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Dr. Luis ValledorUniversidade de Aveiro, PortgualGCRC, Academy of Sciences of the Czech Republic, [email protected]

Transcriptómica y Proteómica

Universidad de OviedoMáster en Biotecnología Aplicada a la Conservación y Gestón Sostenible de los Recursos Vegetales

Transcriptómica

La transcriptómica es el estudio del conjunto de ARNs presentes en un organismo o tpo celular. El transcriptoma es dinámico, y responde en gran medida a las condiciones ambientales.

En este conjunto de transcritos no solo se incluye el ARNm, refejando en consecuencia los genes están siendo expresados de forma actva, si no tambiénotros tpos de ARN con actvidad estructural, catalítca y reguladora.

¿Qué otros tpos de ARN se pueden estudiar?

¿Qué otros tpos de ARN se pueden estudiar?

¿Por qué puede ser interesante medir los

niveles de expresión de un gen?

¿Por qué puede ser interesante medir los

niveles de expresión de un gen?

¿Estudia la transcriptómica algo

más que genes?

¿Estudia la transcriptómica algo

más que genes?

¿Qué técnicas existen para medir los niveles de

expresión?

¿Qué técnicas existen para medir los niveles de

expresión?

La transcriptómica no estudia solo los mRNA, ¿Qué otros tpos deRNA hay? ¿Qué funciones tenen?

En la actualidad se conocen 30 tpos diferentes de ARN los cuales pueden agruparse en 5 grupos funcionales diferentes:

-Síntesis de proteínas: mRNA - mensajero, ARNt - transferencia, rRNA – ribosómico, Signal recogniton partcle(SRP)-RNA.

-Regulatorios: siRNA – pequeño de interferencia, miRNA – micro de interferencia, aRNA - antsentdo, lncRNA – largo no codifcante.

Nos conformaremos con conocer solo estos RNAsNos conformaremos con conocer solo estos RNAs

-Modifcadores postranscripcionales o relacionados con la replicación del ADN: snRNA – pequeño nuclear, snoRNA – pequeño nucleolar, Rnase P – ribonucleasa P.

-RNAs parasítcos-Otros tpos de RNA¡¡Parece complicado!!

¿Cómo funciona todo esto?¡¡Parece complicado!!

¿Cómo funciona todo esto?

Biología molecular de la transcripción (breve resumen)

Los RNAs son sintetzados por un grupo de enzimas denominada RNA-polimerasas (RNAP), que utlizan como molde al ADN. Las distntas RNAP están especializadas en la síntesis de distntos tpos de RNA:

-RNA Pol. I: rRNA-RNA Pol. II: mRNAs, snRNAs, miRNAs -RNA Pol. III: tRNA, rRNA, small RNAs citoplasmicos-RNA Pol. IV: siRNA-RNA Pol. V: siRNA (RNA Pols. IV & V solo descubiertas en plantas)

El pre-mRNA producido por la RNA Pol. II sufre una seriede modifcaciones antes de salir del núcleo como son el Capping, la poliadenilación y el ayuste (splicing).

Estructura del mRNA eucariota

ATG TAGTAATGA*

*TGA tambíen puede codifcar para Selenocisteína, e l aminoácido proteinogénico 21, descubierto recientemente.

Este esquema con la estructura del mRNA es muy importante para entender las

bases de datos

Este esquema con la estructura del mRNA es muy importante para entender las

bases de datos

No son lo mismo las secuencias FL

genome, FL cDNA o CDS

No son lo mismo las secuencias FL

genome, FL cDNA o CDS

Biosíntesis de proteínas

… Y estos son los principales RNAs

relacionados con la síntesis de proteínas.

… Y estos son los principales RNAs

relacionados con la síntesis de proteínas.

Modifcación del ADN -Química (Metlación) -Estructural (Compactación de la cromatna, alteraciones en los nucleosomas) -RNAs pequeños (inductores de modifcaciones del ADN)

Niveles de regulación de la transcripción

Regulación de la transcripción -Factores de especifcidad -Represores -Factores de transcripción “generales” (GTFs) -Actvadores -Potenciadores

Regulación post transcripcional -Ayuste (Splicing) -Adicción de una caperuza (Capping) -Poliadenilación

e.g. ERE CAAT ExonIntronAUG ExonIntronExon Ter

+1

Upstream regulatory region

Terminator codon UGA, UAA or UAG

5’ untranslatedregion of mRNA

Coding sequenceORF (open reading frame)

Transcribed region5’end of gene 3’end of gene

Initator codon

enhancers TATA ExonIntronExonIntronExon Ter

+1

Promoter

Upstream regulatory region

Transcripton start Terminator codon UGA, UAA or UAG

5’region of mRNA

5’end of gene 3’end of gene

3’ untranslatedregion of mRNA

Initator codon

Basic promoter sequence motfs such as TATA and CAAT, additonal promoter elements such as ERE (ethylene response element, in some plant genes) and up- or downstream regulatory regions on the same strand as the coding region are called cis-elements. Before the RNA transcript (mRNA) serves as a template for protein biosynthesis, non-coding sequences (introns) are eliminated, coding sequences (exons) are fused (referred to as ‘splicing’) and the 5‘ and 3‘ untranslated regions (UTRs) are post-transcriptonally modifed. Open reading frames (ORFs) that are translated into a protein always start with the initator codon AUG and end with one of the terminator codons UGA,UAA or UAG.

Estructura de un gen eucariota (II)

Close-up of the promoter of the plant gene strictosidine synthase (alkaloid synthesis)

BA

-58-100-208-339 +1-103-108

Trans - actng factors (= transcripton factors)

Cis - actng elements

JERE TATA

-58-100-208-339 +1-103-108

STR gene

CrBPF1 CrMyc2 CrGBFs ORCAs RNA polymerase II

G-Box

DNA binding proteins that actvate or suppress transcripton and thus modulate transcript abundance

…transcripton factors

Regulación de la transcripción …

= miRNAa = small, single-stranded RNA molecules (~21-mer) that bind to complementary of one or more mRNAs (ofen transcripton factor mRNAs)

Mature miRNA within RNA-induced silencing complex (RISC)

miRNA – RISC complex binding to complementary mRNA

miRNAs either degrade or impair the translaton of their target mRNAs!

Taken from htp://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/index.html

Regulación de la transcripción por miRNA

http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/index.html

Regulación de la transcripción por miRNA

Figure 1: Polymerase IV (Pol IV) initates the RNA-directed DNA methylaton (RdDM) pathway (1), generatng transcripts that are then copied into double-stranded RNA (dsRNA) by RNA-DEPENDENT POLYMERASE 2 (RDR2) (2). The putatve chromatn remodeler and/or helicase CLSY1 assists in one or more of these steps. DICER-LIKE 3 (DCL3) cleaves the dsRNA into 24-nucleotde small interfering RNA (siRNA) duplexes (3) that are methylated by HEN1 (4). A single strand of the siRNA duplex associates with AGO4 to form an RNA-induced silencing complex (RISC) (5).

Independent of siRNA biogenesis, Pol V transcripton is assisted by the DDR complex (DRD1, DMS3, and RDM1) and DMS4 (6). AGO4 binds Pol V transcripts via base-pairing with the siRNA and is stabilized by AGO4 interacton with the NRPE1 carboxyl-terminal domain (CTD) and KTF1, which also binds RNA (7). IDN2 may stabilize Pol V transcript–siRNA pairing (8). The RDM1 protein of the DDR complex binds AGO4 and the de novo cytosine methyltransferase DRM2, bringing them to Pol V–transcribed regions (9). Histone modifcatons resultng from the RdDM pathway include the removal of actvatng marks (acetylaton) and the establishment of repressive marks (deacetylaton), facilitatng transcriptonal silencing (10).

See also Haag, J.R., and htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pikaard%20CS%22%5BAuthor%5D"Pikaard, C.S. 2011. Nature Reviews Molecular Cell Biology 12:483–492.

Regulacion de la transcripción por miRNA

Resumiendo

Elementos necesarios:

- DNA polimerasa - Oligonucleótdo (primer o cebador):

• 18-30 nucleótdos• complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar

- Mezcla de los 4 desoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) - Una pequeña cantdad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidos trifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*)

Secuenciacion del ADN

Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimátca (de la polimerización de DNA).

Frederick Sanger

Sanger F, Coulson AR (1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J. Mol. Biol. 94 (3): 441–8

Secuenciación del ADN

OHdNTP

Desoxi nucleótdo

Didesoxi nucleótdo(bloqueo de la síntesis de DNA)

Reacción de la polimerasa:

Enlace fosfodiéster entre 3’-OHde la cadena cebadora y P del dNTP (liberación de PPi).

Secuenciacion del ADN

Secuenciador automátco (detección por fuorescencia)- Usa 4 ddNTPs unidos a una molécula fuorescente (de diferente color para cada uno)- Una única reacción- Lectura: electroforesis en gel capilar, láser + detector fuorescencia (automatzado)

Reacción de polimerización en cadena = polymerase chain reaccion (PCR)

- Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado)- Múltiples copias (de una molécula templado 1 millon de copias)- DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol)- Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción)- dNTPs- Tampón (Mg2+, tampón) 30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg apareamiento, 40-60ºC, 30seg extensión, 72ºC, 30seg

ESPECIFICIDADVELOCIDAD SENSIBILIDAD CONTROLES!

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Generación de cDNA

Marcaje de sondas

Nick Translaton Marcaje terminal, Marcaje por PCR

Northern Blotng

Purifcación de RNA

RT-PCR

The reverse transcriptase-polymerase chain reacton (RT-PCR) technique for determining whether a partcular type of mRNA is present. First, the mRNA from a small sample is converted to double-stranded cDNA using the enzymes reverse transcriptase and RNase H. A primer is added to the cDNA and the s e c o n d s t ra n d i s c o m p l e t e d u s i n g thermostable DNA polymerase from T. aquatcus (Taq polymerase). This “target” DNA is then denatured and two sets of primers are added; the primers hybridize to opposite ends of the target sequence if the sequence is present. (This will happen only if the mRNA of interest was originally present.) When Taq polymerase is added to the denatured DNA, each strand synthesizes its complement.

Gen de expresión consttutva(control)

Genes problema

© 2005 Prentce Hall Inc. / A Pearson Educaton Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

statonary supportpolyT

mRNApolyA

tssue or cell

Librerías de cDNA

Paso 1, extracción de cDNA:

© 2005 Prentce Hall Inc. / A Pearson Educatoz Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Librerías de cDNA

Paso 2, generación de cDNA

Etapas necesarias:

-Purifcación del mRNA (opcional).-Eliminación del DNA contaminante (Dnasa).-Generación del cDNA (transcriptasa reversa) empleando oligo dT o “random hexamers”.-Eliminación de quimeras DNA/RNA (Rnasa H).-Síntesis de la segunda hebra del cDNA.-Digestón del cDNA con enzimas de baja frecuencia de corte (opcional).-Inactvación de enzimas y purifcación del cDNA.

E. Colibacteria

plasmid

© 2005 Prentce Hall Inc. / A Pearson Educatoz Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Librerías de cDNA

Paso 3, clonación del cDNA

Etapas necesarias:

-Inserción y ligación de los fragmentos de cDNA medianteel uso de un vector (plásmido) y la enzima DNA ligasa

¿Que realidades experimentales pueden darse en este paso?

Librerías de cDNA

Paso 3, clonación del cDNA

Etapas necesarias:

-Transformación bacteriana. En la actualidadse emplea uno de estos dos métodos:

1.Transformación química (ver esquema). Enfriar las células en presencia de Ca2+ peremeabiliza las membranas de E. coli para plásmidos de D N A . L as célu las son posteriormente inducidas a tomar ese DNA mediante un shock

2.Electroporación- se crean pequeños agujeros en las memebranas de las células, capaces de “comer” DNA plasmídico mediante un corto shock electrico (10-20kV/cm).

Librerías de cDNA

Paso 4, screening

El screening puede ser funcional, colorimétrico, o isotópico.

Radioactveprobe

selectedcolonies

membrane

hybridizaton

X-ray flm

Librerías de cDNA

Insert

Vector

Confrmación de inserción mediante digestón

cDNAlibrary

Clone 1 2 3 4 5

Librerías de cDNA

1.La secuenciación de los ESTs requiere disponer de colonias individualizadas. Los clones deberán ordenarse sistemátcamente.

2.Las colonias se ordenan, de forma habitual, en tubos o en placas de cultvo de 96 o 384 pocillos (aunqe existen placas más grandes y mas pequeñas).

3.Los plásmidos contenidos en cada colonia son extraídos y secuenciados.

Paso 5, secuenciación

Librerías de cDNA avanzadas: cDNA-AFLPs, Hibridación Sustractva Supresiva

Librerías de cDNA

Paso 6, análisis de la librería

… Esto lo veremos más adelante en las práctcas de tablero!!!

Basados en la hibridación ADN-ADN permite estudiar los niveles de expresión de las distntas secuencias presentes en el array. Se pueden utlizar para cuantfcar, pero solo un tpo de muestra puede resolverse de cada vez. Para multplexar es necesario stripear la membrana y re-hibridar. Son necesarios muchos controles, el error experimental es alto y su resolución es baja comparado con otros sistemas. No obstante pueden ser útles para ciertos screenings debido a su bajo costo.

Arrays de ADN, dot blot

En la membrana se encuentran las secuencias diana (“nuestros genes”) y sobre ella hibridaremos nuestros cDNAs problema que previamente han sido marcados (P32, Digoxigenina, etc.) empleando alguno de los metodos ya descritos.

PCR Cuanttatva (qPCR)

ADN moldePrimers

Taq polimerasadNTPsMgCl2

BuferFluorocromo

La PCR cuanttatva o en tempo real agrupa una metodología y un grupo de instrumentos que pueden considerarse la evolución natural de los sistemas de PCR. El sistema se divide en dos partes, un bloque térmico de alta precisión, equivalente al de los sistemas de PCR convencionales y un sistema para la deteccion de fuorescencia en cada pocillo, que nos permitrá cuantfcar de forma muy exacta la cantdad de DNA presente.

PCR en Tiempo Real PCR convencional

Amplifcación y detección de productos en una misma etapa.

Amplifcación y detección de productos en 2 etapas separadas.

Rango dinámico de detección amplio. Rango dinámico de detección estrecho.

Detección durante la fase exponencial temprana (máxima

efciencia de reacción).

Detección durante la fase exponencial.

Mayor sensibilidad. Menor sensibilidad.

Mayor especifcidad con el uso de sondas.

Menor especifcidad.

Requerimiento de equipamiento y reactvos muy costosos.

Requerimiento de equipamiento y reactvos de bajo costo.


PCR convencional

PCR en Tiempo Real

PCR Cuanttatva (qPCR) vs PCR convencional

Ventajas de la PCR en Tiempo RealSensibilidadCuantfcaciónMonitoreo de todo el procedimientoDisminución del riesgo de contaminaciónAutomatzaciónAmplicones pequeñosAmplio rango dinámicoTranscripción reversa

PCR Cuanttatva (qPCR) vs PCR convencional

ΔRn es la intensidad de emisión de fuorescencia y se calcula como la diferencia en la emisión de fuorescencia normalizada (Rn) de la muestra y de un control sin templado (control negatvo).

La longitud óptma del amplicón es <100 pb. Sin embargo, se amplifcan bien fragmentos de hasta 200 pb.

La concentración de ADN inicial está entre 1-100 ng.

En el caso del uso de sondas, estas deben tener un Tm 10ºC mayor que el de los primers..


Lámparas (de halógeno o cuarzo). Diodos emisores de luz (LEDs). Láseres.

Microarrays de ADN

Permiten comparar patrones de expresión entre dos estados celulares (p.ej. normal-enfermo, entre tpos celulares, entre diferentes fases del desarrollo…)

Superfcie con diferentes secuencias conocidas de DNA inmovilizadas (cada punto se corresponde con un determinado gen).

Microarray o microchip:

Microarrays de ADN

43

ReverseTranscription

Microarrays de ADN

Array de 2 colores:

Microarrays de ADN

Canal 1 Canal 2

Canal 2

Canal 1

Rango de Intensidades

0 Max

canal 1 canal 2

<1 ……….1 ………. >1

Microarrays de ADN

• Spotted (cDNA)– Transferencia de los productos de PCR mediante un robot a portas de vidrio

recucubiertos de poli-lisina.

• Sintéticas (oligo)– Síntesis directa de las sondas sobre el porta de vidrio.– Emplea fotolitografía (Affymetrix) o tecnología de impresión por chorro de

tinta (Agilent)– Hasta 100,000 sondas por cm2

– Las sondas pueden variar en longitud desde los 20 hasta los 150meros.

• Todas las configuraciones asumen que el DNA en el array es más abundante que el presente en la muestra a hibridar. En consecuencia las reacciones ocurren de manera lineal y la intensidad de un spot refleja su abundancia en la muestra original.

• El marcaje puede ser radiactivo, fluorescente (un color), o dos colores.

Clases de Microarrays de ADN

Secuenciación de genomas completos, principios básicos

Start with many copies of genome. Bacterial genome length: 5 million.

Find overlapping reads. ACGTAGAATCGACCATG...

...AACATAGTTGACGTAGAATC

Merge overlapping reads into contgs....AACATAGTTGACGTAGAATCGACCATG...

Fragment them and sequence reads at both ends. Read length: 35 to 1000 bp.

Contg Contg ContgGap Gap

Coverage at this locaton=2

Roche454-FLX

Applied BiosystemsSOLID

SolexaIllumina GA

Next Generaton Sequencing – Sistemas Óptcos (2ª Generación)

Roche454-FLX


SolexaIllumina GA

Next Generaton Sequencing – Sistemas Óptcos

A/B fragments selected using streptavidin-biotn purifcaton

Genome fragmented by

nebulizaton

sstDNA library created with

adaptors

Generación de la librería:1. Fragmentación de la muestra y unión de los adaptadores.

Next Generaton Sequencing 454-FLX Roche

Anneal sstDNA to an excess of DNA Capture

Beads

Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil

microreactors

Break microreactors,

enrich for DNA-positve beads

Clonal amplifcaton occurs inside microreactors

Generación de la librería:1. Fragmentación de la muestra y unión de los adaptadores.2. PCR en emulsión.


1.6 million wells per PTPWell diameter: average of 44 µmEach well is only able to accept a

single DNA bead.

DNA capture beads and enzyme beads deposited onto PicoTiterPlate (PTP)

Generación de la librería:1. Fragmentación de la muestra y unión de los adaptadores.2. PCR en emulsión. 3. Preparación de la placa de secuenciación.


Reacción de secuenciación - Pirosecuenciación:


Pirosecuenciación, procesamiento de datos:

1. Raw data is series of images

dNTP Base AdditionT

AG

CT 2. Each well’s data

extracted, quantified and normalized

3. Read data converted into “flowgrams”


Flowgram

Key sequence = TCAG for signal calibration

Flow Order

1-mer

2-mer

3-mer

4-merTACG

Pirosecuenciación, procesamiento de datos:

Errores: insercionesT T C T G C G A A


Key Concept454 Sequencing from individual DNA molecules

Library of single stranded DNA molecules

One DNA molecule per bead

Clonal amplification of that single molecule to ~10 million copies

Independent sequencing of each bead

One Bead = One Read = One DNA molecule


Roche454-FLX


SolexaIllumina GA

Next Generaton Sequencing SOLiD-Applied Biosystems


2. PCR en emulsión


Reacción de secuenciación – Secuenciación por ligación:



R

1-2B

16-17

G

21-22

R

11-12

Y

6-7

Y-probe5’

3’B-probe

5’

3’G-probe

5’

3’R-probe

5’

X Xn n n z z z

X X n n n z z z X X n n n z z z

X X n n n z z z


A C G TA

C

G

T

2nd Base

1st

Base

Red-probe5’

A T n n n z z z

3’

Blue-probe 5’

T T n n n z z z

3’




Errores: sustituciones


Roche454-FLX


SolexaIllumina GA

Next Generaton Sequencing Illumina-Solexa

Generación de la librería:1. Fragmentación de la muestra y unión de los adaptadores.2. PCR en puente.


Reacción de secuenciación –Terminadores reversibles:


Reacción de secuenciación –Terminadores reversibles:

Errores: sustituciones


Plataforma MétodoPreparación

muestra

Longitud de las

lecturas

Data per run

(Gbp)

454-FLX (Roche)

Pirosecuenciación PCR de emulsión 400 0.5

SOLiD (Applied Byosistem)

Ligación PCR de emulsión 50 10

Illumina (Solexa)

Terminadores reversibles

PCR en puente 150 15

Coste y análisis informático a tener en cuenta. ¡IMPORTANTE!


Next Generaton Sequencing (Tercera generación) – Ion Torrent

Secuenciación iónica (non-optical sequencing):

Secuenciación Iónica

Secuenciación iónica (non-optical sequencing):


5. Transcriptoma (análisis cualitativo y cuantitativo)

1. Secuenciación de novo (genomas completos, BACs, …)

2. Resecuenciación (genomas completos, regiones genómicas, reordenamientos, …)

3. Metagenómica (secuenciación completa de todos los organismos presentes en un ambiente)

4. Paleogenómica

6. Análisis de variabilidad genética (viral, bacteriana, humana, …). Presencia de SNP

7. Epigenética (metilación, modificaciones nucleosómicas)

8. Estudios de regulación génica a gran escala (sncRNAs, ChIP-sequencing)

Aplicaciones

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