o r e i n -t r i g u i n g ) d i f f e r e n c e i s t h e p o s s i b l e r o l e o f a D N A r e p l i c a t i o nt e r m i n a t i o n f u n c t i o n i n t r a n s p o s i t i o n . T o c o m p l e t e r e p l i c a t i o no f t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t b y t h e p r e s e n t m o d e l p o s e s t h e s a m et o p o l o g i c a l p r o b l e m s a s f i n i s h i n g r e p l i c a t i o n o f a n y c i r c u l a rm o l e c u l e t h a t p a s s e s t h r o u g h a t h e t a s t r u c t u r e ( 3 6 ) . T h u s , t h et o t a l p r o c e s s a l m o s t c e r t a i n l y r e q u i r e s t h e b i o c h e m i c a l a c t i v i t i e sn e e d e d f o r n o r m a l t e r m i n a t i o n a n d s e p a r a t i o n o f d a u g h t e rr e p l i c o n s . W i t h o u t t h e s e , t h e t w o r e c o m b i n a n t d u p l e x p r o d u c t so f s t e p I I I w o u l d n o t b e f o r m e d . S u c h a n a c t i v i t y i s n o t r e q u i r e db y t h e G r i n d l e y a n d S h e r r a t t r e p l i c a t i o n s c h e m e . T h e t e s t s f o r

1 9 3 6 G e n e t i c s : S h a p i r o

0%

8/2/2019 Trasposicin

5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 ) 1 9 3 7m a n y o f t h e a l t e r n a t i v e p r e d i c t i o n s o f t h e s e t w o m o d el s a w a i td e v e l o p m e n t o f i n v i t r o t r a n s p o s i t i o n s y s t e m s . B o t h m o d e l si n d i c a t e t h a t t r a n s p o s i t i o n i s a m o r e c o m p l e x p r o c e s s t h a n i n -t e g r a t i v e X r e c o m b i n a t i o n ( 7 ) .T h e r e a r e c l e a r l y m a n y d e t a i l s t o f i l l i n . T h e m e c h a n i s m sg o v e r n i n g t h e f o r m a t i o n o f t h e i n i t i a l d o n o r - t a r g e t c o m p l e xr e m a i n t o b e e l u c i d a t e d . T h i s i s a p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n gq u e s t i o n b e c a u s e b o t h g e n e t i c a n d s e q u e n c e d a t a i n d i c a t e t h a tt h e r e a r e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e w a y s i n w h i c h T n 9 a n d T n l Oc h o o s e i n s e r t i o n s i t e s ( 1 1 , 3 3 ) . S t e p s I I I a n d I V a r e v a g u e b e c a u s et h e n a t u r e s o f b o t h r e p l i c a t i o n i n i t i a t i o n a n d s i t e - s p e c i f i c r e -c o m b i n a t i o n e v e n t s n e e d t o b e s p e c i f i e d . N o n e t h e l e s s , t h i sm o d e l h a s s o m e o r i g i n a l f e a t u r e s , p r o v i d e s n e w e x p l a n a t i o n sf o r p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s , m a k e s s e v e r a l t e s t a b l e p r e d i c t i o n s ,a n d h o p e f u l l y w i l l a i d i n t h e d e s i g n o f b o t h g e n e t i c a n d b i o -c h e m i c a l e x p e r i m e n t s f o r e l u c i d a t i o n o f t h e b e h a v i o r o ft r a n s p o s a b l e e l e m e n t s .N o t e A d d e d i n P r o o f . I t h a n k A r i a n n e T o u s s a i n t a n d N i g e l G r i n d l e yf o r b r i n g i n g s o m e a d d i t i o n a l p o i n t s a b o u t Mu r e p l i c a t i o n a n d M u -m e d i a t e d c h r o m o s o m e r e a r r a n g e m e n t s t o my a t t e n t i o n : ( i ) Mu D N Aa p p e a r s t o r e p l i c a t e u n i d i r e c t i o n a l l y s t a r t i n g a t t h e i m m u n i t y ( c ) t e r -m i n u s [ C . W i f f e l m a n a n d P . v a n d e P u t t e ( 1 9 7 7 ) , i n r e f . 3 , p p . 3 2 9 -3 3 3 ] . ( i i ) W h e n a Mu p r o p h a g e m e d i a t e s d e l e t i o n f o r m a t i o n a t a d i s t a n tr e g i o n o f t h e g e n o m e , t h e r e s u l t i n g m u t a n t c e l l c o n t a i n s t w o c o p i e s o fMu-one l i n k e d t o t h e d e l e t i o n a n d o n e a t t h e o r i g i n a l s i t e ( 3 5 ) . T h u s ,i n t h i s c a s e t r a n s p o s i t i o n h a s o c c u r e d w i t h o u t l o s s o f t h e d o n o r p r o -p h a g e . ( i i i ) B o t h e n d s o f t h e Mu p r o p h a g e a r e r e q u i r e d f o r t h e f o r -m a t i o n o f a n a d j a c e n t d e l e t i o n ( 3 5 ) . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e m o d e lf o r a d j a c e n t d e l e t i o n f o r m a t i o n d e p i c t e d i n F i g . 4 . ( i v ) M u - m e d i a t e dr e c o m b i n a t i o n e v e n t s t h a t r e q u i r e o n l y o n e c y c l e o f t r a n s p o s i t i o n a n dr e p l i c a t i o n ( e . g . , a d j a c e n t d e l e t i o n f o r m a t i o n a n d i n t e g r a t i o n o f X g a li n t o t h e c h r o m o s o m e o f a Mu l y s o g e n ) o c c u r a t t h e s a m e f r e q u e n c i e si n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f Mu B f u n c t i o n ( 1 2 , 3 5 ) . On t h e o t h e rh a n d , M u - m e d i a t e d r e c o m b i n a t i o n e v e n t s t h a t r e q u i r e t w o o r m o r ec y c l e s o f t r a n s p o s i t i o n a n d r e p l i c a t i o n ( e . g . , d e l e t i o n f o r m a t i o n a t s i t e sd i s t a n t f r o m a p r o p h a g e ) o c c u r a t t h e f r e q u e n c y o f a s i n g l e e v e n t i np r e s e n c e o f Mu B f u n c t i o n b u t a t t h e f r e q u e n c y o f t w o s u c c e s s i v e i n -d e p e n d e n t e v e n t s i n t h e a b s e n c e o f Mu B f u n c t i o n ( 3 5 ) . T h i s o b s e r -v a t i o n s u g g e s t s a f u n c t i o n f o r t h e Mu B g e n e p r o d u c t : t h e p r e s e n c e o fMu B p r o d u c t p e r m i t s t h e Mu A f u n c t i o n t o c a t a l y z e r e p e a t e d r o u n d so f t r a n s p o s i t i o n ( s u c h a s n e e d e d t o i n i t i a t e s u c c e s s i v e r o u n d s o f v e g e -t a t i v e r e p l i c a t i o n ) . I n t h e a b s e n c e o f Mu B p r o d u c t , t h e Mu A f u n c t i o nc a n c a t a l y z e o n l y a s i n g l e r o u n d o f t r a n s p o s i t i o n a n d r e p l i c a t i o n . T h i sh y p o t h e s i s p r e d i c t s t h a t d e n s i t y - l a b e l e d Mu A + B - p h a g e w i l l f o r mh y b r i d d e n s i t y p r o p h a g e s a f t e r i n f e c t i o n o f s e n s i t i v e b a c t e r i a .

I t h a n k L o m e M a c H a t t i e f o r i n t r o d u c i n g me t o t h e m y s t e r i e s o f T n 9 ,f o r l o n g h o u r s o f i n v a l u a b l e d i s c u s s i o n s , a n d f o r m a k i n g t h e s e f i g u r e su n d e r s t a n d a b l e . I am g r a t e f u l t o N i c h o l a s C o z z a r e l l i , A l a n M o r r i s o n ,P a t B r o w n , P a t H i g g i n s , a n d K e n K r e u z e r f o r c o m m u n i c a t i n g u n -p u b l i s h e d r e s u l t s a n d h e l p i n g me e n s u r e t h e b i o c h e m i c a l p l a u s i b i l i t yo f t h e m o d e l ; t o A h m a d B u k h a r i , M a r t h a H o w e , a n d A r i a n n e T o u s s a i n tf o r m a n y h e l p f u l l e s s o n s o n p h a g e Mu b i o l o g y ; t o R o n G i l l a n d J e f fM i l l e r f o r c o m m u n i c a t i n g u n p u b l i s h e d r e s u l t s o n r e p l i c o n f u s i o n e x -p e r i m e n t s ; a n d t o N i g e l G r i n d l e y f o r g o i n g o v e r o u r r e s p e c t i v e m o d e l st o c l a r i f y t h e i r s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s . R e s e a r c h i n my l a b o r a t o r yi s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a lS c i e n c e s ( G M 2 4 9 6 0 ) , t h e U n i v e r s i t y o f C h i c a go C a n c e r R e s e a r c hC e n t e r ( C A 1 4 5 9 9 - 0 5 - 3 0 7 ) , a n d t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n ( P C M7 7 - 0 8 5 9 1 ) . I am t h e r e c i p i e n t o f a R e s e a r c h C a r e e r D e v e l o p m e n tA w a r d ( 1 - K 0 4 - A I 0 0 1 1 8 - 0 1 ) f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f A l l e r g y a n dI n f e c t i o u s D i s e a s e s .

1 . C o h e n , S . N . ( 1 9 7 6 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 3 , 7 3 1 - 7 3 8 .2 . S h a p i r o , J . A . ( 1 9 7 7 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 2 , 1 7 6 - 1 8 0 . -3 . B u k h a r i , A . I . , S h a p i r o , J . A . & A d h y a , S . L . , e d s . ( 1 9 7 7 ) D N AI n s e r t i o n E l e m e n t s , P l a s m i d s a n d E p i s o m e s ( C o l d S p r i n gH a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) .4 . N e v e r s , P . & S a e d l e r , H . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 8 , 1 0 9 -1 1 5 .

5 . K l e c k n e r , N . ( 1 9 7 7 ) C e l l 1 1 , 1 1 - 2 3 .6 . C a m p b e l l , A . M . ( 1 9 6 2 ) A d v . G e n e t . 1 1 , 1 0 1 - 1 4 5 .7 . N a s h , H . A . , M i z u u c h i , K . , W e i s b e r g , R . A . , K i k u c h i , Y . & G e l l e r t ,M . ( 1 9 7 7 ) i n D N A I n s e r t i o n E l em en t s , P l a s mi d s a n d E p i s o m e s ,e d s . B u k h a r i , A . I . , S h a p i r o , J . A . & A d h y a , S . L . ( C o l d S p r i n gH a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 3 6 3 - 3 7 3 .8 . G r i n d l e y , N . D . F . ( 1 9 7 8 ) C e l l 1 3 , 4 1 9 - 4 2 7 .9 . C a l o s , M . P . , J o h n s r u d , L . & M i l l e r , J . H . ( 1 9 7 8 ) C e l l 1 3 , 4 1 1 -4 1 8 .1 0 . G r i n d l e y , N . D . F . & S h e r r a t t , D . ( 1 9 7 8 ) C o l d S p r i n g H a r b o rS y m p . Q u a n t . B i o l . 4 3 , i n p r e s s .1 1 . J o h n s r u d , L . , C a l o s , M . & M i l l e r , J . H . ( 1 9 7 8 ) C e l l 1 5 , 1 2 0 9 -1 2 1 9 .1 2 . F a e l e n , M . , T o u s s a i n t , A . & d e l a F o n t a y n e , J . ( 1 9 7 5 ) J . B a c t e r i o l .1 2 1 , 8 7 3 - 8 8 2 .1 3 . H e f f r o n , F . , B e d i n g e r , P . , C h a m p o u x , J . & F a l k o w , S . ( 1 9 7 7 ) i nD N A I n s e r t i o n E l e m e n t s , P l a s m i d s a n d E p i s o m e s , e d s . B u k h a r i ,A . I . , S h a p i r o , J . A . & A d h y a , S . L . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a -t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 1 6 1 - 1 6 7 .1 4 . M a c H a t t i e , L . A . & S h a p i r o , J . A . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 5 , 1 4 9 0 - 1 4 9 4 .1 5 . G i l l , R . , H e f f r o n , F . , D o u g a n , G . & F a l k o w , S . ( 1 9 7 8 ) J . B a c t e r i o l .1 3 6 , 7 4 2 - 7 5 6 .1 6 . S h a p i r o , J . A . & M a c H a t t i e , L . A . ( 1 9 7 8 ) C o l d S p r i n g H a r b o rS y m p . Q u a n t . B i o l . 4 3 , i n p r e s s .1 7 . M e y e r , R . , B o c h , G . & S h a p i r o , J . ( 1 9 7 9 ) M o l . G e n . G e n e t . , i np r e s s .1 8 . M a c H a t t i e , L . A . & J a c k o w s k i , J . B . ( 1 9 7 7 ) i n D N A I n s e r t i o nE l e m e n t s , P l a s m i d s a n d E p i s o m e s , e d s . B u k h a r i , A . I . , S h a p i r o ,J . A . & A d h y a , S . L . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n gH ar b o r , N Y ) , p p . 2 1 9 - 2 2 8 .1 9 . B u k h a r i , A . I . ( 1 9 7 6 ) A n n u . R e v . G e n e t . 1 0 , 3 8 9 - 4 1 2 .2 0 . O ' D a y , K . J . , S c h u l t z , D . W . & H o w e , M . M . ( 1 9 7 8 ) i n M i c r o -b i o l o g y 1 9 7 8 , e d . S c h l e s s i n g e r , D . ( A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o -b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D C ) , p p . 4 8 - 5 1 .2 1 . W a g g o n e r , B . T . & P a t o , M . C . ( 1 9 7 8 ) J . V i r o l . 2 7 , 5 8 7 - 5 9 4 .2 2 . L j u n g q u i s t , E . & B u k h a r i , A . I . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA7 4 , 3 1 4 3 - 3 1 4 7 .2 3 . B e r g , D . ( 1 9 7 7 ) i n D N A I n s e r t i o n E l e m e n t s , P l a s m i d s a n d E p -i s o m e s , e d s . B u k h a r i , A . I . , S h a p i r o , J . A . & A d h y a , S . L . ( C o l dS p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p .2 0 5 - 2 1 2 .2 4 . B e n n e t t , P . M . , G r i n s t e d , J . & R i c h m o n d , M . H . ( 1 9 7 7 ) M o l . G e n .G e n e t . 1 5 4 , 2 0 5 - 2 1 1 .2 5 . H i c k s , J . B . , S t r a t h e r n , H . N . & H e r s k o w i t z , I . ( 1 9 7 7 ) i n D N AI n s e r t i o n E l e m e n t s , P l a s m i d s a n d E p i s o m e s , e d s . B u k h a r i , A .I . , S h a p i r o , J . A . & A d h y a , S . L . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 4 5 7 - 4 6 2 .2 6 . B o t s t e i n , D . & K l e c k n e r , N . ( 1 9 7 7 ) i n D N A I n s e r t i o n E l e m e n t s ,P l a s m i d s a n d E p i s o m e s , e d s . B u k h a r i , A . I . , S h a p i r o , J . A . &A d h y a , S . L . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n gH a r b o r , N Y ) , p p . 1 8 5 - 2 0 3 .2 7 . K l e c k n e r , N . , C h a n , R . K . , T y e , B . K . & B o t s t e i n , D . ( 1 9 7 5 ) J . M o l .B i o l . 9 7 , 5 6 1 - 5 7 5 .2 8 . S n o p e k , T . , S u g i n o , A . , A g a r w a l , K . L . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 7 6 )B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 6 8 , 4 1 7 - 4 2 4 .2 9 . W a n g , J . C . & L i u , F . ( 1 9 7 8 ) i n M o l e c u l a r G e n e t i c s , e d . T a y l o r ,J . H . ( A c a d e m i c , N ew Y o r k ) , P a r t I I I , i n p r e s s .3 0 . P e e b l e s , C . L . , H i g g i n s , N . P . , K r e u z e r , K . N . , M o r r i s o n , A . ,B r o w n , P . O . , S u g i n o , A . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 7 8 ) C o l d S p r i n gH a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 4 3 , 4 1 - 5 2 .3 1 . E i s e n b e r g , S . , G r i f f i t h , J . & K o r n b e r g , A . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U S A 7 4 , 3 1 9 8 - 3 2 0 2 .3 2 . R e i f , H . J . & S a e d l e r , H . ( 1 9 7 5 ) M o l . G e n . G e n e t . 1 3 7 , 1 7 - 2 8 .3 3 . W a g g o n e r , B . , P a t o , M . L . & T a y l o r , A . L . ( 1 9 7 7 ) i n D N A I n -s e r t i o n E l e m e n t s , P l a s m i d s a n d E p i s o m e s , e d s . B u k h a r i , A . I . ,S h a p i r o , J . A . & A d h y a , S . L . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 2 6 3 - 2 7 4 .3 4 . K l e c k n e r , N . & R o s s , D . G . ( 1 9 7 8 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p .Q u a n t . B i o l . 4 3 , i n p r e s s .3 5 . F a e l e n , M . & T o u s s a i n t , A . ( 1 9 7 8 ) J . B a c t e r i o l . 1 3 6 , 4 7 7 - 4 8 3 .3 6 . G e f t e r , M . ( 1 9 7 8 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 4 , 4 5 - 7 8 .

G e n e t i c s : S h a p i r o