tesis rodrigo rojas
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
“Estudio químico de Stevia monardifolia y Eupatorium pazcuarense”
T E S I S Q U E C O M O R E Q U I S I T O P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E :
MAESTRO EN CIENCIAS QUÍMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A :
RODRIGO ENRIQUE ROJAS PÉREZ
MÉXICO, D. F. 2009
El presente trabajo se llevó a cabo en el Departamento de Química
Orgánica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Eleuterio Burgueño
Tapia, con el apoyo de la beca CONACYT (206874) y SIP 20070891,
20082339 y 20091515.
Este trabajo forma parte del proyecto CONACyT 62213 “Estudio
químico-biológico y por RMN de terpenoides, alcaloides y derivados
del ácido shiquímico de origen vegetal”.
Esta tesis generó las siguientes participaciones en congresos:
1. Nuevo derivado de longipineno aislado de Stevia monardifolia.
Rodrigo E. Rojas-Pérez , Abigail I. Buendía-Trujillo, Ernestina Cedillo-Portugal,
Pedro Joseph-Nathan y Eleuterio Burgueño-Tapia. Presentado en la 4ª Reunion
de la Academia de Química Orgánica el 10 y 11 de Abril de 2008 en Patzcuaro,
Michoacan.
2. Cromenos de Eupatorium pazcuarense y evaluación de su actividad
antimicrobiana
Rodrigo Rojas-Pérez , Abigail I. Buendía-Trujillo, Ernestina Cedillo-Portugal, José
T. Hernández-Méndez y Eleuterio Burgueño-Tapia. Presentado en la 5ª. Reunión
de la Academia Mexicana de Química Orgánica, el 28 y 29 de Mayo de 2009 en
Zacatecas, Zacatecas.
Además derivó en la publicación:
A new longipinene diester from Stevia monardifolia Kunth.
Rodrigo E. Rojas-Pérez, Ernestina Cedilo-Portugal, Pedro Joseph-Nathan y
Eleuterio Burgueño-Tapia, Natural Product Communications Aceptado 2009.
I
ÍNDICE
1. Introducción 1
1.1. Productos Naturales 1
1.1.1. Biosíntesis de Productos Naturales 1
1.1.2. Importancia Biológica de los Productos Naturales 2
2. Antecedentes 5
2.1. Familia Compositae (Asteraceae) 5
2.1.1. El género Stevia 6
2.1.1.1 Importancia biológica del género Stevia. 8
2.1.2. El género Eupatorium. 10
2.1.2.1. Importancia biológica del género Eupatorium. 11
3. Justificación 14
4. Objetivos 14
4.1. Objetivo General 14
4.2. Objetivos Específicos 14
5. Resultados y Discusión 15
6. Conclusiones 55
7. Parte Experimental 55
9. Bibliografía 64
Anexo I 67
Anexo II 68
Anexo III 72
Anexo IV 73
Anexo V 74
Anexo VI 77
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Productos Naturales
Todos los compuestos aislados de origen orgánico se le denominan productos
naturales. Algunos de ellos como los polisacáridos, proteínas, grasas y ácidos
nucleícos son utilizados para el sustento del ser vivo que los genera y se les
denomina metabolitos primarios. Otros compuestos no parecen ser esenciales
para la existencia del organismo que los produce, y son llamados metabolitos
secundarios. Algunos ejemplos de estos últimos son los terpenos, los alcaloides,
etc. La razón por la cual los metabolitos secundarios son sintetizados es un
misterio, algunos autores creen que son productos de desintoxicación que el
organismo no puede eliminar y que almacena en vacuolas, pared celular, etc. Esta
explicación es válida si se considera que los organismos superiores cuentan con
sofisticados procesos para eliminar estos productos secundarios a través del
hígado y los riñones. 1
1.1.1 Biosíntesis de Metabolitos Secundarios
Conocer la síntesis biológica y el por qué y para qué el organismo produce
determinadas sustancias químicas, han sido algunos de los objetivos de los
científicos de todos los tiempos.
La ruta biogenética es una secuencia de reacciones en las cuales un organismo
sintetiza a una sustancia comenzando con una molécula inicial. Los compuestos
en los que la molécula inicial se transforma hasta llegar al producto final se les
denomina intermediarios naturales. Un metabolito secundario no es siempre el
resultado de un solo paso en una ruta biosintética. Y esta puede ramificarse a lo
largo de un enorme número de puntos.1
En la figura 1 se muestra una representación simple de lo anterior, donde se
puede ver la gran diversidad de tipos de compuestos que se pueden obtener a
través de relativamente pocas rutas fundamentales que dan lugar a miles de
productos naturales.2
2
Figura 1. Esquema general de rutas biosintéticas.
1.1.2 Importancia Biológica de los Metabolitos Secundarios
Por cientos de años los metabolitos secundarios han estado íntimamente ligados
al uso de medicinas tradicionales. Estudios clínicos, químicos y farmacológicos de
estas medicinas tradicionales, las cuales han sido derivados predominantemente
de plantas, fueron la base de muchas medicinas antiguas como la aspirina (1),
digitoxina (2), morfina (3), quinina (4), pilocarpina (5).3
El descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1928, re-aislamiento y estudios
clínicos hechos por Chain, Florey y colaboradores a inicios de los años 40’s y la
comercialización de penicilinas sintéticas revolucionaron la investigación para el
descubrimiento de nuevos fármacos. Después de lo acontecido con la penicilina,
compañías farmacéuticas y grupos de investigación montaron una gran colección
de cultivos de microorganismos para descubrir nuevos antibióticos. La producción
en esos años fue prolífica e incluye ejemplos como: estreptomicina (6),
CO2
hidratos carbono
acetato
piruvato
alcaloides
flovonoides
ácidos grasos
antraquinonas
fenoles
Análogos del fenilpropano
ácido shiquímico
óligo y
polisacáridos
carotenoides
fragmentos de
un carbono
proteínas
porfirinas
ciclo de Krebs
aminoácidos
porfobilinógeno
ácido mevalónico
diterpenos
geranil geraniol
sesquiterpenos
farnesol
monoterpenos
esteroides
triterpenos
escualeno
acetogeninas
3
cloramfenicol (7), clortetraciclina (8), cefalosporina C (9) y eritromicina (10). Todos
estos compuestos o derivados de ellos siguen utilizándose en la actualidad.3
Figura 2. Nuevos fármacos descubiertos en siglo XX.
En la actualidad una gran parte de medicamentos son de origen natural, ya sea
por que el principio activo es aislado de una planta o por que es sintetizado a partir
de un producto natural.3
En la Tabla 1 se muestran los resultados del análisis hecho por Newman y
colaboradores donde se puede apreciar que aproximadamente el 32% de los
fármacos registrados en el periodo de 1981 a 2002 estan relacionados con una
fuente natural.4
4
Tabla 1. Tipo y origen de nuevos fármacos. Origen del Fármaco Origen del Fármaco
Tipo Tot B N DN S S* V Tipo Tot B PN DN S S* V
Analgésico 15 13 2 Antiviral 35 2 1 8 24
Anestésico 5 5 Anticiolítico 10 10
Anti-Alzheimer 4 1 3 Contra hipert. pros. 4 1 2 1
Anti-Parkinson 10 2 4 4 Broncodilatador 8 2 6
Antialérgico 15 1 3 11 Metab. del Calcio 17 8 9
Antianginal 4 4 Carditotónico 13 3 5 5
Antiarrítmico 15 1 12 2 Antídoto 5 5
Antiartrítico 12 2 1 9 Contracepción 6 6
Antiasmático 12 2 8 2 Diurético 4 4
Antibacterial 90 9 61 19 1 Gastroprocinético 4 3 1
Anticancer 79 12 9 21 25 10 2 Hematopoyesis 5 5
Anticoagulante 16 3 12 1 Hematofilia 9 9
Antidepresivo 21 19 2 Hepatitis 17 7 1 9
Antidiabético 23 12 1 2 7 1 Hormonal 20 10 10
Antiemético 7 1 6 Terapia hormonal 4 4
Antiepiléptico 10 1 6 3 Hipnótico 11 11
Antifúngico 24 1 2 21 Hipocolesterolémico 9 3 1 2 3
Antiglaucoma 13 4 5 4 Hipolipidémico 8 1 7
Antihistamínico 12 12 Inmunoestimulante 10 4 3 2 1
Antihiperprolactinemia 4 4 Inmunosupresante 10 4 5 1
Antihipertensivo 75 1 40 34 Relajante muscular 10 4 3 3
Antiinflamatorio 50 1 3 46 Neuroléptico 10 8 2
Antimigraña 10 3 7 Nootrópico 8 3 5
Antiparásito 13 2 5 4 2 Inhib. ag. plaq. 4 3 1
Antipsoriatico 4 3 1 Sínd. def. respirat. 6 3 1 2
Antipsicótico 7 5 2 Vasodilatador 6 3 3
Antitrombótico 28 13 1 5 7 2 Vulneraria 5 2 2 1
Antiulcera 32 1 1 12 18 Total 868 91 40 209 386 131 11
Categorías de nuevos fármacos. Las categorías más importantes son las siguientes. “B”: Biológica. “N”: Producto natural. “DN”: Derivado de
producto natural. “S”: Sintético. “S*”: Sintético, pero el farmacóforo es un producto natural. “V”: Vacuna.4
Por otro lado, en un análisis hecho por Butler en 20043 se muestra que de los 35
medicamentos mas vendidos a nivel mundial en el periodo de 2000-2002,
aproximadamente el 34% son derivados de productos naturales y el resto son
derivados biológicos o productos sintéticos. 3
5
B12%
N5%
DN23%
S33%
S/IN10%
S*4% S*/IN
10%
V3%
B
N
DN
S
S/IN
S*
S*/IN
V
Figura 3. Nuevos fármacos 1981-2002.
El género Stevia es una fuente importante de terpenoides y algunos extractos se
han usado como edulcorantes, en el tratamiento de la diabetes y como
antioxidantes. Por otra parte, algunos extractos del género Eupatorium se han
empleado como agentes antimicrobianos y en el tratamiento de úlcera estomacal.
En este trabajo se describe el estudio químico de las especies S. monardifolia y E.
pazcuarense, como parte del estudio hecho a 5 especies distribuidas en el Valle
de México, para el estudio antimicrobiano.
2. ANTECEDENTES
2.1 Familia Compositae (Asteraceae)
La familia Compositae (Asteraceae) está constituida por unas 20000 especies de
plantas distribuidas por todo el mundo, principalmente en regiones templadas y
subtropicales. Las especies de esta familia son en su mayoría hierbas anuales y
vivaces, aunque también se pueden encontrar arbustos y árboles. Por su
estructura floral y por su composición química, se considera la familia más
evolucionada de todas las dicotiledóneas. Se caracterizan por presentar las flores
agrupadas en capítulos, inflorescencia que funcionalmente se comporta como una
6
flor. Sus hojas se muestran sin estípulas, generalmente alternas y en ocasiones en
roseta basal. La inflorescencia es un capítulo, que consiste en una estructura
ensanchada (receptáculo) donde se sitúan desde una a cientos de flores, rodeada
por las brácteas del involucro. Las flores pueden ser hermafroditas, unisexuales o
estériles. Sin cáliz o con éste reemplazado por vilano de pelos o escamas. La
corola está formada por 5 pétalos soldados; puede ser tubulosa, con forma de
tubo (flósculos o flores flosculosas) o de lengüeta con 3 o 5 dientes (lígulas o
flores liguladas).5
2.1.1 El género Stevia.
El género Stevia consta de aproximadamente 400 especies.6 Algunas de las
especies más comunes son S. elongata, S. eupatoria, S. purpurea, S. salicifolia, S.
serrata, S. tomentos, S. rhombifolia, S. reboudiana, etc.7-15 Dichas especies
pueden ser hierbas o arbustos, los cuales los podemos encontrar a altitudes que
van desde los 500 hasta los 3500 m sobre el nivel del mar. Éstas crecen por lo
regular en terrenos montañosos, sus hábitats pueden ser: prados, bosques,
bosques montañosos y bosques de coníferas.16
Especies de este género se encuentran distribuidos alrededor del mundo en
países como Japón, Argentina, Paraguay, Brasil, Bolivia, 9-11, 13, 14 y en México en
los estados de Morelos, Oaxaca, Pachuca, Veracruz, Edo. de México y el Distrito
Federal.7, 8, 12, 15
7
Figura 4. La especie más común del género Stevia: S. reboudiana.
Figura 5. Distribución mundial del género Stevia.
8
Algunas de las características morfológicas principales de este género son: tienen
cabezuelas pequeñas, mimoso-paniculadas, con 5 flores isomorfas, involucro
cilíndrico, de 5-6 brácteas angostas, receptáculo plano, desnudo, corolas
tubulosas, anteras de base obtusa y estilo de ramas lineares, obtusas, papilosas.
Generalmente las especies de este género son hierbas perennes o sufrutices.7
2.1.1.1 Importancia biológica del género Stevia.
Los indígenas de Paraguay y de Brasil han utilizado los extractos dulces como
edulcorante, en el tratamiento contra la obesidad, diabetes mellitus, enfermedades
del corazón y de caries.17
Los extractos dulces de algunas especies de este género han demostrado cierta
actividad en beneficio de la salud del ser humano como: antihipertensivo,
antihiperglicémico, antioxidante, noncariogénico, etc. 18
Una gran cantidad de terpenoides se han aislado de este género. A continuación
en la figura 6 se describen algunos grupos y entre paréntesis el número de
compuestos por grupo aislados hasta 2009.19
Algunos metabolitos secundarios aislados de este género han mostrado actividad
biológica interesante; por ejemplo, se ha demostrado que el esteviósido (11) y su
aglicona (12) actuan como antiinflamatorios y antitumorales;17 la ludartina (13)
exhibió protección en úlceras gástricas.20 De la parte aérea de la especie S. triflora
se aisló el flavonol (14), el cual mostró actividad antimicrobiana,21 la costunolida
(15), un constituyente de muchas plantas medicinales, incluida la parte aérea de
S. yaconensis y S. chamaedrys, el cual ayuda al tratamiento de la hepatitis B en
humanos.22 Por otro lado, se ha descrito que el eupatoriopicrin (16) se ha aislado
de S. sarensis, S. procumbens y S. maimarensis, ha mostrado una interesante
actividad anti-tumoral en cáncer de pulmón en ratones.22 También se ha descrito
que el casticin (17), aislado de S. breviaristata, es responsable de la actividad
antifúngica exhibida sobre Cladosporium cucumerinum.22
9
O
O O
O
H
H
O
O
H
O
O
O
HH
H
Germacrólidos (39)
Guaianólidos (93)
Eudesmanólidos (19)
Eremofilanos (7)Longipinanos (126)
Labdanos (32) ent-Kauranos (27)
Figura 6. Terpenoides aislados de algunas especies de Stevia.
Figura 7. Algunos metabolitos secundarios de Stevia con actividad biológica
10
2.1.2 El género Eupatorium.
El género Eupatorium consta de aproximadamente 1865 especies.7 Entre las más
distribuidas en el mundo tenemos a E. cannabinum, E. tinifolium, E. villosum, E.
glabratum, E. glutinosum, E. purpureum, E. lindleyanum, E. odoratum, E.
maculatum, E. saltillenseis, E. coelestinum, etc.7, 23-29
Este género se encuentra alrededor del mundo en países como Ecuador, China,
India, E.U.A., Colombia, Jamaica24-29 y también en diversos estados de la
Republica Mexicana, como Baja California Norte, Jalisco, Edo. de México y Distrito
Federal.7
Figura 8. Algunas especies comunes del género Eupatorium: a) E. cannabinum,
b) E. purpureum, c) E. maculatum, d) E. coelestinum.
11
Figura 9. Distribución mundial del género Eupatorium.
Algunas características principales de esta especie son: tienen cabezuelas de
tamaño diverso, aponajadas, o solitarias, sus flores son isomorfas, hermafroditas;
involucro cilíndrico, con pocas o muchas series de bracteas, receptáculo plano
convexo, desnudo o cerdoso; corolas tubulosas, 5-dentadas; anteras de base
obtusa, con apéndice apical; estilo de ramas lineares, obtusas o algo dilatadas
hacia el apéndice. Generalmente son hierbas, plantas sufruticosas o arbustos.7
2.1.2.1 Importancia biológica del género Eupatorium.
Este género ha sido empleado en la medicina tradicional como astringente,
antirreumático, antimicrobiano, antihistamínico, antibacterial, y también ha sido
utilizado en la cura de úlceras estomacales, diarrea, influenza y dolores de
cabeza; 24 y en algunos casos ha sido empleado como veneno de peces.26
Algunos extractos de plantas de Eupatorium han sido de gran utilidad para la
medicina y otras ciencias. Por ejemplo, extractos de E. capillifolium30 y de E.
odoratum31 mostraron actividad antimicrobiana, mientras que el extracto de AcOEt
de E. glutinosum ha mostrado actividad antimicrobiana y actividad citotóxica.24
A continuación se describen algunos metabolitos secundarios aislados de
extractos de especies de Eupatorium, de los cuales se ha descrito alguna
actividad biológica. El ácido sesquiterpénico (18), el diterpeno glucosidado (19) y
12
su aglicona (20), y el cromeno (21) aislados de la parte aérea de E.
aschenbornianum mostraron actividad antimicrobiana,24,30 contra los
microorganismos: Trycophyton mentagrophytes, T. rubrum, Candida albicans y
Aspergiilus niger.32 Por otro lado, el metilriocromeno (22), el cual fue aislado de E.
riparium mostró tener actividad antifúngica contra 5 especies.22
COOH
18
OH
RO
COOH
19. R= GLUCOSIL20. R= H
O
OH
O
21
O
O
O
22
O
Figura 10. Productos naturales de Eupatorium con actividad antimicrobiana.
La yeteina (23), el bakkenoloide A (24), el eupatolido (25) y el eupatólido (26)
fueron descritos como metabolitos secundarios con actividad inhibitoria de la
alimentación de insectos.23
El eupacunin (27), la eupacunexina (28) y la eupatocunina (29) han mostrado
actividad antitumoral33 y actividad citotóxica, junto con los compuestos
eupalinólidos B (30) y E (31).25
13
O
O
O
MeO
OMe
OMe
H
H
O O
H
O
O
O
X
25. X= N(CH2CH3)226. X= OMe
23
24
Figura 11. Productos naturales de Eupatorium con actividad inhibitoria de la
alimentación en insectos.
O
R'O OR''
RO
O
27 R= H; R'= Ac; R''= Ang
28 R= H; R'= Ac; R''=O
O
O
AcO OR
O
OR'
29 R= Ang; R'= H
O
O
O
OHH
HHO
30
O
O
O
H
H
31
OHHO
Cl
Figura 12. Metabolitos secundarios de Eupatorium con actividad citotóxica.
14
Continuando con el estudio químico de especies del Valle de México, en una
colecta reciente se obtuvieron muestras de E. pazcuarense, Penstemon
gentianoides, Penstemon roseus, Salvia concolor y S. monardifolia, cuyos
extractos serán evaluados contra algunas baterías de interés médico. Como parte
de esta investigación en este trabajo se planteó llevar a cabo el estudio químico de
E. pazcuarense y S. monardifolia.
3. JUSTIFICACION
Especies de los géneros Stevia y Eupatorium se han utilizado en la medicina
tradicional para tratar diferentes padecimientos, algunos de estos causados por
microorganismos. En la literatura se ha descrito la actividad antimicrobiana de
algunos extractos orgánicos y en menor proporción de productos naturales
aislados de especies de los géneros Stevia y Eupatorium.
Este trabajo forma parte de un estudio biodirigido, en el cual 5 especies que
crecen en el valle de México, fueron estudiadas para conocer su efecto contra 13
cepas de interés médico.
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Aislamiento, purificación y elucidación estructural de los metabolitos secundarios
presentes en la fracción no polar, medianamente polar y polar del extracto
metanólico de Stevia monardifolia y Eupatorium pazcuarense.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
4.2.1 Recolección, secado y molienda de la parte aérea de Stevia monardifolia y
Eupatorium pazcuarense.
4.2.2 Obtención de las fracciones no polar, medianamente polar y polar del
extracto metanólico.
4.2.3 Separación y purificación por técnicas cromatográficas y/o químicas de los
metabolitos secundarios presentes en dichas fracciones.
15
4.2.4 Obtención de sus propiedades físicas y espectroscópicas necesarias para la
elucidación estructural de estos metabolitos secundarios.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Estudio químico de Stevia monardifolia
El material vegetal seco y molido (600 g) se extrajo por maceración con metanol a
temperatura ambiente, durante 3 días. Después de este tiempo se filtró y el
disolvente se evaporó a presión reducida. Este procedimiento se repitió dos veces
más y se juntaron los extractos. El extracto crudo (27 g) se suspendió en una
mezcla metanol agua 7:3, se extrajo primero con hexano y posteriormente con
acetato de etilo, para dar después de la evaporación de los disolventes 12, 4 y 10
g, de las fracciones no polar (FNP), medianamente polar (FMP) y polar (FP),
respectivamente.
Fracción no polar.
Con la finalidad de eliminar el material graso, la fracción no polar se diluyó en la
mínima cantidad de acetona, se enfrió a 0 ºC durante 12 h, se filtró y se evaporó el
disolvente.
En el espectro de RMN 1H (Figura 13) de esta fracción se observaron señales
múltiples alrededor de δ 6.1, características del grupo angeloilo; también se
pueden observar señales alrededor de 2 ppm, características de protones
enlazados a carbonos con hibridación sp2. Por último, hacia frecuencias mas
bajas, se observan señales de grupos metilo.
Posteriormente 6 g de esta fracción se sometieron a cromatografía en columna
(CC) empacada con sílica gel como adsorbente, eluyendo con hexano y mezclas
de hexano-acetato de etilo de polaridad ascendente y finalmente con acetato de
etilo.
El análisis de la cromatografía en capa fina (CCF) condujo a la obtención de 8
fracciones principales, de las cuales se lograron obtener los compuestos 3234 y 33
(Figura 14).
16
Figura 13. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de la FNP de S. monardifolia.
17
Fig. 14 Derivados de longipineno aislados de la FNP de S. monardifolia.
Identificación del 7β,8α-diangeloiloxi-longipin-2-en-1-ona (32)
De la fracción eluida con hexano-acetato de etilo (9:1) de la cromatografía del
extracto hexánico, se obtuvieron 20 mg (0.074%) de 32 como un aceite color
amarillo claro.
El espectro de RMN 1H de 32 (Figura 15) mostró en 6.09 ppm (cc, 7.4 y 1.4 Hz, H-
3’) una señal múltiple que integró para dos protones, característica del protón
vinílico del grupo angeloilo. A frecuencias altas se observó una señal en 5.80 ppm
(m, H-2) que corresponde al protón vinílico H-2. Señales correspondientes a
protones unidos a carbonos base de oxígeno se observaron en δ 5.17 (d, 11 Hz,
H-7) y 5.44 (ddd, 11, 11 y 5 Hz, H-8). Las señales de los grupos metilos se
observaron en δ 2.05 (d, 1.4 Hz, Me-12), 1.15 (s, Me-14), 1.03 (s, Me-13) y 0.92
(s, Me-15).
Los metilos de los grupos angeloilo se observaron en δ 1.96 (dc, 7.4 y 1.4 Hz, H-
4’), 1.85 (q, 1.4 Hz, H-5’), 1.99 (dc, 7.4 y 1.4 Hz, H-4’’) y 1.78 (q, 1.4 Hz, H-5’’).
El espectro de RMN 13C de 32 mostró la presencia de 25 carbonos (Figura 16) de
los cuales 9 corresponden a carbonos con una hibridación sp2 y 16 con hibridación
sp3. De éstos, 2 están unidos a oxígeno.
La asignación de las señales de RMN 13C de los átomos de carbono protonados
se hizo en base a un experimento gHSQC (Figura 17). Así, se observó que las
señales de los protones de los metilos a frecuencias bajas en δ 2.05 (Me-12), 1.15
(Me-14), 1.03 (Me-13) y 0.92 (Me-15), mostraron correlación con las señales de 13C a δ 23.3, 20.2, 24.0 y 26.8 asignando éstas a los carbonos 12, 14, 13 y 15,
respectivamente.
18
H3’ H8
H7
H11H2 H4
H5
H9β
Me12
Me4’’
Me5’
Me14
Me13
Me15
O
O
O
O
O
2
4
6
8
10
12
13
15 14
2'
4'
5'
32
Me4’
Me5’’
H9α
Figura 15. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) del compuesto 32.
19
C1 C3
C1’ C3’ C2’
C2C7 C8 C5 C11
C10
C4
C9
C6 Me15
Me13
Me12
Me14
Me4’
Me5’
Figura 16. Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) del compuesto 32.
20
Las señales del metileno que aparecen en δ 1.94 (H-9α) y 2.22 (H-9β)
correlacionaron con la señal de δ 43.8 asignada al C-9. Mientras que la señal del
grupo metino vinílico en δ 5.80 (H-2) mostró correlación con la señal de 13C a δ
122.6 asignándose así el C-2. Por otro lado, los metinos base de oxígeno, cuyas
señales aparecen en δ 5.17 (H-7) y 5.44 (H-8), muestran correlación con las
señales en δ 75.8 y 68.2 asignándose a los carbonos 7 y 8, respectivamente. Los
metinos restantes, cuyas señales aparecen en δ 2.79 (H-4), 2.32 (H-5) y 2.89 (H-
11), y que correlacionaron con las señales en δ 49.0, 65.2 y 57.7, permitió asignar
estas señales a los C-4, C-5 y C-11, respectivamente. Finalmente, las señales de
los protones de los grupos angeloilo que aparecen en δ 6.09 (H-3’ y 3’’), 1.99 (H-
4’’), 1.96 (H-4’), 1.85 (H-5’) y 1.78 (H-5’’), mostraron correlaciones con las señales
en δ 139.4, 139.5, 15.7, 15.8, 20.5 y 20.2, asignándose así los átomos C-3’, C-3’’,
C-4’’, C-4’, C-5’ y 5’’, respectivamente.
La asignación de los carbonos cuaternarios se logró con la ayuda del experimento
gHMBC, el cual muestra correlaciones entre los átomos de hidrógeno y de
carbono a 2 y 3 enlaces (Figura 18). Las correlaciones observadas en este
experimento se describen a continuación: δ 2.79 (H-4), 2.32 (H-5) y 2.05 (Me-12)
correlacionaron con la señal en δ 170.9 asignando esta señal al carbono
cuaternario C-3; la señal a δ 2.79(H-4), 2.32 (H-5), 5.17 (H-7), 5.44 (H-8), 2.89 (H-
11), 1.15 (Me-14) y 0.92 (H-15) mostraron correlación con la señal en 36.7 ppm, la
cual se asignó al C-6; por su parte las señales a δ 2.79(H-4), 2.32 (H-5), 1.94 y
2.22 (H-9α y β), 2.89 (H-11) y 1.03 (Me-13) correlacionaron con la señal en δ 52.4,
lográndose asignar el C-10. La asignación de los carbonilos de los grupos
angelatos se hizo gracias a su correlación con los protones H-7 (5.17 ppm) y H-8
(5.44 ppm). La asignación del carbonilo α, β insaturado se hizo por
desplazamiento químico (δ 203.0) y su correlación a dos enlaces con H-2.
21
H3’ H2 H8H7
H11 H4H5
H9α
Me12Me4’
Me5’
Me13
Me14
Me15
C3’
C2
C7
C8C5
C11
C4
C9
Me15
Me4’
Me5’
Me14
Me12
Me13
Figura 17. Experimento HSQC del compuesto 32.
22
H3’H2
H8H7 H11 H4
H5
H9α
Me12
Me4’ Me5’
Me13
Me14
Me15
C3’
C2
C7
C8C5
C11C4
C9
Me15
Me4’
Me5’
Me14Me12
Me13
C6
C10
C1
C1’C3
C2’
Figura 18. Experimento gHMBC del compuesto 32.
23
La estereoquímica de los grupos angeloilo y la estereoquímica relativa de los
protones del metileno 9, se hizo gracias a la ayuda de un experimento NOESY
(Figura 19), en el cual se observaron correlaciones entre la señal de H-11 (2.89
ppm) y la señal de H-7 (5.17 ppm), asignándose así la estereoquímica β para el
grupo angeloilo unido a C-7. La constante de acoplamiento entre H-7 y H-8 es de
11.0 Hz, lo que permitió establecer que estos protones se encuentran trans,
estableciendo la estereoquímica relativa de los grupos angeloilo. La asignación de
la estereoquímica relativa de los protones del metileno 9, se hizo con la ayuda del
mismo experimento NOESY a través de la correlación mostrada entre H-8β y la
señal de H-9, observada en δ 2.22, asignándose así el átomo H-9β; en
consecuencia, la señal de H-9 observada en δ 1.94 se asignó como α.
Una búsqueda bibliográfica detallada mostró que este compuesto ya se había
descrito como producto natural de la especie S. lemmonia,34 sin embargo, solo se
describieron algunos datos de RMN de 1H y no se describieron los datos de RMN
de 13C. La asignación completa de los datos de RMN de 1H y de 13C se muestran
en la Tabla 2.
24
Me14
H3’ H2 H8H7
H11 H4
H5
H9α
Me12
Me4’
Me5’
Me13
Me15
Me15
Me14
Me13
Me5’
Me4’Me12
H9αH5
H4
H11
H7
H8
H2
H3’
Figura 19. Experimento NOESY del compuesto 32.
25
Tabla 2. Datos de RMN para 32.
δ 13C δ 1H (J Hz) HMBC
1 203.0 - -
2 122.6 5.80 m C4, C11, C12
3 170.9 - -
4 49.0 2.79 d (6.9) C2, C3, C5, C6, C9, C10, C11, C12
5 65.2 2.32 s C1, C3, C4, C6, C7, C10, C11, C14, C15
6 36.7 - -
7α 75.8 5.17 d (11.0) C6, C8, C9, C14, C15, C1’
8β 68.2 5.44 ddd (11.0, 11.0, 5.0) C6, C7, C9, C1’’
9α 43.8 1.94 dd (14.3, 11.0) C4, C7, C8, C10, C11
9β 43.8 2.22 dd (14.3, 5.0) C4, C7, C8, C10, C11
10 52.4 - -
11 57.7 2.89 dd (6.9, 1.4) C1, C2, C4, C5, C6, C9, C10
12 23.3 2.05 d (1.4) C2, C3, C4
13 24.0 1.03 s C4, C9, C10, C11
14 20.2 1.15 s C5, C6, C7, C15
15 26.8 0.92 s C5, C6, C7, C14
1’ 166.6 - -
2’ 127.4 - -
3’ 139.4 6.09 cc (7.4, 1.4) C1’, C2’, C4’, C5’
4’ 15.8 1.96 dc (7.4, 1.4) C1’, C2’, C3’, C5’
5’ 20.5 1.85 q (1.4) C1’, C2’, C3’
1’’ 166.8 - -
2’’ 127.3 - -
3’’ 139.5 6.09 cc (7.4, 1.4) C1’’, C2’’, C4’’, C5’’
4’’ 15.7 1.99 dc (7.4, 1.4) C1’’, C2’’, C3’’, C5’’
5’’ 20.2 1.78 q (1.4) C1’’, C2’’, C3’’
26
Identificación del 7β-angeloiloxi-8α-isovaleroiloxi-longipin-2-en-1-ona (33)
Continuando con la purificación de las fracciones obtenidas de la cromatografía en
columna de la FNP, la fracción eluida con la mezcla de hexano:acetato de etilo 4:1
se sometió a recromatografía, de donde se obtuvieron 40 mg de un aceite amarillo
pálido. El espectro de RMN mostró que se trataba de la mezcla de 32 y del nuevo
derivado de longipineno 33 en una proporción 4:1. La asignación estructural y la
asignación de las señales de RMN de 1H y 13C se hizo con base en sus datos de
RMN de1H y 13C en una y dos dimensiones de esta mezcla.
El espectro de RMN de 1H (Figura 20) mostró una señal en 6.15 ppm,
característica del protón vinilico del grupo angeloilo, que a diferencia de 32, solo
integró para un protón. La señal del protón vinilico del anillo de 6 miembros se
observó a 5.80 ppm (H-2). El área bajo la curva de estas dos señales es
aproximadamente la misma, lo que permitió concluir que solo estaba presente un
grupo angeloilo. Sin embargo, seguían observando 2 señales de protones unidos
a carbonos base de oxígeno de éster a δ 5.32 (H-8) y 5.14 (H-7).
Las señales de los grupos metilos del anillo de longipineno se observaron en δ
2.05 (d, 1.4 Hz, Me-12), 1.15 (s, Me-14), 1.03 (s, Me-13) y 0.92 (s, Me-15), así
como también se observó una señal adicional del gem-dimetilo como una señal
doble en δ 0.91 (d, 5.9 Hz). El resto de las señales fueron muy parecidas a las
observadas para 32.
El espectro desacoplado de RMN de 13C de 33 (Figura 21), mostró 25 señales,
correspondientes al anillo de longipineno y dos ésteres de cinco átomos de
carbono. El espectro de RMN de 13C fue muy similar a 32, con excepción de las
señales correspondientes al grupo isovaleroiloxi, las cuales se observaron en δ
172.2 (C-1), 43.3 (C-2), 25.5 (C-3) y 22.3 (C-4 y 5).
La asignación completa de los datos de RMN de 1H y 13C de 33 se hizo de la
misma forma que 32, con la ayuda de experimentos gHSQC, gHMBC y NOESY
(Figuras 22, 23 y 24, respectivamente), y se muestran en la Tabla 3.
La asignación de la estereoquímica de los ésteres, así como la de los protones del
metileno 9, se hizo con la ayuda de un experimento NOESY.
27
H3’
H2
H8
H7
H5
H11 H4 Me2’’
H9
Me12
Me4’
Me14
Me13
Me5’
Me15Me4’’Me5’’
Figura 20. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) del compuesto 33.
28
C1
C9 C3’’
C6
C2’’
C15
C13
C4 y 5’’
C1’’
C3
C1’
C3’
C2’
C5C7
C2
C8
C11 C4
C10
C12
C14
C5’
C4’
Figura 21. Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) del compuesto 33.
29
Una vez concluida la asignación estructural, la revisión de la literatura mostró que
el compuesto en nuestras manos (33) no había sido descrito anteriormente.
Para obtener los datos espectroscópicos y espectrométricos, se requería el
compuesto puro, por lo cual se realizaron múltiples recromatografias en columnas
sin tener éxito. Se utilizó, entonces la Cromatografía de Líquidos de Alta
Resolución (HPLC). La separación de la mezcla de los dos compuestos se logró
con una columna de silica de 250 x 4.6 mm y 5 µm de tamaño de partícula,
usando hexano como eluente, de dicha separación de lograron obtener 7 mg de
33 con un tiempo de retención de 26 minutos.
Con el fin de conocer la conformación de mínima energía del compuesto 33, se
realizó un protocolo Montecarlo a nivel de mecánica molecular utilizando el
programa PC Model.35 De este se lograron obtener 83 confórmeros divididos en 3
grupos de conformaciones con una diferencia de energía de 10 kcal/mol, los
cuales se muestran en la fig. 25. En cada uno de estos grupos de conformaciones
se puede observar que los anillos del triciclo mantienen una conformación fija y
que lo que muestra movilidad son los residuos de los ésteres. En la conformación
A, el ángulo dihedro 7α-8β, 8β-9α y 8β-9β es de -51.5, 63.8 y -49.8º,
respectivamente; mientras que estos mismos ángulos dihédros para los
confórmeros B y C son de 168.2, 172.7 y 60.6º, y de -136.6, 70.6 y -41.0º,
respectivamente.
A B C
Fig. 25 Conformaciones de mínima energía de 33 (∆E=10 kcal/mol)
30
Una vez realizado esto, cada uno de estos confórmeros se optimizaron utilizando
la teoría de funcionales de la densidad (DFT) a un nivel B3LYP/6-31G*36 lo que
condujo únicamente a 18 confórmeros, con una diferencia de energía de 2.5
kcal/mol. Estos confórmeros fueron reoptimizados a un nivel de cálculo
B3LYP/DGDZVP,37,38 obteniéndose así los 13 confórmeros mas estables, los
cuales contribuyen con el 96.7 % de la población conformacional. Los ángulos
diedros y las constantes de acoplamiento calculadas se muestran en la tabla 4.
Como se puede ver en la tabla 3, los valores de las constantes de acoplamiento
calculadas y las experimentales son muy similares, por lo que podemos decir que
la conformación en solución y la conformación calculada son prácticamente las
mismas.
Tabla 4. Constantes de acoplamiento calculadas y experimentales para 33.
Átomos J calculadas J experimentales
7α-8β 9.6 10.8
8β-9β 4.7 4.8
8β-9α 10.8 10.8
31
H3’ H2 H8 H7 H11 H4H9
H5
Me2’’
Me12
Me4’
Me5’Me14
Me13
Me15
Me4’’
Me5’’
C3’
C2
C7
C8C5
C11
C4
C9 C2’’
C15
C3’’
C13C12
C4 y 5’’
C14
C5’C4’
Figura 22. Experimento HSQC del compuesto 33.
32
H3’ H2 H8 H7 H11 H4H9
H5
Me2’’
Me12
Me4’
Me5’
Me14
Me13
Me15
Me4’’
Me5’’
C3’
C1
C1’’C3
C1’
C2’
C2
C7
C8
C5
C11C10
C4C9
C2’’C6
Figura 23. Experimento gHMBC del compuesto 33.
33
H3’H2 H8 H7
H11 H4 H9
H5
Me2’’
Me12
Me4’
Me5’
Me14
Me13
Me15
Me4’’
Me5’’
Figura 24. Experimento NOESY del compuesto 33.
34
Tabla 3. Datos de RMN para 33.
δ 13C δ 1H (J Hz) HMBC
1 203.1 - -
2 122.5 5.80 m C4, C11, C12
3 171.0 - -
4 49.0 2.76 d (6.6) C2, C3, C5, C6, C9, C10, C11, C12
5 65.1 2.31 s C1, C3, C4, C6, C7, C10, C11, C14, C15
6 36.6 - -
7α 75.8 5.14 d (10.8) C6, C8, C9, C14, C15, C1’
8β 68.6 5.32 ddd (10.8, 10.8, 4.8) C6, C7, C9, C1’’
9α 43.7 1.88 dd (14.2, 10.8) C4, C7, C8, C10, C11
9β 43.7 2.15 dd (14.2, 4.8) C4, C7, C8, C10, C11
10 52.4 - -
11 57.6 2.87 dd (6.6, 1.2) C1, C2, C4, C5, C6, C9, C10
12 23.3 2.05 d (1.2) C2, C3, C4
13 24.0 1.03 s C4, C9, C10, C11
14 20.2 1.15 s C5, C6, C7, C15
15 26.8 0.92 s C5, C6, C7, C14
1’ 166.6 - -
2’ 127.5 - -
3’ 139.5 6.15 cc (7.3, 1.5) C1’, C2’, C4’, C5’
4’ 15.9 2.02 dc (7.3, 1.5) C1’, C2’, C3’, C5’
5’ 20.6 1.88 q (1.5) C1’, C2’, C3’
1’’ 172.2 - -
2’’ 43.3 2.08 d (1.8) C1’’, C3’’, C4’’, C5’’
3’’ 25.5 2.02 th (6.9, 1.8) C2’’, C4’’, C5’’
4’’ 22.3 0.91 d (6.9) C2’’, C3’’, C5’’
5’’ 22.3 0.91 d (6.9) C2’’, C3’’, C4’’
35
Fracción medianamente polar.
El espectro de RMN 1H de dicha fracción (Figura 26), muestra el mismo tipo de
señales que el de la parte no polar; señales múltiples alrededor de δ 6.1,
característica del grupo angeloilo, la señal del protón vinilico alrededor de 5.8 ppm,
además se observan señales a frecuencias altas que podrían ser de flavonoles.
Para iniciar con el trabajo de purificación se tomaron 4 g de esta fracción y se
sometieron a cromatografía en columna (CC) empacada con silica gel como
adsorbente, eluyendo con hexano y mezclas de hexano-acetato de etilo de
polaridad ascendente hasta llegar a acetato de etilo, mezclas de acetato de etilo-
metanol de polaridad ascendente y finalmente metanol. Después del análisis por
CCF se lograron obtener 9 fracciones principales. De la fracción eluida con 9:1 se
lograron aislar 4 mg (0.015 %) del compuesto 3439 (Figura 27).
De la recromatografía de la fracción eluida con 4:1, de la cromatografía inicial, se
aislaron 40 mg de la mezcla de 32 y 33 en una proporción 2:3.
Figura 27. Derivado de longipinano aislados de la FMP de S. monardifolia.
5.2 Parte Química
Con la finalidad de tener más evidencias estructurales de los compuestos
obtenidos de la parte aérea, se decidió hidrolizar a los ésteres 32 y 33. Sin
embargo, las cantidades obtenidas de estos compuestos fue realmente pequeña,
por lo que se decidió llevar a cabo la reacción de hidrólisis, tratando 1 g del
extracto hexánico de la raíz de S. monardifolia con 3 g de KOH, obteniéndose así,
después del trabajo de purificación, al nuevo compuesto 35 y a los previamente
descritos en la literatura, 3639 y 3740 (Figura 28).
36
Figura 26 Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de la FMP de S. monardifolia.
37
Figura 28. Alcoholes obtenidos de la hidrólisis de la mezcla de longipinenos.
Identificación del 7β,8α-dihidroxilongipin-2-en-1-ona (35)
De la recromatografía de la fracción eluida con hexano-acetato de etilo (7:3), se
obtuvieron 62 mg (10.33%) del nuevo compuesto derivado de longipineno 35,
como un sólido blanco.
El espectro de RMN 1H de 35 (Figura 29) ya no mostró las señales debidas al
grupo angeloilo, el resto de las señales fueron muy parecidas al compuesto 33,
excepto las señales de protones unidos a carbono base de oxígeno, las cuales se
observaron ahora en δ 3.34 (d, 10.5 Hz, H-7) y 3.87 (ddd, 10.5, 4.5 Hz, H-8).
La asignación de la estereoquímica de los grupos hidroxilo, así como la de los
protones del metileno 9 y la asignación completa de los datos de RMN de 1H y de 13C (Tabla 5) se hizo de la misma forma que para 32.
La recristalización de 35 con una mezcla de hexano-acetato de etilo (7:3) produjo
cristales adecuados para su análisis por difracción de rayos X de monocristal. En
la figura 30 se observa la perspectiva molecular, la cual muestra la estereoquímica
relativa de H-7 y H-8 con ángulos diedros H7-C7-C8-H8, H4-C4-C5-H5 y H5-C5-C11-
H11 de 169.7, 96.0 y -100.2 °, respectivamente.
En las tablas 6 y 7 se pueden observar los datos de este estudio.
El compuesto 35 (60 mg) se trató con anhídrido acético y piridina para obtener
después de su purificación el compuesto 38.
38
H2
H8
H7
H5
H11 H4 H9β
Me14
H9α
Me13
Me15
Figura 29. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) de 35.
39
Tabla 5. Datos de RMN para 35.
δ 1H (J Hz) δ 13C HMBC
1 203.9
2 5.80 m (1.0) 122.4 C-4, C-11, C-12
3 171.5
4 2.58 d (7.0) 49.3 C-2, C-3, C-11, C-12
5 2.28 s 65.8 C-1, C-3, C-4, C-6, C-7, C-10, C-15
6 36.9
7 3.34 d(10.6) 78.6 C-6, C-8, C-9, C-14, C-15
8 3.87 ddd (10.6, 10.6, 4.5) 68.3 C-6, C-7
9β 2.25 dd (14.0, 4.5) 46.8 C-8, C-10, C-13
9α 1.68 dd (14.0, 10.5) 46.8 C-4, C-7, C-8, C-10, C-11, C-13
10 52.5
11 2.73 dd (7.0, 1.0) 57.8 C-1, C-4
12 2.05 d (1.0) 23.4 C-2, C-3, C-4
13 1.08 24.2 C-4, C-9, C-10, C-11
14 1.18 27.1 C-5, C-6, C-7, C-15
15 0.98 18.8 C-5, C-6, C-7, C-14
Figura 30. Estructura de difracción de Rayos-X de 35
40
Tabla 6. Datos del cristal y de la colección de 35.
Fórmula empirica C15 H22 O3 Peso molecular 250.33
Temperatura 294(2) K
Dimensiones 0.71073 Å
Sistema del cristal Ortorombico
Grupo espacial P 21 21 21 Dimensiones de la celda a = 7.5104(2) Å α= 90°. b = 10.6711(2) Å β= 90°. c = 17.3320(4) Å γ= 90°.
Volumen 1389.06(6) Å3
Z 4
Densidad (calculada) 1.197 Mg/m3
Coeficiente de absorción 0.082 mm-1
F(000) 544
Tamaño de cristal 0.41 x 0.26 x 0.13 mm3
Rango de teta para la colección 2.96 a 32.40°.
Rangos del índice -10<=h<=11, -15<=k<=15, -24<=l<=21
Reflexiones colectadas 8896
Reflexiones independientes 2620 [R(int) = 0.0205]
Corrección de la absorción Semi-empirica de equivalentes
Transmisión mínima y máxima 0.989 y 0.952
Método de refinamiento Full-matrix least-squares on F2
Índice final R R1 = 0.0534, wR2 = 0.1340
41
Tabla 7. Ángulos de torsión seleccionados (°) de la estruct ura cristalina de 35.
Átomos Ángulos °
C(3)-C(4)-C(5)-C(6) -155.11(16)
C(10)-C(4)-C(5)-C(6) 95.23(17)
C(3)-C(4)-C(5)-C(11) 82.91(14)
C(10)-C(4)-C(5)-C(11) -26.76(13)
C(11)-C(5)-C(6)-C(12) -79.7(2)
C(4)-C(5)-C(6)-C(12) 176.01(18)
C(11)-C(5)-C(6)-C(13) 163.57(15)
C(4)-C(5)-C(6)-C(13) 59.3(2)
C(11)-C(5)-C(6)-C(7) 39.1(2)
C(4)-C(5)-C(6)-C(7) -65.2(2)
C(12)-C(6)-C(7)-C(8) 169.62(17)
C(13)-C(6)-C(7)-C(8) -70.8(2)
C(5)-C(6)-C(7)-C(8) 52.0(2)
C(6)-C(7)-C(8)-C(9) -79.2(2)
C(7)-C(8)-C(9)-C(10) 57.7(2)
C(8)-C(9)-C(10)-C(14) 164.0(2)
C(8)-C(9)-C(10)-C(4) 31.0(3)
C(8)-C(9)-C(10)-C(11) -63.8(2)
C(3)-C(4)-C(10)-C(14) 39.1(2)
C(5)-C(4)-C(10)-C(14) 145.36(19)
C(3)-C(4)-C(10)-C(9) 165.57(16)
C(5)-C(4)-C(10)-C(9) -88.17(17)
C(3)-C(4)-C(10)-C(11) -79.73(15)
C(5)-C(4)-C(10)-C(11) 26.53(12)
C(6)-C(5)-C(11)-C(10) -98.77(16)
C(4)-C(5)-C(11)-C(10) 26.62(13)
C(14)-C(10)-C(11)-C(5) -147.14(18)
C(9)-C(10)-C(11)-C(5) 86.08(16)
C(4)-C(10)-C(11)-C(5) -26.65(12)
42
Identificación del 7β,8α-diacetiloxilongipin-2-en-1-ona (38)
Después de la purificación, se obtuvieron 7 mg (10%) del nuevo compuesto 38
como un aceite color amarillo tenue, cuyo espectro de RMN 1H (Figura 31) mostró
las señales típicas de los grupos acetilo a δ 2.08 y 2.03, y los protones base de
oxígeno en δ 4.99 (d, 11 Hz, H-7) y 5.26 (ddd, 5 y 11 Hz, H-8).
La asignación completa de los datos de RMN de 1H y de 13C se muestra en la
Tabla 8.
Tabla 8. Datos de RMN para 38.
δ 1H (J Hz) δ 13C HMBC
1 202.9
2 5.79 m (1.5) 122.5 C-4, C-12
3 170.9
4 2.74 d (6.5) 49.0 C-2, C-3, C-11, C-12
5 2.29 s 65.0 C-1, C-3, C-4, C-7, C-10, C-14, C-15
6 36.4
7 4.99 d (11.0) 78.4 C-6, C-8, C-9, C-14, C-15, C-1’
8 5.26 ddd (11.0, 11.0, 5.0) 68.9 C-7, C-1’’
9β 2.17 dd (5.0, 14.5) 43.5 C-4, C-8, C-10, C-11, C-13
9α 1.86 dd (11.0, 14.5) 43.5
10 52.3
11 2.85 dd (6.5, 1.5) 57.6 C-1, C-9, C-10
12 2.05 d (1.5) 23.3 C-2, C-3, C-4
13 1.00 24.0 C-4, C-9, C-10, C-11
14 1.09 26.7 C-5, C-6, C-7, C-15
15 0.90 20.0 C-5, C-6, C-7, C-14
1’ 170.04
2’ 2.03 21.0
1’’ 170.02
2’’ 2.08 20.8
43
H2 H8
H7 H5
H11 H4 H9β
Me14
H9α
Me13
Me15
O
O
O
O
O
O
2
4
6
8
10
12
13
15 14
38
Me12
Figura 31. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) de 38.
44
5.3 Estudio químico de Eupatorium pazcuarense
El material vegetal seco y molido (600 g) de E. pazcuarense se trabajó siguiendo
la misma metodología que aquella usada para S. monardifolia. Se obtuvieron 7, 5
y 16 g, de las fracciones no polar, medianamente polar y polar, respectivamente.
Fracción no polar.
La fracción no polar se diluyó en acetona y se enfrió, para después filtrar y eliminar
las grasas. El espectro de RMN 1H de dicha fracción (Fig. 32), mostró la presencia
de un compuesto principal, así como señales en la región de los protones
aromáticos y vinílicos para otros compuestos minoritarios.
Posteriormente, a 5 g de esta fracción se sometieron a CC empacada con sílica
gel como adsorbente, eluyendo con hexano y mezclas de hexano-acetato de etilo
de polaridad ascendente y finalmente con acetato de etilo.
El análisis de CCF permitió reunir 8 fracciones principales, de las cuales se obtuvo
el compuesto 3941 y la mezcla de 4042 y 4143 (Figura 33), cuya identificación se
hizo con base en sus datos espectroscópicos y por comparación con aquellos
descritos en la literatura.
Figura 33. Derivados de cromeno aislados de la FNP de E. pazcuarense.
45
Figura 32. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de la FNP de E. pazcuarense.
46
Identificación del 5-hidroxi-6-acetil-8-metoxicromeno (39)
De la fracción eluida con hexano-acetato de etilo (9:1) de la cromatografía del
extracto hexánico, se obtuvieron 4.2 mg (0.084%) de 39 como un sólido amorfo
color amarillo. El espectro de RMN 1H de 39 (Figura 34) mostró una señal a δ
12.79 (OH) característica del protón del grupo hidroxilo puenteado. En δ 7.04 se
observó la señal del protón aromático. A frecuencias altas se observaron dos
señales dobles en 6.72 ppm (d, 7.4 Hz) y otra en 5.61 ppm (d, 7.4 Hz) que
corresponden a los protones vinílicos H-4 y H-3, respectivamente. La señal del
grupo metoxilo se observó en δ 3.85, mientras que la señal correspondiente al
grupo acetilo se observó en δ 2.54. Por último, a campos altos se observó la señal
correspondiente al gem-dimetilo alrededor de 1.51 ppm.
El espectro de RMN 13C de 39 mostró la presencia de 14 carbonos (Figura 35) de
los cuales 9 corresponden a carbonos con una hibridación sp2 y 5 con hibridación
sp3, de los cuales uno está unido a un átomo de oxígeno.
La asignación de las señales de RMN 13C de los átomos de carbono protonados
se hizo con base en un experimento gHSQC (Figura 36). Así, tenemos que la
señal del protón aromático observada a frecuencias altas en δ 7.04 (H-7) mostró
correlación con la señal de 13C a δ 116.0 asignándose ésta al átomo de carbono 7.
Las señales de los protones vinilicos que aparecen en δ 6.72 (H-4) y 5.61 (H-3)
correlacionaron con las señales en δ 116.0 y 128.4, asignándose a los átomos de
carbono 4 y 3, respectivamente. El grupo metoxilo en δ 3.85 (O-Me) mostró
correlación con la señal de 13C a δ 57.2, asignándose así el carbono del metilo del
grupo metoxilo. Por otro lado, el metilo del grupo acetilo cuya señal aparece en δ
2.54, muestra correlación con la señal en δ 26.3, asignándose así el carbono del
metilo del grupo acetilo. Finalmente, el gem-dimetilo cuya señal aparece en δ 1.58
mostró correlación con la señal en δ 28.2.
47
OH
ArH4 H3
OMe
O
(Me)2
Figura 34. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) del compuesto 39.
48
C=O
C5
OMeC2
C4a
C6
C7
C4C3
C8a
C8
(Me)2
O
Figura 35. Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) del compuesto 39.
49
La asignación de los carbonos cuaternarios se hizo gracias a la ayuda del
experimento gHMBC, (Figura 37). Las correlaciones observadas en el espectro de
dicho experimento se describen a continuación: δ 1.58 (Me), 5.61 (H-3) y 6.72 (H-
4) correlacionaron con la señal en δ 78.2, pudiéndose así asignar esta señal al
carbono 2; δ 12.79(OH) y 5.61 (H-3) observó correlación con la señal en 110.3
ppm, la cual se asignó al carbono 4a; mientras que las señales a δ 12.79(OH),
7.04 (H-7) y 6.72 (H-4) correlacionaron con la señal en δ 155.0, lográndose, así,
asignar el C-5. Las señales en δ 12.79 (OH) y 2.54 (Ac), tuvieron correlación con
la señal en 111.8 (C-6). Las señales del protón 7 y del metilo del grupo metoxilo,
las cuales se observan en 7.04 y 3.85 ppm, respectivamente, mostraron
correlación con la señal observada en 141.2 ppm, asignando así a C-8. Por último,
el carbono 8a se pudo asignar, ya que su señal (150.3 ppm) correlacionó con las
señales observadas en δ 12.79 (OH) y 6.72 (H-4).
Al hacer la búsqueda bibliográfica de este compuesto, se encontró que este ya
había sido aislado como producto natural de la especie Flourensia cernua,41 donde
solo se describen los datos de RMN de 1H y no se describen los datos de RMN de 13C, la asignación completa se muestra en la tabla 9.
50
OO
HOO
2
45
78a
Ar H4 H3
OMe
(Me)2
C3
C4C7
OMe
(Me)2
O
O
Figura 36. Experimento HSQC del compuesto 39.
51
OO
HOO
2
45
78a
ArH4 H3
OMe
O
(Me)2
OH
C=O
C5C8a
C8
C3
C4 C7C6
C4a
C2
OMe
(Me)2
O
Figura 37. Experimento gHMBC del compuesto 39.
52
Tabla 9. Datos de RMN para 39.
δ 1H (J Hz) δ 13C HMBC
2 78.2
3 5.61 (7.4) 128.4 C-4a, C-2, (Me)2
4 6.72 (7.4) 116.0 C-8a, C-5, C-2
4a 110.3
5 155.0
6 111.8
7 7.04 113.4 C-8a, C-8, C-5, C=O
8 141.2
8a 150.3
OH 12.79 C-6, C-5, C-4a
(Me)2 1.51 28.2 C-3, C-2
C=O 202.2
Ac 2.54 26.3 C-7, C-6, C=O
OMe 3.85 57.2 C-8
Fracción medianamente polar.
El espectro de RMN 1H de dicha fracción (Figura 38), en el cual se observa el
mismo tipo de señales que el de la parte no polar, principalmente señales del
compuesto 39, así como otras menos intensas que mostraron la presencias de
otros compuestos.
Se comenzó el trabajo de purificación de dicha fracción y para ello se tomaron 5 g
y se sometieron a CC empacada con sílica gel como adsorbente, eluyendo con
hexano y mezclas de hexano-acetato de etilo, acetato de etilo, mezlcas de acetato
de etilo-metanol y finalmente metanol.
Tras el análisis por CCF se juntaron 9 fracciones principales, de las cuales, las
eluidas con 9:1 y 4:1 se sometieron a CC, de la primera se lograron aislar 10 mg
(0.034 %) de la mezcla de los compuestos 40 y 41, y de la segunda se obtuvieron
100 mg (0.345 %) y 4 mg (0.014 %) de 39 y 42,44 respectivamente.
53
Figura 39 Derivados de cromeno aislados de la FMP de E. pazcuarense.
El análisis de la bibliografía del género Eupatotium mostró que una buena parte de
los metabolitos secundarios con actividad biológica interesante habían sido
aislados de los extractos polares de la parte aérea. Se decidió explorar el extracto
metanólico de las flores de E. pazcuarense.
Extracto metanólico de las flores de E. pazcuarense.
Se tomaron 56 g de la flor y se trato de la misma forma que a la planta, después
de la evaporación del disolvente se obtuvieron 3 g de extracto crudo.
Estos 3 g se sometieron a CC, utilizando como eluentes hexano, mezclas de
hexano-acetato de etilo a polaridad ascendente y acetato de etilo, de la cual
después de analizar por CCF se obtuvieron 10 fracciones principales.
De la fracción eluida con la mezcla de acetato de etilo y hexano a una proporción
de 3:2 se logró aislar 3 mg (0.1 %) del compuesto 43 (Figura 40), el cual ya había
sido aislado anteriormente de la especie Eupatorium glabrata.45
OH
O
O
OH
43
Figura 40. Dihidrofurano (43) aislado del extracto metanólico de E. pazcuarense.
54
Figura 38. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de la FMP de E. pazcuarense
55
6. CONCLUSIONES
• Los metabolitos secundarios principales de la fracción no polar de S.
monardifolia son, el nuevo derivado de longipineno 7β-angeloiloxi-8α-
isovaleriloxilongipin-2-en-1-ona (33) y el conocido 7β,8α -
diangeloiloxilongipin-2-en-1-ona (32).
• Los metabolitos secundarios principales de la fracción medianamente polar
de S. monardifolia son 32, 33, y 7β,8α -diangeloiloxilongipin-1-ona (34).
• Del tratamiento de la fracción no polar de S. monardifolia con KOH se
lograron obtener los compuestos 35, 36 y 37.
• Se obtuvo el compuesto 38 por tratamiento de 35 con anhídrido acético.
• Los metabolitos secundarios principales de las fracciones no polar y
medianamente polar de E. pazcuarense son los cromenos 5-hidroxi-6-
acetil-8metoxi-2,2-dimetilcromeno (39), 6-acetil-2,2-dimetilcromeno (40), 7-
8-dimetoxi-2,2-dimetilcromeno (41) y 6-acetil-8metoxi-2,2-dimetilcromeno
(42).
• Con base en los datos de RMN de 1H y 13C en 1 y 2 dimensiones se hizo la
asignación completa de los datos de 1H y 13C de 32, 33, 35, 38 y 39.
• El análisis conformacional a nivel de Mecánica Molecular (MMFF94)
seguido de TFD permitió conocer a las 13 estructuras principales que
contribuyen a la población conformacional de 33.
7. PARTE EXPERIMENTAL
7.1 General
Los puntos de fusión se determinaron en un aparato Cole-Parmer y no están
corregidos. Los espectros de infrarrojo (IR) se obtuvieron en solución de CHCl3 de
un equipo Perkin Elmer 2000 FT-IR y solo se muestran las lecturas de las
absorciones más importantes. Los datos espectroscópicos de RMN de 1H, 13C y
2D fueron registrados en un equipo Varian Mercury 300 operando a 300 y 75 MHz,
56
respectivamente ó en un equipo Varian System 500 operando a 500 y 125 MHz,
respectivamente, usando CDCl3 como solvente y TMS como referencia interna.
La separación por HPLC fue hecha en un cromatógrafo Perkin Elmer Serie 200
usando una columna Alltech Econosil de silica con dimensiones 4.6 x 250 mm, con
un tamaño de partícula de 5 µm.
Los espectros de masa de alta resolución por impacto electrónico (EIHRMS) se
determinaron en un espectrómetro Jeol JGCmate II.
La determinación de la rotación óptica se llevó a cabo en un polarímetro Perkin
Elmer 341, empleando CHCl3 como solvente.
Para las separaciones cromatográficas en columna abierta se usó Sílica gel 60
(100-200 mallas ASTM) de Merck y para la cromatografía en capa fina, se usaron
placas de sílica gel con indicador de luz ultravioleta, se usó una solución de sulfato
cérico amoniacal en ácido sulfúrico acuoso como revelador y calentamiento de la
placa.
7.2 El material vegetal
Las plantas completas de S. monardifolia y E. pazcuarense se colectaron en la
Marquesa, Estado de México, en Noviembre del 2006.
Una planta compuesta de cada especie se preparó para su depósito en el
Herbario de la Universidad Autónoma de Chapingo, la identificación fue realizada
por la M. en C. Ernestina Cedillo Portugal quien le asignó el número de depósito
61070 a S.monardifolia y 61069 a E. pazcuarense.
7.3 Extracción del material orgánico
El material seco y molido (800 g) se extrajo a temperatura ambiente durante 3 días
(X3) con metanol (3 L). El solvente se evaporó a presión reducida. El extracto
resultante se suspendió en una mezcla metanol agua 7:3 y se extrajo con hexano
primero y luego con AcOEt, para dar después de la evaporación de los solventes,
12, 4 y 10 g, de las fracciones no polar, medianamente polar y polar,
respetivamente.
57
Se llevó a cabo el mismo procedimiento para E. pazcuarense y se obtuvieron 7, 5
y 16 g, de las fracciones no polar, medianamente polar y polar, respectivamente.
Con la finalidad de eliminar las grasas de cada uno de los extractos, los extractos
se diluyeron en la mínima cantidad de acetona y se enfriaron a 4 ºC. Las grasas se
eliminaron por filtración. La operación se repitió 2 veces más.
7.4 Separación y purificación de los compuestos
7.4.1.1 Extracto Hexánico de S. monardifolia.
Se tomaron 6 g del extracto y se realizó cromatografía en columna (CC) utilizando
Sílica gel 60 (100-200 mallas ASTM) de Merck. Se utilizó una columna de 5 cm de
diámetro y una altura de adsorbente de 20 cm. La elusión de la columna se hizo
empleando hexano, mezclas de hexano-AcOEt y AcOEt, con los siguientes
gradientes (1:0, 400 mL), (49:1, 400 mL), (97:3, 900 mL), (19:1, 400 mL), (9:1, 200
mL), (4:1, 800 mL), (3:1, 400 mL), (7:3, 500 mL), (3:2, 1000 mL), (1:1, 300 mL) y
(0:1, 200 mL). Se colectaron 140 fracciones de 50 mL aproximadamente.
La CC se monitoreó por cromatografías de capa fina (CCF), de sílica gel con
indicador para luz UV. Las 8 fracciones principales fueron: A(1-26), B(27-40),
C(41-58), D(59-74), E(75-90), F(91-105), G(106-123) y H(124-140). Cada una de
estas fracciones fueron sometidas a recromatografías en columna (RCC).
Las recromatografías en columna (RCC) se realizaron empleando columnas de
diferentes diámetros y alturas, dependiendo de las características de cada
muestra a purificar; éstas fueron empacadas con Sílica gel 60 (100-200 mallas
ASTM) de Merck, empleando gradientes de elusión con mezclas de hexano y
acetato de etilo.
De la RCC de la fracción E, empleando gradientes de elusión con mezclas de
hexano y acetato de etilo 19:1, 9:1 y 4:1, se aisló el compuesto 3234 (25 mg).
7β,8α-diangeloiloxilongipin-2-en-1-ona (32). Aceite color
amarillo claro. C25H34O5 [α]589 +48, [α]578 +51, [α]546 +60,
[α]436 +134, [α]365 +540 (c = 2.84, CHCl3). EIMS (70 eV) m/z
O
O
OO
O
32
58
(rel int): 414 [M]+ (9), 315 (13), 214(39), 199 (49), 159 (13), 83 (100), 55 (58). IR
(CHCl3) νmax 3030, 2968, 1716, 1670, 1228, 1158 cm-1. UV: (EtOH) λmax (ε) 218
(7917), 246 (2604) nm. Los datos de RMN de 1H y 13C se muestran en la tabla 2.
De la RCC de la fracción F, empleando gradientes de elusión con mezclas de
hexano y acetato de etilo 19:1, 9:1 y 4:1, se aisló una mezcla de los compuestos
32 y 33, la cual fue purificada utilizando HPLC usando una columna de sílica
250x4.6 mm y 5µm de tamaño de partícula y hexano como eluente, para dar 32 (7
mg) y 33 (5 mg).
7β-angeloiloxi-8α-isovaleroiloxilongipin-2-en-1-ona (33).
Aceite color amarillo claro. C25H36O5 [α]589 +35.3, [α]578
+37.2, [α]546 +43.5, [α]436 +99.3, [α]365 +456.5 (c = 2.84,
CHCl3). IR (CHCl3) νmax 1723, 1673, 1465, 1379, 1239,
1163 cm-1. UV: (EtOH) λmax 214.8, 247.73 nm. EIHRMS:
m/z [M]+ calcd para C25H36O5: 416.2563; encontrado: 416.2573. Los datos de RMN
de 1H y 13C se muestran en la tabla 3.
7.4.1.2 Extracto de Acetato de Etilo de S. monardifolia
Se tomaron 4 g del extracto y se realizó cromatografía en columna (CC) utilizando
las mismas características que para el extracto hexánico. La elusión de la columna
se hizo empleando hexano, mezclas de hexano-AcOEt, AcOEt, con los siguientes
gradientes (1:0, 200 mL), (9:1, 300 mL), (4:1, 300 mL), (7:3, 300 mL), (3:2, 300
mL), (2:3, 300 mL), (0:1, 900 mL), mezclas de cloroformo metanol y metanol (9:1,
1000 mL), (7:3, 700 mL), (3:2, 300 mL), (2:3, 300 mL) , (0:1, 200 mL) . Se
colectaron 180 fracciones de 50 mL aproximadamente.
La CC se monitoreó por CCF, de sílica gel con indicador para luz UV. 9 fracciones
principales fueron obtenidas, A(1-31), B(32-48), C(49-68), D(69-85), E(86-105),
F(106-121), G(122-142), H(143-161) y I(162-180), las cuales fueron
recromatografiadas en columna abierta.
O
O
OO
O
33
59
Las RCC se hicieron empleando columnas de diferentes diámetros y alturas,
dependiendo de las características de cada muestra a purificar; éstas fueron
empacadas con Sílica gel 60 (100-200 mallas ASTM) de Merck; empleando
gradientes de elusión con mezclas de hexano y acetato de etilo.
De la RCC de la fracción A, empleando gradientes de elusión con mezclas de
hexano y acetato de etilo (19:1, 400 ml) y (9:1, 400 ml), se aisló el compuesto 34
(8 mg). Cuya identificación se hizo con base a sus datos de RMN de 1H y de 13C
con aquellos descritos.39
7β,8α-diangeloyloxylongipin-1-ona (34). Aceite color
amarillo claro. C25H36O5.
De la RCC de la fracción B, empleando gradientes de
elusión con mezclas de hexano y acetato de etilo (19:1,
400 ml) y (9:1, 400 ml), se aisló la mezcla de los
compuestos 32 y 33 (40 mg).
La fracción polar se sometió a CC usando hexano, mezclas de hexano-AcOEt,
AcOEt, con los siguientes gradientes (1:0, 200 mL), (9:1, 300 mL), (4:1, 300 mL),
(7:3, 300 mL), (3:2, 300 mL), (2:3, 300 mL), (0:1, 900 mL) y metanol (200 mL).
La recromatografía de las fracciones principales condujo a mezclas muy complejas
que aun después de varios intentos de separación no fue posible obtener
compuestos puros.
7.4.2.1 Extracto Hexánico de E. pazcuarense.
Se tomaron 7 g del extracto y se realizó cromatografía en columna (CC) utilizando
Sílica gel 60 (100-200 mallas ASTM) de Merck. Se utilizó una columna de 5 cm de
diámetro y una altura de adsorbente de 25 cm. La elusión de la columna se realizó
empleando hexano, mezclas de hexano-AcOEt y AcOET, con los siguientes
gradientes (1:0, 600 mL), (9:1, 600 mL), (4:1, 600 mL), (7:3, 600 mL), (3:2, 600
mL), (1:1, 600 mL) y (0:1, 600 mL). Se colectaron 25 fracciones de 150 mL
aproximadamente.
O
O
OO
O
34
60
La CC se monitoreó por Cromatografías de Placa Fina (CPF), de sílica gel con
indicador para luz UV. Se obtuvieron 8 fracciones principales, A(1-2), B(3-5), C(6-
8), D(9-11), E(12-14), F(15-17), G(18-22) y H(23-25), las cuales fueron
recromatografiadas en columna.
Las recromatografías en columna (RCC) se realizaron empleando columnas de
diferentes diámetros y alturas, dependiendo de las características de cada
muestra a purificar, éstas fueron empacadas con Sílica gel 60 (100-200 mallas
ASTM) de Merck, empleando gradientes de elusión con mezclas de hexano y
acetato de etilo.
De la RCC de la fracción C, empleando gradientes de elusión con mezclas de
hexano y acetato de etilo 19:1, 9:1, 17:3, 4:1 y 7:3, se aisló el compuesto 3941 (4.2
mg).
5-hidroxi-6-acetil-8-metoxicromeno (39). Sólido amorfo color
amarillo claro. C14H16O4 p.f. 69-70 °C Los datos de RMN de 1H y 13C se muestran en la tabla 6.
De la RCC de la fracción D, empleando gradientes de elusión con mezclas de
hexano y acetato de etilo 19:1, 9:1, 17:3, 4:1 y 7:3, se aisló una mezcla de los
compuestos 40 y 41 (7.7 mg) en una proporción de 2:1.
6-acetilcromeno (40), 7,8-
dimetoxicromeno (41). Aceite color
amarillo claro. RMN de 13C para 40: δ
196.7 (C=O), 157.4 (C8a), 131.2 (C3),
130.2 (C7), 126.9 (C5), 121.8 (C4), 121.6 (C6), 120.7 (C4a), 116.1 (C8), 77.2 (C2),
O
OHO
O
39
O O
O
OO
+
40 41
61
28.3 (Me2), 26.2 (Ac). RMN de 13C para 41: δ 153.6 (C7), 146.5 (C8a), 137.8 (C8),
128.4 (C3), 122.2 (C4), 120.8 (C5), 116.3 (C4a), 104.2 (C6), 76.3 (C2), 66.7 y 56.0
(OMe), 27.9 (Me2).
7.4.2.2 Extracto de Acetato de Etilo de E. pazcuarense
A 5 g del extracto se trataron por CC utilizando las mismas características que
para el extracto hexánico. La elusión de la columna se realizó empleando hexano,
mezclas de hexano-AcOEt, AcOEt, con los siguientes gradientes (1:0, 400 mL),
(9:1, 300 mL), (4:1, 500 mL), (7:3, 600 mL), (3:2, 300 mL), (2:3, 400 mL), (0:1, 700
mL), y mezcla de cloroformo-metanol (19:1, 200 mL). Se colectaron 14 fracciones
de 200 mL aproximadamente.
Se obtuvieron 9 fracciones principales: A(1), B(2-3), C(4-6), D(7-9), E(10), F(11),
G(12) , H(13) y I(14), que fueron posteriormente sometidas a RCC.
De la RCC de la fracción A, empleando gradientes de elusión de hexano y acetato
de etilo 49:1, 97:3, 19:1, 9:1 y 8:2, nuevamente se logró aislar al compuesto 39
(110 mg).
De la RCC de la fracción B, empleando los mismos gradientes de elusión que para
la fracción A, nuevamente se logró aislar la mezcla de los compuestos 40 y 41 (6.6
mg), así como también al timol 43 (4.4 mg).
Timol (43)Aceite color amarillo claro. C10H14O.
De la RCC de la fracción C eluida como la fracción B se logró aislar al compuesto
4244 (11 mg).
OH
43
62
6-acetil-8-metoxicromeno (42). Aceite color amarillo claro.
C14H16O3. RMN de 13C para 40: δ 5.68 (7.4 Hz, H3), 6.35 (7.4
Hz, H4), 7.43 (H5), 7.28 (H7), 1.51 (Me2), 2.56 (Ac), 3.91 (OMe).
7.5 Métodos computacionales
La conformación de mínima energía de 33 se obtuvo haciendo en primera
instancia, una búsqueda sistemática a nivel de mecánica molecular (MMX) usando
el campo de fuerza MMFF94 a través de un protocolo Monte Carlo. 83
Conformaciones fueron encontradas en un intervalo de energía de 10 kcal/mol.
Estas conformaciones fueron reoptimizadas usando DFT a un nivel de cálculo
B3LYP/6-31G(d) utilizando el programa Spartan’04W. Después de la
reoptimización en DFT fueron encontrados soló 24 confórmeros en un rango de
energía de 2.5 kcal/mol. Cada una de estas conformaciones fueron reoptimizadas
para obtener un modelo de mayor precisión usando un nivel de cálculo
B3LYP/DGDZVP usando el programa Gaussian 03W. Después de este cálculo se
obtuvieron 13 confórmeros que contribuyen con un 96.67 % de la población
conformacional. En ningún cálculo fueron incluidos los efectos del disolvente.
7.6 Derivados Químicos
7.6.1 Hidrólisis de la mezcla de 32 y 33
La hidrólisis de la mezcla se llevó a cabo bajó las siguientes condiciones: en un
matraz de reacción se colocaron 100 mg de la muestra que se disolvieron en 1 mL
de MeOH. A esta solución se le agregó 0.4 mL de solución de KOH (0.75 g/mL).
La mezcla de reacción se colocó en una parrilla a agitación constante y se reflujó
por 15 minutos. Después de transcurrido este tiempo, se redujo el volumen y se
extrajo con AcOEt. La purificación del compuesto 35 se hizo por cromatografía en
O
O
O
42
63
columna, empacada con Sílica gel 60 (100-200 mallas ASTM) de Merck, usando
AcOEt como eluyente. Se obtuvieron 130 mg (70%) de 35.
7β,8α-dihidroxilongipin-2-en-1-ona (35). Sólido amorfo color
blanco. C15H22O3 p.f. 175-176 °C Los datos de RMN de 1H y 13C se muestran en la tabla 4.
[α]589 +84.58˚, [α]578 +88.92˚, [α]546 +103.16˚, [α]436 +215.83˚,
[α]365 baja energía (c = 1.2, CHCl3) IR 3624, 3026, 2962, 1668,
1614, 1434, 1376, 1328, 1224, 1218, 1156 (CHCl3) EIHRMS: m/z [M]+ calcd para
C15H22O3: 250.1569; encontrado: 250.1571.
7.6.2 Acetilación de 35
La acetilación de 35 se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: en un matraz
de reacción se colocaron 60 mg de la muestra que se disolvieron en 0.5 mL de
piridina. A esta solución se la agregaron 0.5 mL de anhídrido acético. La mezcla
de reacción se colocó en una parrilla a agitación constante y se reflujó por 15
minutos. Después de transcurrido este tiempo, se redujo el volumen y se extrajo
con AcOEt. La purificación del compuesto 38 se hizo por cromatografía en
columna, empacada con Sílica gel 60 (100-200 mallas ASTM) de Merck, usando
AcOEt como eluyente. Se obtuvieron 7 mg de 38.
7β,8α-diacetiloxilongipin-2-en-1-ona (38). Aceite color
amarillo tenue. C19H26O5 p.f. 175-176 °C Los datos de RMN
de 1H y 13C se muestran en la tabla 5.
[α]589 +45.7˚, [α]578 +48.8˚, [α]546 +58.88˚, [α]436 +135.96˚,
[α]365 baja energía (c = 0.89, CHCl3) IR 3026, 2968, 2932,
1740, 1670, 1616, 1434, 1394, 1370, 1328, 1254, 1236, 1218, 1212, 1206, 1158,
1068 (CHCl3) EIMS m/z 334.1751 [M]+, 214.0931, 199.0435, 161.0672, 148.9798,
O
OH
OH
35
O
O
O
38
O
O
64
122.0001, 84.9743 EIHRMS: m/z [M]+ calcd para C19H26O5: 334.1780; encontrado:
334.1782.
8. REFERENCIAS
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66
ANEXOS
Espectro de 1H de RMN del 7β-angeloiloxi,8α-isovaleriloxi-longipin-1-ona (34) Espectros de RMN: 13C, gHSQC, gHMBC, NOESY para el 7β,8α-dihidroxi-longipin-2-en-1-ona (35) Espectro de 1H de RMN de 7β,8α-dihidroxi-longipin-1-ona (36) Espectro de 1H de RMN de 7β,8α,9α-trihidroxi-longipin-1-ona (37) Espectros de RMN: 13C, gHSQC, gHMBC para 7β,8α-diacetil-longipin-2-en-1-ona (38) Espectros de RMN: 1H, 13C, gHSQC, gHMBC, NOESY para 6-acetilcromeno (40) y 7,8dimetoxicromeno (41)
67
H3’ H2βH8
H7
H5
H11
H4
H9α
Me12
Me4’
Me14
Me13
Me15
Me5’
H3
H2αH9β
Me5’’
Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) de 34.
68
C1
C9
C6
C15
C12
C3
C5C7
C2
C8
C11 C4
C10
C13
C14
Espectro de RMN de 13C (500 MHz, CDCl3) de 35
69
C9 C15
C12
C5C7
C2C8
C11 C4C13
C14
H2
H8
H7
H5
H11
H4
H9β
Me14
H9α
Me13
Me15
Me12
Experimento gHSQC de 35.
70
H2 H8 H7
H5
H11 H4H9β
Me14
H9α
Me13
Me15
Me12
C1
C9
C6
C15
C12
C3
C5
C7
C2
C8
C11C4
C10
C13C14
Experimento gHMBC de 35.
71
H8 H7
H5
H11 H4 H9β H9α
Me12
H8
H7
H11
H4
H5
H9β
Me12
H9α
Experimento NOESY de 35.
72
H2βH8
H7
H5
H11
H4H9α
Me12
Me14
Me13
Me15
H3
H2α H9β
Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) de 36.
73
H2
H8
H7
H5
H11 H4H9
Me14
Me13
Me15Me12
Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) de 37.
74
C15
C1
C2
C3
C7C8 C5 C11
C10C4 C9
C6
C12
C14
C13
C2’
C1’
Espectro de RMN de 13C (500 MHz, CDCl3) de 38.
75
C2C7 C8
C5C11
C4C9
C15C2’
C14C13 C12
H2
H8H7
H11
H4
H5
H9α
O
Me13
Me14
Me15
Me12
Experimento gHSQC de 38.
76
H2
H8H7
H11
H4
H5
H9α
O
Me13Me14
Me15
C1
C2
C3
C7C8 C5
C11
C10C4
C1’
C9
C6 C2’
C14C13
C12
C15
Me12
Experimento gHMBC de 38.
77
H7H5
H8H5’ H6’ H4’
H4
H3 H3’
OMeAc
(Me)2
Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de 40 y 41.
78
Ac
(Me)2’
(Me)2
OMe
OMeH6’
H4a’H8
H4a
H4
H4’
H5
H3’
H7
H3
H5’
H8a’H8a H6
H7’ H8’
C2C2’
Espectro de RMN de 13C (300 MHz, CDCl3) de 40 y 41.
79
H7 H5 H8 H5’ H6’ H4’
H4
H3 H3’
OMe Ac
(Me)2
Ac
(Me)2
OMe
OMe
C6’
C8C5’C4’
C4C5C3’C7C3
Experimento gHSQC de 40 y 41.
80
H7H5
H8 H5’H6’ H4’
H4
H3 H3’
OMeAc
(Me)2
Ac
(Me)2
OMe
OMe
C6’
C8C5’C4’C4
C5C3’C7C3
C2’C2
C8a’C7’
C8a
C=O
Experimento gHMBC de 40 y 41.
81
H7H5 H8 H5’
H6’ H4’
H4
H3 H3’
OMe Ac
(Me)2
Experimento NOESY de 40 y 41.
