1  

Stem Cell Imaging: Tips, Tricks & Best Practices  [0:00:20] Slide 1 Sean Sanders:  Hello and a warm welcome to this Science/AAAS webinar. My name 

is Sean Sanders and I'm the editor for custom publishing at Science.    In  today's  webinar,  we'll  be  talking  about  the  preparation  and 

imaging of  stem  cells.  The unique pluripotent nature of  stem  cells makes them of particular interest to researchers looking to treat and cure  a number of disorders,  including neurodegenerative diseases, heart disease, and spinal cord  injuries.  In order  to  investigate stem cell  function  in  vivo  and  in  vitro,  researchers  need  robust methodologies and accurate imaging capabilities. 

   In this webinar, our expert panel will focus on best practices for the 

manipulation and imaging of stem cells in the laboratory, and explain how  they have  successfully  applied  the  latest  imaging  solutions  to advance  our  understanding  of  stem  cells  and  their  application  in disease treatment. 

 Slide 2   I'm very pleased to welcome three very knowledgeable speakers for 

our webinar  today.  They  are Dr. Weibo Cai  from  the University of Wisconsin‐Madison  in Madison, Wisconsin, Dr. David Schaffer  from the  University  of  California  at  Berkeley,  and  finally  Dr.  Clemens Cabernard  from  the  Biozentrum  at  the  University  of  Basel  in Switzerland.  I very much appreciate all of you taking the time to be with us today. 

   Before we  get  started,  I have  some  important  information  for our 

audience. Please note that you can resize or hide any of the windows in your viewing console. The widgets at  the bottom of  the console control  what  you  see.  Click  on  these  to  see  the  speaker  bios, additional  information  about  technologies  related  to  today's discussion, or to download a PDF of the slides. 

   Each of our  speakers will  talk briefly about  their work. After which 

we will have a Q&A session during which our guests will address the questions submitted by our  live online viewers.  If you are watching us live, start thinking about some questions now and submit them at any  time  by  typing  them  into  the  box  on  the  bottom  left  of  your viewing console and clicking the submit button.  If you can't see the 

2  

box,  click  the  red Q&A widget at  the bottom of  the  screen. Please remember to keep your questions short and to the point as this will give them the best chance of being put to our panel. 

   You  can  also  log  in  to  Facebook,  Twitter,  or  LinkedIn  during  the 

webinar  to post updates or send  tweets about  the event,  just click the  relevant widgets at  the bottom of  the  screen.  For  tweets,  you can add the hash tag, #sciencewebinar. 

   Finally,  thank  you  to  Leica Microsystems  for  their  sponsorship  of 

today's webinar.    Now,  I'd  like to  introduce our first speaker for today and that  is Dr. 

Weibo Cai. Dr. Cai  is  currently  an Assistant  Professor  of  Radiology and Medical Physics at  the University of Wisconsin‐Madison School of Medicine  and Public Health. He  received his Ph.D.  in Chemistry from the University of California, San Diego and did his postdoctoral research at the Molecular Imaging Program at Stanford University. In 2008, Dr. Cai  joined the University of Wisconsin‐Madison where his research has focused on molecular imaging and nanotechnology. Dr. Cai  is  a  prolific  author  and  has  won  many  prestigious  awards, including  the  Society  of  Nuclear  Medicine  Young  Professionals Committee  Best  Basic  Science  Award  in  2007  and  the  European Association  of Nuclear Medicine  Springer  Prize  in  2011.  Dr.  Cai,  a warm welcome to you. 

 Slide 3 Dr. Weibo Cai:  Thank you, Sean, for the very kind  introduction. Welcome everyone 

to  this  Science  webinar  series.  Today,  I'm  going  to  give  a  brief overview about the techniques that we use to track stem cells in vivo while Dr. Schaffer and Dr. Cabernard will be more  focusing on  the cell‐based imaging studies. 

 Slide 4   So, the field of molecular imaging has really expanded tremendously 

over the first decade of this century and on this slide, you'll see some of  the major  techniques  that  people  use  for  imaging  applications, many  of  these  can  be  applied  to  stem  cells.  For  example,  the reporter gene  techniques or  the  imaging of  the metabolism where you can use this to  label cells and then track them  in vivo and I will give you a few examples about this a little bit later in the talk. 

 Slide 5 

3  

  In  terms of  imaging  techniques,  there are several different  imaging modalities and here are the six major imaging modalities that people use  for  in  vivo  imaging.  Many  of  these  have  the  corresponding clinical  imaging equipment and the  last decade has really witnessed very  tremendous  advancement  in  terms  of making  these  scanners for many more imaging studies. So, the six techniques include optical imaging, which includes fluorescence and bioluminescence, also MRI (Magnetic  Resonance  Imaging),  and  then  PET  (Positron  Emission Tomography),  SPECT  which  is  Single  Photon  Imaging  Computed Tomography, and ultrasound, and the CT. For ultrasound and the CT, they  are not  very  commonly used  for  stem  cell  tracking  in  vivo  so most of  it  is  focused on  the other  four  techniques namely optical, MRI, PET, and SPECT. 

 [0:05:09] Slide 6   So, this next slide shows some of the agents that have been used for 

tracking  cells  in  vivo.  For  fluorescence,  there  are  three  major categories of fluorophores. One  is the organic dye, the other one  is fluorescent  protein,  the most  famous  being  the  green  fluorescent protein  or  red  fluorescent  protein,  recently,  they  are  also [indiscernible]  fluorescent  protein,  and  nanoparticles  such  as quantum dots, which also are fluorescent. 

   For  bioluminescence  imaging,  they  are  typically  focused  on 

luciferases like firefly luciferase, renilla luciferase. For MRI, the major agents  used  include  iron  oxide  nanoparticles  or  some  gadolinium‐based chelates. 

 Slide 7   Those three techniques do not use any radioactivity at all and there 

are also a few agents that are radio‐labeled where you can use this for PET imaging or SPECT imaging. Here, I gave a few examples about some of the commonly used agents for labeling cells so that you can track  it with  SPECT or PET.  For  example,  indium‐111‐labeled oxine and technetium‐99m‐labeled HMPAO, which can be used for SPECT imaging. While for PET, FDG is one of the most commonly used agent for  clinical use  in oncology and  it has also been used  for  stem  cell imaging. 

 Slide 8   So, I'll give you just a few examples of each of these techniques, and 

this slide shows one of the earliest clinical studies on tracking cells in vivo  using  18F‐FDG  labeled  bone  marrow  cells.  In  A  and  B,  they 

4  

injected unselected bone marrow  cells, which means  the  stem  cell population is very low and it does not home to the heart as much as in  C  and  D where  they  preselect  some  of  the  cells  through  FACS analysis  using  CD34  as  a  stem  cell marker,  and  they  found  that  it indeed  goes  to  the  heart  at  much  higher  frequencies  than  the unselected cells. So this  is one of the earliest studies  in terms of  in vivo  imaging  in patients of  labeled stem cells and this used positron emission tomography as the imaging technique labeled with 18F‐FDG, which is a glucose analogue. 

 Slide 9   This slide shows a reporter‐gene based technique for tracking cells in 

vivo using a multimodality imaging and this is done in animal models. In this case, the reporter gene includes three different proteins. One is firefly  luciferase, which can be used for bioluminescence imaging. The other one  is  a  red  fluorescent protein, which  can be used  for FACS analysis and microscopy studies  to  isolate  the cells. And  then the TTK, which  is a  truncated  thymidine kinase, which  is a reporter gene for PET, for positron emission tomography, which can be used for long‐term monitoring of the stably transfected cells. In this case, they used RFP  to  select  the best  transfection method.  They  found that  lentiviral method  gives  the highest  transfection efficiency  and also is confirmed by microscopy studies. 

 Slide 10   So,  for  in  vivo  tracking,  the  top  shows  bioluminescence  imaging 

where they found that after injection of these cells into the heart of the rat, the signal goes up in for about four weeks showing that the cells are proliferating and  this was also confirmed via PET, which  is shown on the lower panel. The two imaging modalities match pretty well. 

 Slide 11   One extra  feature about  this  reporter gene  is  that  this TK  reporter 

gene  is also a suicide gene. So  if something goes wrong,… as we all know one of  the major  fears of pluripotent  stem  cells  is  that  they form teratomas, and in this case, the reporter is also a suicide gene. So  we  can  administer  a  certain  drug,  which  will  eliminate  the teratoma  as  shown here  in  the  left where most of  the  signals  are gone for both bioluminescence and PET on the left panel while in the right panel saline control shows that the teratoma keeps growing. 

 Slide 12 

5  

  So which is the best method to use for in vivo imaging? Here is a kind of very  short  summary about  the different  imaging  techniques and radiolabeling  includes both PET and SPECT or MRI typically  includes gadolinium  chelates  or  iron  oxide  nanoparticles.  Reporter  genes typically  include  either  single  modality  reporter  gene  or multimodality reporter gene. 

   In terms of biocompatibility, which  is also kind of the  least toxicity, 

radiolabeling  and  MRI  has  both  been  shown  to  be  pretty  safe. Reporter gene has not been extensively validated. 

[0:10:03]   In  terms  of  least  perturbation  to  the  biological  function, 

radiolabeling  and MRI  has  also  been  shown  to  be  very  safe while reporter gene  techniques  still need a  little bit more validation, but many studies have shown that  indeed reporter genes did not affect the biocompatibility of all the biological functions. 

   In  terms  of  anatomical  location,  this  depends  on  the  imaging 

techniques we are using. MRI can give a very high  resolution while the  radiolabeling with PET or  SPECT,  resolution  is  a  little bit  lower and reporter genes depending on which  techniques  they are using, you can get either high resolution or low resolution. 

   In  terms of  cell viability,  if you  label  the  cells with  radiolabeling or 

MRI,  you  don’t  really  know  whether  the  cells  are  alive  or  dead because all you are detecting is the actual signal of the label. For the reporter  gene  techniques,  you'll  know  for  sure  the  cells  are  alive because  if the cells are not alive, they're not expressing the protein then you cannot detect it. 

   In  terms of dilution  in  signal, when  the  cells divide,  those  that are 

radio‐labeled or MRI labeled will be diluted into daughter cells while the  reporter  genes  if  they  are  stably  transfected,  they  should  be quite stable for long term tracking. 

 Slide 13 to Slide 14   So,  these  techniques  can  apply  to  not  only  stem  cells  but  also 

tracking on T cells  if you're  interested.  It can also be used  to  track stem cells so that we can better understand stem cell biology. 

 Slide 15   Of  course,  one  of  the  hottest  topics  on  stem  cells  is  induced 

pluripotent  stem  cells, which were developed by  a  group  in Kyoto University  and  also  another  group  in  the University  of Wisconsin‐

6  

Madison. These  induced pluripotent  stem cells can also be  tracked long  term and  there's a  recent publication on  stem cell earlier  this year. They showed that you can use bioluminescence imaging where the cells were stably transfected with firefly luciferase and they were able  to monitor  the  long  term proliferation  in vivo as shown  in  the bottom panel of this slide. 

 Slide 16   So, to quickly summarize, the wide availability of these small animal 

imaging  systems  has  really made molecular  imaging  a  very  useful tool  for  stem  cell  research  as  well  as  several  other  biological disciplines.  In  terms of  the  techniques used  for  stem  cell  tracking, there are generally speaking four major techniques: Optical imaging, which  includes  fluorescence  and  bioluminescence, MRI where  the cells  are  labeled  with  magnetic  nanoparticles  or  magnetic compounds,  and  nuclear  imaging where  the  cells  are  labeled with radio‐labeled  agents,  and  reporter  gene  approach  which  can  be either  single  modality  of  one  of  the  abovementioned  three  or combinations of multiple imaging techniques. 

   Nuclear  imaging basically means PET and SPECT, and MRI  is useful 

for measuring  acute  deliveries.  You  can  see  exactly where  it  goes right after  injection, but  it cannot give you too much  information  in terms of the long‐term survival, proliferation, or differentiation. 

   The reporter gene approach  is most suitable for  long‐term tracking, 

but  it will need a  lot more validation before  it can eventually go to human  studies. But nonetheless,  some of  the  reporter  gene‐based imaging studies have been in patients, probably not in stem cells, but in some other disciplines so there is definitely a future for this. 

   In  terms  of  imaging  techniques,  the  different  imaging  techniques 

they are  complementary. They  can allow  for  cross validation. They are more complementary rather than competitive. 

 Slide 17   So, if you're interested in more details, I'll give you a few examples of 

review  articles.  The  first  three  were  written  by  us  over  the  last couple of years and the  last one was a short review comparing the imaging  techniques  for  tracking of  stem  cell  therapy  in  cardiology, which was written by a group at Stanford University. 

   So with that, I'd like to stop here and pass it on to Dr. David Schaffer 

who is the next speaker. 

7  

 Sean Sanders:  Great. Thank you very much, Dr. Cai, excellent presentation.  Just a 

reminder  to  the audience,  if you'd  like  to download  the slides, you can just click on the green resource web page icon and there's a link there  to  download  the  slides  if  you want  to  take  a  look  at  those resources once again. 

 Slide 18   Now, we're going to move on to our second speaker for today, that's 

Dr.  David  Schaffer.  Dr.  Schaffer  is  a  professor  of  Chemical  and Biomolecular  Engineering,  Bioengineering,  and  Neuroscience  at University  of  California  Berkeley,  where  he  also  serves  as  the director  of  the  Berkeley  Stem  Cell  Center.  He  graduated  from Stanford University with a Bachelor's degree in chemical engineering in  1993.  Afterwards,  he  attended  the  Massachusetts  Institute  of Technology  and  earned  his  Ph.D.  also  in  chemical  engineering  in 1998.  Finally, he did a postdoctoral  fellowship at  the  Salk  Institute for  Biological  Studies  in  La  Jolla,  California  before  moving  to  UC Berkeley  in  1999.  At  Berkeley,  Dr.  Schaffer  applies  engineering principles  to  enhance  stem  cell  and  gene  therapy  approaches  for neuroregeneration, work that includes developing new technologies to enable mechanistic investigation of stem cell control. Dr. Schaffer has received numerous awards during his career including a National Science  Foundation  CAREER  Award,  a Whitaker  Foundation  Young Investigator Award, and he was also named Technology Review Top 100 Innovator. A very warm welcome to you, Dr. Schaffer, thanks for being here. 

 [0:15:32] Dr. David Schaffer:  Thank you very much. I'm very happy to be a part of this panel. So, 

our group  is very  interested  in developing and utilizing technologies to image cells and specifically stem cells at the single cell level. 

 Slide 19 to slide 20   As stem cell  researchers know, a major motivation  for doing  this  is 

that stem cells exhibit sometimes random or stochastic behavior. So specifically,  you  can  take  a  field  of  isogenic  cells,  apply what  you think  is  the uniform  signal  to  that population  of  cells,  and  end up getting  a  very  broad  distribution  of  outcomes  from  the  cell behaviors.  So, we  need  to  or  are  interested  in  imaging  or  getting information at the single cell level. 

   In  addition,  the  stem  cell  niche  present  cells  with  a  lot  of  rich 

information  both  biochemical  in  nature  as  well  as  biophysical  or 

8  

mechanical  sometimes  in nature  and we're  interested  therefore  in gathering  a  broad  range  of  information  from  cells,  in  other words using different imaging modalities to gather information. 

   So,  we  work  with  three  different  technologies  and  I'll mirror  the 

comments  of Weibo  in  saying  that  these  are  very  complementary approaches  to  gain  or  interrogate  different  types  of  information from  the  cell.  So  specifically,  single  cell  fluorescent  imaging  in  real time,  single  cell  biophysical measurements  in  real  time,  and  then moving at least towards single cell measurements in vivo. 

 Slide 21   So,  in order  to be able  to  image a  cell  in a  fluorescent mode,  you 

obviously need  to  introduce a  sensor  such as a genetic  fluorescent reporter  into  the  cell. Often,  the way  that  this  is done  is  that one takes out regulatory information from the inside of a cell, let's say a promoter  that  one whose  activity  one would  like  to monitor,  and then  puts  on  top  of  that  a  fluorescent  protein,  for  example  or luciferase, and  then  in  some cases, we'll  truncate  that promoter  in order  to  be  able  to  make  it  fit  into  a  delivery  vehicle  then reintroduce  this  in  the  cells. As a  result of  this  reintroduction, you lose  some  control  over  the  localization  inside  the  genome  and furthermore  they  are  often  many  copies  that  integrate  into  the genome, sometimes concatemeric, sometimes a different loci. 

   So,  this  technology  provides  somewhat  poor  control  over  copy 

number,  therefore,  expression  level.  If  one  is  actually  tagging fluorescent protein, losing control over the expression level can have some  deleterious  effect  on  the  outcome  of  the  experiment. Furthermore,  these  randomly  integrated  constructs  don’t  really report on the chromatin environment of the endogenous gene. 

   So,  another  approach  that's  been  utilized  over  the  past  several 

decades  is  to  take  a  piece  of  genetic  information  such  as  a fluorescence or reporter and knock it into the genome and tag it on to  a  gene whose  activity one would  like  to monitor.  This provides higher  fidelity  reporting of endogenous protein  levels, perhaps  less disruptive to cell as a result, and furthermore maintains information about the chromatin environment of the gene that one would like to study.  But  one  problem  of  course  encountered within  this  field  is that mammalian gene targeting and for example, stem cell targeting is still quite inefficient compared to other organisms such as yeast. 

 Slide 22 

9  

  So it was discovered a number of years ago or several years ago that one  can  utilize  a  virus  to mediate  homologous  recombination  or editing  of  an  endogenous  locus  with  very  high  efficiency.  So, specifically  adeno‐associated  virus  because  of  the  form  of  its genome mediates  gene  targeting or homologous  recombination  at rates  that  are  of  the  order  103  to  104  more  efficiently  than  the corresponding plasmid. This can be utilized to  introduce sensors, to knock out genes, introduce mutations or in the long term, one could think  about  this  even  therapeutically  for  correcting  a  patient's genome at the stem cell. 

 Slide 23   However, AAV is notoriously bad at mediating gene delivery to many 

different cell types that's shown here on this slide where regardless of  whether  you're  talking  about  an  ES,  a  neural  stem  cells,  or  a murine  ES  cell.  Unfortunately,  this  data  indicate  that  AAV  is  very poor  at  carrying  its  genome  inside  the  cells  and  therefore  cannot mediate homologous recombination very efficiently. 

 Slide 24   So, our group over the past eight years or so has been utilizing a high 

throughput  protein  engineering  technique  or  technology,  directed evolution  technology,  to  adapt  AAV  and  engineer  it  for  high efficiency gene delivery to a number of different stem cell types. As a result of getting more copies of the genome  into the nucleus of the stem  cell,  you  can  then  mediate  homologous  recombination  and knock  in  the  fluorescent proteins at a much higher  rate. So  shown here with using  this  gene  targeting  construct, we're now  targeting neural  stem cells at a  rate of about 0.15% whereas  I believe  there was no previous published  report of any gene  targeting within  the neural stem cell using a plasmid. 

 [0:20:02] Slide 25   This  can  also  be  applied more  recently  to  human  embryonic  stem 

cells  and  human  IPS  cells where  a  plasmid  construct  typically  gets gene targeting efficiency of 1 in 1M to 1 in 10M cells and we're now achieving gene targeting rates on the order of 0.1%. 

   In  addition,  it's  been  reported  that  you  can  use  a  nuclease  to  cut 

specific  sites within  a  genome  such  as  in hESC  and  achieve higher efficiencies. However, this AAV approach doesn't require creating a brand new genome or creating a brand new nucleus. As a result of this, we're  not  knocking  in  fluorescent  proteins  into  a  number  of 

10  

genes  inside a stem cell so that we can study the process of neural differentiation across a colony  for example  in  real  time and  shown here is an image for OC4. 

 Slide 26   So  in  addition  to  using  these  sensors  as  ways  to  probe  the 

biochemical cues that the stem cell is receiving, we're also interested in gathering information about biophysical cues. 

 Slide 27   So, cells that's known in tissues inside the body exhibit a broad range 

of mechanical properties. So for example, our bodies reside typically in mechanical ranges on the order of 102 to 106 units of stiffness, this Pascal  unit.  However,  when  we  culture  cells  on  glass  or  plastic, you're often taking them out of this soft gel tissue environment and placing  them  on  a  rock‐hard  surface  that  can  be millions  of  folds stiffer in its properties. 

 Slide 28   So,  we've  been  studying  the  effects  of mechanical  properties  on 

stem cell differentiation and in this case, we're studying neural stem cells, which are shown here in this tissue slice in blue. 

 Slide 29 to slide 30   We  can place  these  cells  in  culture on  top of  surfaces of different 

stiffness and if you quantify these effects, you see that stem cells on a  stiff  gel,  on  a  stiff  surface  are  predisposed  or  biased  strongly towards  differentiating  into  a  glial  lineage whereas  on  a  very  soft surface, they're very strongly biased to differentiating into a neuron. So all the biochemistry in this case is identical and all that's changing is the mechanical properties of the environments in which the cell is living. 

 Slide 31   So  we're  extremely  interested  therefore  in  gathering  information 

that's  not  just  biochemical  in  nature  but  also  biophysical  or mechanical  in  nature.  So,  we've  been  using  an  imaging modality referred to as atomic force microscopy. This is an outdated analogy, but you can kind of think of it as a record player where you take the needle  and  tap  into  the  cell  and by  getting  information  about  the force and the displacement of that tapping, you can image or raster across  the  cell and you  can also get mechanical  information about the cells. 

 

11  

Slide 32   So for example, and this  is a real‐time dataset that can be gathered 

on  live cells  in culture  in a nondestructive way, you can both  image the  cells  using  AFM  as  well  get  information  about  how  their mechanical  properties  or  stiffness  adapts  to  that  of  their environment. 

 Slide 33   In  addition,  you  can  use  again  fluorescence microscopy  to  gather 

information about  the biophysical properties of a  cell. This  is work done by Sanjay Kumar a collaborator at UC Berkeley where he has used  laser  ablation of  cytoskeletal  elements  inside of  a  cell where you can actually use an  infrared  laser  to punch a hole out  into  the middle of a cytoskeletal element and then  image  in real time using visible  fluorescence  microscopy,  the  retraction  of  an  actin microfilament.  This  data  can  be  used  to  gather  high  resolution information  about  the  mechanical  properties  of  a  cytoskeletal network as well as the cytosol inside of a cell. 

 Slide 34 to Slide 35   So  finally,  I'm  going  to  talk  about  another  imaging modality  that's 

been  developed  at  Berkeley  and  we're  collaborating  with  the developer  of  this,  Professor  Steve  Conolly  in  our  bioengineering department. This is a modality called magnetic particle imaging. This is a very different technology from MRI. The way that it works is that a magnetic  field  is  applied  to  a  sample  in  such  a way  that  a  small magnetic particle such as a similar type of particle that's sometimes used  in MRI  is scanned across  the magnetic  field.  It  reaches a zero field point where at that stage, the properties or the magnetization of that small particle flips from one direction to another. That can be sensed  in  an  inductive way  and  as  a  result  of  that  flipping  of  the magnetic field of a sensor or a particle; you get a signal that can be imaged. 

   The  advantages of  this modality  are  that unlike  sometimes optical 

imaging,  the  body  is  completely  transparent  to magnetic  fields  so you  can  image  very,  very  deep  into  tissue.  In  addition,  it  has  the potential  to  be  up  to  three  orders  of  magnitude  more  sensitive compared to MRI and therefore you could begin to get down to very small numbers of cells. 

 Slide 36   So  this  can  be  used  initially  for  example  angiography  applications 

where you can  image an entire organism soon or very shortly after 

12  

injection or introduction of these particles into the organism. Shown here  is  a  3D  reconstruction  of  a  mouse.  Finally,  we've  been collaborating with Steve Conolly to be able to apply this towards,  in this case, human embryonic stem cells. 

 Slide 37   We're now down to the stage where we can detect 5000 cells within 

a tissue sample and both for technical as well as theoretical reasons; we  think we  can  push  that  down  by  several  orders  of magnitude further so that we can get towards single cell imaging in vivo. 

[0:25:14] Slide 38   So with  that,  I'd  like  to  thank  the people who  really did  this work, 

both  our  collaborators  Steve  Conolly  and  Sanjay  Kumar  as well  as other investigators within our lab. So thank you very much. 

 Slide 39 Sean Sanders:  Great.  Thank  you  so much, Dr.  Schaffer. Our  final  speaker  for  this 

webinar  is  Dr.  Clemens  Cabernard.  Dr.  Cabernard  completed  his undergraduate  and  graduate  degrees  at  the  Biozentrum  at  the University  of  Basel  in  Switzerland,  after  which  he  undertook postdoctoral  training  at  the  Institutes  of  Molecular  Biology  and Neuroscience  in Eugene, Oregon  in the US. He then returned to the Biozentrum  and  he  currently  holds  a  Swiss  National  Science Foundation  professorship  in  Growth  and  Development  and Neurobiology.  Dr.  Cabernard’s  research  uses  advanced  imaging techniques to visualize asymmetric stem cell division, particularly  in Drosophila neuroblasts. Welcome to you, Dr. Cabernard. 

 Dr. Clemens Cabernard:  Thank you very much, Sean. It's a pleasure to be here.  Slide 40   So, during the remainder of this webinar, I will be talking about  live 

imaging  in Drosophila melanogaster brains and particularly, we are interested  in asymmetric cell division of neural stem cells of the  fly also called neuroblasts. 

 Slide 41   This  image  sequence  nicely  illustrates  we  can  see  that  these 

neuroblasts are highly polarized cells along the  internal apical‐basal axis and this then results in the complete segregation of these green cell fate determinants into the small differentiating ganglion mother cell,  but  at  the  same  time  also  forming  a  self‐renewed  apical neuroblast, which is also different in size. 

13  

 Slide 42   So, we  are  usually  imaging  these  neuroblasts  in  third  instar  larval 

brain depicted with these dark blue spheres in one or the other brain lobe.  These  neuroblasts  are  really  closely  located  to  the  brain surface, which makes them ideally suited for imaging in general and live imaging in particular. 

   Here,  this  overview  movie  shows  four  pseudo  colored  mitotic 

neuroblasts and since these are fly cells, not only can we easily label subcellular  structures  such  as  the mitotic  spindles, but  can  also of course employ all the genetic tools to manipulate these cells at our will. 

 Slide 43   So  in order  to  live  image  these neuroblasts, we are using a  special 

setup  depicted  in  this  slide  here.  Essentially,  it's  consisting  of  this metal base, which was originally published in '94 by Dan Kiehart. This metal base  is also taking advantage of a metal split ring, which can then be adapted or assembled  in a particular way and that's shown on the next slide here. 

 Slide 44   Essentially what we're using is a gas permeable membrane on which 

our  specimens  are  sitting. We  then  attach  this membrane  to  this metal base and cover the entire setup with a coverslip and seal it off with Vaseline. 

 Slide 45   In  terms  of  imaging mode,  if  this  setup  is  used  to  image with  an 

upright microscope as most of us probably have at our disposal, the specimen  is  sitting  in  a  small  chamber  with  the  gas  permeable membrane  on  the  bottom  and  a  coverslip  on  the  top.  This  really enables  the  neuroblast  to  be  very  close  to  the  objective  and therefore provides very high optical resolution. 

 Slide 46   However, we can also use  the  same  imaging  setup  to  image on an 

inverted microscope by just flipping this imaging chamber around.  Slide 47   In  terms of  instrumentation, we have originally started using single 

point confocal microscopes, which as you probably all know, provide good  optical  resolution.  They  have  as  an  advantage  an  electronic 

14  

zoom option  as well  as  adjustable emission  filters.  In  addition, we can  have  several  laser  lines,  which  allow  us  to  image  several different  fluorophores.  The  only  real  disadvantage  to  single  point confocal microscopes  is probably  the  fact  that  acquisition mode  is relatively slow. 

 Slide 48   In  the  last couple of years, we have  therefore been using spinning‐

disk microscopes, which  similar  to  single point  confocals  also have good optic resolution, provide several laser lines, have in contrast to single point confocal very fast acquisition mode, and also deploy low phototoxicity  on  the  specimen.  The  only  disadvantage  in  this particular case with this microscope  is probably no electronic zoom can be applied and emission filters are fixed, which somehow takes away some of the flexibility. 

 Slide 49   So in this slide, we see some of the probes we can use in Drosophila 

in general and neuroblast in particular to image and label subcellular structures  such  as  the  DNA,  the  mitotic  spindle.  We  can  label microtubule + ends, centrosomes, but also  furrow markers  such as myosin  is  used,  and  then  last  but  not  least, we  also  have  polarity markers to distinguish between apical and basal cortex. 

   Traditionally, most of these constructs were tagged with GFP based 

on  its  inherent  stability and also  relative brightness, but nowadays with the advantage of new fluorescent proteins of course novel tags also employed and Cherry is just one example of this whole cascade. 

 [0:30:36]   So, I also would like to point out, as Dave already mentioned, it's of 

course important how do you deliver these probes into the cell or at least  how  you  express  those.  In  Drosophila,  we  have  several possibilities  to  do  this.  On  one  hand,  we  can  use  endogenous promoter  and  enhancer  elements  to  drive  expression  of  these reporter  constructs  and  this  can  be  done  by  BAC‐mediated recombineering or even homologous recombination. 

   In addition, we also have binary expression system called the GAL4‐

UAS system, which allows us to express these constructs in a tissue‐specific  manner  also  in  a  cell  type  specific  manner;  however, proteins might not be expressed at physiological levels. 

 Slide 50 

15  

  So  here  in  this  slide,  I'd  like  to  show  you  two  examples  of asymmetrically dividing neuroblasts.  In  this  particular example, we see a third  instar  larval brain neuroblast  image with a spinning‐disk microscope. In green, we see Par3 tagged with GFP localizing to the apical cortex and the mitotic spindle is also outlined in white. I hope that we can appreciate from these  images here that using spinning‐disk microscopy; we  can  achieve  good  optic  resolution  as well  as high temporal and spatial resolution. 

 Slide 51   On my next slide, we will see another example of an asymmetrically 

dividing third instar larval neuroblast in this case labeled with myosin in green as well as microtubule binding protein  in white  to outline the mitotic spindle. Also here, we can appreciate how dynamic this marker  as  we  localize  and  therefore  live  imaging  is  really  an important and very precise tool to visualize the very dynamic process asymmetric cell division in stem cells. 

 Slide 52   So, to wrap this up, I'd like to provide three conclusions. As a general 

statement,  I would  like  to  say  that  live  imaging  really  provides  an ideal tool to elucidate the basic cellular and molecular mechanism of asymmetric cell division. One of the tricks I learned or one of the tips I learned over the course of my imaging studies was that minimizing laser power  and exposure  time  to  laser  is  really  key  for  successful imaging especially for long term stem cell imaging. 

   I  would  also  like  to  point  out  that  in  our  case  at  least  using  a 

mounting  setup, which  allows  exchange  of  gases,  is  really  a  great advantage and maintains the viability of these cells over a long, long time. 

   Again, as mentioned earlier, one of the best practices I can mention 

is  that  whenever  possible,  the  use  of  endogenous  regulatory elements  to  drive  reporter  construct  should  be  considered.  This really will  allow  it  to  express  these  proteins  on  their  physiological levels. 

Slide 53   With  this  last  slide,  I'd  like  to acknowledge  some of my  former  lab 

mates,  Karsten  as  well  as  Sarah, which  really  pioneered  some  of these  live  imaging studies and also taught me a great deal about  it. I'd  like  to  acknowledge my  financial  support.  Currently, my  lab  is mostly  funded by  the Swiss National Science Foundation.  I'd  like  to thank  my  host  the  Biozentrum  from  the  University  of  Basel  for 

16  

providing a great work environment. Thank you very much and  I'm looking forward to questions. 

 Sean Sanders:  Great. Thanks so much, Dr. Cabernard, and many thanks to all of our 

speakers  for  their  fantastic  and  very  informative  presentations. We're  going  to move  now  to  questions  submitted  by  our  online viewers. 

 Slide 54   Just  a  quick  reminder  to  those watching  us  live  that  you  can  still 

submit your questions by typing them  into the text box and clicking the submit button. If you don't see this box on your screen, just click the red Q&A icon and it should appear. 

   Also a reminder, you can download the slides, just click on the green 

widgets with the  folder  icon at the bottom of your screen and that should  give  you  a  link  to  download  the  slides. Also,  if  you missed some of  those movies,  this webinar will be made available  to view again  as  an  on‐demand  video  usually within  about  48  hours  from now so you can re‐watch those excellent movies, very interesting. 

   So,  I'm going to move on to our first question for today and  I think 

this  is  probably  going  to  be  best  suited  to  Dr.  Cabernard  and  Dr. Schaffer. This person asks, could the speakers briefly discuss one of the most difficult sample preparations that they've had to deal with in  their  research  and  describe  the  solution  that  they've  found  for that issue? So let's start with Dr. Schaffer. 

 [0:35:24] Dr. David Schaffer:  Sure.  I'll  describe  it  not  necessarily  from  the  imaging  itself  but 

actually  the preparation of  the  cells beforehand, before  they were imaged. I think the field recognizes probably as a whole that the best way to prepare a cell for fluorescent imaging with a genetic sensor is to actually have that genetic sensor reporting on the activity of the endogenous protein  specifically  knocking  that  sensor  into different genes within  the  cell  that  one would  like  to  study.  So,  that's  very difficult  to  do  and  that's  probably  the  reason  that we  invested  a significant  amount  of  effort  to  develop  technologies  that  can mediate very high efficiency gene targeting. So  I described some of that within our talk and we're now enjoying the fruits of that  initial investment of effort. 

 Sean Sanders:  Dr. Cabernard?  

17  

Slide 45 Dr. Clemens Cabernard:  Well, from my point of view, I would like to point out that I guess in 

order to get high quality  images,  it's really  important that the setup is optimized.  I think  I can speak from experience,  I had to  learn the hard way that  in our case, there's really  involves a  lot of dissecting. So in order to get from the actual specimen to the image, a number of  dissecting  steps  have  to  be  performed.  Once  these  brains  are actually  dissected  and  mounted  on  an  imaging  slide,  our  next difficulty  is  then  to  really  provide  or  at  least  ensure  that  these neuroblasts are  in very close proximity  to  the objective. This  really requires  a  lot  of  practice  and manually  requires  that  some  of  the imaging  solution  where  these  specimens  are  sitting  in  is  being removed.  So  again,  that  really  is  something,  which  has  to  be practiced and cannot just be learned from one day to another. 

   In  addition,  I'd  like  to point out  another difficulty we encountered 

during live imaging is that for every probe or every reporter we use, usually  the settings have  to be adjusted on  the microscope. This  is again a trial and error phase, which can lead to some frustration, but of  course  it  has  to  be  practiced  and  it  has  to  be  done  for  every specimen, which takes some time. 

 Sean Sanders:  A  question  for  you,  Dr.  Cai.  In  terms  of  researching  stem  cells  in 

neurological  imaging studies, would the MRI be more efficient than radiolabeling methods to show the different receptors? 

 Dr. Weibo Cai:  Well,  this  I  guess  it  depends  on  what  question  you  are  asking 

because MRI does  give  you a much higher  resolution and  typically you  can  go  to  probably  100‐micron  resolution while  labeling with radioactive agents might typically will give you a resolution of a few millimeters. So, I think  in that case, nuclear radioactive agent based imaging  probably  will  not  give  you  a  very  good  biological information. It can probably only tell you where it's going. 

   I'm not sure whether I got the question about the receptors because 

in this case, direct labeling is probably not the way to go. I think it's probably  going  to  be  some  kind  of  conditional  promoters  type  of reporter  gene  based  approach.  So,  I  think MRI  is  probably more accessible  and  while  PET  or  SPECT  does  require  a  lot  of infrastructure. Like you'll need to have the tracer, you need to have people, you need  to collaborate with a  radio chemist  to synthesize the  tracer,  you  also  need  to  have  the  kind  of  license  to  handle radioactive materials  so  it's  a  lot more  complicated  than  imaging with MRI or with optical techniques. 

18  

 Sean Sanders:  Okay. Excellent. So a question for Dr. Schaffer now that just came in. 

Could  you  talk  a  little  bit  more  about  you  mentioned  mixed differentiation  conditions  and  the  viewer  is  asking  for  a  little  bit more detail on that. 

 Dr. David Schaffer:  Sure.  In  this  case,  we  were  really  interested  in  seeing  how 

mechanical  properties  or  biophysical  properties  at  the microenvironment could  tip  the balance one way or another when the cell is faced with the choice of a 50/50 decision about whether to go down one lineage or another. So we've studied this in the context of human embryonic stem cells more recently, but the data I showed there were  for adult neural stem cells, stem cells  isolated  from the adult  hippocampus  of  the mammalian  brain.  The  cells were  given biochemical  cues  that  led  them  to  flip  a  coin  and  decide whether they wanted to go down a neuronal lineage or a glial lineage. Under those  identical biochemical  conditions,  it  turns out  the mechanical properties  the  environments  could  almost  completely  tip  the balance one way versus the other. 

 [0:40:10] Sean Sanders:  Another quick question  for  you, Dr.  Schaffer,  a  technical question, 

would  you  recommend  coating  glass  bottom  dishes  for  stem  cell imaging?  

 Dr. David Schaffer:  Yes. The stem cells that we utilized, we primarily utilized neural stem 

cells,  human  induced  pluripotents,  and  human  embryonic,  all  of those require a coating on the surface on the substrate  in order to attach  to  the  surfaces  and  be  grown  either  as  colonies  or  as monolayers. So  for  the neural stem cells, we  typically used  laminin and something  like poly‐ornithine or poly‐lysine and  for the human embryonic  stem  cells,  the  field  is  probably  converged  on  the standard of using, if you're not using a feeder layer, using a Matrigel coating  on  the  surface.  There  are  an  increasing  number  of  fully synthetic surfaces that are composed either of a polymer with good properties  or with  one  or more  defined  peptides  that  can  engage with  specific  adhesion  receptors  on  the  cell  surface. At  this  stage, these  are  more  at  the  research  level  and  had  not  been  mass produced  to  the point where  they could be adapted as a  standard across the field yet though. 

 Sean Sanders:  Now, do you find that in dishes that stem cells are motile or mobile 

or not?  

19  

Dr. David Schaffer:  So neural stem cells, the ones that we work with are highly motile. So  on  the  stiff  surfaces,  the mechanically  stiff  substrates  that we utilize,  the  cells  are  highly migratory. As  you move  towards  softer substrates, the cells tend to be a bit more stationary. For the human embryonic stem cells,  I kind of  liken  them  to a rugby scrum almost where there's a  large mass of cells aggregating together  in a colony and we  haven't  really  seen  too much motility  of  the  colony  as  a whole,  but  certainly  when  cells  on  the  periphery  of  that  colony begins to differentiate, they migrate away. 

 Sean Sanders:  Dr. Cabernard, do you have any input on that?  Dr. Clemens Cabernard:  Well in terms of motility?  Sean Sanders:  Yeah.  Dr. Clemens Cabernard:  We have not  seen neuroblasts  to move  around either  in  an  intact 

organ  or  in  culture. What  I  have  to  say  though  of  course  is  these neuroblasts  are non‐adherent  cells,  if  you  just put  them  in  a Petri dish, they will move around. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Clemens Cabernard:  So if somebody wants to image in a different setup, it's advisable to 

use a certain coating such as a laminin surface to have them stick to the slide to a certain degree. 

 Sean Sanders:  Great. Dr. Cai,  you mentioned  that magnetic  resonance  imaging  is 

useful  for measuring  the  efficiency  of  acute delivery. Can  you  talk about  the  temporal  limitations  of  these methods,  in  other words how fast images can be obtained? 

 Dr. Weibo Cai:  Well, in this case for MRI, typically you could get a scan done within 

a  few  minutes,  for  nuclear  medicine  techniques  it's  also  a  few minutes so on order of minutes. 

 Sean Sanders:  Okay. Great. Another question for you, sorry, hold on one second,  I 

have  it  right  here.  How  do  you  test  the  biocompatibility  of  the chemical cell tags that you use? 

 Dr. Weibo Cai:  Well in this case then, typically people can just look at the expression 

of  the  stem  cell  markers,  you  know,  the  various  markers.  Some people also go even  further and  look at, you know, microarray and also look at the gene expression patterns and compare whether you 

20  

see any differences. Many studies have shown that there's really not a big difference in terms of, you know, before and after labeling and of  course  that  has  to  be  studied  very  rigorously  on  case‐by‐case basis. 

 Sean Sanders:  Dr.  Cabernard,  for  your  experiments,  what  is  the maximum  time 

duration of time‐lapse imaging?  Dr. Clemens Cabernard:  Well, that's a good question. I think the longest we ever imaged was 

about  20  to  24  hours  with  of  course  lower  time  resolution,  but technically it's possible. 

 Sean Sanders:  Okay. Back to you, Dr. Schaffer. Have you considered using ethidium 

bromide histology microscope  slides and UV  light with UV blocking lenses? 

 Dr. David Schaffer:  Ethidium bromide to be able to visualize the nucleus in real time?  Sean Sanders:  I believe so, yeah.  Dr. David Schaffer:  Well ethidium bromide is of course a DNA intercalator and things like 

Hoechst and ethidium bromide. Hoechst is a permeate to live cells so you  can  visualize  live  cells  with  Hoechst.  But  even  so,  since  it interacts with  the DNA,  it  can perturb  the  function of  the  cell and chromatin mediated  biology.  So  rather  than  imaging  the  nucleus using a chemical dye, the field as a whole and we've done this to a small  extent,  has  been  genetically  labeling  nuclei  and  DNA  by  for example fusing a histone to a fluorescent protein. So that is probably the  approach  I would  tend  to  adapt more  so  than  a  chemical dye that could interact with DNA. 

 [0:45:13] Sean Sanders:  I'm going to stay with you for a second. A question that just came in 

that  comes  back  to  something  you were  talking  about  just  a  few minutes ago, do you think your findings on the influence of stress on these cells could possibly explain or help explain differences in stem cell adaption to suspension versus surface growth? 

 Dr. David Schaffer:  Yes,  I  do.  I  think  it  can.  So  in  the  case  of  a  neural  stem  cell  for 

example  the  brain  is  a  couple  of  hundred  of  these  Pascal  units  in stiffness, although there  is heterogeneity, there's stiffness gradients within the brain. The brain  it turns out changes stiffness within age as well. So, when you take a stem cell out of the brain and put it on top  of  a  dish,  it's  about  a  hundred  million‐fold  increase  in  the 

21  

stiffness of  the environment  that  the  cell  is experiencing, and  that pretty dramatic change  in  the  stiffness does affect a variety of cell behaviors, anything from adhesion and motility through, our results are  indicating,  a  differentiation.  So  if  you  have  a  cell  in  a neurosphere or an embryoid body compared  to being adherent on to  a  dish,  it's  going  to  experience  a  very  different  mechanical property. 

   So  there  are  certainly  other  biochemical  differences  between 

adhered cells versus a ball of cells since cells of course in the interior of  an  EB  or  a  neurosphere  would  experience  a  very  different environment  for  those  on  the  exterior.  But  certainly  mechanical differences are very significant between adherent versus suspension cultures. 

 Sean Sanders:  So, Dr. Cai,  I  think  this question might be best directed at you, but 

I'm  happy  for  the  others  to  answer  as well.  This  viewer  says  that they're trying to monitor the dynamic protein modification state of a specific  transcription  factor during stem cell differentiation. Do you have  some  suggestions or  tips on  some  things  they might need  to consider when they're doing this? 

 Dr. Weibo Cai:  Yeah.  I was  looking at  this question and  I  think probably David and 

Clemens  will  have  a  better  answer  to  this.  I  think  this  one  is definitely in need of some kind of reporter gene techniques in a way of  specifically  putting  that  gene,  you  know,  on  the  specific transcription factor to do longitudinal imaging? 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Weibo Cai:  Dave, do you have any comments on this?  Dr. David Schaffer:  Sure.  I mean we're sort of the proponents again of knocking‐in  into 

endogenous  loci so that you ‐‐  it's been shown of course that some promoter enhancer elements that regulate the expression of a given gene can be  tens of KB away  from  the  transcriptional  start  site  for that  gene.  So  the  only  way  that  one  can  really  replicate  and reproduce  that  regulation  is  by  inserting  a  sensor  into  the  actual endogenous site of the gene. So that's the approach that we would like to take. 

 Sean Sanders:  Dr. Cabernard, anything to add?  

22  

Dr. Clemens Cabernard:  Yes.  So,  I  was  thinking  about  this  question  too  and  I  thought  if somebody  is  known,  you  know,  if  something  is  known  about  the changes of modification state of that transcription factor, one could of course try to design a FRET probe, which would take into account any  confirmation  changes  this  transcription  factor  undergoes.  So that would  then,  I guess, be  the best way  to visualize and even  to image  the dynamics of  these  transcriptional or  the  changes within this transcription factor. 

 Sean Sanders:  I have another question for you, Dr. Cabernard. I know you've been 

working mostly on the Drosophila brain, but maybe you can give this viewer some  tips. They're asking about  releasing,  finding a method to  release  more  insect  stem  cells  from  mid  gut  tissue  during isolation. So maybe you can  talk about how you do your  isolations and what might work for them? 

 Dr. Clemens Cabernard:  Right. Well that's kind of a difficult question. In our case, I guess we 

never  faced  the problem  that we don’t have enough  cells because the brains we usually use; they each contain 50 neuroblasts per brain lobe.  So  the neuroblasts  can  theoretically be  imaged,  although we usually only  image  the one on  the very  top so closest  to  the cover slide. However,  in the case of the mid gut,  I don’t really know how one could achieve a higher number except  for dissecting more mid gut tissue, I guess that will be my approach I would be choosing. 

 Sean Sanders:  Dr. Schaffer, one for you. The dyes that you use as cell tags, how do 

they enter the cell membrane?  Dr. David Schaffer:  This is probably the super paramagnetic iron oxide for the magnetic 

particle  imaging. Those are small particles that are  ‐‐ we actually or Steve Conolly I should mention actually uses these particles that are of the order 10, 15 nanometers  in size they originally developed for MRI  as  contrast  agents  for MRI  and  then  uses  it  in  this  different imaging  technology, MPI  (Magnetic Particle  Imaging). The way  that we  end  up  introducing  them  to  cells  is  either  to  do  it  very nonspecifically where  you  coat  the outside  surface of  that particle with  something  cationic  like  protamine  sulfate  or  poly‐lysine  such that  it  undergoes  nonspecific  endocytosis within  the  cells. Or  you could alternatively tag it with something that's specific, a ligand that would  direct  it  to  particular  cell  types  and  that  would  have  for example  utility  for  in  vivo  imaging  and  diagnostic  purposes  for example if you could generate a particle that localized to a tumor. 

 [0:50:31] 

23  

Sean Sanders:  Great. Dr. Cai,  I  think you might be able  to  take  this one. What do you feel is the optimum ratio of the number of cells to the amount of chemical tag that you use? 

 Dr. Weibo Cai:  We typically do not do too much of chemical labeling.  Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Weibo Cai:  We are kind of more  into  the  reporter gene based approach using 

other firefly luciferase, sometimes we also do iron oxide labeling.  Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Weibo Cai:  In terms of the actual amount, I don't really have the exact numbers, 

but I think many of these details are kind of  in the methods section in some of the actual research articles. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Weibo Cai:  At this point, I just don’t have an exact number in mind.  Sean Sanders:  Right.  Anyone  else  want  to  add  anything  on  that?  Not  for  now? 

Okay.  I  wanted  to  ask  maybe  a  more  general  question  to  Dr. Cabernard and Dr. Schaffer about what they feel are the most useful and  flexible  imaging  tools  for  live  cell  imaging  that  they've  had experience with. So maybe, Dr. Cabernard, you can start first. 

 Dr. Clemens Cabernard:  Okay. Well,  I  guess one of  the most useful  setups  I would  think  is 

probably a  regular  single point  scanning confocal  system especially for labs which usually do immunohistochemistry assays anyways and usually these scopes are ‐‐ I mean they are fairly distributed all over these  institutes.  So  I  think  this  setup  can  at  least  to  start  with definitely be used  to  live  image  stem  cells and  then depending on the needs of course, you know, if one really wants to image at a high temporal resolution, it would be advisable to move on to a spinning‐disk system. 

 Sean Sanders:  And, Dr. Schaffer?  Dr. David Schaffer:  Yes. One way of answering that maybe  is that I run a stem cell core 

at  Berkeley  that  has  a  lot  of  imaging  equipment  within  it  and certainly our confocal and we have a 2P as well on the same rig, gets a good amount of business. The thing that probably surprised me the most  is  that  the  instrument  that gets booked 24/7  is one of  these 

24  

high content imagers, Cellomics makes one of these, General Electric makes  one  of  these, we  got  one  from Molecular Devices  or MDS. These are imagers that I'm sure many people are familiar with where you can load samples into it. 

   It's just a regular epifluorescence microscope, but it has robotics and 

software associated with  it that will enable you to for example scan every well at the bottom of a 96‐well plate or a 384‐well plate every 15 minutes for 24 hours in a row, and then process the images to be able to gain quantitative information from them such as the number of  cells of different  identities or  the amounts of  label  that's  in  the nucleus  versus  the  cytosol,  the number of branches  that a neurite has. So this high content  information, although you can  fill up hard drives  pretty  quickly  is  able  to  get  a  huge  amount  of  data  that enables  us  to  consider  experiments  we  simply  would  not  have considered three years ago. 

 Sean Sanders:  So, Dr. Schaffer, a question came  in about your opinion on whether 

stem cell  fate based on changing  the  substrate elasticity may have real functional implications for stem cell differentiation in vivo or do you believe  that  this might  just be an artifact  that you're  seeing  in the laboratory. 

 Dr. David Schaffer:  Sure.  So  I'll  start  out  heuristically  by  saying  that  of  course  the 

stiffness of  tissue  inside  the body ranging all  the way  from adipose which  is very soft, brain which  is not that much harder, all the way through  bone,  it  ranges  over  about  four  orders  of  magnitude  in stiffness.  The  brain  itself  and  the  hippocampus  that we  study  has around  a  five‐fold  variation  in  stiffness  and  that  variation  occurs across the exact same range that we're observing flips in cell fate as a function of stiffness. 

   So  it's  difficult  to  directly  change  the  stiffness  of  a  tissue  like  the 

brain  without  changing  other  biochemical  properties,  but  we've done  a  lot  of  work  in  analyzing  the  mechanism  by  which  a  cell responds  to  these mechanical properties  and have  gone  a  lot  into the biochemistry and  the  signal  transduction  involved. So what we can say  is  that  if we go  in vivo and use viral vectors  to manipulate signaling pathways  that  respond  to mechanical differences, we  see the  analogous  flips  in  cell  fate  in  vivo  that we  observe  in  vitro  in response to stiffness changes. 

 [0:55:06] 

25  

Sean Sanders:  Dr. Cabernard, I'm coming to you for a fairly specific question on fly neurons. This viewer  is trying to culture them on poly‐lysine‐coated dishes and they said they're finding quite a lot of debris and floating cells and not all the cells are attaching. Maybe you can advise them on something they should be looking at? 

 Dr. Clemens Cabernard:  Well,  that's  pretty  specific.  I'm  not  sure  how  I  could  provide  any 

advice to this question. What I would say is probably obviously what happens here is that if a lot of debris is being observed that cells are not happy with the substrate so they're probably undergo apoptosis or  retract  or whatever might  happen with  these  cells.  So  I would probably  try  to use different coatings, different  slides, maybe even different glasses or different manufacturers for glass slides and then of course use different substrates as their coating surface as well. 

 Sean Sanders:  Excellent. Thank you. So we're coming up to the end of our hour, but 

I'm going to try to sneak a couple more questions in. One for you Dr. Cai. 

 Dr. Weibo Cai:  Yeah.  Sean Sanders:  This  asks,  is  bioluminescence  amenable  to  the  recently  developed 

family of super resolution microscopy techniques?  Dr. Weibo Cai:  Probably  not  at  this  point.  I  think  most  of  the  super  resolution 

imaging are using  fluorescent proteins rather than bioluminescence and also bioluminescence the signal  is kind of relative to ‐‐  it's a  lot weaker, but  there's not much background.  So  at  this point  I don’t think  is  bioluminescence  is  amenable  to  those  super  resolution imaging. 

 Sean Sanders:  Another question for you, which imaging methods are being used to 

complement  one  another  in multimodal  or  correlative manner  to facilitate  stem  cell  research  on  different  scales,  in  other  whole animal to organs, organs to tissues, etc? 

 Dr. Weibo Cai:  I think fluorescence imaging it can be used to reach different scales, 

but typically the fluorescence signal does not penetrate very well so you can only at superficial tissue. Let's say for mice, typically you can only image to maybe a few millimeters deep. The typical correlation people use are probably bioluminescence and say the multimodality reporter gene techniques that typically use bioluminescence and the PET. Those are  the  two  that's most widely used  for  in vivo  imaging while  the  fluorescence  is mostly  for  a  selection  of  cells  like,  you 

26  

know, FACS analysis, not very widely used for in vivo imaging at this point. 

 Sean Sanders:  Dr. Schaffer, a question about AAV that you talked about a  little bit 

in your presentation, what do you  foresee might be  the  future  for AAV  mutants  specifically  for  the  improved  efficiencies  in  various stem  cell  types.  Do  you  think  there's  going  to  be  improvement there? 

 Dr. David Schaffer:  Well, that's one of the goals of our research, to be able to engineer 

AAV for improved efficiency on the stem cells that are of interest to ourselves and hopefully of some  interest to others within the  field. So  in terms of efficiencies, we have created mutants that are really good so far on neural stem cells and different mutants that are good on  human  embryonic  stem  cells  and  human  induced  pluripotent stem cells. For  the NCSs, we're getting efficiencies on  the order of, you know, 80% cells are transduced by the vector and of those 80%, around 0.15% ‐‐ if your goal is to do a homologous recombination or a gene targeting then it results in about a 0.15% gene targeting rate, which is quite good within the field. For the human embryonic stem cells,  we're  getting  around  60%  gene  expression  and  that's compared  to  for  example  a  nucleofection,  a  plasmid  transfection method that perhaps gets around 30% or so. So then I think that at this  stage  we're  not  efficiency  limited  as  far  as  delivery  goes anymore. 

 Sean Sanders:  Fantastic.  Well  unfortunately,  that's  all  the  time  we  have  for 

questions today. So on behalf of myself and our viewing audience, I wanted  to  thank  our  excellent  speakers  for  providing  such interesting talks and a very engaging discussion: Dr. Weibo Cai from the  University  of Wisconsin‐Madison,  Dr.  David  Schaffer  from  the University of California at Berkeley, and Dr. Clemens Cabernard from the University of Basel. 

   Many thanks to our online audience for the questions you submitted 

to the panel. I'm sorry that we didn't manage to get to all of them.  Slide 55   Please go to the URL now at the bottom of your slide viewer to learn 

more about resources related to today’s discussion, and look out for the  more  webinars  from  Science  available  at www.sciencemag.org/webinar. As  I mentioned before,  this webinar will be made available to view again as an on‐demand presentation within approximately 48 hours from now. 

27  

   We'd love to hear what you thought of the webinar, just send us an 

email at the address now up in your slide viewer; webinar@aaas.org.    Again,  thank  you  to our panel  and  to  Leica Microsystems  for  their 

kind sponsorship of today’s educational seminar.    Goodbye.  [1:00:23]  End of Audio