tinción de gram.labo 1 de microbiologia (1)

Integrantes: Nathalie Gonzales Materia: Laboratorio de microbiología Lyannie Gorena Emanuel Bustamante

Tinción de Gram

I. Introducción

El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista, sin embargo, las colonias que se forman en medios solidos si son visibles, de esta manera se puede hacer una observación a simple vista o macroscópica, en las colonias se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a una ligera identificación, como a nivel morfológico (forma de las colonias), elevación, margen o borde y color de las colonias; es decir que por medio de una observación macroscópica no se puede identificar al tipo de bacterias, es por esto que se debe realizar una observación microscópica.

Ramos y Pérez (2004), las células microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18-24 horas dan lugar a la aparición de masas visibles de células sobre medios solidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que está formada por un único tipo de microorganismo. Las colonias tienen una morfología característica que se estudia a simple vista con la ayuda de una lupa. Las características más importantes de las colonias y cuyo estudio tiene interés en la caracterización son los siguientes:

Forma: puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada. Tamaño: se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm. Elevación: vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve),

convexa, pulvinada (más elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresión central).

Forma del borde: puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso y rizado.

Superficie: puede ser lisa, rugosa, mate, brillante, transparente u opaca. Color: presencia de colores característicos y difusión de pigmentos en el medio. Capacidad de emulsión en agua: puede formar una suspensión uniforme, formar una

suspensión grumosa o no se emulsiona.

En este laboratorio solo se tomó en cuenta la forma, borde, elevación y color.

La observación microscópica es una de las características de la microbiología y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (por ejemplo protozoarios), en el caso de las bacterias es necesario la coloración de los preparados para aumentar el contraste con el fondo. Existen diversos métodos de coloración para una observación microscópica, como ser: tinción de Ziehl Neelsen, coloración de esporas, coloración de flagelos, tinción de Gram, y muchos otros, el que nosotros realizamos fue el último.

Integrantes: Nathalie Gonzales Materia: Laboratorio de microbiología Lyannie Gorena Emanuel Bustamante Según Garcia (2010) las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan en la tinción de Gram. Sobre la base de su tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tienen que ver con la carga eléctrica, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Las Bacterias Gram positivas y Gram negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo.

García (2010), el material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de las células Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico, generalmente, 80% a 90% de la pared de la célula Gram positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram negativa, por otro lado contiene una capa mucho más delgada únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacaridos y lipoproteínas. Solo de un 10% a 20% de la pared de la célula Gram negativa es peptidoglicano.

Las células Gram positivas, a causa de que sus paredes celulares son más espesas en peptidoglicano y menos lípidos, no son permeables al disolvente, ya que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Mientras que para las Gram negativas se utiliza una coloración de contraste, habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fuscina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

Madigan, Martinko, Parker (…..), las diferencias estructurales entre las paredes celulares de las Bacterias Gram positivas y Gram negativas son las responsables del diferente comportamiento de las células a la tinción de Gram. En dicha tinción, se forma dentro de las células un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram negativas puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram positivas. El alcohol deshidrata las Bacterias Gram positivas, que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Bacterias Gram negativas, el alcohol penetra rápidamente en la capa externa que es rica en lípidos y la fina capa de peptidoglicano no impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fácilmente.

En la tinción de Gram es importante respetar los pasos y los tiempos:

Cristal violeta (1 minuto)


Lavar Lugol (1 minuto) Lavar (Gram positivo) Decolorante Lavar Safranina (30 segundos) Lavar Secar y observar en el microscopio

II. Objetivos

Observar macroscópicamente cinco colonias mixtas y dos colonias puras (controles) para clasificarlas de acuerdo a su forma, elevación, borde y color.

Distinguir las bacterias gram positivas y gram negativas de un cultivo mixto utilizando dos controles través de la observación microscópica, por el método de tinción de gram para conocer sus características estructurales.

III. Materiales y reactivos

- 3 cajas Petri (2 Colonias puras y una mixta) - Alcohol- 7 portaobjetos - Asa de inoculación- Mechero Bunsen - Solución fisiológica- Cristal violeta - Lugol- Decolorante (alcohol acetona) - Colorante de contraste (safranina)- Agua - Microscopio- Aceite de inmersión - Gotero

IV. Procedimientos

Se realizó la práctica en 2 partes, primero se realizó una observación macroscópica y luego otra microscópica.

Inicialmente se limpió y desinfecto el área de trabajo con el uso de alcohol al 70%. Posteriormente se nos proporcionaron 3 cajas Petri, dos de ellas contenían colonias puras

Integrantes: Nathalie Gonzales Materia: Laboratorio de microbiología Lyannie Gorena Emanuel Bustamante (bacterias de control) y la otra contenía colonias mixtas. Luego se clasificaron 5 colonias mixtas de acuerdo a su forma, elevación, borde, color y aspecto, de la misma forma se realizó la operación con las dos colonias puras.

Para hacer usó del asa de inoculación primero se lo flameo en el mechero hasta que se obtuvo un color rojo vivo, luego se mantuvo el asa dentro del área de esterilidad del mechero el cual es aproximadamente de 20 cm, y se lo dejo enfriar por algunos segundos. Paralelamente se lavó el portaobjetos y se colocó una gota de solución fisiológica estéril. Una vez que el asa enfrió se tomaron las bacterias encontradas al borde de cada colonia, las cuales fueron colocadas en el portaobjetos al costado de la solución fisiológica para posteriormente juntarlos y esparcir las bacterias con el fin de separarlas para una mejor observación. Se dejó secar la preparación hasta que el agua se evaporo por completo, entonces se fijó la muestra pasándola 3 veces por el mechero con la precaución de no quemarlas. Este procedimiento se repitió con las diferentes colonias previamente clasificadas.

Ya fijadas las muestras se prosiguió con la tinción de Gram la cual consistió en cubrir la muestra con cristal violeta durante 1 minuto, luego se lavó con agua de grifo. Se cubrió el extendido con lugol igualmente durante 1 minuto y se volvió a lavar con agua. Se puso un decolorante (alcohol-acetona) hasta que la muestra ya no desprendió el color violeta, nuevamente se lavó con agua. Se cubrió con safranina durante 30 segundos, de nuevo se lavó con agua y se dejó secar a temperatura ambiente. Una vez seca la muestra esta se observó por medio del microscopio con el objetivo de inmersión, identificando si la bacteria corresponde a una Gram (+) o Gram (-), también se sacaron fotos para la observación morfológica de dichas bacterias.

V. Resultados y discusión

Observación Macroscópica

Tabla Nº1

Cultivo Mixto 1

Cultivo Mixto 2

Cultivo mixto 3

Cultivo mixto 4

Cultivo Mixto 5

Control - Control +

Forma filamentoso circular puntiforme Circular rizoide circular circularMargen Ondulado ondulado ondulado entero entero entero enteroElevación

elevado convexa plana elevado elevado elevado convexo

Color Blanco/crema

Blanco/crema

Blanco/crema

Blanco/crema

Blanco/crema

Blanco/crema

Blanco/crema

Tabla Nº2

Figura 1: Cultivo mixto-Colonia I Figura 2: Cultivo mixto-Coloni II

1 2


Figura 3: Cultivo mixto-Colonia III Figura 4: Cultivo mixto-Colonia IV

Figura 5: Cultivo mixto-Colonia V Figura 6: Muestra control (Gram negativas)

Figura 7: Muestra control (Gram positivo)

3 4

5-


Elaboración propia 2013

Discusión

Según Ramos y Pérez (2004), las células microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18-24 horas dan lugar a la aparición de masas visibles de células sobre medios solidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que está formada por un único tipo de microorganismo. Las colonias tienen una morfología característica que se estudia a simple vista con la ayuda de una lupa. Las características más importantes de las colonias y cuyo estudio tiene interés en la caracterización son los siguientes:

Forma: puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada. Tamaño: se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm. Elevación: vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve),

convexa, pulvinada (más elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresión central).

Forma del borde: puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso y rizado.

Superficie: puede ser lisa, rugosa, mate, brillante, transparente u opaca. Color: presencia de colores característicos y difusión de pigmentos en el medio. Capacidad de emulsión en agua: puede formar una suspensión uniforme, formar una

suspensión grumosa o no se emulsiona.

Aquí se muestran imágenes tomadas por una cámara de celular. En este laboratorio solo se tomó en cuenta la forma, borde, elevación y color, ya que son los parámetros más importantes para una observación macroscópica.

+

Integrantes: Nathalie Gonzales Materia: Laboratorio de microbiología Lyannie Gorena Emanuel Bustamante Como se dijo anteriormente con una observación macroscópica no se puede identificar al tipo de bacterias presentes, es por esto que más adelante se hace una observación microscópica.

En la parte superior se muestran imágenes de los cultivos, en la que tuvimos uno mixto y dos puros, los cuales eran las muestras control. Mediante esta observación pudimos determinar cuatro factores (forma, elevación, borde y color). La figura 1, pertenece al cultivo mixto y por lo que pudimos observar con la ayuda de la lupa es que esta colonia es filamentosa, elevada y ondulada; la figura 2, igual pertenece al cultivo mixto y pudimos observar que es circular, convexa y ondulada; la figura 3, pertenece de la misma forma al cultivo mixto y vimos que es puntiforme, plana y ondulada; la figura 4 perteneciente al cultivo mixto es circular, elevada y entera; la figura 5 al igual que las anteriores pertenece al cultivo mixto y es rizoide, elevada y entera; la figura 6 es una de las muestras control (Gram negativo) la cual es circular, elevada y entera y por último la figura 7 es la muestra control (Gram positivo) es circular, convexa y entera.

Observación microscópica.

Tabla Nº3

Control (+) Control (-)

Muestra 1 Muestra 2


Muestra 3 Muestra 4

Muestra 5

Elaboración propia 2013


Discusión

Según Salazar (2007), Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. Las bacterias Gram-negativas presentan una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.

Aquí se muestran imágenes de lo observado en los porta objetos, que fueron tomadas por una cámara digital. Primeramente el control (+) y (-), fueron los primeros en observarse en el microscopio, debido a que su función era ser un punto de referencia para poder distinguir las bacterias gram + y gram – en las otras 5 muestras provenientes de un medio de cultivo mixto. Al observar el control (+) se observó una coloración azul/violeta, lo cual nos comprueba que contienen una gruesa capa de peptidoglucano capaz de retener el colorante cristal violeta como también que la constitución de su pared celular es diferente en comparación con las bacterias gram (-) debido a que estas bacterias poseen una pared de peptidoglucado muy delgada, incapaz de retener el complejo formado por la combinación de cristal violeta y lugol. De esta forma podemos estar seguros que el control (+), son bacterias gram positivas y el control (-) gram negativas.

Una vez que se verifico que los controles positivo y negativo correspondían a las bacterias gram positivas y negativas, se pudo analizar con mayor certeza las 5 muestras. En la muestra Nº1 podemos ver que hay un alto grado de retención de color azul/violeta, es decir que posee un pared celular gruesa, sus características coinciden con las del control (+) se puede concluir de que se trata de bacterias gram positivas, como también tienen forma de coco agrupándose en forma de diplococos, estafilococos y sarcinas principalmente, este creció en grupos similares a racimos de uvas. En la muestra Nº2 se observa un coloración rosada tenue, es decir que hubo una escasa retención de color, característica de las bacterias gram (-) por su delgada capa de peptidoglucano, similar al control (-) como también se observó que las bacterias poseen forma de bacilos. La muestra Nº3 se puede observar que ocurrió una tinción mixta por que que se puede distinguir bacterias gram positivas de color azul/violeta en forma de bacilos y las bacterias gram negativas de color rosado tenue en forma de bacilos, una de las razones por las que estas bacterias se encuentran en una misma muestra puede ser es resultado de provenir de un medio de cultivo mixto por lo cual hay una mezcla de bacterias gram (+) y (-). En la muestra Nº 4 se puede observar una coloración azul/violeta característica de las bacterias gram (+) y en forma de bacilos por ultimo esta la muestra Nº5 la cual tiene una coloración rosado tenue que concuerda con el control de bacterias gram (-) y las bacterias tienen forma de cocos agrupados en forma de racimos o estafilococos.

Integrantes: Nathalie Gonzales Materia: Laboratorio de microbiología Lyannie Gorena Emanuel Bustamante En el comienzo de la clase el docente nos proporcionó la información de que los cultivos fueron hechos con las bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus y que debíamos identificarlos mediante la observación microscópica como también consultar bibliográficamente para poder comparar resultados.

Según Tortora (2007), la bacteria Escherichia coli es posiblemente unos de los microorganismos más estudiados por el ser humado, es necesaria para el funcionamiento de nuestro aparato digestivo y se caracteriza por ser una bacteria gram (-) ya que no se tiñe de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram.

Tabla Nº3

Comparativa

Tortora (2007)

E. coli

Control (-)

E.coliTortora(2007)

S.aureus

Muestra Nº1

S.aureus

Como podemos ver las bacterias E.coli son gram (-) y la bacteria S.aureus es gram (+)


VI. Conclusión

Se logró observar los diferentes cultivos mixtos y puros (muestras control), de manera muy sencilla, ya que solo se utilizó una lupa para diferenciar y clasificar a las diferentes colonias, de acuerdo a sus características morfológicas, elevación, borde y color.

Como resultado de la tinción de Gram, las bacterias gram positivas, correspondientes al estafilococo aureus quedaron teñidas de violeta, mientras que las gram negativas, correspondientes a E. Coli aparecieron de color rojo. Este comportamiento diferente frente a la tinción de Gram obedeció a la diferente composición de la pared celular de los dos grupos bacterianos.

VII. Cuestionario

1. Explique detalladamente(a nivel de la pared celular) qué es lo que ocurre durante la tinción de Gram, para que las bacterias presenten diferente coloración.

Al poner el cristal violeta y luego el Lugol-Yodo sobre el portaobjeto con la muestra fijada, se forma dentro de cada célula un complejo cristal insoluble Violeta –Yodo. Posteriormente al poner el alcohol acetona, en las Gram (+) se deshidrata su pared celular compuesta por varias capas de Peptidoglicano, formando una barrera y manteniendo el complejo cristal Violeta-Yodo en su interior, en cambio en las Gram (–) el alcohol acetona elimina su segunda bicapa lipídica compuesta por Lipopolisacaridos, permitiendo el escape del complejo cristal Violeta-Yodo.

Luego se cubre el extendido con safranina y solo las Gram (-) se tiñen de color anaranjado a rojizo y no las Gram (+) debido a que estas últimas tienen sus poros cerrados por el alcohol acetona y no permite el ingreso de este segundo colorante. Y de esta manera las Gram (+) quedan teñidas de color violeta a azulado y las Gram (–) de un anaranjado a rojizo.

(Cf. MADIGAN; MARTINKO; PARKER 2003:79 y PRESCOTT; HARLEY; KLEIN 2002:29)

2. ¿Qué tipo de coloración existe? Explique cuáles son y en qué se diferencian.

Tinción simple: Se utiliza solo un colorante, pueden tener colorantes básicos y ácidos.

o Tinción vital: Son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas,

mediante la introducción de un colorante en la circulación, estos colorantes pueden ser:


Colorantes Básicos: Azul de metileno, Fucsina básica, Cristal violeta, Safranina. Verde malaquita.

Colorantes Ácidos: Eosina. Rosa de bengala y Fucsina ácida.

o Tinción no vital: Se realizan sobre células muertas.

Lugol

Tinción diferencial: Tinción de un colorantes para diferenciar tipos de bacterias, morfología.

o Tinción de Gram.

o Tinción de ácido-a1cochol resistencia (Ziehl-Neelsen).

Tinción de estructuras específicas: Para teñir estructuras bacterianas.o Tinción de esporas

o Tinción negativa ( observación de capsulas )

o Tinción de flagelos

(Cf. PRESCOTT; HARLEY; KLEIN 2002:28-31 y COLLINS; LYNE 1989: Cap.6)

3. Nombre científico de 3 bacterias Gram(+) y 3 de Gram (-),que no sean los controles utilizados.

Bacterias Gram (+)

Listeria monocytogenes Corynebacterium diphtheriae Streptococcus pnwumoniae

Bacterias Gram (-)

Neisseiria meningitidis Haemophilus influenzae Bordetella bronchiseptica

(Cf. JOKLIK (et al.) 1997: 596,611,637,651,662,670)

VIII. Bibliografia

Aquiahuatl M. Ramos M. Manual de Practicas del Laboratorio de Microbiología General. Primera edición. Editorial universidad autónoma metropolitana, unidad Iztapalapa 2004 Mexico. Pag 15.


Collins, Christopher H.; LYNE, Patricia M. (1989). Métodos microbiológicos. Zaragoza. Acribia, S.A.}

García F. Reporte de práctica: laboratorio de microbiología, Practica 2 Tincion de Gram. 2010.

Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. 2007. Introducción a la Microbiología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.Pag.69-71.

Joklik, Wolfgang K. (et al.) (1997). Zinsser Microbiología. Buenos Aires. Panamericana S.A.

Madigan, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack (2003). Biología de los microorganismos. Madrid. Pearson Educación.

Michael T. Jhon M. Jacko. Biologia de microorganismos. Decima Edicion. Editorial Pearson. Madrid, Espania. Pag 74, 81.

Prescott, Lansing M.; HARLEY, John P.; KLEIN Donald A. (2002). Microbiología. Madrid. McGraw-Hill Companies.

Salazar Wilson.2007. Guías de práctica de Laboratorio de Microbiología. Departamento de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito –Ecuador. Pag, 14.

http://www.google.com.bo/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Christopher+Herbert+Collins%22&source=gbs_metadata_r&cad=7

tinción de gram.labo 1 de microbiologia (1)

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