the study on the preparation and characterization of gene-loaded immunomagnetic albumin nanospheres...

8/20/2019 The Study on the Preparation and Characterization of Gene-loaded Immunomagnetic Albumin Nanospheres and T…

1/18

INSTITUTO POLITÉCNICONACIONAL

Unidad Profesional

Interdisciplinaria deBiotecnología

Estudio de la preparación y caracterización de nanoesferas

inmunomagnéticas de albumina cargadas con genes y sus efectos de

proliferación anti-celular combinados con fluidos magnéticos de hipertermia

en células GLC-82

Integrantes:

González Lugo ValeriaPineda Girón Janette Marisol

Marín Flores Armando

Hernández Ruiz Dulce Itzelastillo Ruiz H!ctor

Profesores

• ortes Arro"o Hernán

• Flores Gómez #stela

• $ánc%ez Arellano Jocel"n &erenice

Eqipo ! "#$%

#ec&a de entrega: '()Enero)!'%*

a+oratorio de

Biotecnología #ar,ac-tica


2/18

El estudio de la preparación y caracterización de nanoesferas inmunomagnéticas de

albumina cargadas con genes y sus efectos de proliferación anti-celular combinados con

fluidos magnéticos de hipertermia en células GLC-82

Obeti!os"

- General"

o Estudiar las posibles estrategias a seguir para la cura y/o tratamiento contra el

cáncer mediante métodos de tratamientos génicos en conjunto con otro tipo de

tratamientos utilizando un enfoque inmunológico.- Espec#ficos"

o Preparar nanoesferas magnéticas de albumina genéticamente cargadas.

o Preparar nanoesferas inmunomagnéticas genéticamente cargadas.

o Acoplar las nanoesferas en anticuerpos monoclonales C!.

o E"aluar los efectos y efecti"idad de las nanoesferas en conjunto con un

tratamiento térmico y tratamiento de identificación molecular en células #$C%&.

$ntroducción"

Como una de los tumores malignos más comunes' las consecuencias cl(nicas y socio%económicas

del cáncer de pulmón son significati"as.

$as principales estrategias de tratamiento para cáncer de pulmón' incluyendo radioterapia'

quimioterapia' cirug(a' y terapia biológicas' )an logrado ciertos efectos curati"os' sin embargo' la

tasa de super"i"encia para pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo bajo.

El método de tratamiento no"el de la combinación de terapia génica con termoterapia y terapia de

anticuerpos monoclonaes fue utilizada para el tratamiento de cáncer in vitro.

En la terapia de gen inmune' *+, γ ' *$% y -,+ α )an sido ampliamente aplicados y tienen

un efecto curati"o mas definido. $a epresión local de esos genes en tumores puede mejorar la

inmunogenecidad del tumor' y estimular y enlazar la respuesta inmune de cuerpos antitumorales.

$a terapia de genes inmunes' la cual puede ser combinada con la respuesta de inmune del cuerpo'

se )a con"ertido en un nue"o prospecto atracti"o para una terapia génica del cáncer de pulmón.

n "ector "iral es el método mas efecti"o de transferir un gen' sin embargo' el embotellamiento de

un gen de transfección se )a con"ertido en una progresi"a materia de terapia génica.

Afortunadamente' recientemente descubrimientos nanotecnológicos )an generado "ectores

genéticos de transferencia basados en nanopart(culas que )an atra(do bastante la atención debido

a su gran área de superficie y baja toicidad. El bajo lanzamiento de los genes para su etenso

tiempo de respuesta efecti"a' la )abilidad de mantener una concentración eacta de los productos

y el potencia para dar la transfección eficaz y biodisponibilidad de los productos.

El enfoque de este tratamiento es referido para )ipertermia de fluidos magnéticos0 tienen por objeto

espec(ficamente tumores y as(' más profunda y efecti"a localización de los mismos.$a terapia de localización molecular puede in)ibir la proliferación celular e induce apoptosis por

interferencia espec(fica con la se1alización metabólica de células tumorales' las cuales puede que

constituyan una estrategia efecti"a contra el cáncer. Este enfoque puede eliminar las células

cancer(genas más efecti"amente y reducir el da1o al tejido sano.

As(' la combinación de terapias se )a con"ertido en una dirección importante del descubrimiento.


3/18

%etodolog#a

2 Preparación y caracterización de nanoesferas de +e345

6. 7ezclar 688 m$ de +eCl3 9:4 8.6 7 con 98 ml de +eCl 5:4 8.6 7 bajo purga de nitrógeno y

agitación

. Adicionar amoniaco ;6.!7< a la mezcla anterior )asta alcanzar un p: de =. :abrá un precipitado

negro rápidamente.

3. $a solución se agita por 38 min a =8> C

5. El precipitado se a(sla con un magneto y se seca a "ac(o.

!. Eaminar precipitado mediante -E7

9. 7odificar nanopart(culas de +e345

9.6 disol"er nanopart(culas en agua desionizada para preparar 5? del fluido magnético

9. @esuspender precipitado en PB y dispersar con sonicador

9.3 A1adir PE* y agitar a temperatura constante por 5 )oras.

9.5 Beparar part(culas magnética con un método magnético la"ar con agua destilada y metanol

. Becar en "ac(o las 7,Ps ;PE*% +e345<

2 E"aluación de la capacidad de PE*% +e345 para unirse al plásmido

6. *ncubar nanopart(culas y el D,A del plásmido Pegfp durante 38 minutos a temperatura ambiete

;Proporciones 8 6' 68 6' 38 6' !8 6' y 688 6 ;F / F


4/18

!. Dializar el reactante con PB para remo"er el D$%ditiotreitol y obtener sulfidril%actii"ado C!

9. Diluir una cantidad del gen 7A,B con buffer de acetato y a1adir !8 H$ de 8 m7 BPDP etanol

mientras se agita para remo"er el eceso de BPDP

. *ncubar con agitación el gen acti"ado 7A,B y C!%PDP%B: a 5>C por 6! )oras

&. $a"ar mediante centrifugación "arias "eces

2 Eperimento de transfección celular

6. Diluir en !8 H$ de medio libre de suero 5 Hg de plásmido pE#+P y nanopart(culas de

PE*%+e3o5 o C!%E#+P%*7A,B. *ncubar por 38 minutos3. $as células #$C%& y :EI=3 fueron sembradas en 9 placas con una densidad inicial de

3J68K! células/por placa en m$ de medio.5. *ncubar por 5 )oras!. @emplazar el medio con 6.! m$ de medio libre de suero y !88 H$ de PE*%+e345/pE#+P9. *ncubar por 5 )oras mas. @eemplazar el medio con medio que contenga suero

&. *ncubar por 5& )oras=. 4bser"ar las células en un microscopio de fluorescencia

2 E"aluación orientada del gen%cargado 7A,B in "itro

6. *ncubar las células #$C%& con grupos de C!%orientadas ;C!%*+,#%*7A,B


5/18

!. 4bser"ar la combinación de nanoesferas y células con un microscopio de fluorescencia. $as

células :$8 sir"ieron como control para los grupos anteriores.

M in vitro

6. Bembrar células #$C%& / :$ 8 ;3 L 68! / ml< en total 6958 medio suplementado con 68?

de suero de ternera fetal en placas de seis pocillos a 3 >C y se culti"ar en !? de C4 durante

5 )oras.. A1adir C!%*+,A%7A,B o *+,#%7A,B a las células' e incubar durante 5 )oras.3. Digerir las células con 8'!? de tripsina' recolectar y luego se resuspendier en tubos

Eppendorf ;EP< de 8'! ml con 6? de agarosa para una posterior centrifugación. n tubo de EP

con agarosa se utilizó como control.5. Escanear los tubos de PE con .8 -esla.!. 7edir los "alores de - en multicorte' secuencias multi%eco%-%mapa.

2 Prueba de calentamiento de +e345 7,Ps y C!%*+,#%*7A,B

6. Dispersar "arias dosis de nanopart(culas de +e345 en 8.! ml 8'=? de ,aCl' concentraciones de

+e345 de 8.!' 6.8' 6.!' .8' .! y 3.8 mg / ml' y a1adir ml de al(cuotas de fluidos magnéticos a

cubetas de fondo plano.. Color las cubetas en el centro de la )ipertermia de la bobina del campo electromagnético de

alta frecuencia. $a frecuencia de salida era 38 O:z y la salida corriente fue de ! A.3. 7edir la temperatura cada ! minutos durante 6 )ora de incubación.5. Ensayar C!% *+,#%*7A,B que contenga diferentes cantidades de )ierro de acuerdo con los

pasos anteriores. $as concentraciones de )ierro en el C!%*+,%*7A,B son 8.6!' 8.!'

8.3!' 8.!' 8.9!' 8.!' 8.&!' y 6'8 mg / m$.

2 $os efectos terapéuticos de C!% *+,#%*7A,B combinado con 7+: culti"adas en carcinoma

de pulmón de #$C%& ;CCI & ensayo<

6. Culti"ar células #$C%& ;5 L 685< en tres placas de =9 pocillos por 5 )oras.. Bometer las células a oc)o diferentes condiciones grupo de control negati"o ;6958 contiendo

68? de suero de ternera fetal


6/18

RGR=GrupoexperimentalOD−Grupodecontrol enblanco

Grupodecontrol negativoOD−Grupodecontrol enblanco x 100

Ensa!o de citometr"a de flu#o

6. Ajustar las células #$C%& en fase de crecimiento logar(tmico a la suspensión con 3 68!

células / ml.. *ncubar durante 5& )oras.3. @ecolectar las células de los oc)o grupos y la"arlas tres "eces con PB fr(o.5. @esuspender en un tampón 6 de unión a una concentración de 6 L 689 células / ml.!. -ransferir 688 Sl de la solución dentro de & tubos de ! ml' y a1adir !Sl de isotiocianato de

Aneina de fluoresce(na y ! Sl de yoduro de propidio ;P*< a cada tubo.9. 7ezclar sua"e e incubar durante 6! minutos a temperatura ambiente ;! >C< en la oscuridad'

a1adir 588 Sl de tampón 6 de unión a cada tubo.. Analizar los tubos por citometr(a de flujo dentro de 6 )ora.

&esultados y discusión'

(igura ) Caracterización de +e345

*otas" ;A< -E7 de las nanopart(culas de +e345 que eran de alta densidad de electrones con un diámetro de

aproimadamente 8 nm. ;< Distribución de diámetro )idrodinámico de nanopart(culas de +e345 en PB medido por

un analizador de tama1o de part(cula. +bre!iaturas" -E7' microscop(a electrónica de transmisión0 PD*' (ndice de

polidispersidad0 PB' solución salina tamponada con fosfato.

$a +igura 6A muestra las fotos de -E7 de nanopart(culas de +e 345. ajo -E7' las nanopart(culas

de +e345 mostraron una alta densidad de electrones. Bu diámetro era de aproimadamente 8

nm. De los resultados de D$B' se determinó que el tama1o )idrodinámico de +e 345 fue de 95'&

nm y el (ndice de polidispersidad fue de 8.6! ;+igura 6


7/18

medición por D$B muestra el tama1o )idrodinámico de las nanopart(culas. $a agregación de 7,P

es muy fácil' as( que el tama1o )idrodinámico del 7,Ps es más grande que su tama1o real.

(igura 2 Caracterización de nanopart(culas de PE*%+e345.

*otas" ;A< -E7 de las nanopart(culas de PE*%+e345 cuya forma y tama1o fueron similares a las nanopart(culas de

+e345. . ;< Espectro +-*@ de nanopart(culas magnéticas de PE*%+e 345. $a cur"a de negro es la +e 345 y la cur"a roja

es la PE* +e345. -res flec)as azules indican respecti"amente tres picos caracter(sticos de PE* situados en 3'853.9 cm%

6' '=!8.6 cm%6 y 6'595.& cm%6. ;C< El potencial zeta de +e345 y PE*%+e345 en el p: . $a carga superficial de +e 345 fue

8 T 8'! mG y se con"irtió en 39'3 T 8'9 mG después de ser modificado con PE*. +bre!iaturas" -E7' microscop(a

electrónica de transmisión0 PE*' polieterimida0 +-*@' espectroscop(a infrarroja por transformada de fourier.

El monómero ;%C:%C:%,:< PE*' es un agente comMn de modificación de la superficie de pol"o'

puede unirse al AD, y se ad)ieren a las células' y ejerce la repulsión electrostática y los efectos de

impedimento estérico.

En este estudio' se preparó nanopart(culas de PE*%+e 345 cuya forma y tama1o fueron similares a

las nanopart(culas de +e345 ;+igura A


8/18

(igura , *magen de electroforesis en gel de agarosa de plásmido de AD,' libre y complejado con nanopart(culas de

PE*% +e345'*otas" 6' marcador0 ' ,P P%E#+P ;8 6


9/18

(igura . Caracterización de *+,#%7A,B y C!%*+,#%*7A,B.

*otas" ;A< -E7 de *7A,B cargadas de genes. ;< Distribución de diámetro )idrodinámico de *+,#%7A,B en PB

tal como se mide mediante un analizador de tama1o de part(cula. ;C< distribución del diámetro )idrodinámico de

C!%*+,g%*7A,B en PB tal como se mide mediante un analizador de tama1o de part(cula. ;D< El potencial zeta

de *+,#%7A,B y C!%*+,#%*7A,B en p: . +bre!iaturas" -E7' la microscop(a electrónica de transmisión0 PB'

solución salina tamponada con fosfato0 7A,B' nanoesferas de albMmina magnéticas0 *7A,B' nanoesferas de

albMmina inmunomagnéticas0 PD*' (ndice de polidispersidad0 C!' cetuimab.

reparación y detección de caracter#sticas de $%+*0 cargado de genes 1C22-$(*g-$%+*03

El análisis de -E7 mostró que el auto%preparado C!%*+,#%*7A,B era aproimadamenteesférico y de tama1o uniforme. $os materiales de magnetita con una alta densidad de electrones

se incorporaron bien en los nMcleos de A,B ;+igura 5A


10/18

(igura 4bser"ación de eficiencia de transfección de nanopart(culas.

*otas" ;A< células #$C%& y :EI=3 obser"adas bajo un microscopio de fluorescencia ;L 688


11/18

-anto en las células #$C%& como en las :EI=3 epresan bien el plásmido pE#+P. $a eficiencia

de la transfección de las PE*%+e345 y lipofectamina del grupo de las :EI=3 fue la misma que para

las #$C%&' y la eficiencia de transfección de C!%*+,#%*7A,B de las #$C%& fue más alta que

con las del grupo :EI=3.

$as nanopart(culas magnéticas ;7,Ps< )an sido desarrolladas como un nue"o "ector genético no

"iral y )an mostrado una biodisponibilidad satisfactoria además de una larga área de superficie

espec(fica.

$as 7,Ps pueden transportar D,A foráneo en células. Ua que las nanopart(culas son ligandos

para una "(a atracción electrostática de D,A' la superficie de +e345%7,Ps son recubiertas con

PE* cargadas positi"amente en este eperimento' las cuales son absorbidas mejor por la carga

negati"a de las moléculas D,A y cargando eficazmente el plásmido de epresión pE#+P para las

células #$C%&

(igura 4. Células te1idas de azul de Prusia después del tratamiento con los diferentes grupos de la sonda ;L 688

aumentos


12/18

(igura . $a interacción espec(fica entre células y C!%*+,#%*7A,B

*otas" 1+3 Eperimentos de inmunofluorescencia de células #$C%&a' C! dirigido a grupos0 b' ,o%C! dirigida

a grupos. 6' DAP* fluorescencia0 ' Alea +luor 5&& fluorescencia0 3' +luorescencia fusionada ;6 y


13/18

(igura 8 7@* in "itro.

*otas" ;A< 7@* in "itro de células :$8 y #$C%& y después del tratamiento con los diferentes grupos de la

sonda. ;< tiempo de relajación - de células #$C%& y :$8 después del tratamiento con los diferentes grupos

de la sonda ;2 indica P V8'8!


14/18

(igura Prueba de calor de nanopart(culas de +e345 y C!%*+,#%*7A,B in "itro.

*otas" ;A< Prueba de calor de +e 3 4 5 fluido nanopart(culas en A7+ in "itro. $a concentración de +e345 es 3'8' '!'

'8' 6'!' 6'8' y 8'! mg/m$. ;< Ensayo de calentamiento de C!%*+,#%*7A,B l(quido en A7+ in "itro. $a

concentración de +e en nanoesferas de albMmina fue de 6'8' 8'!' 8'!' 8'3!' 8'!' y 8'6! mg /

m$.+bre!iaturas" *7A,B' nanoesferas de albMmina inmunomagnéticas0 A7+' campo magnético alterno0 C!'

cetuimab.

rueba de calentamiento de Fe

3O

4 %*s y C22-$(*G-$%+*'

$a prueba termodinámica de 7,Ps de Fe

3O

4 in "itro mostró que cuando se coloca en A7+

;88 O:z' 8 A


15/18

(igura )9 $os resultados del ensayo de CCI&.

*otas" 2 Comparación entre el grupo eperimental y el grupo de control negati"o' P V8'8!. W Comparación entre cada

uno de los grupos eperimentales' P V8'8!. +bre!iaturas" CCI&' recuento de células Iit%&0 A,B' nanoesferas de

albMmina0 7A,B' nanoesferas de albMmina magnéticas0 *7A,B' nanoesferas de albMmina inmunomagnéticas0 )')ora0 @#@' tasa de crecimiento relati"o0 C!' cetuimab0 *A,B' inmuno%nanoesferas de albumina.

Los efectos terapéuticos sobre células GLC-82 y CC: 8 ensayo'

$os -@CB celulares de oc)o grupos después de 5 )oras' 5& )oras' y )oras se muestran en la

+igura 68. $os grupos eperimentales y de control negati"as difer(an significati"amente ;P' 8'8!


16/18

(igura )) $a apoptosis y necrosis de células #$C%& analizadas por citometr(a de flujo después de diferentes

tratamientos. *otas" ;A< #rupo de control negati"o0 ;< #rupo C! libre ;solución de C!


17/18

Citometr#a de ensayo de fluo

$as células #$C%& se ti1eron con aneina G y P* y se sometieron a citometr(a de flujo para

detectar la capacidad de di"ersos tratamientos para inducir la apoptosis.

$as rupturas de membranas durante finales de la apoptosis' y P* pueden infiltrarse en las células.

$as células necróticas se pueden diferenciar a partir de células apoptóticas' ya que pierden su

integridad de la membrana' y su fosfatidilserina degrada. $as células positi"as para sólo P* son

necróticas' mientras que las positi"as para aneina G y P* están en las Mltimas etapas de la

apoptosis y los Mnicos positi"os para aneina G se encuentran en las primeras etapas de la

apoptosis. El flujo citométrico de células apoptóticas re"eladas #$C%& en todos los grupos

eperimentales. $os (ndices de apoptosis fueron 6'? en el grupo C! libre' 69'35? en el grupo

de terapia génica' 33'&&? en el grupo de terapia génica C!%dirigida' 8'85? en el 7+: grupo'

3='6? en el grupo 7+:%C! dirigido' 3='? en la terapia génica y grupo de combinación 7+:'

9'9&? en el -erapia génica orientada C! y el grupo de combinación 7+:' y 8'!? en el grupo

control negati"o ;+igura 66


18/18

the study on the preparation and characterization of gene-loaded immunomagnetic albumin nanospheres...

Documents