1  

Techniques and Methods in Live Cell Imaging: Practical Advice for Miscroscopy‐based Research 

Webinar 18 July 2012 

 [0:00:14] Slide 1 Sean Sanders:  Hello and a welcome to this Science/AAAS audio webinar. My name 

is Sean Sanders and I'm the editor for custom publishing at Science.    Imaging  technologies  can  be  found  today  in  just  about  every  life 

science  laboratory.  The  imaging of  live  cells  in particular,  either  in culture  or  in  vivo,  has  enabled  many  biological  questions  to  be addressed  that were not possible with  fixed  samples. This webinar will examine some of the cutting‐edge technologies available today, and  provide  you,  our  audience,  with  a  practical  look  at  the challenges  encountered  and  possible  solutions  when  applying imaging modalities in a basic research setting. 

   We have a wonderful panel of experts on  the  line with me  today. 

They  are  Dr.  Vytas  Bindokas  from  the  University  of  Chicago,  Dr. Simon Watkins from the University of Pittsburgh School of Medicine, and Dr.  Tomasz  Zal  from MD Anderson Cancer Center  in Houston, Texas. It’s a pleasure to have you all with us today.  

 Slide 2   Before we get  started,  I have  some  information  that our  audience 

might  find  helpful.  Note  that  you  can  resize  or  hide  any  of  the windows  in your viewing console. The widgets at the bottom of the console control what you see. Click on these to see the speaker bios, additional  information  about  technologies  related  to  today's discussion, or to download a PDF of the slides. 

   Each of our  speakers will  talk briefly about  their work. After which 

we will have a Q&A session during which our guests will address the questions submitted by our live online viewers. So if you're joining us live,  start  thinking about  some questions now and  submit  them at any  time  by  typing  them  into  the  box  on  the  bottom  left  of  your viewing console and clicking the submit button. If you can't see this box,  just  click  the  red  Q&A  widget  at  the  bottom  of  the  screen. 

2  

Please remember  to keep your questions short and concise, as  this will give them the best chance of being put to our panel. 

   You can also  log  in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts 

during the webinar to post updates or send tweets about the event, just  click  the  relevant  widgets  at  the  bottom  of  the  screen.  For tweets, you can add the hash tag, #sciencewebinar. 

   Finally,  thank  you  to  Leica Microsystems  for  their  sponsorship  of 

today's webinar.  Slide 3   Now, I’d like to introduce our first speaker for this webinar, Dr. Vytas 

Bindokas. Dr. Bindokas earned his PhD degree from the University of Illinois at Chicago and  trained as a postdoctoral  fellow at both  the Davis and Riverside campuses of the University of California. He has been a research associate in the University of Chicago’s Department of  Neurobiology,  Pharmacology  and  Physiology  since  1997,  and  is currently  also  the  core  director  for  the  Biological  Sciences Division/Cancer  Center/Digestive  Diseases  Integrated  Light Microscopy Core  Facility. Dr. Bindokas has  extensive  experience  in many  different  forms  of  fluorescence  microscopy,  including physiologic probes,  FRET,  FLIM,  and  superresolution microscopy  as well as the associated hardware and software. A very warm welcome to you, Dr. Bindokas. 

 Dr. Vytas Bindokas:  Hello  all.  Biology  is  the  study  of  life  and  its  processes.  Because 

biology  is  dynamic,  it  makes  sense  to  observe  the  processes  in context. While  there’s  great  power  in  seeing  biology  happen,  one must  be  cautious  that  the  observations  are  indeed  accurate  and valid. 

 Slide 4   One  problem  is  illustrated  here.  It’s  the  dreaded  observer  effect. 

While the hazard of using a magnifying lens on a sunny day is really appreciated,  the microscope  can  be  just  as  harsh  and worse.  The problem  increases  when  going  from  whole  organism  down  to subcellular detail. 

 Slide 5   Two  major  types  of  live  cell  microscopy  are  transmitted  in 

fluorescence  techniques. Bright  field or  transmitted  light  is suitable for colored materials  like plant cells and even colorless samples can be observed in fine detail with technologies like phase contrast, DIC, 

3  

Hoffman modulation, etc. This  technique  is useful  for  tracking cells and even fine structural detail can be observed. A tip for all modes of imaging transmitted or fluorescence  is to  limit  light exposure to the actual  data  capture  by  using  automated  shutters;  don’t  illuminate when you don’t need to. 

   Fluorescence is well suited for finer details since we can more readily 

see a bright signal against the dark background. Very many types of fluorescent assay are possible and multiple targets can be observed using vital dyes, natural materials, fluorescent proteins, etc. 

 [0:05:03] Slide 6   General  rules  to get  the best  results are  to use  the  least  light,  the 

brightest  probes,  and  the  best  detectors.  The  top  panel  shows  a happy  cell  with  ruffling  edges  and  a  broad  attachment  to  the substrate.  In panel 4  in  lower  left well,  there was  a brief UV  flash applied  to  the  cell  and  now we  could  see membrane  blebbing  or having  these  blister‐like  structures  form.  The  cell  begins  to  round and eventually dies. You can get similar effects with any illumination that is too strong not just UV. So what should you avoid? You should also  avoid over magnification  since magnification  concentrates  the light. Also, avoid prolonged illumination because this creates greater photo damage and bleaching. 

 Slide 7   So what are the best detectors? It can be argued that a back‐thinned 

EM‐CCD camera has the best efficiency. It has the ability to record a wide  range of brightness data,  it has good  speed,  it has very good signal  to noise, yet  they are very expensive and  they  tend  to have too  few  and  too  large  pixels.  Next,  we  can  get  into  all  sorts  of marketing wars. Are more pixels better? Do I need really high speed or can I really get by with a 5‐second exposure? How much bit depth do  I need,  in other words how many brightness values do  I need to record? 

   The answers all depend on the questions being asked. One key point 

is signal to noise in your images. New technologies are available and they  are  opening  new  possibilities.  This  example  here  shows mitochondria  clearly  distinguishable  from  background  in  just  3 intensity values above the background. That’s what the plot shows. 

   One more battle, what resolution do you really need for your study, 

standard microscopy,  confocal, or  superresolution? Each  technique 

4  

requires very different light requirements and more than likely, your prep’s light tolerance is going to set this choice for you. 

 Slide 8   So  live cell microscopy has many more problems compared to fixed 

sample  microscopy.  Beware  that  UV,  blue  light  and  other  short wavelengths  are  potentially  directly  toxic  as  is  any wavelength  at very  high  intensity.  You  need  to  use  but  a  few  percent  of  full illumination brightness,  in other words microwatts not milliwatts.  If you must  use UV,  you  can  use  longer  exposures with  less  light  to build  up  the  image  details.  You  can  forestall damage  by  collecting fewer  images over time or  in Z,  in different focal planes. Try to use redder probes since long wavelengths pose fewer problems. 

   Next,  many  materials  when  illuminated  can  generate  reactive 

oxygen species that damage cells and cause bleaching. Riboflavin  in cell media and certain dyes are prime examples of this. Workarounds would be  to exclude  the B vitamins  from all  imaging media or you use fully defined saline for example hence balance salt solution. You can also radical quenchers or scavengers. 

   Next, focal drift can be a problem. Try to equilibrate temperature of 

the  microscope  in  all  solutions.  Try  keeping  the  dish  volume constant.  You  can,  if  you  can  afford  it,  use  automatic  focusing hardware devices. All of those can work well or you can accept that there will be drift  and  try  to  collect  the  3D  image  stack  and hope somewhere in that volume, you’re going to have that object that you were trying to observe. 

   Mammalian  cells need both elevated  temperature and  their media 

requires 5% CO2. For  the short  term, one can use alternate buffers or, you know, add HEPES  to your normal media. Don’t use normal media,  but  you  can  try  this  for  short  term.  But  the  best  results require incubators. 

 Slide 9   So  here,  short‐term  imaging  can  be made  using  just  plain  heated 

dishes  in  the upper  left  as  an  example of  an  electronically heated dish. It’s better to heat the dish and the objective, objective heater is seen  in  the  upper  right.  It’s  even  better  to  heat  the  entire microscope  system.  Maintaining  gas  is  just  not  possible  in  open dishes without some kind of a mini chamber setup and  in  fact,  the mini  chamber  is  a  good  approach  even  in  these  large  jacketed schemes because there’s a lot of airflow going through them. 

5  

 Slide 10   Long‐term  imaging  is  now  possible  using  devices  such  as  the 

VivaView system. Here, the microscope is actually built into a regular cell  incubator  and  this  provides  for  ideal  temperature,  gas,  and humidity  control.  This  system  even  has motorized  dish  covers  and you can see an example of that in the lower panel. It actually opens to  allow  you  to  feed  the  cells,  to  add  drugs  with  the  least perturbation of the environment within the microscope system. 

[0:10:28]   When  considering  doing  this  kind  of multi‐day  experiments,  think 

about  collecting  multiple  fields  of  view  per  dish  and  multiple dishes/treatments  so as you can concurrently collect as much data as possible in the least amount of time. 

 Slide 11   Next, moving targets are really difficult to deal with. One approach 

would be  to  try  to  trap  the  cell  into a  thick  solution. A number of possibilities exist. Thermogels are  interesting because they’re  liquid when they’re cold and they reversibly gel on warming allowing you to  recover  the cells  fairly easily. The  targets can also be  trapped  in shallow  spaces,  although  this  tends  to  be  a  short‐term  fix.  As evaporation  happens,  you  tend  to  crush  the  cells  in  fairly  short periods  of  time.  Single  targets  can  also  be  tracked  automatically using  certain  software and motorized  computerized XY  stages. You can also try to keep more  in view by using a thicker optical section and lower magnification to look at a larger area. 

   Another  issue  is the relative motion of multiple targets. Here, using 

sequential  image  captures  on  one  camera  or  one  detector,  the objects  can move  before  all  of  the  colored  channels  are  collected giving the appearance that the signals are chasing each other, kind of like head and tail  like. They may  indeed be chasing each other, but the only way to know for sure is to collect the signals simultaneously. 

 Slide 12   Finally, many imaging needs are still beyond the current technology. 

There  are  cases  where  faint  signals,  high  magnification,  multiple illuminations must be used. Photo damage still  limits these types of experiments.  Some  fixes might be  to  some  images  to  increase  the signal, to use averaging to deal with detect the noise, to open up the confocality to view more molecules per image, etc. Importantly, you should  be watching  the  technology  because  new  approaches  and new  hardware  are  continuously  becoming  available.  For  example, 

6  

the  major  bottleneck  like  the  diffraction  limit  has  been  recently bypassed, probes and dyes continue to be improved so really there’s much more  biology, which  is  now  directly  observable  and  in  ever greater clarity. 

 Sean Sanders:  Great.  Dr. Vytas Bindokas:  Thank you for your attention.  Sean Sanders:  Thank you so much, Dr. Bindokas. Fantastic introduction and we did 

have a few questions coming in so I have saved those and if you out there  in  the  audience  have  additional  questions,  please  do  send them in using the question box on the left of your viewing console. 

 Slide 13   So we’re going to move right on to our second speaker for today and 

that  is Dr.  Simon Watkins. Dr. Watkins was  awarded his PhD  from the  University  of  Newcastle  upon  Tyne  in  England  and  received postdoctoral training at the Pasteur  Institute  in Paris, France and at the Dana Farber Cancer Institute in the U.S. 

 Slide 14   He was  recruited  to  the  faculty of  the University of Pittsburgh as a 

tenure  stream  assistant  professor  and  was  promoted  to  full professor with tenure  in 2001. Currently, Dr. Watkins  is a professor of Cell Biology and Physiology, and Immunology, and vice chair of the department of Cell Biology and Physiology. He  is the founder of the Center  for  Biologic  Imaging  at  the  University  of  Pittsburgh,  an internationally renowned intellectual center for the application of all aspects  of  microscopic  imaging.  His  current  research  focus  is understanding  the mechanisms of communication between cells of the  immune  system  using  molecular  and  optical  imaging  tools. Welcome and thanks for being with us, Dr. Watkins. 

 Dr. Simon Watkins:  Thank you. What I’d like to do is grow from the last presentation to 

talk  about  one  area  of  live  cell  imaging, which  seems  to  be  ever present  but  has  had  massive  improvements  over  the  last  short period and this is really how to increase speed. 

 Slide 15   So why would we want to go fast? Well one can – on this slide is just 

a list of the obvious candidates, endocytosis, calcium measurements and obviously as we move more towards organismal biology, we not only need to  image the organs  into cells, but also motions of things 

7  

within  those organisms,  for example,  called heartbeat, blood  flow, sperm motion, etc.  

 Slide 16   What  I’d  like  to  do  now  is  to  look  at  the  microscope  and  its 

components  and  try  and  imagine  the  limiting  factors  and whether they’ve  been  solved  or  not  and  then  I’m  going  to  give  you  an example of how each one of them is solved. The slowest component is  the port changer,  that  is now  fast  switching. Another one of  the slowest components is the electronic changer objective. This has not been  solved but honestly,  I don’t  think  it ever  really  is  a problem, one uses the same objective for nearly all the experiment. Changing colors with cubes has also been solved. Opening and closing shutters at speeds has been solved. Changing the light color has been solved and also we are now using very fast cameras. 

 [0:15:45] Slide 17   Why would you want to change camera ports for example? Well for 

us,  the  most  common  reason  is  when  we  want  to  combine modalities. For example, examining cell  surface with TIRF and  then wanting  to  find  out  what  happened  to  the  endocytosed  or transcytosed molecules where we want to change to a confocal. To do  this,  we  have  to  have  the  ports  on  the  same  side  of  the microscope  as  well,  otherwise most microscopes  as  we  all  know have  ports  on  opposites  sides  of  the microscope  or  including  the bottom port because you want to register the images easily and one really needs  them on  the  same  side. So  this has been  solved using Galvanometer‐driven port switches. They are available in up to three colors.  The  obvious  one  might  be  one  from  Intelligent  Imaging, which you can see here has multiple ports and uses a Galvo to switch between  colors.  The  Galvanometer  runs  at  the  same  speed,  it changes port in millisecond timescales. 

 Slide 18   Traditionally,  to  change  the  light  color  in  a microscope, one might 

use  a halogen or Xenon or metal halide  source  and  then  combine that with  filter wheels  called  cubes  to  change  colors.  These  have defined change times, 15 milliseconds perhaps to change colors and also another 15 milliseconds to open and close the camera port, or open and close  the  shutter. This  is a  significant  issue and probably one of the currently well solved problems but  is traditionally one of the hardest things to do when you are doing fast  imaging such that 

8  

we  often  had  two  cameras  rather  than  one  rather  than  change colors. 

 Slide 19   Also,  traditionally,  the  light  sources  we  use,  for  example  here  a 

mercury  or  argon  source,  have  spectrally  very  different  signal strength so it’s hard to be quantitative. 

 Slide 20   I  would  argue  nowadays  that  the  diode  illuminators  that  are 

available, which are either diodes or dio pumps, and phosphors are incredibly impressive. The amount of power one can get out of these light sources as you can see from this table here from a seven‐color source measured  in milliwatts.  This  is  the  filtered  power, which  is after  it’s  been  through  a  specific  filter  are  very,  very  high,  in  the hundreds of milliwatts range, which as you heard from the last talk is far, far more than you need to do basic fluorescence or any kind of fluorescence  microscopy.  These  are  available  now  from  multiple vendors,  Lumencor,  Lumen,  89North,  and  also  for  Zeiss.  So  if  you want to go fast, you need to use these. 

 Slide 21   The reason is that they have many colors. Unfortunately, they do not 

have – you  still  can’t do UV  so Fura  imaging  is not possible with a diode light source, but they are very fast. Instead of using a shutter, you  turn  them on and off and  they have a  rise  time of about 0.25 milliseconds, which  is exquisitely  fast so you can move  the shutter. They are  continually attenuatable.  In other words,  you  can  choose any brightness so you remove the need for density filters. Also, if you combine them with multiband, match to multiband filter cubes, you can really have no moving parts in the microscopes when you change colors.  You  might  need  an  emission  filter  wheel  if  you  have bleedthrough problems, but routinely as I’m going to show you  in a few images, you can have four colors running very, very fast. 

 Slide 22   Of course, to do this, you need to combine this with a fast camera. 

Now traditionally, one uses cool CCD cameras. This  is a slide, which shows how an interlaying camera chip would work where the light is received undetected  in one area, one pixel  then  it moves across  to another line and then it’s read out to the side. 

 Slide 23 

9  

  Also, we  also  nowadays  use  EM‐CCDs  or  electron multiplying  CCD cameras a lot. These are generally frame transfer chips and also have speed limitations. 

 Slide 24   In  reality,  they are  relatively  slow. Frame  rates are about generally 

around 20 million pixels per second. So,  if you have a 1024 x 1024 chip, then you’ve got 20 frames per second as your maximum speed. Obviously, you can bend the image, which is where you put the data from  many  pixels  into  one  pixel,  that  does  increase  frame  rate because you have less pixels per frame, however, that does decrease resolution. 

[0:20:32]   Ultimately  though,  with  these  camera  technologies,  one  speed  is 

limited by noise and  the noise  is  limited by heat  so  the  faster you make the camera go, the more heat  is generated and therefore the more difficult to use at speed. 

 Slide 25   This  has  really  been  solved  now  using  complementary‐metal‐oxide 

semiconductors  in which  instead  of  having  the  pixels  reading  out serially, one  reads out  in  columns, each pixel essentially  is  its own camera. 

 Slide 27   Nowadays and you can  find  the cameras generally have  four  times 

the real estate of a traditional cool CCD camera and at that full frame which  is  2000  x  2000  pixels,  the  readout  is  generally  about  100 frames per  second. As  the pixels  are  read out, entire  columns not one  in sub arrays or one can read out  individual columns with a full line of about 2000 pixels in about 5 microseconds, which essentially means  you  can  do  a  field  with  2000  x  200  pixels  at  about  1000 frames per  second. This  is  striking and a dramatic  improvement of what one could do traditionally.  

   All  the  camera  manufacturers  who  make  these  devices  are 

improving noise. Right now, the noise is actually very, very low when one compares it with traditional cool CCD devices. There’s still some variance between  the pixels because each pixel  is  its own  camera, but  to  be  honest,  the  technology  is  improving  rapidly  and  daily. There’s  three  main  manufacturers  now  Andor,  PCO  Edge,  and Hamamatsu. They all make fine devices. 

 Slide 28 

10  

  So what  happens when we  combine  the  high‐speed  light  sources with these new cameras? If you trigger the camera, in other words if you use  the camera as a  trigger  source,  in other words,  it controls other devices, you can then use this to trigger changes in color from the  light  source.  So  instead  of  taking  50 milliseconds,  which  you would with  a  filter wheel,  you’re  actually down  to  the millisecond range, sub millisecond range. Also, actually one more thing, this can now  be  combined  using  a  diode  light  source  and  the  transmitted light  illuminator  so  you  can  actually  change  from  fluorescence  to transmitted  light  using  a  combination  of  fluorescence  LEDs  and transmitted light, white LEDs. 

 Slide 29   So here’s an example. What you’re  looking at here  is and  I’ll  show 

you a movie on the next slide, you’re looking at C. elegans. This slide, these worms  came  from Cliff  Luke  and Gary  Silverman  at Pitt  and there  are  two‐color  fluorescence  they  have,  red  and  green  colors. We can  image, and this was tested using three colors,  if we use the full frame, we get about 23 3‐color images per second. If we reduce the  size down  to 256 x 2048 using  the LED and CMOS camera, we can get about 111 3‐color images per second.  

   So  the  next  frame  shows  you  a  movie  of  what  this  looks  like. 

Remember,  this was  collected as  serial black and white  images  for each  color, not  as  a  3D,  the  two‐color  image.  So  right  now  in  the frame, you should be seeing the worms swimming around in perfect red  and  orange.  You’ll  notice  there’s  no  delay  between  the  colors and  you’ll  notice  that  the  colors  overlay  perfectly. With  a  slower camera,  there’s a sort of  jagged,  jumpy sort of  look  to  it. Note  this image here,  this movie here has been  slowed down  threefold.  It’s much, much slower than it’s actually happening in the real life. Okay. 

 Slide 30   So I do need to comment briefly on the use of confocal microscopes 

and speed. This has been made significantly better using resonance scanners, but this is still a single point detector and it’s better if you can  use  array  detector  because  of  this  increased  sensitivity. Obviously,  we  combine  these  with  multipinhole  confocals  and there’s many, many commercial solutions now available, which allow you to go at speed. 

[0:25:05] Slide 31   Honestly,  if  you  want  to  do  live  cell  imaging  at  speed,  the 

multipinhole solution has always been better for us in our hands. An 

11  

example  here  is  the  Prairie  device,  which  actually  has  multiple pinholes  as  well  as  being  very,  very  fast.  When  you  use  this combined with  the  triggered devices  for cameras, you can go very, very fast. 

 Slide 32   Unfortunately,  you  still  are  using  the  non‐CMOS  cameras,  in  our 

hands, we’re still using EM‐CCD so there is a speed limit because the EM‐CCDs  cannot  run  as  quickly  as  a  CMOS  camera. Generally, we feel  that  if  you  are doing  this  kind of microscopy,  you do need  to combine this with a Piezo Z stage to get high‐speed 3D stacks. There are now made by Mad City Labs and PI. But right now, high speed 3D confocal  can do  two or  three 30 Z positions per  second.  If  you do decide you need confocal or you do want  to go  fast,  it’s  important that  you  compare  all  the  various  technologies  to  come  up with  a solution  that  best  fits  your  experimental  needs  be  that  resonant detector or a multipinhole detector with a multipinhole solution with an array detector. 

 Slide 33   So in summary, what I’ve tried to show you in the last few minutes is 

that speed  issues are the new frontier  in  live cell  imaging. Honestly when you go out and you select the system you wish to use, most of these  speed  problems  are  solved  and  widefield  can  go  truly  fast without any moving parts and  the  confocal  could go  relatively  fast with no moving parts.  

   Also what’s  interesting and new  is  that  the new microscope stands 

that we’re seeing coming out now have many of these components implemented  at  their  core  so  the  microscope  stands  themselves have become quicker. With that,  I’m going to close and hand off to the next presenter. Thank you. 

 Sean Sanders:  Wonderful. Many thanks, Dr. Watkins.  Slide 34   Our  final  speaker  for  this  webinar  is  Dr.  Tomasz  Zal.  Dr.  Zal 

completed his Master’s and PhD degrees  in Poland at  the Wroclaw University  of  Technology  and  the  Institute  of  Immunology  and Experimental  Therapy  of  the  Polish  Academy  of  Sciences, respectfully.  He  underwent  postdoctoral  training  at  the  National Institute for Medical Research in London and at The Scripps Research Institute  in California. Dr. Zal then moved to the University of Texas and MD  Anderson  Cancer  Center  in  Houston,  Texas,  where  he  is 

12  

currently an assistant professor and director of the Immune Imaging Core  at  the  Department  of  Immunology.  The  goal  of  his  current research  is to understand the spatiotemporal regulation of  immune interactions  and  the  role  of  tissue  microenvironment  in immunological  regulation,  for  which  he  employs  various  dynamic imaging  techniques.  Dr.  Zal  has  developed  new  dynamic  imaging modalities,  such  as  FRET  and  intravital  dynamics‐immunosignal correlative  or  iDISC  microscopy,  and  is  experienced  in  numerous imaging  technologies,  ranging  from  intravital  multiphoton microscopy to FRET to superresolution microscopy. Many thanks for joining us, Dr. Zal. 

 Slide 35 Dr. Tomasz Zal:  Welcome everyone. It is quite clear from the previous presentations 

that  live  cell  imaging  offers  a  key  advantage  as  an  experimental method. Basically,  it  allows us  to  follow  the  cellular  and  structural biology simultaneously into space and time. The temporal dimension was nicely  covered by  Simon  so we now  know how  to  set up  live microscope, some imaging microscope that use a very high temporal resolution. 

   In my presentation today, I’d like to talk about the spatial dimension. 

Basically, what  I will  talk about  is how  to optimize  the microscope depending on the situation that we have and the specimen that we handle.  For  example,  how  to  optimize  the  optics  for  aqueous samples for cells in chambers then how to observe single living cells best  in  vivo.  Then  I  will  change  gears  and  change  the  spatial dimension  to  the molecular  level. We’ll  talk  briefly  about  imaging molecular  interactions  focusing  on  FRET.  Then  I  will  talk  about  a common problem that we have, which is how to relate the dynamics of  cells  that  we  observe  during  an  experiment  to  the  molecular information  that  cannot  be  easily  visualized  in  living  cells.  In  that part,  I  will  talk  about  an  imaging  technology  that  we  named Dynamics‐Immunosignal Correlative microscopy. 

 Slide 36   So it’s quite clear that live cells exist on a water environment and for 

optics this really presents a challenge. To explain this, let’s compare an  ideal  fixed specimen on  the  left with a  live cell chamber on  the right.  In  the  fixed  cell  specimen,  these  cells  are  mounted  in  a mounting medium whose refractive index is in an ideal situation very similar to the refractive index of the cover glass. Since the indices of the immersion oil is ‐‐ active index of the immersion oil is almost the same  as  that  of  the  glass,  the  light  travels  from  the  fluorescent 

13  

object to the lens in straight lines. An important implication is that it is  now  possible  to  focus  up  and  down  through  this  cell  without experiencing any spherical aberration. 

[0:30:47]   Now, the same oil immersion objective if it’s used for a live cell in a 

chamber  filled  with  water medium,  which  has  a  lower  refractive index,  if  we  did  that  we  would  experience  rapidly  increasing spherical aberration and  loss of detail  if you wanted  to  focus away from the bottom of the dish. 

   If we  look at the right, to overcome this problem,  live cells are best 

imaged with  special  objectives  that  are  designed  to maintain  the optical contact with the cover glass using water rather oil. So in this situation,  the  light  travels  from  the  fluorescent  object  and  at  the most we’re talking about  fluorescence today. The  light travels  from the  fluorescent object  to  the objective and  through  the bottom of the  dish  and  on  that  path,  it  gets  bent  twice  in  equally  opposite angles. So basically, the ray that  leaves the sample and the ray that reaches the objective, these two rays are now  in parallel. So again, now  it becomes possible  to  focus deep within  the  sample without spherical aberration so cells can be imaged freely. 

   Now, there is an important point. So in this arrangement now unlike 

in  fixed cell situation,  the  thickness of  the cover slip  is critical.  It  is important  to  compensate  for  the  thickness of  the  cover glass with the variations that you may have using the objective, the collar that should be on a good water immersion objective. You can also use the same collar to compensate for the temperature that we have in the chamber.  

   So, it would seem that all problems are solved except that the water 

that  couples  the  objective  to  the  cover  glass  bottom  evaporates during prolonged kind of experiments. This problem has been now solved recently by using objectives that are optimized for silicone oil as the immersion medium of the water. So basically, by using silicone instead  of water, we  can  avoid  the  evaporation  and  also  silicone doesn’t show moisture as for example glass or wood. Another bonus of using silicone  is the refractive  index  is slightly higher than that of water  and  for  certain  types  of  cells  and  organelles,  this may  be  a better match because  the refractive  index of certain structures  is a little higher than  that of water. Of course, an old‐fashioned way  to solve the above‐mentioned problem would be also to replenish the water using a small pump. 

 

14  

Slide 37   Yet another arrangement is available for live cell imaging on upright 

microscopes.  But  if  we  go  back  to  the  previous  slide,  I’d  like  to mention  briefly  about  one  additional  topic  that  was  already mentioned before, which is how to maintain the focus. Actually let’s stay on this slide. By setting a  lower refractive  index  in the  imaging chamber,  we  can  now  realize  correction  of  the  focal  drift  by introducing a longer wavelength light through the objective that will now  bounce  from  the  boundary  between  the  cover  glass  and  the water  in medium  and  go  back  into  the  objective,  it  can  be  now picked  up  by  a  sensor  so  that  a  negative  feedback  loop  can  now compensate  for  any  drift.  So  this  is  known  as  autofocus  and  this technology is now available from various manufacturers. 

 Slide 38   So, water or  silicone  immersion works well with  live  cell  chambers 

using cover glass bottom. But for upright microscope, it’s possible to directly dip the objective in the open dish. Water immersion, water‐dipping objectives are designed  to provide  sharp  images without a cover slip so we need a different type of objective which is also very expensive I should mention. 

[0:35:25]   The  direct  dipping  method  is  actually  associated  with  its  own 

problems.  So,  it’s  difficult  to  keep  the  cells  sterile, media  tend  to evaporate.  However,  it  is  easy  now  to  introduce  tools  such  as micropipettes  and  electrodes  into  direct  contact  with  these  cells. Importantly,  the  direct  dipping  configuration  has  been  widely adopted  for  in  vivo microscopy  in  particular  for multiphoton  laser scanning microscopy, which is my second topic today. 

   Without going into details, in 2‐photon microscopy, it is now possible 

to excite fluorophores using a lower energy light, near‐infrared light and  fluorophore  is  basically  absorbed  two  or more  lower  energy photons almost simultaneously and this process is very efficient only in  the  focus  of  the  objective.  Sorry  about  that  ringing,  I  couldn’t switch my primary line. The 2‐photon excitation allows us to remove the pinhole so that we can now detect all photons, which contribute to the image increased sensitivity.  

   Now, what I’m getting to is a problem with keeping the tissue steady 

when we  have  the  dipping  configuration.  Basically,  the  top  of  the tissue  surface  can  now move  unless  the  tissue  is  intrinsically  not moving at all such as the bone for example. But if we have the lungs 

15  

or  the  intestine or  some other  soft  tissue  that  is motile,  the direct dipping configuration is problematic.  

   To overcome this instability, what we do in our lab is to use a holder, 

which basically it consists of a cover glass and a suction. You can see it in the lower right. In this device, soft tissue is gently sucked against the  cover  glass  and  the  exposed  surface  now  becomes  nicely stabilized against the glass. So similar devices were described  in the literature. We adapted it for our needs for lung imaging. 

   So now, we are going back with intravital imaging to the optics that 

requires  water  immersion  objectives  again.  As  of  today,  several manufacturers offer excellent water  immersion objectives  that  can be used for intravital imaging. Basically, those are low magnification objectives, but has high numerical apertures and  they’re  corrected for cover glass. 

 Slide 39   So  since  we  are  talking  about  intravital  multiphoton  imaging,  to 

briefly discuss another problem, which  is basically caused by having to do all the imaging with just a single laser. So, current multiphoton microscopes remain limited by allowing the excitation with only one wavelength. This presents a problem because it might be difficult to excite two or more distinct fluorophores with just one wavelength in an optimal way. As you can see on the spectrum on the  left, such a situation occurs  if we have  for example  cyano  and  yellow  and  red fluorescent proteins. 

   What we do in our lab is to use dual laser multiphoton excitation. On 

the  right,  you  can  see  the  results, which  comes  from  a  time‐lapse movie  that  I will not show  today  recorded  in vivo,  in  the  lungs. So, we are basically combining  the soft  tissue holder here with dual 2‐photon excitation. We can now see four signals. We can see the CFP, YFP,  DsRed  as well  as  second  harmonic  generation  and  all  this  is picked up by only two detectors by multiplexing the excitation. 

 Slide 40   So what  if we don’t have  a  2‐photon microscope,  can we use our 

regular  confocal  for  in  vivo  work?  So,  the multiphoton  excitation clearly  is  the  preferred method,  but  in  fact  we  can  use  confocal scanning  for  certain  in vivo  situations.  So  let’s  compare briefly  the advantages of multiphoton and confocal imaging as it stands today. 

[0:40:18] 

16  

  So, it’s granted that the depth of useful imaging is better in 2‐photon microscopy. We  can  go  typically  about  300 microns  deep  into  the tissue whereas  in confocal we can go 100 microns, but often this  is quite  sufficient.  It  is  said  that  photobleaching  and  phototoxicity  is lower in multiphoton microscopes, but what we actually see is quite opposite. Confocal can be quite mild on cells if we use the low laser powers of  course.  It’s also  important  to use  resonant  scannings  to decrease the dwell time and accelerate the speed of imaging. 

   If  we  have  a  single  multiphoton  laser,  of  course  the  number  of 

channels  is  low  2  to  4  whereas  in  confocal  we  can  increase  the number of useful colors. The resolution on multiphoton is a little bit worse. When using confocal, we can also use additional sources of contrast  such  as  autofluorescence  and  reflection.  Of  course,  the price is much, much lower as well, which is important. 

 Slide 41   So, to move on to the dimension of molecular interactions, there are 

of course numerous methods that are available to detect molecular interactions  in  living cells. Here,  I have arranged  these  three major approaches on a triangle. This arrangement is to convey that there is no  single method  for  imaging molecular  interactions  that  is better than other. 

   Let’s take FRET. In this method, the donor fluorophore is excited and 

the energy is transferred to the acceptor depending on the distance. The key measure of FRET  is the efficiency, which basically  is a value from 0% to 100% of the photons that are picked up by the donor and then  transferred  to  the  acceptor.  If  the  efficiency,  the  E  value,  is known,  then  we  can  calculate  the  distance  between  the fluorophores,  which  of  course  is  of  great  importance  for understanding  the  biology.  FRETiness  can  be measured  in  several ways  as  shown  here  on  here  sensitized  emission,  donor  lifetime FLIM, polarization. The key advantage of all  those FRET methods  is that they can be performed in real time with a higher resolution.  

   In  contrast,  bimolecular  fluorescence  complementation  doesn’t 

allow to follow interactions in real time because the principle of the method is based on the recombination of two pieces of a fluorescent protein  into  fluorescent  for  a  molecule  and  that  process  is irreversible. However, fluorescent complementation is very sensitive in  contrast  to  FRET,  which  is  actually  a method  that  is  not  very sensitive.  There’s  also  fluorescence  cross‐correlation  available,  but it’s not often used for imaging so I will not go into it today. So this is 

17  

the  case with  FRET  as  the  non‐perfect,  but  preferred method,  to image molecular interactions in living cells. 

 Slide 42   In this slide, I briefly summarized basically a recipe how to calculate 

FRET efficiency  from desensitized emission, which  is  still a  topic of certain  confusion  in  the  community.  Just  to make  the  long  story short, we basically need three  images of which the first two  images where we excite the donor and read the emission of the donor and the  acceptor,  which  contains  the  sensitized  emission.  These  two images are collected simultaneously preferably with dual cameral or an  image  splitter  and  then  we  quickly  change  the  excitation  and collect  the  image  of  acceptor  and  we  need  that  said  image  to eliminate  the  bleedthrough,  which  is  present  in  all  these  three images at certain levels. Then we can calculate FRET efficiency based on  the  formula  that  you  can  see  here  after  we  collect  the bleedthrough or  the SE,  the  sensitized emission.  Important  feature of  this  method  is  that  we  can  now  correct  for  fluorophore photobleaching so that we can easily follow FRET in time or in 3D as shown on the right and I will not go into this detail today. 

 Slide 43   So now, we have the data, we have the dynamics of our cells that we 

observed. The question now is how do we now relate this dynamics to the biology. Using various type of software, we can observe and quantify  very  nicely  motility  parameters.  For  example  for translational motility,  we  can  answer  the  question  is  the motility now faster or slower due to treatment or genetic mutation, does  it become random or directional or is it steady or with arrests? We can follow  shape  dynamics  in  various  ways.  We  can  follow  calcium fluxes. 

[0:45:40]   But what we would  like  to  do  really  is  to  relate  this  dynamics  to 

molecular  information that may not be readily available for  imaging in a  live cell. Of course, we can quantify all these parameters using various software, which tends to be expensive so let me just mention again  that  ImageJ  is  a  free  package  that  is  very  powerful  if  you download the correct plugins. 

 Slide 44   So, the method that we used to now relate the dynamics of cells to 

molecular  information  of  almost  any  kind  is  the  Dynamics‐ImmnunoSignal  Correlative  microscopy  or  DISC  microscopy.  But  I think it’s very simple. What we do is to visualize live cells in the dish 

18  

or  in  vivo  and  then  we  fix  those  cells  in  a  rapid  manner  using formaldehyde.  Then  we  can  take  the  specimen  and  stain  it  for almost  any  molecule  including  signaling  proteins  using  typical immunofluorescence  technologies. What we can do now  is  to align the resulting  images with  the prior  intravital or dynamic recordings using landmarks and then we can do that on a subcellular basis. 

 Slide 45   So to explain this, let’s quickly go over this last example. Here we can 

see a movie, which  I hope you can  see on your  screen, where you can see a red tumor, which  is surrounded by green T cells. These T cells  are  very  heterogeneous.  Some  of  them  are  moving  in  a translational manner. Some of them are interacting immobilized. We would  like to now understand how these cells are different, but we cannot  do  that  in  vivo  because  our ways  to  label  the  cells  in  vivo might be very limited.  

 Slide 46   So, we are now  fixing  this movie at  the  last  frame and  in  this slide 

you should see now the last frame of the movie on the left and after fixation you see the same area in the specimen observed on a slide.  

 Slide 47   We can now identify every single cell by numbers. You can recognize 

that the shapes remain unchanged.   Slide 48   So, what we can now do is to basically stain our cells for almost any 

molecule  that we  choose.  Here,  just  a  proof  of  principle, we  are staining  for  CD4  and  CD8, which  label  the  helper  and  cytotoxic  T‐cells.  So we  can  now  give  names  to  our  cells. Here  is  a  CD4  cell, here’s a CD 8 cell. 

 Slide 49   We can feed this  information back  into the  intravital movie and we 

can now  identify  the motility of  these  two populations. Of  course, we  can  repeat  this  process  for  almost  any  fluorophore  and  any molecule  using  antibodies  that  are  available.  In  this  particular example,  we  are  finding  that  CD8  cells  are  slower  and  they  are rested for longer times when interacting with the tumor.  

 Slide 50   So to pull it all together, what I talked about today is basically how to 

adjust the microscope spatial resolution depending on the specimen. 

19  

The  conclusion  is  that  special  objectives  are  required.  They  are expensive,  but  they  are  very  critical.  For  in  vivo  imaging,  I  didn’t mention  it, but  I  like to emphasize that the upright configuration  is probably more versatile  in particular when you use a suction‐based tissue  holder  than  the  inverted  configuration  for  example.  It’s important to use adjustable objectives to correct for refractive index changes  and  that’s  also  important  for  in  vivo  work.  You  can  use confocal  for  intravital  imaging quite efficiently  if you don’t have 2‐photon.  

[0:50:03]   As far as  imaging of molecular  interactions, we very much  like FRET 

by sensitized emission and we can use it in a quantitative manner to calculate FRET efficiency. We like this method because it’s gentle on live cells and fast and quantitative.  

   Dealing with the data of course  is the weakest  link  in the chain,  it’s 

most  time  consuming.  But  one  thing  that we  are  doing  now  is  to correlate the dynamics of cells with the molecular  information that we can obtain by regular immunofluorescence microscopy.  

   If  you’d  like  to  see more  on  the  topic,  here’s  a  reference  to  our 

recent publication. So with  that,  I’d  like  to  finish and  thank you  for listening. 

 Sean Sanders:  Wonderful. Thank you so much, Dr. Zal, and thank you to all of our 

speakers for the fascinating presentations.  Slide 51   We’re going to move right on now to the questions submitted by our 

online viewers. We have about 10 minutes  so we’ll get  through as many  of  those  questions  as  possible.  A  quick  reminder  to  those watching us  live  that you can still submit questions by  typing  them into the textbox and clicking the submit button.  

   So  I’m going to start with a question  for the entire panel that asks, 

and  maybe  we’ll  start  with  you,  Dr.  Bindokas,  is  there  a recommended approach for assessing the viability of cells in culture when performing fluorescent imaging? 

 Dr. Vytas Bindokas:  Primarily,  you  can  use  the morphology  of  the  cells  if  you’re  using 

transmitted  light  modes.  From  experience,  you  can  get  an impression of what the cell will look like in a normal fashion. 

 Slide 6 

20  

  For  example,  this  slide  I  showed,  these  cells  have  protruding lamelopodia  the  sheet‐like  extensions  and  the  fingerlike  filopodia, which are observable over time and in the bottom row, you can see what  happens  to  the  cell  when  it’s  unhealthy.  The membrane  is being disrupted, vacuoles will form in the cell, the cell will round up and basically detach  from  the media. You  can also use  fluorescent techniques and I’ll pass that to my colleagues. 

 Sean Sanders:  Dr. Watkins?  Slide 51 Dr. Simon Watkins:  So absolute health there are dyes one can use, for example live cell, 

dead  cell,  live/dead  kits.  One  we  use  a  lot  is  ‐‐‐  one  of  the  first components  of  the  cells  become  perturbed  and  distressed  is  the mitochondrion so cells MitoTracker dyes work very well. Of course, most cells are generating some RO species, reactive oxygen species when  they’re  under  stress  so  dyes  like  DHE  or  if  you  think  it’s mitochondrial MitoSox all give you some indication of cell stress. But I  would  also  agree  that  cell  morphology  is  a  very  powerful component when you’re looking at the cells in a dish. 

 Sean Sanders:  And, Dr. Zal, anything to add?  Dr. Tomasz Zal:  Yes. So what we’d like to do to look at the viability, the other way is 

to how cells move. If the motility remains consistent throughout the whole  imaging  sequence  and  if  there  were  no  intentional perturbations, we  like that. Another thing that we do  is to take the cells after imaging and culture them and see if they keep on growing and dividing.  

 Sean Sanders:  So  I also had a question and  that  is maybe  related  to  this asking  if 

there’s  any  reagents  that  are  available  that  work  as  radical scavengers to keep cells healthy maybe something like vitamin C and would this help? Dr. Zal, maybe you could talk to that? 

 Dr. Tomasz Zal:  Trolox  is  one  reagent  that’s  been  reported  to  decrease 

photobleaching and increase viability vitamin E as well.  Sean Sanders:  Excellent.   Dr. Simon Watkins:  We use Oxyrase. Oxyrase is another product, which is very good. So 

it  scavenges  oxygen  so  you’re  working  in  a  slightly  low  oxygen environment,  but  it  improves  the  scavenging  of  –  decreases  free radical generation. 

21  

 Dr. Vytas Bindokas:  You  can  also  use  propyl  gallate, which  is  a  nontoxic  fairly  general 

scavenger.  There  are  scavenging  enzyme  systems  for  instance B27 supplements that can be added to the solution. These work outside the  cell,  not  inside  the  cell.  Beta‐carotene  can  be  a  scavenger  for singlet oxygen. EzyTe is great, but it’s going to kill your cells. 

 Sean Sanders:  Great.  So  a  broad  question  now  that maybe  I’ll  send  to  you,  Dr. 

Watkins, this person is interested in live imaging of nanometer scale bacteria on an outer surface membrane and they were asking is this possible?  So  I  guess  the  broader  question  is  what  is  the  current resolution limit of the microscopy techniques that are available? 

 Dr. Simon Watkins:  So most live cell techniques rely on minimizing and this was alluded 

to  at  the  beginning  of  this  discussion.  So  the  superresolution techniques be  they  STRM,  STED, PALM,  FLIM, whatever  four‐letter acronym  you  wish  to  use,  often  rely  on  collecting  many,  many images. For example  to do a good PALM or STRM  image stochastic optical  reconstruction  microscopy  or  photo‐activated  localization microscopy  demand  tens  of  thousands  of  images.  So while  some people are using them for  live cell  imaging, they’re really not ready for primetime.  Structured  illumination microscopy, which demands many, many  less  images, but also does not give you quite the same resolution improvement is probably currently a viable option. 

[0:55:51]   So to give you an idea, normally the ultimate limit of resolution in XY 

on  a microscope  is  about 200 nanometers.  Structured  illumination microscopy will bring that down to about 125 nanometers or maybe a little less. STRM and PALM go down into the 20s to 30 nanometers. You could also use STED, stimulated emission depletion microscopy, which  is  a  confocal  technique,  but  that  brings  all  the  dangers  of phototoxicity that come with a point scanning system. 

   So my own personal bias is towards FLIM imaging in that it gives you 

a  definite  improvement  in  X,  Y,  and  Z  resolution.  But  more importantly,  it  doesn’t  demand  use  of  different  fluorophores  than the one we’re using at the moment.  It works with any fluorophore, as  it’s an optical  trick  rather  than depending on a dye or a probe. However,  we  still  have  problems  resolving  the  range  that  this question was asked at, you know, and I think in this case like many of us, we go back to electron microscopy, which is obviously a non‐live cell approach. 

 

22  

Sean Sanders:  Fantastic. A  question  for  you, Dr. Bindokas,  about  the CyGEL.  This viewer  asks  when  to  use  a  CyGEL  slow  tracking  of  fluorescently labeled  compounds  that  are  being  released  from  the  cells  and monitored in real time? 

 Dr. Vytas Bindokas:  I suppose that’s possible. It depends on what the particular material 

is. I’m not convinced I know what the pore size of that CyGEL gel. So it may  slow  down  the  diffusion,  it  probably  does,  but  I would  say that’s a better question for their product support people. 

 Sean Sanders:  Great.  Dr. Simon Watkins:  Can I speak to the CyGEL question for one second?  Sean Sanders:  Sure, absolutely.   Dr. Simon Watkins:  This  is  Simon Watkins. CyGELs  are not  very  gas  permeable  so  you 

can’t use them for longer term imaging. They really are already used for  short  term  imaging.  But  they  do  allow  you  to  image  non‐adherent cells in a live situation but not for long term imaging. 

 Sean Sanders:  Well that’s actually a perfect lead‐in to my next question, which was 

asking about imaging of non‐adherent cells so perhaps you could talk a  little bit more  about  that  then we  can  take  comments  from  the other speakers too. 

 Dr. Simon Watkins:  Actually, that was my answer.  Sean Sanders:  Okay. Fantastic. Dr. Zal, any other—  Dr. Simon Watkins:  Using CyGEL is a good way of doing it. There are certain situations for 

example we’ve done a fair amount of imaging of T‐cells where we’re looking at calcium flux and we actually put the T‐cell receptor on the dish and then dropped T‐cells in. They come down and adhere to the dish  because  of  the  receptor  on  the  dish  surface,  but  those  are generally  very  specific  products.  Loosely  adherent  cells,  you  can either use Matrigel to embed the cells  in or you can use poly‐lysine or collagen‐coated dishes, they all help, but they do not specifically solve the problem of totally non‐adherent cells.  

 Sean Sanders:  Dr. Zal, some more comments?  Dr. Tomasz Zal:  I  think  it’s  been  answered.  It’s  important  to  remember  that  non‐

adherent cells in real life they actually are surrounded by some kind 

23  

of matrix unless they are  in the blood so  it’s really  important to put those  non‐adherent  cells  in  some  kind  of matrix  like Matrigel  or collagen matrix  and  to  really  look  at  those  interactions  in  such  an environment. 

 Sean Sanders:  Excellent.  So  we’re  at  the  top  of  the  hour,  but  I’m  going  to  try 

squeeze in just a few more questions before we finish and I’m going to stay with you, Dr. Zal. It’s a question about your iDISC technique. The viewer is asking if it’s possible to extend DISC microscopy to look at intracellular events such as pathogen entry into cells? 

 Dr. Tomasz Zal:  And  this  is actually exactly what we did and  I didn’t cover  it  today, 

not  pathogen  entry,  but  we  looked  at  intracellular  protein phosphorylation  during  T‐cell  receptor  activation.  So  for  further reference  I would refer to the publication that  I showed on the  last slide.  

[1:00:03]   Basically,  we  looked  at  dendritic  epidermal  T‐cells  and  then  we 

followed  their  motility  in  vivo  and  then  we  fixed  the  tissue  and looked  at  proteins  and  kinase  phosphorylation  CD3  receptor phospho forms and so on, zeta chains and we could exactly where T‐cell receptor was activated in vivo and at the sub cellular resolution. 

  Sean Sanders:  Perfect. So, Dr. Bindokas, a good question  for you on  temperature. 

How  important  is  the  temperature  for  living  cell  imaging experiments  and  how  long  would  one  need  to  maintain  the temperature for an experiment? For instance, is a 30‐minute imaging experiment  considered  a  long  time  and  would  that  timespan  be enough to affect the cells? 

 Dr. Vytas Bindokas:  It’s quite possible that even a short departure from 37 degrees can 

affect  the  biology  you’re  trying  to  study.  It  depends  really  on  the enzymes and how quickly they double their speed of action, the Q10 factor.  You  know,  a  couple  degrees  could  make  a  difference.  In general, you want mammalian cell physiology to be above absolutely 32  degrees  Centigrade.  Below  that, most  systems  are  affected.  If they’re  affected  at  36  versus  37,  it may  depend  on  the  particular system.  You  know,  having  good  temperature  control  is  critical  for long‐term imaging, but even I the short term it could be a significant factor.  

 Sean Sanders:  Any other comments from the other speakers? If not,  I’m not going 

to  ask  you  all  a  final  question  and  we’ll  start  with  Dr.  Bindokas. 

24  

Where do you think the biggest advances in microscopy are going to be seen  in the next say two to  five years and what are you  looking for in order to really drive your research? 

 Dr. Vytas Bindokas:  The push is still smaller and smaller. The diffraction limit is currently 

broken. We’re down  to a  few  tenths of nanometers, but  that’s still large  compared  to many  of  the  individual  proteins  and molecules that we’re interested in studying. 

 Sean Sanders:  Great. Dr. Watkins?  Dr. Simon Watkins:  I  think  a  combination  of  scale  and  speed.  Many  of  the  high 

superresolution  techniques  are  speed  limited.  By  integrating  the faster, ever faster cameras and detectors, cameras and light sources we’ll  be  able  to  improve  the  speed  at  which  we  can  use  these superresolution  methods  such  that  we  can  use  them  practically within a live cell situation.  

 Sean Sanders:  And final word for you, Dr. Zal.  Dr. Tomasz Zal:  Oh, well what  I am very excited about  is  the optogenetics basically 

not  only  to  image  cells  live,  but  to  use  light  to  manipulate  cell behavior and to interrogate the processes with subcellular resolution and  this  is now possible with channelrhodopsin molecules  that can be activated to  induce  ion fluxes  in a particular sub region of a cell. So this combined with imaging already is very informative and I’d like to see this employed more often actually. 

 Sean Sanders:  Fantastic. Well unfortunately, we are out of time for this webinar so 

many thanks to our speakers for providing such interesting talks and discussion and for being here to answer questions for our audience. They were Dr.  Vytas  Bindokas  from  the University  of  Chicago, Dr. Simon Watkins from the University of Pittsburgh School of Medicine, and Dr. Tomasz Zal from the MD Anderson Cancer Center.  

   Many  thanks  to  our  live  online  audience  for  all  the  questions  you 

submitted  to  the  panel.  I’m  sorry  that  we  didn't  manage  to  get through all of them. 

 Slide 52   Please go to the URL now at the bottom of your slide viewer to learn 

more about resources related to today’s discussion and look out for more  webinars  from  Science  available  at  webinar.sciencemag.org. 

25  

This particular webinar will be made available to view again as an on‐demand presentation within approximately 48 hours from now. 

   We'd  love  to  hear what  you  thought  of  the webinar,  send  us  an 

email at the address now up in the slide viewer, webinar@aaas.org.    Again, thank you to our wonderful panel and to Leica Microsystems 

for their kind sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.  [1:04:35]  End of Audio