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TOXICIDAD AGUDA Y LESIONESHISTOPATOLÓGICAS EN CACHAMA BLANCA

(Piaractus brachypomus) EXPUESTAS A LA MEZCLADE HERBICIDA ROUNDUP® MÁS SURFACTANTE

COSMOFLUX® 411F

ACUTE TOXICITY AND HISTOPATHOLOGICAL LESIONS INSILVER PACU (Piaractus brachypomus) EXPOSED TO A

MIXTURE OF THE HERBICIDE ROUNDUP AND THE SURFACTANTCOSMOFLUX 411F

Wilson Ramírez D1*, MVZ, Iang Rondón B1, M.Sc, Hover Vidal B, MVZ,Pedro Eslava M1, M.Sc.

1Universidad de los Llanos, Instituto de Acuicultura, AA 110, km 4 vía Puerto López,Villavicencio, Meta, Colombia. *Correspondencia [email protected].

Recibido: Octubre 17 de 2008; Aceptado: Febrero 18 de 2009

RESUMEN

Objetivo. Determinar la concentración letal 50 (CL50) y lesiones anatomopatológicas inducidaspor la exposición a la mezcla del herbicida Roundup® más el surfactante Cosmoflux® 411F enjuveniles de cachama blanca (Piaractus brachypomus). Materiales y métodos. Ejemplaresde 44.5 ± 3.7 g de peso fueron expuestos por 96 h a varias concentraciones de la mezclaherbicida más surfactante. Se registró la mortalidad al cabo de las 96 h y se tomaronmuestras de tejidos para evaluación histopatológica. Resultados. La CL50 fue de 23.42mg.l-1 para el Roundup® y de 0.19 mg.l-1 para el Cosmoflux® 411F (p<0.05) en la mezcla.En las branquias se hallaron lesiones necróticas proliferativas, y aneurismas y hemorragiasen las lamelas. En el hígado se observaron procesos apoptóticos y necróticos de loshepatocitos, vacuolización lipídica y gotas hialinas citoplasmáticas en los mismos. En eltelencéfalo se halló necrosis y apoptosis de cuerpos neuronales asociados y no asociados acélulas granulares eosinofílicas/células mast, y gliosis. En el intestino se evidenció vacuolizacióndel borde apical de los enterocitos, e infiltración leucocitaria en la lámina propia. En la piel sehalló hiperplasia e hipertrofia de células pavimentosas y células de moco, infiltración leucocitariaepidermal y acumulación subepidermal de pigmentos. En el riñón caudal se observaronhemorragias y lesiones necróticas multifocales. Conclusiones. La mezcla Roundup® másCosmoflux® 411F ocasiona lesiones histopatológicas en branquias, piel, cerebro, hígado,intestino anterior y riñón caudal en juveniles de cachama blanca expuestos a lasconcentraciones y proporción evaluadas.

Palabras clave: Agroquímicos, lesiones anatomopatológicas, peces, toxicología acuática.

ORIGINAL

Rev.MVZ Córdoba 14(1):1563-1575, 2009

1563

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 14 (1), Enero - Abril 20091564

ABSTRACT

Objective. To determine the 50% lethal concentration (LC50) and anatomopathologicallesions associated with exposure to a mixture of Roundup® herbicide and Cosmoflux® 411surfactant in juvenile silver Pacu (Piaractus brachypomus). Materials and methods. Fishof 44.5 ± 3.7 g body weight were exposed for 96 h to several concentrations of herbicideplus surfactant mixture. Mortality was recorded at 96 h and tissue samples were collectedfor histopathological evaluation. Results. The LC50 was 23.42 mg.l-1 for Roundup® (p<0.05)and 0.19 mg.l-1 for Cosmoflux® 411F (p<0.05) in the mixture. Necrotic and proliferativelesions were seen in the gills as well as hemorrhages and aneurysms in lamellae. In the liver,apoptotic and necrotic processes, lipidic vacuolization and cytoplasmic hyaline droplets inthe hepatocytes were observed. In the telencephalon, apoptosis and necrosis of associatedand non-associated neuronal bodies to eosinophilic granule cells/mast cells, and gliosis werefound. In the intestine, vacuolization in the apical border of enterocytes, and leukocyteinfiltration in the lamina propia were detected. In the skin, hyperplasia and hypertrophy ofpavimentous and mucous cells as well as epidermal leukocyte infiltration and subepidermalpigment accumulation were found. In the caudal kidney, hemorrhages and mild multifocalnecrotic lesions were observed. Conclusions. The Roundup® herbicide plus Cosmoflux®411F surfactant mixture in the concentrations and the ratio used caused histopathologicallesions in the gills, skin, brain, liver, anterior intestine and caudal kidney in exposed juvenilesilver pacu.

Key words: Agrochemicals, anatomopathological lesions, fish, aquatic toxicology.

INTRODUCCIÓN

El Roundup® (glifosato – N – fosfonometilglicina) es un herbicida de amplio espectrousado en actividades agrícolas. Además, enColombia es usado bajo la formulaciónRoundup Ultra® (presentación comercial delRoundup® con variaciones leves en laconcentración de sus componentes)mezclado con el surfactante Cosmoflux®

411F y agua en la proporción 44:1:55volumen/volumen, respectivamente, para laerradicación de cultivos de coca y amapolapor aspersión aérea, en una tasa deaspersión de glifosato (GP) de 10.4 l/ha.Estos parámetros exceden lasconcentraciones recomendadas por elfabricante del Roundup Ultra® de 1.6 a 7.7 %y una tasa de aspersión de un galón por acre(2.33 l/ha) (1). Esta práctica de aspersiónestá basada en estudios que reportan latoxicidad del glifosato, pero no delRoundup® (2) ni de la mezcla Roundup®

más Cosmoflux® 411F.

El Roundup® está compuesto de salisopropilamina de glifosato (48%), unsurfactante cat iónico denominado

polioxietilamina (POEA, 15%) y agua.Estudios previos determinaron que latoxicidad del Roundup® en peces se debeal surfactante POEA y que la toxicidad deeste herbicida se altera por algunosparámetros físico-químicos del agua,incluyendo pH, temperatura y dureza (3),así como por la especie del pez,presentando valores de CL50 en un rangode 2.3 a 97.4 mg.l-1 (3, 4). Estudios enteleósteos expuestos a Roundup® hanreportado lesiones proliferativas enbranquias, vacuol ización l ip ídica yacumulación de gotas hialinas en elcitoplasma de los hepatocitos, cambiosproliferativos en la epidermis y neuronasapoptóticas y necróticas, así comoinf i l tración de células granulareseosinof í l icas / células mast en eltelencéfalo (5, 4).

Respecto al Cosmoflux® 411F, este es unsurfactante no iónico cuya composiciónexacta es desconocida. Sin embargo, estáconstituido por una mezcla de tensoactivosestereoespecíficos no iónicos basada en

alcoholes propoxilados lineales con una bajaproporción de compuesto aril etoxilado yaceite isoparafínico. Rondón-Barragán et al(6) reportaron un valor de CL50 para elCosmoflux® 411F en cachama blanca de4417.99 mg.l-1 y hallaron vacuolizaciónlipídica de hepatocitos incrementada;hiperplasia de células epiteliales, moco enlas branquias; vacuol ización deenterocitos; mayor frecuencia de centrosmelanomacrófagos en el riñón caudal;gliosis, degeneración y muerte neuronalacompañado de infiltración de célulasgranulares eosinofílicas / células mast enel telencéfalo.

Los surfactantes pueden influir en la toxicidadde los herbicidas a través de variosmecanismos: 1) reducción de la tensiónsuperficial, 2) alteración de la permeabilidadde la barrera de difusión de membranasbiológicas, 3) alteración de los procesos detransporte de membrana y 4) por interaccióndirecta con el herbicida (7).

Se eligió la cachama blanca por ser unaespecie nativa que habita las cuencas delos ríos Amazonas y Orinoco, áreas que sonafectadas por los cultivos de coca y amapolay en los cuales la fumigación con productosagroquímicos constituye una práctica común.

El presente estudio fue llevado a cabo conel fin de determinar la CL50 de la mezclaRoundup® más Cosmoflux® 411F en juvenilesde cachama blanca y las posibles lesionesanatomopatológicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de estudio. El presente estudio fuerealizado en el Laboratorio de Bioensayos delInstituto de Acuicultura de los Llanos (IALL) dela Universidad de los Llanos (Villavicencio, Meta- Colombia), a una altitud de 422 m ytemperatura ambiental promedio de 25ºC.

Sustancias experimentales. El herbicidaRoundup® de grado técnico elaborado porMONSANTO Co., conteniendo 48% de GP,15% de POEA y 37% de agua y el surfactanteCosmoflux® 411F de grado técnico elaboradopor COSMOAGRO – Colombia fueron

adquiridos de una fuente comercial. Aunquela composición del Cosmoflux® 411F no estádescrita con exactitud, se sabe que contiene170 g.l-1 de alcoholes etoxilados ypropoxilados lineales y aril etoxilados.

Animales experimentales. Juveniles decachama blanca, Piaractus brachypomus,(44.5 ± 3.7 g) clínicamente sanos, criadosen estanque en tierra, procedentes del mismodesove del IALL, fueron aclimatados acondiciones experimentales en el Laboratoriode Bioensayos del IALL por 14 días usandoagua de pozo profundo con las siguientescaracterísticas: 6.6 ± 0.5 mg.l-1 de oxígenodisuelto; temperatura de 25.5 ± 0.1°C y pH6.2 ± 0.1. Antes de iniciar la aclimatación,los peces fueron sometidos a un baño ensolución de NaCl sin yodo ni fluor al 1%durante una hora para eliminar ectoparásitos.

Los peces fueron aclimatados en acuariosde 64 L, con ventilación constante, sin filtroy fueron alimentados dos veces al día conuna dieta comercial al 30% de proteína yuna ración del 2% de la biomasa de cadagrupo. Los peces fueron mantenidos sinalimentación desde 24 horas antes de ydurante la fase experimental. El pH (PinpointpH Monitor®, American Marine Inc. USA),oxígeno disuelto y temperatura del agua (HachPortable LDO™ HQ10 Dissolved OxygenMeter®, USA) fueron registrados dos vecesal día a las 7:00 y a las 18:00 h;adicionalmente, se determinaron lasconcentraciones de calcio y magnesio a las24 y 96 h de la fase experimental porespectrofotometría de absorción atómica(AAnalist 100 Atomic AbsortionSpectrometer®, Perkin Elmer Instrument). Paralos procedimientos de medición, pesaje ysacrificio, los animales fueron tranquilizadospor inmersión en agua fría (5ºC).

Diseño experimental. Se implementó unsistema semi-estático con recambio diariodel 50% del volumen de agua, manteniendola concentración de las sustanciasexperimentales en cada grupo por medio dela adición de la mitad de la dosiscorrespondiente. Se realizó un diseñocompletamente al azar para cadatratamiento. Los animales fueron distribuidosen seis grupos: control (T0; n= 20) que

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corresponde al grupo libre de las sustanciasexperimentales; T1 (n=21), 7.5 y 0.06 mg.l1;T2 (n=21), 15 y 0.12 mg.l-1; T3 (n=21), 30y 0.24 mg.l-1; T4 (n=20), 60 y 0.48 mg.l-1 yT5 (n=21), 120 y 0.96 mg.l-1 de Roundup® yCosmoflux® 411F en la mezcla,respectivamente. Para cada tratamiento serealizaron 3 réplicas, de modo que por cadaacuario se manejaron 6 ó 7 animalesdependiendo del tratamiento. Lasconcentraciones de la mezcla experimentalse determinaron con base en la proporción44:1, volumen:volumen de Roundup® yCosmoflux® 411F, respectivamente, usada enla mezcla para aspersión aérea en Colombiay con base en la CL50 a 96 h de 97.47 mg.l-1

para el Roundup® en juveniles de cachamablanca (4). La fase experimental tuvo unaduración de 96 h tomando como hora 0 elmomento en el cual se adicionó la sustanciaexperimental a los acuarios.

Necropsia e histopatología. Todos lospeces muertos durante la fase experimentaly los sobrevivientes al cabo de las 96 horasfueron desensibilizados mediante secciónmedular por corte dorsal al opérculo, se lesrealizó la necropsia y se tomaron muestrasde branquias (segundo arco), hígado, riñóncaudal, estómago, intestino anterior, piel ycerebro para examen histopatológico. Lasmuestras de tejidos fueron fijadas enformalina buferada al 3,7%, cortadas (4 a 5µm de grosor) y teñidas con hematoxilina-eosina (H&E) tradicional. La evaluaciónhistopatológica se llevó a cabo con unmicroscopio óptico Nikon ECLIPSE 80i (NikonCorporation, Japan) usando una cámara DS-5M (DS Camera Head + DS Camera ControlUnit DS-L1, Nikon Corporation, Japan). Los

hallazgos de necropsia e histopatología sondescritos con base en el grado de severidadde las lesiones, haciendo comparacionesentre tratamientos.

Determinación de la CL50. Se determinóusando el programa Trimmed Spearman-Karber (TSK) version 1.0.

Análisis estadístico. Los parámetros decalidad del agua se compararon medianteanálisis de varianza de una vía (ANOVA) yposteriormente con una prueba de Tukey-Kramer usando el programa GraphPad Instat®

(GraphPad Software, Inc.Version 3.06 forWindows). Los datos se expresaron comomedia, desviación estándar, con un valorp<0.05 considerado como significativo.

RESULTADOS

Parámetros de calidad del agua. Losparámetros de calidad de agua registradosdurante la fase experimental se muestranen la tabla 1.

Concentración letal 50 (CL50). La tabla 2registra la mortalidad observada durantela fase experimental. La CL50 fue de 23,42mg.l-1 para el Roundup® (p<0.05) y 0.19mg.l-1 para el Cosmoflux® 411F (p<0.05)en la mezcla. Estos valores fueroncomparados con los obtenidos por Ramírez-Duarte et al (4) y Rondón-Barragán et al (6)para el Roundup® (97.47 mg.l-1) y elCosmoflux® 411F (4417.99 mg.l-1),respectivamente, en juveniles de la mismaespecie, y se determinó el tipo de interacciónentre estas dos sustancias aplicando lafórmula de Timbrell (8):

Tabla 1. Parámetros de calidad de agua durante la fase experimental.

Los datos son expresados como promedio ± desviación estándar. a,b,c,d Valores con letras distintas indicandiferencias significativas (p<0.05).

Tabla 2. Mortalidad durante la fase experimental.

*Los tratamientos T0 y T4 constaron de 20 animales.

A: CL50 del Roundup®

B: CL50 del Cosmoflux® 411FV: Coeficiente

De acuerdo con Timbrell (8), un coeficienteinferior a 0,7 indica antagonismo, entre0,7 y 1,8 indica un efecto aditivo, ysuperior a 1,8 sugiere sinergismo opotenciación.

Hallazgos de necropsia. En el T0 no seevidenciaron alteraciones macroscópicas.En T1, T2, T3, T4 y T5 se apreció unresiduo grisáceo en el tercio distal de losfilamentos branquiales, de mayor severidaden los tratamientos de concentracionessuperiores. Del mismo modo se hallócongestión, hemorragias e hipersecreciónmucosa en las branquias. El hígado de lostratamientos T2 a T5 se hal lócompletamente pálido con coloracionesblanquecinas multifocales. Igualmente, seobservó hipersecreción mucosa en la pielde T4 y T5, y de forma infrecuentecongestión en intestino, estómago, hígadoy cerebro en los diferentes tratamientos.

HALLAZGOS HISPATOLÓGICOS.

Piel. En el T0 la piel conservó la morfologíanormal con la epidermis y su superficieregular presentando acumulación multifocalde melanina a nivel subepidermal yepidermal (Figura 1). En los tratamientosT1 a T5 se apreció la epidermis de mayor

Figura 1. Piel del grupo control (T0). Seobserva la morfología normal de ladermis y de la epidermis con lasuperficie regular y presencia demelanina epidermal. Escala de 100µm (40x. Tinción con H&E).

Figura 2. Piel del tratamiento 4 (T4). Se apreciaincremento del grosor de la epidermisjunto con infiltración de célulasinflamatorias. Barra de escala de100 µm (40x. Tinción con H&E).


grosor con hiperplasia de célulaspavimentosas y de moco, de mayorseveridad a mayor concentración de lassustancias experimentales (Figura 2), asícomo acumulación de melanina a nivelsubepidermal. Además, en los tratamientosT3 a T5 se observó infiltrado leucocitario,esponjiosis leve, cambios necróticos y unpatrón festoneado de la superficie epidermal.


Branquias. En el T0, las lamelas seapreciaron largas y delgadas, condesprendimiento leve del epitelio e hiperplasiainterlamelar multifocal poco frecuente,preservando la estructura normal de lascélulas epiteliales y del órgano (Figura 3).En los tratamientos expuestos a lassustancias experimentales, la hiperplasiainterfilamental proximal e interlamelar fue demayor severidad a mayor concentración delas sustancias experimentales (Figura 4).

levantamiento, festoneamiento e hipertrofiadel epitelio lamelar. En los tratamientos T2 aT5, se halló unión de los extremos distalesde las lamelas por medio de un pseudoepiteliosin hiperplasia lamelar y con cambiosnecróticos generalizados leves del epiteliolamelar, áreas de denudación lamelar,congestión, aneurismas y hemorragias demayor severidad y frecuencia a lasconcentraciones más altas. En lostratamientos T3 a T5, la hiperplasiainterlamelar progresó hacia fusión lamelar(Figura 5) principalmente en la porción distalde los filamentos con hemorragia multifocalen estas zonas, y en la porción proximal sehalló necrosis lamelar severa, la cual enalgunos casos progresó hacia denudaciónlamelar. Adicionalmente, se hallaron de formaesporádica quistes de myxosporidios.

Figura 3. Branquias del grupo control (T0). Laslamelas están largas y delgadas conel epitelio lamelar e interlamelardelgado. Barra de escala de 100 µm(10x. Tinción con H&E).

Figura 4. Branquias del tratamiento 2 (T2). Seaprecia hiperplasia interlamelargeneralizada. Barra de escala de100 µm (10x. Tinción con H&E).

Figura 5. Branquias del tratamiento 4 (T4). Sepresentan fusión lamelar,microhemorragias e infiltración decélulas inflamatorias en filamentos.Barra de escala de 100 µm (40x.Tinción con H&E).

Hígado. El T0 preservó la morfología normalexcepto por vacuol ización l ip ídicageneralizada leve de los hepatocitos(Figura 6). En los tratamientos expuestosa las sustancias experimentales, seevidenció el hígado congestionado (asícomo en T0), vacuolización lipídica dehepatocitos y material eosinofílico reticularo gotas hialinas en casos de mayorseveridad en el citoplasma de loshepatocitos, alternando con zonas devacuolización lipídica. Estás lesiones fueronde mayor severidad en los grupos expuestosa las concentraciones más altas (Figura 7).

Esto estuvo acompañado de hiperplasia ehipertrofia de células de moco, infiltraciónde leucocitos y de células granulareseosinofílicas/células mast (CGE/CM) y

Adicionalmente, se halló anisocitosis,necrosis multifocal y apoptosis dehepatocitos de mayor severidad a mayorconcentración de las sustanciasexperimentales. De modo semejante, sehallaron algunos centros melanomacrófagos(CMM) dispersos en el parénquima.

Riñón caudal. En el T0, el riñón preservó lamorfología normal. También se hallaron CMMpequeños dispersos en el parénquima. Enlos tratamientos expuestos a las sustancias

experimentales se evidenció necrosismultifocal de túbulos renales, de mayorseveridad y frecuencia en lasconcentraciones más altas. Adicionalmente,se observaron CMM asociados y noasociados a esporas de myxosporidiosdispersos en el parénquima renal.

Intestino. En el T0, el intestino estabanormal. Los grupos expuestos a lassustancias experimentales presentaronvacuolización de los enterocitos, hiperplasialeve de células de moco, infiltradoleucocitario en la mucosa, necrosis ydesprendimiento leve de los enterocitos.

Estómago. En el T0 se halló normal y lostratamientos T1 a T5 presentaroncongestión de la lámina propia e hiperplasialeve de células de moco. Además, en el T5se presentó infiltrado de célulasmononucleares en la mucosa y lasubmucosa, y procesos necróticosmultifocales en la mucosa.

Cerebro. En el T0 el cerebro no presentóalteraciones histopatológicas (Figura 8).

Figura 6. Hígado del grupo control (T0). Seobserva la morfología normal de loshepatocitos con vacuolización lipídicacitoplasmática y homogeneidad en eltamaño de los mismos. Barra de escalade 100 µm (40x. Tinción con H&E).

Figura 7. Hígado del tratamiento 4. En loshepatocitos se observan gotashial inas c itoplasmáticas yvacuolización lipídica severa. Barrade escala de 100 µm (40x. Tincióncon H&E).

Figura 8. Cerebro del grupo control (T0). Seaprecia la estructura normal delcerebro y de las meninges. Barra deescala de 100 µm (40x. Tincióncon H&E).


En los tratamientos expuestos, se presentónecrosis, apoptosis y procesosdegenerativos de cuerpos neuronales congliosis y/o infiltración de CGE/CM asociadaen el telencéfalo (incluyendo meninges)(Figura 9 y 10).


Las CGE/CM se observaron hipertrofiadas yllenas de material eosinofílico en elcitoplasma de tamaño variable (gotashialinas y granulaciones finas).Adicionalmente, se observó edemaperivascular y perineural acompañado decongestión cortical y de las meninges.

DISCUSIÓN

Parámetros de calidad del agua. No sehallaron diferencias significativas en latemperatura y concentraciones de calcio y

magnesio. Las diferencias significativasentre tratamientos en el oxígeno disuelto yel pH no fueron consideradas relevantesdado que en todos los tratamientos sehallaron dentro del rango descrito para estaespecie (9). Por tanto estas variables noinfluyeron en la presentación de las lesionesreportadas. El pH fue progresivamente másbajo con el incremento de la concentraciónde las sustancias experimentales. Estareducción del pH es ocasionada por lanaturaleza ácida del GP (Tabla 1).

Concentración letal 50 (CL50). Los valoresde CL50 del Roundup® y del Cosmoflux® 411Fen la mezcla son inferiores a los obtenidospor Ramírez-Duarte et al (4) y Rondón-Barragán et al (6) para el Roundup® y elCosmoflux® 411F, respectivamente. Elcoeficiente de 191.2 sugiere un efectosinérgico o de potenciación (8). Puesto quela mortalidad registrada fue ocasionada porlas lesiones braquiales y dado que estas soncomunes a las dos sustanciasexperimentales (4, 6) se presentó un efectosinérgico entre el Roundup® y el Cosmoflux®

411F.

Para el Roundup® se ha descrito un rangode CL50 en teleósteos de 2.3 a 97.4 mg.l-1

(3, 4). La toxicidad aguda del Roundup® enpeces ha sido asociada con el surfactantePOEA. La CL50 del Cosmoflux® 411F en lamezcla es inferior al rango descrito parasurfactantes no iónicos (6, 10); sin embargo,la escasez de información sobre sucomposición limita el análisis de su toxicidadbasado en relaciones estructura/actividad.

HALLAZGOS DE NECROPSIA EHISPATOLOGÍA.

Piel.La piel y las branquias están encontacto directo con el ambiente acuáticoy son, de este modo, un blanco primario dexenobióticos irritantes.

El festoneado y la necrosis de célulasepidermales son ocasionados por el efectocitotóxico del GP (11). El POEA y elCosmoflux® 411F pueden incrementar estosefectos sobre la epidermis al ocasionarcambios estructurales en la membrana delas células epiteliales (12, 13).

Figura 10. Cerebro del tratamiento 5 (T5). Seaprecian cuerpos neuronalesapoptóticos asociados a CGE/CM ygotas hialinas citoplasmáticas enestas células. Barra de escala de10 µm (100x. Tinción con H&E). CGE/CM: células granulares eosinofílicas/células mast.

Figura 9. Cerebro del tratamiento 4. En eltelencéfalo se aprecian CGE/CMasociadas a cuerpos neuronales ygliosis. Barra de escala de 100µm (40x. Tinción con H&E). CGE/CM: cé lu las granu lareseosinofílicas/células mast.

Los cambios proliferativos y la hiper-reactividad de células de moco con cambiosdegenerativos leves en la epidermis indicanuna fase reactiva la cual constituye unarespuesta general a condiciones de estrésambiental (14).

La acumulación de melanina, el infiltradoleucocitario en la epidermis y los procesosdegenerativos en la superficie de lascélulas epidermales de mayor severidaden los tratamientos expuestos a lassustanc ias exper imenta les es tánasoc iados a est rés y a procesosinflamatorios (15). La acumulación demelan ina está re lac ionada con sucapacidad depuradora de radicalesl ibres, además de sus propiedadesbactericidas que junto con el infiltradoleucocitario, constituye una barrera dedefensa en la piel. Las alteracionesest ructura les en la p ie l y lahipersecreción mucosa predisponen a laproliferación de microorganismos yprocesos infecciosos (16).

Los procesos degenerativos en las célulaspavimentosas fueron más severos que losencontrados en estudios previos ante laexposición individual al Roundup® (4) y alCosmoflux® 411F (6), lo cual se debe alsinergismo entre los componentes de estasdos sustancias. El surfactante POEA y elCosmoflux® 411F incrementan lapermeabilidad de la membrana celular porprocesos de desnaturalización proteica (12),facilitando la pérdida de electrolitosintracelulares (13) y el acceso del GP alinterior de la célula.

Branquias. El incremento de la producciónde moco en las branquias y la piel es unarespuesta descrita en peces sometidos aambientes contaminados (16, 17). Lahipersecreción mucosa en las branquiasmejora la remoción, dilución y/oneutralización de compuestos tóxicos ypatógenos (17) reduciendo la difusión deagentes nocivos hacia la sangre. Sinembargo, este proceso dificulta elintercambio gaseoso al incrementar ladistancia de difusión a través de lasbranquias (16).

El residuo grisáceo (observadomacroscópicamente) y el acortamiento delos filamentos pudo ser ocasionado por laacción irritante de los surfactantes POEAdel Roundup® y del Cosmoflux® 411F, por elefecto citotóxico del GP, así como por unareducción de la irrigación al extremo distalde lo filamentos branquiales para disminuirla absorción de las sustancias experimentalesy la pérdida de electrolitos por difusión haciael agua (17).

La necrosis del epitelio branquial ha sidodescrita como un efecto directo desustancias irritantes en el agua. Eldesprendimiento del epitelio, edema, fusióny plegamiento lamelar podríancorresponder a adaptaciones fisiológicasdel pez que le permiten reducir el áreasuperficial con el fin de preservar lahomeostasis hidro-electrolítica (18). Estasmodificaciones incrementan la distancia dedifusión entre el ambiente acuático y lasangre. La necrosis del epitelio branquialpuede ocurrir por la citotoxicidad ejercidapor el GP (11) o por alteraciones de lamembrana celular ocasionadas por lossurfactantes (12, 13, 19).

La hiperplasia de células de moco reduce ladifusión de xenobióticos a través del epiteliobranquial y constituye una respuesta a unposible desequilibrio electrolítico ocasionadopor las lesiones branquiales (20). Elincremento en el tamaño de las célulascompatibles con células de cloro puedeconstituir una respuesta compensatoria alestrés osmótico (20).

La formación de pseudoepitelio es unarespuesta adaptativa rápida frente a unestímulo irritante severo cuando lahiperplasia interlamelar no es losuficientemente rápida para proteger laslamelas, el epitelio lamelar se fusiona yestablece una barrera entre el plasma y elagua disminuyendo la superficie expuesta.

Los aneurismas y las hemorragias podríanresultar de un incremento en la presiónvenosa y del efecto irritante de lossurfactantes sobre la células pilar y lossenos venosos lamelares (12, 13, 19). Losaneurismas lamelares ocurren por ruptura



de células pilar (17). La necrosis lamelarsevera podría resultar de la acción citotóxicadel Roundup® (11), de la alteración de lamembrana por desnaturalización de proteínas(12) y de la formación de canales deconducción catiónica inducida por lossurfactantes (13) así como por la acción desustancias líticas liberadas por los leucocitosinfiltrados.

Las lesiones branquiales descritas en elpresente trabajo alteran los procesos derespiración, osmorregulación, balance ácido-básico y excreción de desechosnitrogenados. Exposiciones prolongadas otransitorias a concentraciones subletalestóxicas, aun cuando no induzcan efectosagudos, pueden predisponer al desarrollo deprocesos infecciosos (16).

Hígado. La vacuolización lipídica, común atodos los tratamientos, pudo ser inducidapor el periodo de supresión alimenticia alque fueron sometidos los animales. Sinembargo, los cambios lipídicos fueron demayor severidad en los grupos expuestos alas sustancias experimentales. Las gotashialinas descritas han sido reportadas porotros autores en peces expuestos aRoundup® (5, 4) y pueden representar laacumulación de proteínas mal plegadas osubunidades proteicas no ensambladas (21)relacionadas con fallos en el proceso detranscripción ocasionado por el Roundup®

(22) o con la acumulación de materialproteico debido a un desequilibrio entre lasíntesis y liberación de proteínas hacia lasangre sistémica o hacia la bilis (5). Fallosen el proceso de transcripción y en la síntesisde proteínas podrían estar relacionados conla vacuolización lipídica más severa en lospeces expuestos a la mezcla experimentaldebido a una alteración en la síntesis delipoproteínas requeridas para la liberación ytrasporte de lípidos desde los hepatocitos(23). La vacuolización lipídica también puedecorresponder a una estrategia fisiológicapara concentrar xenobióticos liposolubles,como los surfactantes, con el objetivo dereducir su disponibilidad (24). Las lesioneshepáticas fueron más severas que lashalladas por nuestro grupo en exposicionesal Roundup® sin Cosmoflux® 411F (4).

Riñón caudal. Las lesiones necróticasmultifocales no asociadas a esporas demyxosporidios en estructuras tubularespueden corresponder al efecto citotóxicodel GP descrito por Monroy et al (11) o a unefecto de los surfactantes o de susmetabolitos. La asociación frecuente de CMMa esporas de myxosporidios (25) hace difícildistinguir entre una respuesta a las esporas,una respuesta a las sustanciasexperimentales, y una posible influencia delos componentes del Roundup® y elCosmoflux® 411F a favor de los parásitos.

Intestino. La vacuolización de losenterocitos puede corresponder asurfactante, dado que su lipofilicidad lepermite atravesar membranas celulares. Lanecrosis y desprendimiento de enterocitospueden resultar de la citotoxicidad del GP(11) y del efecto de los surfactantes sobrelas membranas celulares (12,13,19).

Estómago. La ausencia de cambiosdeletéreos considerables como los halladosen la piel y las branquias puede estarelacionada con el pH bajo del contenidogástrico, el cual reduce la toxicidad delPOEA (3), y con la secreción de moco en lamucosa gástrica, lo cual tiene un efectoremovedor y/o neutralizante (17).

Cerebro. Las lesiones cerebrales fueronsemejantes a las halladas por Ramírez-Duarte et al (4) y por Rondón-Barragán etal (6) en cachama expuestas a Roundup® yCosmoflux® 411F, respectivamente. Loscomponentes del Roundup® y el Cosmoflux®

411F, podrían tener acceso al sistemanervioso central (SNC) a través del epitelioolfatorio y desde allí al telencéfalo, dondese focalizaron las lesiones, y/o a través dela barrera hematoencefálica, donde lossurfactantes, en virtud de su naturalezaanfifílica podrían co-acceder con el GP alSNC. La predisposición del telencéfalo a losprocesos degenerativos puede resultar desu comunicación con el epitelio olfatorio y/o se puede deber a la presencia de centrosde proliferación y regeneración neuronal (26)donde los componentes del Roundup®

pueden alterar los puntos de control del ciclocelular o el proceso de transcripción, durantela neurogénesis, como fue demostrado por

Marc et al (22, 27). Los surfactantes puedenejercer un efecto directo al alterar laintegridad de la membrana celular (12, 13,19). Estas lesiones en el telencéfalo puedenconstituir una explicación al bloqueoreversible en los procesos olfatoriosreportados en salmón del Atlántico (Salmosalar) por Lewis (28) ante la exposición asurfactantes catiónicos y al surfactanteaniónico alquilbenceno sulfonado. Lareversibilidad de dicho proceso puededeberse a la reposición neuronal llevada acabo en los centros de proliferación neuronal.

Las CGE/CM siguen un patrón de satelitosisen torno a neuronas con procesosdegenerativos (Figura 9), por lo que puedenestar involucradas en estos cambiosneuronales. El patrón observado indicaprocesos focales entre las neuronas y lasCGE/CM, donde la degranulación de estáscélulas no induce una reacción generalizadadel parénquima. Las CGE/CM descritas enteleósteos están relacionadas con lascélulas mast de los vertebrados superiores(29). Las células mast sintetizan y liberanfactor de crecimiento neural (30). Estahabilidad y su implicación en los procesosde reparación neural está por ser evaluada

en CGE/CM. Un proceso de hipoxia tisularinducida por las lesiones branquiales pudohaber contribuido al desarrollo de las lesionesneuronales.

Las lesiones neuronales evidenciadas puedenalterar procesos de olfacción, elcomportamiento individual y grupal, eldesempeño reproductivo y dinámicaspoblacionales.

En conclusión, juveniles de cachama blancaexpuestos a la mezcla Roundup® másCosmoflux® 411F, en la proporción yconcentraciones evaluadas, desarrollaronlesiones anatomopatológicas en piel,branquias, hígado, riñón caudal, intestino ycerebro. La CL50 de la mezcla sugiere unainteracción sinérgica entre estas sustancias.

Agradecimientos

Esta investigación fue soportada por elInstituto de Investigaciones de la OrinoquíaColombiana (IIOC), Universidad de los Llanos,Villavicencio, Colombia. Los autoresagradecen al personal del IALL por el apoyotécnico.

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